CN103384829A

CN103384829A - 预测大肠直肠癌复发的生物标记

Info

Publication number: CN103384829A
Application number: CN2012800036479A
Authority: CN
Inventors: 王婷慧; 李彦朋; 郭沛棻; 陈诗雅; 林家如; 李政昌; A．H-L．李
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2012-01-11
Publication date: 2013-11-06
Also published as: SG189505A1; TW201309805A; EP2778237A1; WO2012097069A1; JP2014503221A; US20120184453A1; EP2619587A4; EP2619587A1; JP5836397B2

Abstract

本发明提供预测个体大肠直肠癌(CRC)复发机率的方法，关于测量来自该个体的生物样本中两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNA)的表达水平，使用标准化及已测量的表达水平，预测该个体大肠直肠癌的复发机率。此方法中，特定miRNA的标准化表达水平系根据其对CRC复发的贡献来衡量，以计算CRC复发的机率。本发明也提供用于测量可预测CRC复发机率的该特定miRNA表达水平的套组。

Description

预测大肠直肠癌复发的生物标记

本申请基于美国法典35U.S.C.§119(e)主张2011年1月13日申请之美国临时申请案申请号61/432,468之优先权，该申请案全文并入本申请作为参考数据。

【发明所属之技术领域】

本发明关于预测个体大肠直肠癌复发机率的方法。

【先前技术】

大肠直肠癌(CRC)为源自于大肠或直肠的癌症。CRC为全世界男性罹患癌症的第三名，女性罹患癌症的第二名。2008年全世界约有608,000例的死亡归因于CRC，占癌症死亡总数的8%，使得CRC为全世界癌症死亡的第四名。在美国及欧洲，CRC为癌症相关死亡的第二名，占癌症相关死亡总数的10%。美国癌症协会(ACS)估计，2011年美国约有10万个大肠癌新案例，即将近4万个直肠癌新案例。ACS更估计，2011年美国将有将近5万个CRC相关死亡案例。

大肠癌和直肠癌在分子层次上可能代表相同疾病或相似疾病，但是因为解剖学上的问题，直肠癌的手术较大肠癌更为复杂。原因可能是，直肠癌的癌化组织手术切除后的局部复发机率明显高于大肠癌，因此对此二者的治疗方法明显不同。

协助肿瘤科医师作出合理的治疗策略之临床试验是无价的。肿瘤科医师重复地面临是否以化疗剂治疗患者的决定。目前的癌症化疗剂通常仅有适度的药效，但却伴随实质上的毒性。因此，如果可得知转移复发的机率，有利于肿瘤科医师决定已切除原发性肿瘤的病患的治疗策略。基于如此的讯息，高风险患者可选择进行化疗，而不具癌症复发风险的患者可免除暴露于化疗所伴随的副作用。

追踪大肠直肠癌的进展有两类系统:改良的杜克(Duke)(或Astler-Coller)分期系统(第A-D期)(Astler V B,Coller F A.,AnnSurg1954;139:846-52)及最近衍生自美国关节委员会在癌症上的TNM分期(第I-IV期)(AJCC Cancer Staging Manual,6^th Edition,Springer-Verlag,New York,2002)。两个系统皆是以测量原发性肿瘤由大肠或直肠壁层向邻近器官、淋巴结及远程分布来评估。大肠癌的复发风险及治疗的评估目前主要基于肿瘤的分期。

是否投予辅助性化疗的决定并不明确。在美国每年有约33,000个诊断为第II期大肠直肠癌的新例。这些患者几乎皆进行手术切除肿瘤，且约40%的手术后患者进行以5-氟脲嘧啶(5-FU)为主的化疗治疗。仅进行手术切除的第II期大肠直肠癌患者的5年存活率为约80%。以5-FU+若克瘤(leucovorin-mediated fluorouracil)的标准辅助性治疗，在5年存活率上的绝对改善只有2-4%，而此化疗伴随显著的毒性。

治疗第III期大肠癌的化疗优势显然远高于第II期大肠癌的化疗。诊断为第III期大肠癌的患者有一大部分接受5-FU为主的辅助性化疗。已报导的第III期大肠癌的化疗绝对优势依疗程而异。已有报导以5-FU+若克瘤(leucovorin)治疗的患者的存活率增加约18%，以5-FU+若克瘤+益乐铂(oxaliplatin)治疗的患者的存活率增加约24%。目前对第III期大肠癌患者的照护常态化疗是适度有效的，达到5年存活率从约50%(仅进行手术)至约60%(5-FU+若克瘤)或约70%(5-FU+若克瘤+益乐铂)的改善。单独以5-FU+若克瘤治疗或组合益乐铂的治疗伴随一些副作用，包括接受治疗的病患有约1%的毒性死亡。还不能确定的是，是否有一小群的第III期患者(未治疗的5年存活率整体为约50%)存在类似于第II期患者(未治疗的5年存活率整体为约80%)所观察到的复发风险。

直肠癌的分期使用类似大肠癌分期的标准。第II/III期直肠癌具有与第II/III期大肠癌合理的相关性，如同其进展的状态。如上述，直肠癌与大肠癌在局部复发率及预后的其它方面有所不同，这些差异可能来自于直肠肿瘤完全切除的困难度。

因此，如果了解已存在的化疗信息的毒性及在手术切除后的CRC复发机率，将有利于肿瘤科医师决定是否化疗有利于患者。

癌症的临床试验通常是单一分析物测试。单一分析物试验无法捕捉可发生于与一特定癌症相关的数种不同标记之间的复杂关系。而且，许多已存在的癌症临床试验没有根据免疫组织化学而定量。不同实验室所得到的免疫组织化学结果可能不同，部分是因为试剂没有标准化，部分因为对结果的理解主观且无法简单地量化。

以核糖核酸(RNA)为主的试验不常用于临床试验，因为组织样本中的RNA易于分解。但是，RNA为主的方法可能可自发地观察取自癌症患者的材料(如组织或细胞)中的多重癌症标记的表达。

微型RNA(miRNA)为所有真核细胞中皆可发现的短核糖核酸(RNA)分子，除了真菌、藻类及海洋植物。相较于其它RNA，miRNA分子具有非常少的核苷酸(平均22个)。miRNA为后转录调节物，结合于目标信使RNA转录本(transcript)(mRNA)的互补序列，通常导致转译抑制或目标物崩解及基因沉默(gene silencing)。人类基因组(human genome)可编码超过1000个miRNA，其可目标约60%的哺乳类动物基因，而且富含于许多人类细胞型态中。

直到21世纪初，miRNA被认为是具有保守性功能的生物调节物中独特的一群。之后，研究显示miRNA在负调控中具有多重角色(转录分解及隔离、转译抑制)及可能与正调控有关(转录及转译活性)。藉由影响基因调控，miRNA可能与多数的生物反应过程有关。在不同细胞型态及组织中可发现不同组的miRNA表达。miRNA的异常表达暗含于数种疾病状态。

