CN103966327A - 一种miR-27a的应用及其诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和医学技术领域，提供了一种miR-27a在制备结肠癌发生或转移诊断试剂盒中的应用，还提供了一种miR-27a在制备抑制结肠癌发生或转移药物中的应用，还提供了一种结肠癌发生或转移诊断试剂盒，试剂盒含有miR-27a的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为：上游引物序列为：5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAA G-3’；通用下游引物序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。本发明提供的试剂盒通过检测miR-27a的表达，可以对结肠癌发生进行早期诊断，通过检测其表达水平与临床分期以及转移的关系，对病人预后作出评价。

Description

一种miR-27a的应用及其诊断试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术和医学技术领域，特别涉及一种miR-27a对结肠癌发生或转移诊断的应用。

背景技术

结肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，结肠癌发生发展的原因尚未完全清楚。结肠癌的淋巴转移和其他脏器远端转移是结肠癌病人死亡的主要原因，结肠癌远端转移的患者预后极差，因此，对结肠癌的发生和转移的研究一直是基础和临床研究的热点。结肠癌的常规治疗手段主要是手术治疗、放化疗。近年来迅速发展的免疫治疗和基因治疗显示了巨大的应用潜力。近年来研究表明表观遗传的改变和癌信号分子的激活是恶性病变发生和进展的主要原因。表观修饰尤其是miRNAs的异常表达与肿瘤的形成、转移相关，并在肿瘤治疗中起关键作用。microRNAs(miRNAs)是一类内源性小分子非编码RNA，结构高度保守，具有表达时序性和组织特异性，通过与靶基因3’非编码区互补序列特异性结合，导致翻译抑制或mRNA降解，从而调节基因的表达。基于miRNA的以上特点，以及随着大规模、高通量miRNA检测技术的推广应用，发现新的miRNA不仅为肿瘤的诊断和预后提供了颇具价值的标准，同时也为寻找新的肿瘤生物治疗靶点奠定基础。

miR-27a位于19号染色体，其表达水平和生物功能随肿瘤类型而异，一些研究报道miR-27a是一种癌基因，例如，在乳腺癌、结肠癌细胞系，肝细胞腺癌细胞中表达增高，而且miR-27a的高表达与乳腺癌的进展和不良预后密切相关。另外一些研究也发现miR-27a通过促进转录因子特异蛋白(Sp)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的表达来发挥其作为癌基因的功能。另一方面miR-27a也扮演着抑癌基因的角色，例如，miR-27a在食管癌、口腔鳞癌和非小细胞肺癌中表达降低。在非小细胞肺癌中，miR-27a靶作用于MET和EGFR的3’UTR导致MET和EGFR的表达降低。

我们的研究发现，miR-27a在结肠癌组织中表达显著降低(41例结肠癌标本中33例miR-27a表达降低)，另外miR-27a的低表达和结肠癌的远处转移(二者正相关)以及临床分期(3-4期的表达低于1-2期)密切相关。miR-27a通过靶作用于smad2、SGPP1抑制肿瘤的生长和转移。我们对miR-27a在结肠癌组织中的表达水平以及其生物功能的研究尚属首次，该研究对结肠癌的发生和转移以及治疗具有重大的意义。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种miR-27a的应用及其诊断试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供了一种miR-27a在制备结肠癌发生或转移诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种miR-27a在制备抑制结肠癌发生或转移药物中的应用。

本发明还提供了一种结肠癌发生或转移诊断试剂盒，试剂盒含有miR-27a的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为：

上游引物序列为：5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，如SEQ IDNO：1所示；

通用下游引物序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如SEQ ID NO：2所示。

该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。作为优选，试剂盒包括：组织总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、逆转录试剂、定量PCR试剂。

其中，逆转录试剂中包括miR-27a的特异逆转录引物，其序列为：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCGGAA，如SEQ ID NO：3所示；

内参snord47的逆转录引物，其序列为：GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCTC，如SEQ IDNO：4所示；

