CN102108369A - Dna修复蛋白rad51在制备治疗骨肉瘤表达方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA修复蛋白RAD51的pGCsi3.0-shRAD51质粒载体，具有干扰载体功能，同时也公开了RAD51在骨肉瘤的发生、发展中起重要作用，即DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤药物中的应用，它可能成为临床诊断和治疗骨肉瘤的一个潜在靶点，本发明通过研究实验首次证实了同源重组修复途径参与了骨肉瘤的放化疗耐受，抑制修复蛋白RAD51的表达可提高骨肉瘤的敏感性，从而可为今后的治疗提供理论基础。

Description

DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤表达方面的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及临床常见恶性骨肿瘤的治疗方法，更具体的说DNA是修复蛋白RAD51在治疗骨肉瘤表达方面的应用。

背景技术

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，是骨骼系统最常见的恶性肿瘤，好发于青少年。对骨肉瘤的治疗主要是手术联合化疗，然而化疗耐药的出现对对骨肉瘤治疗提出了严峻的挑战；骨肉瘤对放疗不敏感，放疗一般仅可以用作辅助治疗和姑息性治疗；骨肉瘤的放化疗耐受，其主要原因可能是骨肉瘤细胞其DNA损伤修复功能增强。

哺乳动物细胞针对DNA双链断裂有多种修复方式。其中最主要的是HR和NHEJ。HR的正常进行需要有姐妹染色单体的存在，而催化断裂的DNA双链与完整的同源DNA姐妹链进行链间转移置换时，需要一种关键酶即RAD51蛋白。

实验表明当Rad51蛋白水平异常升高时，可严重干扰通过效应性半胱天冬酶Caspase-3所介导的细胞凋亡途径，使肿瘤细胞在出现DNA损伤后，能够在抗凋亡BCL-2家族蛋白共同作用下避免细胞凋亡的产生。同时，Rad51的升高还可以不直接经过同源重组途径，而通过其他方式干扰正常的细胞周期。肿瘤细胞内Rad51蛋白水平的异常升高，可造成肿瘤对放疗及化疗的抵抗，包括射线、顺铂、氮芥、苯丁酸氮芥、丝裂霉素C、羟基脲、吉西他滨等。Rad51蛋白表达水平的失调也可促进肿瘤的发生和发展，并影响肿瘤的治疗效果和患者的生存率。研究者发现，RAD51的在肿瘤中的表达显著高于正常细胞质，提示靶向作用于该修复蛋白可作用增强放射敏感性的一个潜在的靶点。

目前对于Rad51在骨肉瘤细胞系中的表达及放化疗敏感性的影响，国内外的报道还很少，因此如能对Rad51在骨肉瘤细胞增殖及放化疗抵抗中的作用进行深入的探讨，将可能为骨肉瘤的治疗及增强放化疗敏感性提供一个新思路。

RNAi是一种新的基因沉寂技术，它通过双链RNA引起序列同源的mRNA的降解，降低目标基因的表达，是一项理想阻断特异基因表达技术，如将其应用于肿瘤细胞DNA修复途径关键调控基因Rad51的阻断，将收到比特异性阻断剂更理想的肿瘤放射治疗效果。

发明内容

本发明公开了一种DNA修复蛋白RAD51 pGCsi3.0-shRAD51的干扰载体，其特征在于分别将一对正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi-U6/neo/GFP上，得到真核细胞RNA干扰质粒，见图1。

本发明根据GenBank中的RAD51 cDNA设计了靶序列，分别将一对正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi3.0上，得到真核细胞RNA干扰质粒，见图1，其有效靶序列shRNA-2，见NO1。

本发明进一步公开了DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖及增强放、化疗敏感性表达方面的应用。

本发明所述的放、化疗敏感性药物包括：射线、顺铂、氮芥、苯丁酸氮芥、阿霉素、丝裂霉素C、羟基脲或吉西他滨等，典型的优选：射线、顺铂、阿霉素。

本发明所述的应用，包括DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖表达方面的应用，以及DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤放化疗耐受力方面的应用。