【发明内容】

本发明一方面提供预测个体大肠直肠癌(CRC)复发机率的方法。此方法可包含测量来自该个体的含有大肠直肠癌肿瘤细胞的生物样本中选自下列所构成之群组中的两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNAs)的表达水平:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。如此测量的表达水平可藉由以包括衡量该miRNA的表达水平对大肠直肠癌复发的贡献度的方法计算复发分数。在本发明之实施态样中，可使用该复发分数预测该个体大肠直肠癌复发机率。这些请求专利的方法可更包括制作包含该复发分数及/或使用该复发分数确认的CRC复发机率的报告。

本发明之一具体实施态样为预测个体内大肠直肠癌(CRC)复发机率的方法。此方法可包含测量来自该个体的含有大肠直肠癌肿瘤细胞的生物样本中选自下列所构成之群组中的两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNAs)的表达水平:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。如此测量的表达水平可被标准化(normalize)，且用于以包括衡量该miRNA的标准化表达水平对大肠直肠癌复发的贡献度的方法计算复发分数。在本发明之实施例中，可使用该复发分数预测该个体的大肠直肠癌复发机率。这些请求专利的方法可更包括制作包含该复发分数及/或使用该复发分数预测CRC复发机率的报告。

本发明之另一具体实施态样为预测个体CRC复发的套组(kit)。一实施态样中，套组由至少两种反转录引物所构成，该引物以专一地反转录选自下列所构成之群组中至少两种的微型核糖核酸(miRNAs)为cDNA:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。

本发明之一实施态样中，套组可包含:(a)至少两种反转录引物以专一地反转录选自由下列所构成之群组中的至少两种miRNAs为cDNA:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p；(b)至少两种探针，专一地结合于由该miRNA反转录所形成的cDNA，其中该探针适合用于实时聚合酶链反应(RT-PCR)，例如定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR或Q-PCR)，以定量存在的miRNA；以及(c)一种反转录引物，专一地反转录至少一种非编码RNA及专一地结合于由该至少一种非编码RNA反转录所形成的cDNA的探针，其中该探针适合用于实时聚合酶链反应(RT-PCR)，例如定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR或Q-PCR)，以定量存在的该未编码RNA。

本发明另一实施态样提供预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，关于收集在大肠直肠肿瘤切除手术时取自该个体的(a)大肠直肠肿瘤样本及(b)该肿瘤以外相邻组织型态的非肿瘤组织的配对样本。之后由该样本(a)及(b)中抽取总核糖核酸(RNA)。使用抽取自该样本(a)及(b)中的总核糖核酸(RNA)进行反转录及定量实时聚合酶链反应(RT-PCR)，以确认下列各miRNA的标准化表达水平:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-223*。该miRNA的表达水平可以相对于该样本中非编码RNA(ncRNA)的RNU6B及RNU44而标准化。在本发明方面，根据该标准化表达水平，该个体大肠直肠癌复发的机率可依逻辑斯回归分析(logistic regression analysis)法来计算。

本发明再一实施态样提供预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，包括(a)提供含有小分子RNA的来自该个体的样本；(b)侦测下列各miRNA的表达:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-223*、hsa-miR-655、hsa-miR-1290及hsa-miR-450b-5p；及(c)依逻辑斯回归分析法来计算该个体大肠直肠癌复发的机率。

本发明另一实施态样提供预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，包括(a)提供含有小分子RNA的来自该个体的样本；(b)侦测hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-223*的各miRNA的表达；及(c)依逻辑斯回归分析法来计算该个体大肠直肠癌复发的机率。

【图式简单说明】

第1图显示本发明的发现过程摘要。

第2-1图显示CRC复发预测模式的接收者操作特征曲线下面积(AUROC)与无疾病存活分析。为了达到负预测值(NPV)=1及灵敏度=1.00，以逻辑斯回归分析法，从19个候选基因中选出6个，建立预测模式。

第2-1a图显示获得自65个病患的训练数据集，复发分数组的截取值(cut-off value)为0.1830。

第2-1b图显示获得自15个病患的测试数据集，复发分数组的截取值为0.1830。

第3-1图显示CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病存活分析。为了达到正预测值(PPV)=1及准确度=1.00，以逻辑斯回归分析法，从19个候选基因中选出6个，建立预测模式。

第3-1a图显示获得自65个病患的训练数据集，复发分数组的截取值(cut-off value)为0.2331。

第3-1b图显示获得自15个病患的测试数据集，复发分数组的截取值为0.2331。

第4-49图显示衍生自qPCR、以RNU6B及RNU44标准化的数据(“tumor”表示衍生自肿瘤组织的经标准化的qPCR之Ct值；“normal”表示衍生自配对的非肿瘤组织的经标准化的qPCR之Ct值)。

第50-54图显示衍生自qPCR、未经标准化的数据(“tumor”表示衍生自肿瘤组织的qPCR原始Ct值；”normal”表示衍生自配对的非肿瘤组织的qPCR原始Ct值)。

第55-60图显示来自微列阵实验的数据，每一候选基因显示:肿瘤组织的列阵强度/正常组织的列阵强度。

第4-60图更具体说明如下：

第4图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第5图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第6图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第7图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第8图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第9图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第10图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第11图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第12图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第13图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第14图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第15图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第16图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第17图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第18图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第19图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第20图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第21图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第22图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第23图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第24图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第25图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第26图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第27图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第28图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第29图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第30图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第31图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第32图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第33图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第34图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第35图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第36图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第37图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第38图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第39图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第40图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第41图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第42图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第43图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第44图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第45图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第46图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第47图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第48图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第49图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第50图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第51图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第52图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第53图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第54图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第55图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第56图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第57图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第58图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第59图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

第60图显示本发明一实施态样的CRC复发预测模式的AUROC曲线及无疾病分析。

【实施方式】

下述之详细说明，为解释之目的，记载数种明确细节以使所揭露的实施态样获得充分的了解。然而，显然地，一或以上的实施态样可在无此述明确细节下实施。再者，已知的结构与装置以图表示以简化说明。

熟知此技术领域之人士将理解相似于或等同于此处记载之内容的数种方法及材料可用于实施本发明。本发明因此不限于此述之方法及材料。本发明中所述名词定义如下。

此述“微型RNA(microRNA)”及”miRNA”包括登录于miRBase(microRNA database mirbase.org)的miRNA。miRBase为所有微型RNA序列及注记数据的基本在线数据库。目前版本(miRBase17)包含超过150个物种的1万6千个微型RNA基因位(gene loci)以及超过1万9千个不同的成熟微型RNA序列。此述“微型RNA”及”miRNA”包括前体miRNA及成熟miRNA产物。