定量PCR试剂中包括miR-27a的特异引物：

上游引物：TTCGGTTCACAGTGGCTAAG，如SEQ ID NO：1所示；

内参snord47的特异引物：

上游引物：CGCCAATGATGTAATGATTCTG，如SEQ ID NO：5所示；

通用下游引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGT，如SEQ ID NO：2；

通用Taqman探针:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAATTT/3IABkFQ。

本发明的有益效果：本发明提供的试剂盒通过检测miR-27a的表达，可以对结肠癌发生进行早期诊断，通过检测其表达水平与临床分期以及转移的关系，对病人预后作出评价。基于miR-27a靶作用于smad2、SGPP1的特点，可以设计抑制肿瘤生长、转移的干预策略，提出了miR-27a在制备抑制结肠癌肿瘤生长和转移药物中的作用。本发明在医学和生物制药领域有重大实际意义和巨大的应用价值。

附图说明

图1为miR-27a在41例标本中的表达情况；

图2为miR-27a转染HCT116细胞后划痕实验的结果；

图3为SGPP1和smad2在结肠癌组织和邻近正常组织中表达的免疫组化染色结果；

图4为p-STAT3在结肠癌组织和邻近正常组织中表达的免疫组化染色结果；

图5为miR-27a转染HCT116细胞后SGPP1的表达变化；

图6为miR-27a转染HCT116细胞后smad2的表达变化；

图7为psiCHECKTM-2载体的图谱；

图8为miR-27a转染HCT116细胞后SGPP1和smad2报告基因活性的变化；

图9为MTS实验检测miR-27a转染SW480、HCT116、Caco2后细胞增殖情况；

图10为miR-27a转染后细胞的凋亡变化；

图11为miR-27a转染HCT116和SW480细胞后影响STAT3和Caspase3水平；

图12为miR-27a转染HCT116细胞后抑制SGPP1和Smad2蛋白水平；

图13为miR-27a转染SW480细胞后抑制SGPP1和Smad2蛋白水平；

图14为实验组(miR-27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠在肿瘤细胞接种后增生物的体积随时间的变化情况；

图15为实验组(miR-27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠中增生物的重量情况(NC为negative control)；

图16为实验组(miR-27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠中增生物的情况；

图17为实验组(miR-27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠中增生物的miR-27a的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。

实施例1miR-27a在结肠癌组织标本中的差异性表达

1、人结肠组织标本收集

从新乡市中心医院和新乡医学院第一附属医院，收集2012年11月至2013年12月间的共41例结肠癌标本及其临近的正常结肠组织标本。一部分储存于液氮、-80℃冰箱中，提取RNA和蛋白质用来做实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹。另一部分用10％福尔马林固定，后用石蜡包埋。病人的临床和病理信息如表1所示。所有病人均书面告知，标本收集均经新乡医学院伦理审查委员会同意。

表1miR-27a与临床病理资料间的联系

N：代表病人数；n：代表每组病人数

2、RNA提取和miR-27a加polyA

按照操作手册步骤用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)分别提取冰冻的结肠癌及其邻近正常结肠组织的RNA。用A-Plus^TM Poly(A)Polymerase Tailing Kit(CELLSCRIPT，INC)按操作手册对miRNA-27a进行加polyA。

3、逆转录和实时荧光定量PCR

用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoSCIENTIFIC，USA)按操作手册对mRNA和加poly(A)的miR-27a进行逆转录。

miRNA-27a逆转录的反应体系：Tailed RNA2μl，逆转录引物1μl，AMV buffer2μl，AMV0.5μl，10mM dNTP0.5μl，MgCl₂2μl，H₂O2μl；反应条件：42℃60min，70℃10min，冰上放置2min。

mRNA逆转录的反应体系：总RNA1μg，逆转录引物1μl，AMVbuffer2μl，AMV0.5μl，10mM dNTP0.5μl，MgCl₂2μl，总体积10μl；反应条件：42℃60min，70℃10min，冰上放置2min。

用实时荧光定量PCR(Applied Biosystems Inc.)对miRNA和mRNA进行定量分析。

miRNA-27a定量的反应体系：GoTaq Hot Start Colorless MasterMix10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，probe0.5μl，diluted cDNA2μl，RNase-free water6.7μl。反应条件：95℃2min；变性95℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环。

mRNA定量的反应体系：上游引物(20μm)0.15μl，下游引物(20μm)0.15μl，cDNA0.7μl，H₂O9μl，荧光染料SYBR Green(2X)10μl；反应条件：50℃2min，95℃2min；变性95℃15s，退火/延伸60℃1min，共40个循环。

miR-27a的逆转录引物为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCGGAA；

实时荧光定量PCR的上游引物为TTCGGTTCACAGTGGCTAAG。

内参snord47的逆转录引物为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTaacctc；

实时荧光定量PCR的上游引物为CGCCAATGATGTAATGATTCTG。

miR-27a和内参snord47的通用下游引物为CAGTGCAGGGTCCGAGGT；

miR-27a和内参snord47的通用Taqman探针为56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAATTT/3IABkFQ。