本发明经过大量的药理学实验证明：(1)免疫组织化学法分析骨肉瘤组织及癌旁标本，发现RAD51蛋白在骨肉瘤组织中呈高表达，且表达水平同临床分期及病理分型无关。(2)western blotting和RT_PCR法检测骨肉瘤细胞系和人胚皮肤成纤维细胞系中RAD51蛋白表达，发现肿瘤细胞系中RAD51也呈高表达。(3)western blotting和RT_PCR法检测γ射线和顺铂、阿霉素对RAD51表达的影响，结果提示RAD51的表达同γ射线及化疗药物间有时间和剂量依赖关系。(4)检测不同RAD51表达水平的骨肉瘤细胞系的射线及化疗药物敏感性，发现RAD51表达水平同γ射线和药物敏感性均呈负相关。(5)成功构建pGCshRNA-RAD51干扰载体，并挑选出有效的靶序列。(6)经蛋白和RNA水平鉴定，成功建立了稳定的RAD51基因沉默的骨肉瘤细胞系(7)RAD51基因沉默抑制体外骨肉瘤细胞增殖，在体内抑制裸鼠移植瘤的生长。(8)RAD51基因沉默提高γ射线和顺铂、阿霉素的敏感性。RAD51基因沉默促进γ射线和药物诱导骨肉瘤细胞凋亡。

附图说明：

图1为pGCsi3.0-shRAD51真核细胞RNA干扰质粒结构图。

图2免疫组织化学检测RAD51在骨肉瘤组织中的表达。其中A骨肉瘤组织(强阳性)  B骨肉瘤组织(阳性)C骨肉瘤组织(弱阳性)D癌旁组织(阴性)。

图3RAD51在骨肉瘤细胞系中的表达。其中A为western blotting结果B为RT-PCR结果。

图4γ射线与RAD51表达的时间剂量依赖关系。其中A为8gyγ射线与RAD51蛋白表达的时间依赖关系；B为RAD51蛋白与γ射线的剂量依赖关系。

图5阿霉素与RAD51表达的时间剂量依赖关系.其中A为阿霉素与RAD51蛋白表达的时间依赖关系；B为RAD51蛋白与阿霉素的剂量依赖关系。

图6顺铂与RAD51表达的时间剂量依赖关系。其中A为顺铂与RAD51蛋白表达的时间依赖关系；B为RAD51蛋白与顺铂的剂量依赖关系。

图7为荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。

图8为RNA干扰抑制RAD51蛋白表达和RAD51mRNA水平。

图9shRNA沉默RAD51在体外抑制骨肉瘤细胞的生长。

图10RAD51基因沉默在体内抑制裸鼠移植瘤生长。

图11RAD51对骨肉瘤射线敏感性影响。

图12RAD51对阿霉素和顺铂敏感性的影响。其中A为RAD51基因沉默提高骨肉瘤对阿霉素敏感性；B为RAD51基因沉默提高骨肉瘤对顺铂敏感性；C为三种细胞系对阿霉素敏感性变化；D为三种细胞系对顺铂敏感性变化。

图13为Annexin V-PITC/PI双染法显示RAD51基因沉默促进细胞凋亡；其中A射线照射组B阿霉素作用组C顺铂作用组。

图14为DNA ladder显示RAD51沉默促进细胞凋亡.其中1.HOS 2.control3.HOS-shA2。

具体实施方式：

为了更充分的解释本发明的实施，提供详细的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。

实施例1

实验材料

1.菌种、质粒及细胞株

1.1菌种大肠杆菌TOP10本实验室保存(有市售)。

1.2质粒pGCsi3.0-shRAD51，真核细胞RNA干扰质粒，委托上海吉凯有限公司构建。质粒结构图见图1。

1.3细胞株

入骨肉瘤细胞系：HOS、saos-2、MG-63、U-2 OS。

人胚皮肤成纤维细胞系：ccc-esf-1。均购自中国医学科学院基础所细胞中心2实验动物

裸鼠品系Balb/c-Nu，4周龄，雌性，体重16-20g(中国医学科学院放射所动物中心提供并饲养)