此述“肿瘤”表示所有肿瘤细胞的生长及增殖，不论良性或恶性，以及所有癌前(pre-cancerous)及癌化细胞与组织。

此述“癌症”及“癌化”表示典型地以未调控的细胞生长为特征的哺乳动物的生理状态。大肠直肠癌为癌症的一型。此述“大肠直肠癌”为最广义的定义，表示(1)来自于大肠及/或直肠内衬(lining)的上皮细胞的各种型态及各时期的肿瘤，及/或(2)大肠及/或直肠内衬的上皮细胞的各种型态及各时期的肿瘤。大肠直肠癌(CRC)为源自于大肠或直肠的癌症。大肠癌及直肠癌在分子层次上可代表相同或相似的疾病。

在用于大肠直肠癌分类的分期系统上，大肠与直肠被视为一个器官。根据美国关节委员会在癌症上(AJCC)的肿瘤、淋巴结及转移(TNM)分期系统(Greene et al.(eds,),AJCC Cancer StagingManual.6^thEd.New York,N.Y.:Springer;2002)，大肠直肠癌的分期定义如下:

肿瘤:T1:肿瘤侵犯黏膜下层；T2:肿瘤侵犯固有肌层；T3:肿瘤侵犯经固有肌层至浆膜或至结肠周围或直肠周围组织；T4:肿瘤直接侵犯其它器官或组织及/或穿孔。

淋巴结:N0:无区域性淋巴结转移；N1:一至三个区域性淋巴结转移；N2:四个以上区域性淋巴结转移。

转移:M0:无远程转移；M1:有远程转移。

分期:第I期:T1、N0、M0；T2、N0、M0；第II期:T3、N0、M0；T4、N0、M0；第III期:T1～4、N1～2、M0;第IV期:T1～4、N0～2、M1。

根据改良的杜克(Duke)分期系统，大肠直肠癌的分期如下定义:

第A期:肿瘤侵入肠壁黏膜，但未有更进一步的侵入；第B期:肿瘤侵入肠壁且经过肠壁的固有肌层；第C期:肿瘤侵入肠壁但未经过肠壁的固有肌层，在淋巴结有大肠直肠癌的病理证据；或者肿瘤侵入肠壁且经过肠壁的固有肌层，在淋巴结有大肠直肠癌的病理证据；第D期:肿瘤扩散超过淋巴结的范围，侵入其它器官，例如肝、肺或骨。

预后因子根据大肠直肠癌的发生历程而异，当发展为大肠直肠癌时，预后因子会影响患者的复发率及结果。与不良预后有关的临床参数包括:淋巴结的涉入及高度易转移肿瘤(high grade tumor)。预后因子常被用于将病患分类为具有不同复发风险基础的次群组。

此述“预测”表示患者CRC复发的机率。本发明之预测方法临床上可用于对特定病患选择最适当治疗模式以作成治疗决定。

此述“个体”或“患者”或“病患”表示经治疗之哺乳动物。本发明一实施态样中，哺乳动物为人类。

此述“分化表达的生物标记”表示一生物标记(即miRNA)，在个体罹患疾病时，具体地在罹患癌症时，例如CRC，相对于正常或控制组个体中的表达或相对于取自该个体的非癌化组织中的表达，被活化至较高或较低的表达水平。此名词亦包含在同一疾病不同时期时被活化至较高或较低的表达水平的生物标记。此述差异可在前体miRNA或成熟miRNA的改变中得到证实。

本发明的一实施态样为提供确认个体内大肠直肠癌(CRC)复发机率的方法，包括测量来自该个体的含有大肠直肠癌肿瘤细胞的生物样本中选自下列所构成之群组中的两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNAs)的表达水平:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。此测量的表达水平可标准化，且以包括衡量该miRNA的标准化表达水平对大肠直肠癌复发的贡献度的方法计算复发分数。该个体的CRC复发机率可使用此复发分数来确定。本发明实施态样中，该生物样本可为来自该个体的新鲜或冷冻的肿瘤组织或来自此组织样本的细胞。在一实施态样中，该生物样本可为配对的非肿瘤组织。在本发明实施态样中，该生物样本包含小分子RNA。

本发明一实施态样为提供确认个体内大肠直肠癌复发机率的方法，包括:收集在大肠直肠肿瘤切除手术时取自该个体的(a)大肠直肠肿瘤样本及(b)该肿瘤以外相邻组织型态的非肿瘤组织的配对样本。由该样本(a)及(b)中抽取总核糖核酸(RNA)，并以抽取自该样本(a)及(b)中的RNA进行反转录及定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)，确认下列各miRNA的标准化表达水平:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-223*，且此述miRNA的表达水平可以相对于该样本中非编码RNA(ncRNA)的RNU6B及RNU44而标准化。个体内大肠直肠癌复发的机率可根据下式计算:

复发分数=exp(y)/(1+exp(y))

复发分数可根据下述的统计分析所衍生的算式来确认。

本发明实施态样中，miRNA的表达水平可由包含(a)miRNA反转录及定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR或Q-PCR)或(b)微列阵分析的方法来测量。而且，在一些实施态样中，已测量的miRNA表达水平可以相对于一种或一种以上的非编码核糖核酸(ncRNAs)的表达水平而标准化，或者标准化为RNA的总输入量。在一些实施态样中，每一测量的miRNA表达水平的个别贡献可分别被衡量以计算个体CRC复发分数及/或机率。在所述权利要求的方法中，特定miRNA的标准化表达水平可经Kaplan-Meier存活曲线分析。

此述“个体”或“患者”或“病患”系指经处理之哺乳动物。该个体可为哺乳动物，而哺乳动物可为人类。在所述权利要求的方法中，用于确认miRNA表达水平的生物样本可为新鲜的肿瘤组织，例如新鲜的CRC肿瘤组织。本发明实施态样中，新鲜的肿瘤组织可获得自个体所进行的手术切除中或来自组织切片。

大肠直肠癌组织的新鲜或冷冻的样本与视需要的配对的非肿瘤组织可获自本发明所使用的个体。配对的非肿瘤组织可为癌化CRC肿瘤形成以外的相同组织型态的组织。在本发明实施态样中，使用的样本为CRC肿瘤样本及CRC肿瘤形成以外的配对非肿瘤组织。

组织样本可取自于个体手术/切除CRC时。或者样本可取自于组织切片，例如抽吸式切片。

本发明之方法可包括自个体的组织样本(癌化或非癌化)中抽取RNA。确认miRNA表达水平的第一步骤为从组织样本中分离RNA。RNA可以习知方法抽取。总RNA(total RNA)可从组织样本或细胞中抽取。

起始材料通常为从人类肿瘤或肿瘤细胞株与对应的正常组织或细胞株中各自分离的总RNA(total RNA)，因此RNA可从大肠或直肠的原发性肿瘤或者肿瘤细胞株中分离出来。假设RNA的来源为原发性肿瘤，则RNA可从例如冷冻或新鲜的组织样本中被抽取。

RNA(包括mRNA、miRNA、非编码RNA(ncRNA)及核糖RNA(rRNA))抽取的一般方法为此领域中周知，且已揭露于分子生物学的教科书中，例如Ausubel et al.,Current Protocols ofMolecular Biology,John Wiley and Sons(1997)。特别是RNA的分离可使用市售的纯化套组、缓冲液组及蛋白酶，例如Qiagen,Valencia,CA,USA，根据使用手册来进行。例如，来自培养中细胞的总RNA可使用Qiagen miRNA酶微柱或使用MasterPure^TM RNA纯化套组(