SGPP1(鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶1)的实时荧光定量PCR：

上游引物为TGGTCCTCCTCACCTATGGC；

下游引物为CTAGAGAACACCAGCAGGGA；

Smad2的实时荧光定量PCR：

上游引物为AACAGAACTTCCGCCTCTGG；

下游引物为GGAGGTGGCGTTT CTGGAAT；

内参GAPDH的实时荧光定量PCR：

上游引物为GTCAAGGCTGAGAACGGGAA；

下游引物为AAATGAGCCCCAGCCTTCTC。

如图1所示，miR-27a在41例结肠癌组织和邻近正常组织中的表达水平，其中miR-27a在33例结肠癌组织表达水平降低，因此miR-27a可以用来制备结肠癌发生诊断试剂盒。参见表1，miR-27a的表达与结肠癌的远处转移和临床分期密切相关，因此，miR-27a可以用来制备结肠癌转移诊断试剂盒。

实施例2miR-27a抑制结肠癌的远处转移和结肠癌细胞的迁移

1、细胞培养

人结肠癌细胞系HCT116、Caco2和SW480用完全MEM培养基培养。人正常结肠上皮细胞系NCM460从上海Bioleaf(Shanghai,China)购得，用RPMI-1640培养。小鼠结肠腺癌细胞系MC38(来自C57BL6/J小鼠)用MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养。所有的培养基包含10％胎牛血清和抗生素(10000U/ml青霉素，10ug/ml链霉素)。细胞培养箱环境为37℃、湿润、5％CO₂。

2、划痕实验

HCT116细胞培养于100mm培养皿中，用miR-27a和阴性对照miRNA瞬时转染HCT116细胞，在培养皿底部用10μl枪头做一划痕，继续培养，24、48h时分别观察。

参见图2，与对照组相比，转染miR-27a的HCT116细胞的迁移被显著抑制。

实施例3miR-27a靶作用于smad2和SGPP1

1、细胞培养

人结肠癌细胞系HCT116、Caco2和SW480用完全MEM培养基培养。人正常结肠上皮细胞系NCM460从上海Bioleaf(Shanghai,China)购得，用RPMI-1640培养。小鼠结肠腺癌细胞系MC38(来自C57BL6/J小鼠)用MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养。所有的培养基包含10％胎牛血清和抗生素(10000U/ml青霉素，10μg/ml链霉素)。细胞培养箱环境为37℃、湿润、5％CO₂。

2、免疫组化染色

(1)制作切片。取组织蜡块，切下一片置于载玻片上，后置于60℃烤箱中烤片60min。

(2)脱蜡。烤箱中取出切片，分别置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各15min，100％乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min，95％乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min，80％乙醇10min，70％乙醇10min。

(3)取出切片，用PBS(PH7.2-7.6)冲洗2次，5min/次。

(4)抗原修复-蒸汽修复法。将切片放于0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH＝6.0)中，放入蒸锅，使切片在缓冲液中95℃保持20min，取出切片，自然冷却至室温(切片需仍置于缓冲液中，随缓冲液冷却)。

(5)待冷却至室温后，取出切片，用PBS(PH＝7.2-7.6)漂洗2次，5min/次。

(6)灭活内源性过氧化物酶。切片置于保湿盒中，滴加约50微升的3％过氧化氢溶液于切片，室温放置5-10min，若室温较低，可延长时间至20-30min。

(7)切片置于PBS(PH＝7.2-7.6)中漂洗3次，5min/次。

(8)抗原封闭。除去切片上的PBS(PH＝7.2-7.6)，用免疫组化笔在组织周围画一圆圈，滴加山羊血清约50微升于组织上，以浸没组织为益。保湿盒置于37℃恒温箱中15min。

(9)添加一抗anti-SGPP1(Abcam，Cambridge，MA),anti-Smad2和anti-phosphorylated STAT3(Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)。甩去切片上的山羊血清，分别以1:50、1:1000、1:300稀释一抗，每个切片滴加约50微升稀释后的一抗。切片放于保湿盒中置于4℃环境下孵育过夜。