3临床标本

骨肉瘤及癌旁组织均取自天津骨科医院1992-2008年间病例，所有患者术前均未经放疗及化疗。患者年龄13-53岁。标本相关临床资料如下：

4主要试剂

4.1细胞培养用品(有市售)

细胞培养基：McCoy’s 5a，MEM，O pti-MEM(GIBCO)

胎牛血清：(Invitrogen)

胰蛋白酶：(Invitrogen)

4.2酶类(有市售)

RNA酶(Promega)

蛋白酶抑制剂：PMSF(Sigma)

TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶(TaKaRa)

AMV逆转录酶(TaKaRa)

4.3分子量Marker

Wide Range DNA Ladder Maker                北京鼎国生物技术有限公司产品

Prestained Protein Molecular Weight Marker Fermentas

DNA marker                                 朋远生物技术有限公司

4.4试剂盒

Takara RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0             大连TAKARA公司产品

质粒小量中提取试剂盒                       天根生化科技有限公司

质粒无内毒素大提试剂盒                     天根生化科技有限公司

PCR产物纯化试剂盒                          北京赛百盛基因技术有限公司

凝胶回收试剂盒                             北京赛百盛基因技术有限公司

BCA蛋白浓度测定试剂盒子                    碧云天生物技术有限公司

DNA抽提试剂盒(离心柱式)                    碧云天生物技术有限公司

Annexin V-PITC kit                         Beckman

Enhanced Chemiluminescent Detection System boster

4.5主要分子生物学试剂

Trizol(Invitrogen)

Lipofectamine2000，脂质体2000(Invitrogen)

PI(sigma)