,Madison,Wis.)来分离，或者使用胍硫氰酸酯-酚-氯仿(Chomczynski and Sacchi,“Single-step method ofRNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformextraction,”Anal Biochem,April1987,Vol.162,No.1,pages156-159)抽取RNA。例如，可使用

为主的方法(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)或TRI试剂为主的方法(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)抽取RNA。或者可使用无酚:氯仿的方法mirVana^TM miRNA分离方法(Ambion,Austin,TX,USA)，从组织内抽取RNA。此方法涉及以胍硫氰酸酯破坏细胞或组织以及用乙醇溶液处理与施用于RNA结合的玻璃纤维过滤器。在清洗移除蛋白质、DNA及其它污染物后，从过滤器中洗提出被结合的RNA。

微型RNA(miRNA)系释放自含发夹状的长miRNA前体(pre-miRNA)，为20-24个核苷酸的单链成熟miRNA，可进入及引导RNA诱导的沉默复合物(RISC)，经由直接的mRNA切断或转译抑制以确认造成沉默的目标讯息(Bartel,D.P.,“MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function,Cell,2004,Vol.116,pages281-297;Ambros,V.,“The functions of animal microRNAs,”2004,Nature Vol.431,pages350-355)。此种miRNA-媒介的基因沉默已被预测为可调节各种细胞发展、代谢及细胞过程。

本发明方法中确认的特定miRNA的表达水平用于预测个体大肠直肠癌复发的机率。本发明一方面的表达水平系测量来自该个体的生物样本(即肿瘤样本、癌细胞及配对的组织样本)中选自下列所构成之群组中的两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNAs)的表达水平:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。

本发明另一方面的表达水平系测量选自下列所构成之群组中的两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNAs)的表达水平:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-223*、hsa-miR-655、hsa-miR-1290及hsa-miR-450b-5p。

本发明另一方面的表达水平系测量选自下列所构成之群组中的两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNAs)的表达水平:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-223*。

可用于本发明的分析表达轮廓(expression profiling)的方法包括习知的以多核苷酸杂交分析为主的方法及以蛋白体(proteomics)为主的方法。样本中miRNA表达的定量方法习知有RNA印迹法(northern blotting)及以PCR为主的方法，例如反转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Weis et al.,Trends in Genetics8:263-264(1992))及定量实时聚合酶链反应(Q-PCR/qRT-PCR)。

目前已发展出多种miRNA侦测系统，例如mirVana^TM miRNA侦测方法(Ambion,Austin,TX,USA)、侵入物分析为主的侦测(Allawi et al.,“Quantitation of microRNAs using a modified Invaderassay,2004,RNA,Vol.10,p.1309-1322”)、mirMASA^TM miRNA轮廓分析(Genaco Biomedical Products,Huntsville,AL,USA)(Barad etal.,“MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays:system establishment and expression profiling in human tissues”,2004,Genome Res,Vol.14,p.2486-2494)、及改良的微列阵(Miskaet al.,“Microarray analysis of microRNA expression in thedeveloping mammalian brain,”2004,Genome Biol,Vol.5,p.R68;Babal et al.,“Probing microRNAs with microarrays:tissuespecificity and functional interference,”2004,RNA,Vol.10,p.1813-1819)。也已发展出灵敏的实时PCR法用以定量pre-miRNA的表达(Schmittgen et al.,“A high-throughput method to monitor theexpression of microRNA precursors,”2004,Nucleic Acids Res,Vol.32,p.e43)。在本发明的多种实施态样中，多种技术手段皆可用于所揭示的生物标记的表达水平的确认，包括反转录、qRT-PCT及微列阵，但不限于此。本发明一方面以包含miRNA反转录(RT-PCR)及定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法测量miRNA的表达水平。

反转录PCR(RT-PCR)可用于确认多种样本中RNA(即miRNA、ncRNA等)的表达水平。此结果可用于比较样本组(例如正常与肿瘤组织)之间的基因表达型态。

由于RNA无法作为PCR用的模板，以RT-PCR进行基因表达轮廓分析的第一步骤为，使RNA模板反转录而形成cDNA，之后在PCR反应中进行级数扩增。最常用的两种反转录酶为鸟成骨髓细胞白血病病毒的反转录酶(AMV-RT)及鼠白血病病毒反转录酶(MMLV-RT)。反转录的步骤通常根据表达轮廓分析的环境及目标使用特定的引物、任意的六元体或寡dT引物作为开始。例如，可使用GeneAmp RNA PCR套组(Perkin Elmer,CA,USA)根据操作手册使抽取出的RNA进行反转录。所形成的cDNA之后可作为后续PCR反应的模板。

虽然PCR步骤可使用多种热稳定DNA依存的DNA聚合酶，但通常还是选用具有5’至3’核酸酶活性但缺少3’至5’除错内切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。因此

PCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5’核酸酶活性以水解结合于目标扩增子(amplicon)的杂交探针，然而任何具有相等5’核酸酶活性的酶皆可使用。使用两个寡核苷酸引物(对特定miRNA或ncRNA)以产生PCR反应的扩增子。

本发明实施态样中，设计第三寡核苷酸或探针以专一地侦测位于上述两个PCR引物之间的核苷酸序列。此述探针在使用TaqDNA聚合酶时不会延伸，且以荧光染料的报导子(reporter)及荧光染料的淬灭剂(quencher)标记。当此述两种染料在探针的位置上互相接近时，任何从报导子染料发出的激光诱导发光会被淬灭剂染料所抑制。在扩增反应中，Taq DNA聚合酶以模板依存性切断探针。在溶液中分离所造成的探针片段，从报导子染料释放的讯号远离第二荧光分子的抑制效应。每一合成的新分子释放出一分子报导子染料，未抑制的报导子染料的侦测提供数据定量分析的基础。

确认微型RNA表达水平的已知方法，例如

小分子RNA列阵系统(Illumina,San Diego,CA,USA)及/或

微型RNA分析(Applied Biosystems,Life Tecnologies Corp.,Carlsbad,CA,USA)可用于本发明。

微型RNA分析系使用AppliedBiosystems实时PCR仪，事先调配设计于侦测及定量成熟微型RNA(miRNA)、小分子干扰RNA(siRNA)及其它小分子RNA的引物及探针组。此分析方法可侦测及定量具有超过6个log对数的动态范围的1至10ng总RNA的小分子RNA。在用于微型RNA的分析时，此述分析法可区别成熟miRNA序列与其前体miRNA。

微型RNA分析为可用于miRBase的miRNA序列数据库中多数数据的预定分析法。此述分析法可用于目标的定量、筛选及证实miRNA轮廓的结果。

可使用市售装备进行

RT-PCR，例如ABI PRISM7500^TM序列侦测系统^TM(Perkin-Elmer-Applied Biosystems,FosterCity,Calif.,USA)或Lightcycler(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany)。