(10)取出切片，用PBS(PH＝7.2-7.6)冲洗3次，2min/次。

(11)添加二抗，生物素标记的山羊抗兔IgG(Beyotime，Jiangsu)每个切片滴加约50微升。将切片放于保湿盒中置于37℃恒温箱中20min。

(12)PBS(PH＝7.2-7.6)漂洗3次，2min/次。

(13)添加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶约50微升于组织上。保湿盒中37℃放置20min。

(14)用PBS(PH＝7.2-7.6)清洗漂洗4次，5min/次。

(15)DAB显色。配制DAB底物溶液，滴加至切片上，镜下控制反应时间。

(16)用蒸馏水漂洗3次，5min/次。

(17)苏木素复染(染细胞核)。将切片置于苏木素溶液中约30s，蒸馏水漂洗。

(18)分化(去除多余的及细胞质中的苏木素)。配制盐酸酒精溶液(37％浓盐酸：7％乙醇＝1：99)，将切片放入盐酸酒精溶液后迅速取出，动作需快。蒸馏水漂洗。

(19)脱水。分别置于70％乙醇10min，80％乙醇10min，95％乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min，100％乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各15min。

(20)封片。滴加一滴中性树脂，放置盖玻片。

(21)镜下观察。

参见图3和图4，SGPP1、smad2和p-STAT3在结肠癌组织中表达高于邻近正常结肠上皮。

3、miR-27a转染

miR-27a的成熟体从上海吉玛购得，HCT116、Caco2和SW480分别以每孔2×10⁵、1.2×10⁵和4×10⁵个的密度培养于六孔板中。培养24小时后，按照操作手册用Lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)将4.0ug的miR-27a转染以上细胞系。阴性miR-27a序列(GenePharma，Shanghai)作为阴性对照转染细胞。

4、RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR

操作方法同实施例1中的步骤2、3。

参见图5和图6，miR-27a转染HCT116细胞后、SGPP1和smad2的RNA表达显著降低，说明miR-27a能抑制SGPP1和smad2的表达。

5、双荧光素酶报告系统载体构建和转染

psiCHECKTM-2载体为起始优化RNAi提供定量而快速的工具。该载体可以监控与报告基因(海肾萤光素酶)融合的靶基因的表达变化。所研究的基因要克隆在多克隆位点上。针对所研究基因合成的siRNA起始的RNAi过程将导致融合mRNA的切断及其降解。通过测量海肾萤光素酶活性的降低来监控RNAi的效果，该载体的图谱如图7所示：

(1)选择psiCHECKTM-2载体上的Xho1和Not1酶切位点，完成载体双酶切备用。克隆目标基因SGPP1和Smad2的3’UTR(这两个基因的PCR引物均设计有Xho1和Not1酶切位点)，先将SGPP1和Smad2的3’UTR连接入pMD19-T Simple载体，经PCR和酶切鉴定，片段大小均与目标基因符合，测序。

(2)测序鉴定正确的阳性质粒，经Xho1和Not1酶切，酶切产物亚克隆入经Xho1和Not1酶切的psiCHECK-2载体，最后获得含有目标基因的两种质粒：psiCHECK-2-3’-UTR-SGPP1和psiCHECK-2-3’-UTR-Smad2。

(3)转染前24小时，将1.2×10⁴个细胞铺于96孔板中，转染试剂为DharmaFECT Duo Transfection Reagent，0.3ul转染试剂/well；100ngplasmid/well；10pmol miRNA/well。实验设定空白对照(只转质粒)，阴性对照(随机miRNA+质粒)。转染24h后，通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶-双荧光素酶报告系统(Promega，Madison，WI)，检测miR-27a对目标基因的抑制效果，经过标准化变换之后，计算miR-27a的干扰效率。

参见图8，在HCT116细胞中miR-27a能显著抑制SGPP1和smad2的报告基因活性。

6、细胞增殖实验

miR-27a转染SW480、HCT116和Caco2细胞后，通过MTS实验作为检测细胞活性试验的方法。将1×10⁵个细胞铺种于96孔板，待细胞生长至适宜密度时，用Lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染miR-27a，转染试剂：0.5ul/孔，miR-27a：0.2ug/孔。24、48、72h时按照操作手册(CellTiter96Non-Radioactive Cell Proliferation AssayKit，Promega Corporation，Madison，WI)通过MTS实验检测细胞增殖。通过酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)检测570nm时的OD值来表示每孔的细胞数量。