4.6抗体

抗体名称                       公司          产品号

兔抗人Rad51单克隆抗体(H-92)    SANTA CRUZ    sc-8349

兔抗人β-actin                 Boster        BA0410

HRP标记羊抗兔IgG               Boster        EK1002

4.7其它主要试剂及耗材

胰蛋白胨、酵母提取物           OXID公司产品

琼脂糖、DMSO、考马斯亮蓝R-250  Sigma公司产品

SDS、Tris，甘氨酸              北京鼎国生物技术有限公司产品

氨苄青霉素、DEPC               Genview分装

丙烯酰胺、N-N′甲叉双丙烯酰胺、Genview分装

过硫酸胺(AP)                   Genview分装

TEMED                          北京鼎国生物技术有限公司产品

溴酚蓝                         Sigma

PVDF膜                         北京鼎国生物技术有限公司产品

Whatman 3MM滤纸                Bio-Rad

X光胶片                        KODAK

Tween 20                       AMERSCO

MTT                            Sigma

G418                           GIBCO

其他各种试剂：甲醛、甲醇、无水乙醇、异丙醇、氯仿、氢氧化钠、氯化钠、碳酸氢钠、冰醋酸、甘油、显影液、定影液均为国产分析纯试剂。

5引物

5.1人RAD51基因扩增引物

上游引物5 CGGGATCCTGGGGCAAGCGAGTAGAG 3

下游引物5 CGTCTAGAAAGTCATTCCTAAGGCACC 3

产物长度1456bp

5.2人GADPH基因扩增引物

上游引物5 CGGGGAAGCTTGTGATCAATGG 3

下游引物5 GGCAGTGATGGCATGGACTG 3

产物长度358bp

5.3 shRNA-Rad51

shRNA-2：aatgtacatggcctttccttcttcaagacggaaggaaaggccatgtacatt

shRNA-3：aaggcggtcagagatcatacattcaagacgtgtatgatctctgaccgcctt

control：ttctccgaacgtgtcacgt

6主要试剂、缓冲液和凝胶

5×TBE缓冲液

双蒸水   700ml

Tris     54.0g

硼酸     27.5g

0.5mol/L(pH)8.0的EDTA溶液  20ml

调pH值至8.3左右，用双蒸水定容至1000ml，备用。常温密封保存，工作液浓度为0.5×TBE。

5×Tris-甘氨酸缓冲液    

Tris碱          15.1g

甘氨酸(电泳级)  94g

10％SDS溶液     50ml

加双蒸水定容至1000ml，备用。常温密封保存，工作液浓度为1XTris-甘氨酸缓冲液。

SDS-PAGE凝胶染色液

按体积比为甲醇∶乙酸∶水＝5∶4∶1配制500ml三者的混合液，然后将1.25g考马斯亮蓝R-250溶入其中，采用Whatman1号滤纸过滤，滤液避光、密封、常温保存。此染色液可回收重复利用。SDS-PAGE凝胶脱色液

按体积比为甲醇∶乙酸∶水＝3∶1∶6配制1000ml三者的混合液即为脱色液。常温保存，最好现用现配。氨苄青霉素溶液    

用双蒸水配制终浓度为50mg/ml的氨苄青霉素溶液，0.22um的滤膜过滤后分装，-20℃保存。使用时按试剂所需的浓度添加。

1％琼脂糖凝胶

将0.2g电泳级琼脂糖溶于20ml双蒸水中，将溶液加热至沸腾，重复一次。待溶液温度降至45℃左右，加入所需的EB。然后将凝胶溶液缓缓的倒入凝胶槽中，室温放置至完全凝固。若不及时使用可保鲜膜封闭后4℃保存，备用。

DEPC水

通风橱内用双蒸水配制0.1％的DEPC水溶液，用力振摇，使脂性液滴完全分散，室温下静置48小时，高压灭菌20分钟。根据需要小量分装，分装部分-20℃冻存备用。剩余部分密封，室温保存，备用。

McCOYS 5A培养基

取一袋Gibco McCOYS 5A培养基(1L)，溶于800mL去离子水中，加碳酸氢钠2g，充分混匀完全溶解后，加去离子水至1000mL，经0.22um滤膜过滤除菌。用前加胎牛血清至终浓度为10％(v/v)，加青链霉素双抗至终浓度为100U/mL。

不连续SDS-PAGE胶

10％分离胶(10ml)

水                      4.0ml

30％丙烯酰胺混合液      3.3ml

1.0mol/LTris(pH8.8)     2.5ml

10％SDS                 0.1ml

10％过硫酸铵(新鲜配制)  0.1ml

TEMED                   0.004ml

以上溶液按次序添加到小烧杯中，要求快速，待充分混匀后迅速加入到胶槽中，最后在胶溶液中加入约1ml的双蒸水进行水封，室温下30分钟即可凝固。

5％浓缩胶(4ml)

水                      2.7ml

30％丙烯酰胺混合液      0.67ml

1.0mol/LTris(pH6.8)     0.5ml

10％SDS                 0.04ml

10％过硫酸铵(新鲜配制)  0.04ml

TEMED                   0.004ml

分离胶凝固后，倒去胶上面的水，并用滤纸充分吸干，按照浓缩胶配制的程序配制，凝胶溶液加入完毕后迅速插入梳子。室温下45分钟即可凝固，最后轻轻拔去梳子即可。若制备的凝胶不及时使用，可置入4℃冰箱保存。

PI染液

柠檬酸钠    50mg

Nacl        32.4mg

PI          2.5mg

RNase       0.5mg

Triton-100  0.25ml

加水至      50ml

4℃避光保存

7主要培养基

LB液体培养基(普通、抗性)

胰蛋白胨      10g

酵母提取物    5g

NaCl          10g

                                        