可用于qRT-PCR的系统可由热循环器、激光机、电荷耦合装置(CCD)、摄影机及计算机所组成。此系统可在热循环机内以96位格式扩增样本。扩增期间，对所有96位经光纤缆线实时搜集激光诱导的荧光讯号，在CCD上侦测。此系统包括此述装置的操作软件及数据分析软件。

5’-核酸酶分析数据在一开始即可以阈值循环Ct值(thresholdcycle)表示。如上述，每一循环的荧光值被纪录，且表示在扩增反应中扩增产物的量。第1个统计学上显著的荧光讯号为阈值循环(Ct)。

RT-PCR的另一技术为实时定量PCR(Q-PCR或qRT-PCR)，此技术藉由双重标记的荧光探针(即

探针)测量PCR产物的聚集。实时PCR可与定量竞争PCR及定量比较PCR并立，定量竞争PCR使用对每一目标序列的内在竞争物进行标准化，而定量比较PCR使用样本中所含的标准化基因或RT-PCR用的管家基因。更详细的资料可见例如Held et al.,Genome Research6:986-994(1996)。

为了使样本与样本间差异的误差及影响达到最小化，通常使用内在标准(internal standard)进行RT-PCR。理想的内在标准系在不同组织中表达一恒定的程度，且不受实验组处理的影响。

在确认微型RNA表达水平时，起始材料量、样本收集、RNA制备及品质及反转录(RT-PCR)效率的差异可归因于定量误差。内因性控制基因的标准化可用于校正潜在的RNA输入或RT-PCR效率的偏差。因此miRNA的表达水平可相对于未编码RNA(ncRNA)、某些miRNA或核糖RNA(rRNA)的表达水平而标准化。可用于标准化的未编码RNA包括RNU24、RNU66、RNU19、RNU38B、RNU49、Z30、RNU48、RNU43、U18、RNU58B、RNU58A、RPL21、U54、HY3、U75、RNU68、RNU44、U47及RNU6B。可用于标准化目的的miRNA包括hsa-miR-26b、hsa-miR-92、hsa-miR-92N、hsa-miR-423、hsa-miR-374及hsa-miR-16。或者本发明一方面也可使用18S rRNA进行标准化。较佳为使用ncRNA表达水平及总输入RNA进行标准化。或者可基于所有已分析基因或其中大的次群(全球标准化方法)的平均值或中间数讯号(Ct)进行标准化。

本发明的实施态样中，对感兴趣的miRNA已测量的表达水平以相对于一个或一个以上的未编码核糖核酸(ncRNA)的表达水平而标准化。本发明一方面以RNU6B、RNU44及/或RNU48的表达水平确定感兴趣的miRNA的标准化表达水平。本发明另一方面以RNU6B及/或RNU44的表达水平确定感兴趣的miRNA的标准化表达水平。

本发明之实施态样中，对感兴趣的miRNA已测量的表达水平以相对于RNA总量、一个或一个以上的miRNA的表达水平或一个或一个以上的18S rRNA的表达水平而标准化。本发明一方面使用hsa-miR-16及/或hsa-miR-92的表达水平确定感兴趣的miRNA的标准化表达水平。本发明另一实施态样中，miRNA已测量的表达水平未进行标准化，以qPCR的原始Ct值计算复发分数。

分化的生物标记/RNA表达也可以微列阵技术确认或证实。因此可使用微列阵技术测量组织/细胞中与大肠直肠癌相关的生物标记的表达轮廓。此方法中，将感兴趣的多核苷酸序列(包括cDNA及寡核苷酸)涂布或排列于微芯片基板。之后使已排列的序列与来自感兴趣的细胞或组织的特定DNA探针杂交。如同RT-PCR方法，mRNA的来源通常为分离自人类肿瘤或肿瘤细胞株及对应的正常组织或细胞株的总RNA。因此RNA可分离自多种原发性肿瘤或肿瘤细胞株。假使mRNA的来源为原发性肿瘤，mRNA可从组织样本或细胞中抽取。

在微列阵技术的特定实施态样中，可将cDNA选殖株的PCR扩增插入物密集地排列于基板。较佳以至少10,000个核苷酸序列排列于基板。以每个微芯片固定10,000个基因的微列阵基因，适合于严谨条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可经由从感兴趣的组织中抽取的RNA进行反转录及加入荧光核苷酸而产生。已标记的cDNA探针涂布于该芯片，专一地与该列阵上的每一DNA点杂交。经严谨清洗以去除非专一结合的探针后，以共焦激光显微镜或其它侦测方法(例如CCD照相)扫描。每一排列单元的杂交定量可评估对应的mRNA丰富量。藉由双重颜色荧光，形成自两个RNA来源的个别标记的cDNA探针可成对地杂交于该列阵。因此自发性地确认来自对应于各特定基因的两个来源的转录本的相对丰富度。此杂交的微型层次提供便利及快速评估大量基因的表达型态。已知此方法具有侦测少量转录本的灵敏度，即于每个细胞为少量复制本时表达，且可再现地侦测表达水平的至少约两倍的差异(Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(2):106-149(1996))。微列阵分析法可由市售装置根据操作手册实施，例如使用Affymetrix GenChip科技或Incyte微列阵科技。

用于本发明方法的材料适用于以周知步骤生产的套组的制备。本发明因此提供包含试剂的套组，其中可包含生物标记专一的或生物标记选择的探针及/或引物，以定量所揭示之生物标记(即miRNA)的表达，用于预测个体内CRC的复发机率。此述套组可选择性含有从肿瘤样本或细胞抽取RNA的试剂。而且，此套组可选择性含有试剂与其于本发明方法中使用相关的确认说明或标记或指示。此套组可包含容器(包括适用于该方法自动操作的微滴定盘)，每一容器有一种或一种以上用于此方法的不同试剂(通常为浓度上的差异)，例如包括事先制造的微列阵、缓冲液、适当的核苷酸三磷酸酯(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP或rATP、rCTP、rGTP、UTP)、反转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、及一种或一种以上的本发明探针或引物(例如连接于与RNA聚合酶反应的启动子的适当长度的poly(T)或任意的引物)。用于评估或证实预后或预测的信息合格的数学级数也为套组中适当的潜在组成。

因此，本发明套组可包括(a)至少两个反转录引物以专一地反转录选自由下列所构成之群组中的至少两种miRNA为cDNA:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p；(b)至少两种探针，专一地结合于由该miRNA反转录所形成的cDNA，其中该探针适合用于实时聚合酶链反应(RT-PCR)以定量存在的miRNA；以及一种反转录引物，以专一地反转录至少一种非编码RNA及专一地结合于由该至少一种非编码RNA反转录所形成的cDNA的探针，其中该探针适合用于实时聚合酶链反应(RT-PCR)以定量存在的该未编码RNA。