参见图9，miR-27a能显著抑制结肠癌细胞SW480、HCT116和Caco2的增殖。

7、细胞凋亡检测

miR-27a转染HCT116细胞，48小时后收集细胞，并用70％乙醇固定，用propidium iodide(P.I.)和Annexin V(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色。用流式细胞仪(FACScan，BD Biosciences，San Jose，CA)检测细胞凋亡。

参见图10，miR-27a转染组的HCT116细胞凋亡明显增强。

8、蛋白免疫印迹

(1)收集转染miR-27a的HCT116和SW480细胞，提取蛋白。将六孔板的培养基倒掉，用PBS清洗一遍，加入PBS将细胞刮下，加入1.5ml的EP管中，2500r离心5min，4℃。倒掉上清液，加入100ul/孔的裂解液1×RIPA buffer(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)，彻底悬浮细胞后加入1ul的PMSF(苯甲基磺酰氟),室温静置15分钟，12000r离心10分钟，4℃。将上清液吸入新的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液25ul/100ul上清液，煮沸6分钟。

(2)BCA法测蛋白浓度。

(3)灌胶与上样。

①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。

②配10％分离胶10ml，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1mL枪吸取胶沿玻璃板缝隙放出，待胶面升到合适高度时即可。然后胶上加一层水液封，液封后的胶凝固更快。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。)

③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

④配浓缩胶6ml，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

⑤用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)

⑥测完蛋白含量后，计算含50ug蛋白的溶液体积即为上样量。

⑦加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

(4)电泳。打开电源，先用50V电压，等蛋白样品跑出浓缩胶后，电压调至100V，至蛋白样品移至分离胶底部，关闭电源。

(5)转膜。

①转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

②在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

③将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

④除去小玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。(转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。)

⑤将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，应冰浴降温或在冰箱中进行。300mA转膜90分钟。

(6)封闭。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗膜液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。倾尽洗膜液，加入封闭液，摇床上缓慢摇动，室温封闭120分钟。

(7)一抗孵育。分别以1:1000、1:2000、1:1000、1:500、1:1000、1:2000来稀释一抗smad2、phosphorylated Stat3、Stat3(Cell SignalingTechnologies，Danvers，MA)、SGPP1(Abcam，Cambridge，MA)、Caspase3(Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)、β-actin(Sigma，St.Louis，MO)。倾尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜。回收一抗。加入洗膜液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗膜液后，再加入洗膜液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

(8)二抗孵育。1:2000稀释二抗Anti-rabbit lgG，HRP-linkedAntibody Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。室温在摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入洗膜液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

(9)显影。用化学发光成像仪(Tanon，shanghai，China)成像。

参见图11、12、13，miR-27a能够抑制SGPP1、smad2、phosphorylatedStat3、Stat3的表达，促进Caspase3的表达。综合以上结论可以证明SGPP1和smad2是miR-27a的靶点。

实施例4miR-27a抑制小鼠体内结肠癌肿瘤的生长

将1.5×10⁵个鼠结肠腺癌细胞MC38重悬于150ul的PBS中，然后皮下注射8周龄的正常C57B/l6小鼠背部(5只小鼠一组)。MC38细胞系和小鼠都是来自C57B/l6背景，所以不会发生排异反应。小鼠在无菌环境中饲养。从注射后21天起，每3天测量增生物的大小。每隔3天注射一次miR-27a(GenePharma，Shanghai，China)和转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)的混合物，miR-27a：6.26μg/只，Lipofectamine2000：1.6μl，PBS：50μl，共3次。接种30天后，小鼠经脱颈处死后取出增生物，称重、测量大小。

参见图14、15、16、17，miR-27a转染组的增生物明显小于对照组，由此可以说明，miR-27a具有抑制肿瘤生长的作用，因此可以用来制备抗肿瘤生长药物。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.miR-27a在制备结肠癌发生或转移诊断试剂盒中的应用。

2.miR-27a在制备抑制结肠癌发生或转移药物中的应用。

3.一种结肠癌发生或转移诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒含有miR-27a的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为：

上游引物序列为：5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，如SEQ IDNO：1所示；

通用下游引物序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。