摇动培养基瓶直至固形物完全溶解，用NaOH溶液调节pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌15分钟，4℃保存备用。(抗性培养基配制：在使用时在普通培养基中加入抗生素至所需浓度混匀即可。)

LB固体培养基(普通、抗性)

胰蛋白胨      10g

酵母提取物    5g

NaCl          10g

琼脂          15.0g

                                                       

摇动培养基瓶直至固形物完全溶解，用NaOH溶液调节pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌15分钟，待培养基冷却至45度左右即可倒板。(抗性平板的制备：在倒平板之前加入抗生素至所需的浓度倒板即可。)

8主要仪器

PCR基因扩增仪         Thermo

电泳仪装置            北京六一

凝胶成像系统          Bio-Rad

超净工作台            苏州净化设备厂

落地式高速冷冻离心机  Hitachi

台式高速冷冻离心机    上海离心机研究所

常温台式离心机        北京医用离心机厂

超低温冰箱            Thermo

冰箱                  SANYO

恒温摇床              太仓实验设备厂

水平脱色摇床          北京鼎国生物技术有限公司

恒温水浴箱            北京医用设备厂

紫外分光光度计        Bio-Rad

恒温培养箱            ESPEC

高压灭菌器            山东新华医疗器械厂

微量进样器            Eppendorf

实施例2

实验方法

一、骨肉瘤组织中Rad51的表达免疫组织化学染色

1、组织切片的制备

26例骨肉瘤组织标本和癌旁组织标本经4％多聚甲醛固定，常规脱水透明、浸蜡、石蜡包埋，切成厚度为4μm的切片，烤片器60℃烘烤4小时，用于免疫组化染色(Immunohistochemistry，IHC)。

2、免疫组织化学方法

(1)石蜡切片常规脱蜡至水，步骤依次为：二甲苯I和II各5min，100％乙醇I和II各10min，95％乙醇I和II各10min；

(2)蒸馏水冲洗2次，每次5min；

(3)微波抗原修复，以增强其免疫组化染色效果。切片置于含0.01M枸椽酸盐缓冲液(PH6.0)的修复盒中，高火煮沸10min，取出室温自然冷却；

(4)蒸馏水冲洗3次，每次5min，在PBS中浸泡5min；

(5)3％过氧化氢室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶的活性；

(6)蒸馏水冲洗3次，每次5min；

(7)滴加封闭液200μl，室温孵育15min，倾去，勿洗；

(8)滴加1∶300稀释的兔抗人Ku80一抗200μl，4℃孵育过夜；

(9)弃一抗，PBS冲洗3次，每次3min；

(10)滴加生物素标记山羊抗兔IgG二抗200μl，室温孵育15min；

(11)弃二抗，PBS冲洗3次，每次3min；

(12)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液200μl，室温孵育15min；

(13)弃之，PBS冲洗3次，每次3min；

(14)DAB显色1min；取1ml双蒸水，滴加一滴试剂A混合均匀，然后滴加一滴试剂B再次混匀。现用现配，避光保存，应在30min内使用。(注意掌握染色时间)

(15)着色后，浸入水中终止反应，自来水充分冲洗；

(16)苏木精复染1min；(注意掌握染色时间)

(17)自来水冲洗10min；

(18)脱水：依次为95％乙醇I和II各10sec，100％乙醇I和II各10sec，二甲苯I和II各10sec；中性树脂封片。

3、免疫组织化学评分

取一片用PBS代替一抗作阴性对照。参照参考文献的判定标准，根据同样物镜下阳性细胞数不同可以分为以下五个等级：＜5％为0分；5-25％为1分；25-50％为2分；50-75％为3分；75-100％为4分。依据染色强度进行半定量判定，分数标准是：无色为0分；淡黄色，即弱阳性为1分；棕黄色，即中等染色强度为2分；棕褐色，即强阳性为3分。免疫反应的得分为阳性细胞的百分率得分与免疫染色的强度得分的乘积，最终评分范围为0-12分。我们将最终评分≥8～≤12定义为强表达，≥4～＜8为中等表达，≥0～＜4为弱表达。