计算CRC复发机率的预测模式可衍生自包括招募已进行手术切除的大肠直肠癌患者及进行来自该患者的癌化组织/细胞及对应的非癌化组织/细胞中数个已知miRNA的标准化表达水平的统计分析(即T-检定(T-test)、Wilcoxon符号等级检定(WilcoxonSigned-Rank Test)、逻辑回归法(Logistic Regression)、接收者操作特征(ROC)分析法(Receiver Operating Characteristic analysis)、Cox比例危险模式(Cox proportional hazards model)、Pearson相关分析法(Person Correlation analysis)及Kaplan-Meier估计法(Kaplan-Meier estimator))，然而应考虑患者在一定时间以上的CRC复发率。

本发明一方面，已招募的经手术切除的CRC患者可随意地分派于训练数据集与测试数据集。每一数据组可分为两个风险群。「低风险」定义为手术后3年以上无复发事件，「高风险」定义为手术后3年内复发。大肠直肠癌组织与配对的非肿瘤组织的样本可得自所有个体，且可确认一群miRNA的表达水平及用于确定标准化表达水平的其它生物标记。miRNA、ncRNA或rRNA(ncRNA及rRNA用于标准化)的测量可为任何习知方法。此领域中已知有至少754个人类miRNA。

本发明之实施态样中，下列至少两个miRNA的标准化表达水平在统计分析上被考量用于衍生患者CRC复发机率的预测模式:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。

本发明一实施态样中，下列miRNA的标准化表达水平在统计分析上被考量用于衍生出患者CRC复发机率的预测模式:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-223*。

之后，上述表达水平可经统计分析以衍生出预测患者CRC复发机率的预测模式/算式。因此，本发明一方面可对两个定义患者群(低风险、高风险)的表达水平数据经T-检定及Wilcoxon符号等级检定以决定此述基因表达数据中显著的生物标记(例如miRNA)候选者(p<0.05)。可使用Pearson相关分析法计算复发时间与基因表达的相关性。

为了更佳鉴别个体为高风险或低风险，可使用逻辑斯回归分析及ROC曲线分析以分析RT-PCR数据的Ct值。也可使用Kaplan-Meier法及Cox比例危险回归模式。

结合候选基因(qPCR数据)及临床相关因子，可使用逻辑斯回归分析法来建立反应变量及多重预测模型。将每一准则以透过描绘灵敏度(sensitivity)对1-准确度以形成ROC曲线。此步骤计算每一次观察中评估的灵敏度及准确度，也以逻辑斯回归分析法计算每一案例的预测机率。也可计算曲线下面积(AUC)以显示此述模式的表达。

一个事件或案例可定义在研究期间复发或死亡的时间。所有案例皆可被审查，直到丧失后续追踪或至研究期结束(5年)。Kaplan-Meier法可用于计算无疾病存活(DFS)率，及用于描绘两个定义群(高及低风险)的存活曲线。以对对数等级检定(log-rank test)可用于比较两群的两个存活分布(survival distribution)。根据此述分析，可选择候选基因及临床相关因子以形成模式。候选基因可使用Cox比例危险回归模式确认，以研究低风险患者相较于高风险患者的基因表达水平之间的交互作用。Cox比例危险模式也可计算危险率(Hazard Ratio;HR)。

T-检定(T-test)为习知的统计假设测试，当虚无假设(nullhypothesis)被支持时，此统计测试依循Student’s t分布(Student’s tdistribution)。如果此统计分析中分级的值为已知时，此统计测试可依循常态分布。当此分级的值为未知，且替换为以此数据为主的评估值，此统计测试(在某些条件下)依循Student’s t分布。T-检定可用于评估两群之间是否有统计学上的显著差异。

Wilcoxon符号等级检定(Wilcoxon Signed-RankTest)(Wilcoxon,“Individual comparisons by ranking methods,”1945,Biometrics Bulletin,Vol.1,No.6,p.80-83;Siegel,“Non-parametricstatistics for behavioral sciences,”1956,McGraw-Hill,New York,New York,p.75-83)为非参数化的统计假设测试，可用于比较两个相关样本或对单一样本进行重复测量以评估群体平均值是否不同(即配对的差异测试)。

Pearson相关系数(Pearson product-moment correlationcoefficient)(Pearson相关分析(Pearson Correlation analysis))可用于测量两个变异数X及Y的相关性(线性依存)，包括+1至-1间的值(包含+1及-1)。此分析法可被用于测量两个变异数之间的线性依存的强度。

结合候选基因及临床相关因子，可使用逻辑斯回归分析法来建立预测模式。每一模式的效应可由接收者操作特征(ROC)分析法确认。Kaplan-Meier法可用以比较两群患者的存活率。使用Cox比例危险回归模式可确认候选的生物标记/基因(即miRNA)，以研究低风险患者相较于高风险患者的基因表达水平之间的交互作用效应。当测量高风险患者和低风险患者时，候选基因的危险比例(风险比例)可为不同。

在讯号侦测理论中，接收者操作特征(ROC)或简称ROC曲线为用于二元分类系统的灵敏度或真阳性率(true positive rate)与伪阳性率(false positive rate)(1-准确度(1-specificity)或1-真阴性率(1-true negative rate))的绘图，其鉴别的阈值不同。ROC也可同等地以绘制阳性数据中的真阳性比例(TPR=真阳性率)与阴性数据中的伪阳性比例(FPR=伪阳性率)来表示。ROC曲线也已知为相对操作特征曲线，因为其以两个操作特征(TPR&FPR)的比较作为准则变化。ROC分析法提供选择可能的理想模式及排除次理想的模式的工具，无关于(及在明确说明之前)费用或分类分布。

Kaplan–Meier估计法(Kaplan and Meier,“Nonparametricestimation from incomplete observations,”1958,J.Amer StatistAssn,Vol.53,pages457-481)，也已知为乘积极限估计，为从寿命数据评估存活函数的估计法。此估计法可用于测量一部分患者治疗后的存活时间。Kaplan–Meier估计法的存活函数图为强度渐弱的一系列水平步骤，当获得足够大的样本时，强度会达到该族群的真实存活函数。成功区别的样本化观察之间的存活函数值假设是相同的。本发明之实施态样可包含使用Kaplan–Meier存活曲线分析与CRC复发相关的特定miRNA的标准化表达水平。

虽然Kaplan–Meier法与对数等级检定(log-rank test)有效于比较两个或两个以上群体的存活曲线，Cox比例危险回归法允许分析数个风险因子在存活上的效应(Cox,“Regression Models andLife-Tables,”1972,J of the Royal Stat Soc,Series B(Methodological),Vol.34,No.2,pages187-220.)。终点机率(死亡或其它感兴趣的事件，例如CRC复发)设定为危险。

此述统计方法可以习知计算机程序进行统计分析。

下述为说明预测患者CRC复发机率的本发明复发预测模式之两例:

复发预测模式I:

复发分数=exp(y)/(1+exp(y)

y为:

y=315.8-26.3641×(hsa-mir-1224-5p(Tumor))-3.1687×(hsa-mir-1224-5p(Normal))

-3.8282×(hsa-miR-518b(Tumor))+2.9126×(hsa-miR-629(Tumor))+9.4863×(hsa-miR-629(Normal))

-30.1097×(hsa-miR-885-5p(Normal))-6.9425×(hsa-mir-139-3p(Tumor))-2.0399×(hsa-mir-139-3p(Normal))

+0.5164×(hsa-miR-223*(Tumor))+3.1883×(hsa-miR-223*(Normal))

+3.2598×{(hsa-mir-1224-5p(Tumor))×(hsa-miR-885-5p(Normal))}

+0.6281×{(hsa-mir-139-3p(Tumor))×(hsa-miR-223*(Tumor))}

-1.3465×{(hsa-miR-629(Normal))×(hsa-miR-223*(Tumor))}......[formula37]

复发预测模式II:

复发分数=exp(y)/(1+exp(y)

y为:

y=10.1195-0.3503×(hsa-mir_1224-5p(Tumor))+0.9442×(hsa-mir_1224-5p(Normal))

+8.7184×(hsa-miR-518b(Tumor))

+2.2476×(hsa-miR-629(Tumor))-1.4460×(hsa-miR-629(Normal))-0.2093×(hsa-miR-885-5p(Normal))

-4.9632×(hsa-miR-223*(Tumor))+0.5182×(hsa-miR-223*(Normal))-2.5481×(hsa-mir-139-3p(Tumor))

-2.6980×(hsa-mir-139-3p(Normal))-1.8716×(hsa-miR-655(Tumor))+1.9734×(hsa-miR-1290(Normal))

-2.4953×(hsa-miR-450b-5p(Tumor))......[算式50]

在上述预测模式中，(tumor)表示在肿瘤样本或肿瘤细胞样本中该特定miRNA的表达，(normal)表示在该肿瘤形成以外的相同组织型态之非癌化样本中该特定miRNA的表达。

此为本发明预测模式中的两例。其余的预测模式可根据此述方法而发展。其它预测模式可采用较多或较少的微型RNA种类以预测患者CRC复发机率。

因此，RNA可从CRC患者体内的肿瘤样本或癌化细胞抽取。可确认用于此述预测模式的特定miRNA的标准化表达水平，且使用此述的表达水平可计算CRC的复发机率。

本发明所提供的方法可全部或部分自动化。

本发明的方法适合于制作综合来自本发明方法的预测值的报告。因此本发明提供包含上述预测值的报告及制作该报告的方法。此述报告可包括获自患者肿瘤组织的细胞中特定生物标记(即miRNA)的RNA转录本的表达水平的摘要。本发明实施态样中，制作一份包含复发分数及/或来自于上述复发分数所得到的CRC复发机率的确认的报告。此述报告可包含该个体发生CRC复发的机率增加的预测。此述报告可包括治疗形式的建议，例如单纯的手术或者手术与化疗的组合。此述报告可以电子形式或纸本呈现。

本发明的所有方面也皆可具体实施，因此此述的生物标记之中及/或以外，一个预测检测可包含与此述基因共同表现的有限的其它基因，例如证实具有高Pearson相关系数的基因。

根据已描述的本发明，经由下述实施例将更容易了解相同之发明。下述实施例用于提供说明，且不意图限制本发明。此述揭露中所引述之文献在此并入作为参考。

实施例

[实施例1]

患者与组织样本

经手述切除的80个大肠直肠癌患者招募自台湾台南成功大学医院。这些患者任意地被分派至训练数据集(n=65)及测试数据集(n=15)。这些患者的特征整理于表1。每一数据组由两个风险群所构成。「低风险」定义为手术后无疾病发生，「高风险」定义为手术后三年内复发。所有患者皆取得大肠直肠癌组织与其对应的非癌化组织的冷冻样本。

[表1]临床资料汇整

此研究中患者的更详细资料提供于下表2-4中。

表4.患者特征

平均值(SD)

微型RNA的轮廓分析

使用

为主的方法从所有研究个体中抽取总RNA。在发现阶段，使用

小分子RNA列阵系统人类MI_V2(humanmicroarray version2;包括1146个探针)(Illumina,San Diego,CA,USA)鉴定30个可能的候选基因。之后使用

小分子RNA分析(Applied Biosystems,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA,USA)确定及发展演算式。使用微列阵筛选显著分化的小分子RNA候选基因，包括约30个小分子RNA候选基因。使用

人类微型RNA进一步确认所筛选的30个候选基因。以微型RNA分析确认19个miRNA候选基因在高/低风险群中有差异表现。整体的发展过程简要描述于第1图。每一miRNA的表达水平以阈值循环(Ct)值表示。之后以RNU6B及RNU44的表达水平使每一miRNA的Ct值标准化，此方法常用于miRNA定量分析的内在控制。最后，标准化的miRNA表达水平以dCt表示。

统计分析

根据上述两个定义群(低风险、高风险)，使用T-检定及Wilcoxon符号等级检定，决定此基因表现数据中显著的候选基因(p<0.05)。使用Pearson相关分析法计算复发时间与基因表现之间的相关性。

使用逻辑回归法组合候选基因及临床相关因子，建立预测模式。该模式的效应由接受者操作特征(ROC)分析法确认。根据Kaplan-Meier法比较两群患者间的存活率。使用Cox比例危险回归模式确认候选基因，研究低风险患者相对于高风险患者的基因表达水平之间的交互效应。当测量高风险患者与低风险患者时，候选基因的危险率(风险率)会改变。

为了更佳区别高风险或低风险的个体，使用逻辑斯回归分析法与ROC曲线分析法分析来自RT-PCR数据的Ct值。而且，以更加了解癌症进展的复发为目的。也使用Kaplan-Meier法及Cox比例危险回归模式。

使用逻辑回归法组合候选基因(qPCR数据)及临床相关因子，建立反应变量及多重预测模型的模式。ROC曲线由绘制每一准则的灵敏度与1-准确度所形成。此过程计算每一观察中评估的灵敏度及准确度，也以逻辑斯回归分析法计算每一案例的预测机率。计算曲线下面积(AUC)，显示此模式的表现。

一个事件或案例可定义于研究期间中复发或死亡的时间。所有案例被审查至失去追踪或在研究期结束(5年)。以Kaplan-Meier法计算无疾病存活(DFS)率，并绘制两个定义群(高风险、低风险)之间的存活曲线。使用对数等级测试比较两群的二存活分布。选择先前考虑的候选基因及临床相关因子以建立此模式。候选基因可以Cox比例危险回归模式确认，以研究低风险个体相对于高风险个体的基因表达水平之间的交互效应。也可使用Cox比例危险回归模式计算危险率(HR)。

结果

测量大肠直肠癌(CRC)复发的生物标记的表达水平，包括18个miRNAs:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hasmiR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。也测量两个参考的未编码RNA，RNU6B及RNU44的表达水平，以标准化CRC复发生物标记所测量的表达水平。经测量的CRC生物标记(微型RNA)的序列信息整理如表5所示。

[表5]CRC生物标记的序列

衍生自统计分析的两个复发预测模式详细说明如下。在下述的预测模式中，(tumor)表示在肿瘤样本或肿瘤细胞样本中该特定miRNA的表现，(normal)表示在该肿瘤形成以外的相同组织型态的非癌化样本中特定miRNA的表现。

复发预测模式I

基于研究的患者族群中肿瘤组织与配对的组织的表达水平的统计分析，衍生出下列预测模式:

复发分数=exp(y)/(1+exp(y)

y为:

y=315.8-26.3641×(hsa-mir-1224-5p(Tumor))-3.1687×(hsa-mir-1224-5p(Normal))

+0.5164×(hsa-miR-223*(Tumor))+3.1883×(hsa-miR-223*(Normal))

+3.2598×{(hsa-mir-1224-5p(Tumor))×(hsa-miR-885-5p(Normal))}

+0.6281×{(hsa-mir-139-3p(Tumor))×(hsa-miR-223*(Tumor))}

-1.3465×{(hsa-miR-629(Normal))×(hsa-miR-223*(Tumor))}......[formula37]

复发预测模式II

基于研究的患者族群中肿瘤组织与配对的组织的表达水平的统计分析，衍生出下述第二预测模式:

复发分数=exp(y)/(1+exp(y)

y为:

y=10.1195-0.3503×(hsa-mir_1224-5p(Tumor))+0.9442×(hsa-mir_1224-5p(Normal))

+8.7184×(hsa-miR-518b(Tumor))

-2.4953×(hsa-miR-450b-5p(Tumor))......[算式50]

在发展复发模式中所使用及信赖的统计分析的结果显示如第2-60图。第2-60图证实特定的微型RNA候选基因的组合可达到AUROC>0.85(临床上有效值)。惟此述为本发明之例示，但不包含本发明所有可能的实施态样。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。相反地，本发明倾向于涵盖包含于本发明精神及所述权利要求内之各种改良及等同之发明。所有引述于此揭露内容中的先前文献在此并入本文作为参考。

对于熟悉此项技艺之人士可清楚知悉，此述之实施态样可进行各种改良及变化。此述说明书及实施例仅是例示，此揭露的范围为所述权利要求及其等同物。

Claims

1.一种预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，包括:

测量来自该个体的含有大肠直肠癌肿瘤细胞的生物样本中选自下列所构成之群组中的两种或两种以上的微型核糖核酸(miRNAs)的表达水平:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p；

以包括衡量该miRNA的表达水平对大肠直肠癌复发的贡献度的方法计算复发分数；以及

根据该复发分数预测该个体大肠直肠癌的复发机率。

2.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该个体为人。

3.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该miRNA的表达水平由包括(a)miRNA反转录及定量实时聚合酶链反应(RT-PCR)或(b)微列阵分析的方法测量。

4.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中已测量的表达水平以相对于(a)一种或一种以上的非编码核糖核酸(ncRNAs)、(b)RNA的总量、(c)一种或一种以上的miRNA的表达水平、或(d)一种或一种以上的18S rRNA的表达水平而标准化。

5.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该已测量的表达水平未经标准化，使用qPCR的原始Ct结果计算该复发分数。

6.如权利要求4所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该已测量的表达水平以相对于一种或一种以上的非编码核糖核酸(ncRNAs)而标准化，该非编码RNA(ncRNAs)选自RNU6B、RNU44及RNU48的转录本。

7.如权利要求4所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该已测量的表达水平以相对于has-miR-16及/或hsa-miR-92的表达水平而标准化。

8.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中已测量的各miRNA表达水平的个别贡献度分别于该计算步骤中被衡量。

9.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该生物样本为大肠直肠癌肿瘤的新鲜样本、大肠直肠癌肿瘤的冷冻样本或配对的非肿瘤组织。

10.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该生物样本为含有小分子RNA的样本。

11.如权利要求1所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，更包括制作包含该复发分数及/或以该复发分数预测的大肠直肠癌复发机率的报告。

12.一种预测个体内大肠直肠癌复发的套组，由下列所构成:

至少两种反转录引物以专一地反转录选自由下列所构成之群组中的至少两种miRNAs为cDNA:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p。

13.一种预测个体内大肠直肠癌复发的套组，包括:

至少两种反转录引物以专一地反转录选自由下列所构成之群组中的至少两种miRNAs为cDNA:hsa-miR-363*、hsa-miR-1255b、hsa-miR-566、hsa-miR-1265、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-550a*、hsa-miR-588、hsa-miR-651、hsa-miR-223*、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-655、hsa-miR-1290、hsa-miR-450b-5p及hsa-miR-1224-5p；

至少两种探针，专一地结合于由该miRNA反转录所形成的cDNA，其中该探针适合用于实时聚合酶链反应(RT-PCR)以定量存在的miRNA；以及

一种反转录引物以专一地反转录至少一种非编码RNA及专一地结合于由该至少一种非编码RNA反转录所形成的cDNA的探针，其中该探针适合用于实时聚合酶链反应(RT-PCR)以定量存在的该未编码RNA。

14.一种预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，包括:

提供含有小分子RNA的样本；

侦测下列各miRNA的表达:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-223*、hsa-miR-655、hsa-miR-1290及hsa-miR-450b-5p；以及

根据复发分数计算该个体大肠直肠癌复发的机率。

15.如权利要求14所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该复发分数以逻辑斯回归分析法(logistic regressionanalysis)计算。

16.一种预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，包括:

提供含有小分子RNA的样本；

侦测下列各miRNA的表达:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-223；以及

根据复发分数计算该个体大肠直肠癌复发的机率，

其中，复发分数=exp(y)/(1+exp(y))，

y表示结合多重预测模型复发分数的方程式。

17.如权利要求16所述的预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，其中该复发分数由第4-60图所示之一个算式所确认。

18.一种预测个体内大肠直肠癌复发机率的方法，包括:

收集在大肠直肠肿瘤切除手术时取自该个体的(a)大肠直肠肿瘤样本及(b)该肿瘤以外相同组织型态的非肿瘤组织的配对样本；

抽取该样本(a)及(b)中的总核糖核酸(RNA)；

以抽取自该样本(a)及(b)中的总核糖核酸(RNA)进行反转录及定量实时聚合酶链反应(RT-PCR)，确认下列各miRNA的标准化表达水平:hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-518b、hsa-miR-629、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-223*，其中该表达水平以相对于该样本中非编码RNA(ncRNA)的RNU6B及RNU44的表达水平而标准化；以及

根据复发分数计算该个体大肠直肠癌复发的机率，

其中，复发分数=exp(y)/(1+exp(y))，

y为第4-60图所示之一算式，

其中，(tumor)表示该样本(a)中该特定miRNA的表达，(normal)表示来自该肿瘤以外相同组织型态的非肿瘤组织的该样本(b)中该特定miRNA的表达。