4、统计学处理

对于食管鳞癌和正常食管上皮组织之间Ku80表达情况的比较分析，采用配对t检验，P＜0.05具有统计学意义。

二、肿瘤细胞中的RAD51蛋白表达测定(western blotting)

1、细胞总蛋白提取

(1)取生长状态良好的不同肿瘤细胞系(骨肉瘤细胞HOS、MG-63、saos-2和U-2 OS，人胚皮肤成纤维细胞ccc-esf-1)，弃去培养基，用冰冷的PBS清洗两遍，常规消化收集细胞，2000rpm 4℃10分钟离心收集细胞沉淀。

(2)在细胞沉淀中加入200μl蛋白裂解液(20Mm Tris(PH7.5)、150Mm NaCl、1％TritonX-100、sodium pyrophosphate、β-glycerophosphate、EDTA、NaVO4、leupeptin)裂解细胞，冰上作用10min，每5Min剧烈震荡一次。

(3)4℃12,000rpm，离心5min。

(4)取上清即为细胞总蛋白，分装后于-20℃冰箱中保存备用。

2、蛋白定量

按照BCA试剂盒说明书进行操作。

(1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。(工作液室温24小时内稳定)

(2)完全溶解BSA蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

(3)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20μl。

(4)加10μl样品到96孔板中，另加10μl标准品稀释液。

(5)各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。

(6)用酶标仪测定波长为570nm的吸光度值。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

3、SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白电泳

(1)制胶：按蛋白分子量要求制备相应浓度为10％的SDS-聚丙烯酰胺分离胶和5％的浓缩胶，待浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子，反复冲洗上样孔，将凝胶玻璃固定于电泳装置上，加入电泳缓冲液，用弯头注射器排除凝胶底部的气泡，加样孔用电泳缓冲液冲洗后上样。

(2)上样：样品预先用BCA试剂盒定量，取等量蛋白，加入上样缓冲液，100℃煮沸5min变性，4℃12,000rpm离心10min。每孔上样30μg总蛋白。同一板胶上加入预染蛋白分子量marker电泳以确定待检蛋白的分子量和转膜效率。

(3)电泳：先以110V电压电泳，当染料前沿到达分离胶与浓缩胶交界时，调电压至90V电泳，直至染料到达最下沿。

(4)半干式电转染：裁剪滤纸和PVDF膜，使大小与凝胶完全相同。用甲醇浸泡PVDF膜1min，用转移缓冲液浸泡6张3M滤纸，PVDF膜再用转移缓冲液预平衡5min。从阳极到阴极依次是海绵、3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸和海绵，以200MA恒流转膜约1小时。

(5)取出PVDF膜，室温下用TBS洗膜5min，进行下一步程序。凝胶用考马斯亮蓝染色，膜用丽春红染色，以观察转膜效率。

4、蛋白免疫印记(Western Blotting)

(1)取转膜完毕的PVDF膜，放入封闭液中(1×TBST+5％脱脂奶粉)，4℃封闭过夜。

(2)用TBST洗3次，每次5min。用封闭液1∶1000稀释一抗兔抗人Ku80，将PVDF膜放入一抗中，4℃孵育过夜，并且摇床轻微振动。

(3)用TBST洗3次，每次5min。用封闭液1∶5000稀释二抗羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG，室温孵育1小时。

(4)用TBST洗3次，每次5min。将ECL Kit的A液和B液各一滴混均于1ml双蒸水中，将混合液滴在膜上，使之完全覆盖PVDF膜。室温作用1min。

(5)将膜上多余的液体用滤纸从边缘吸走，不要碰到表面，用保鲜膜将其包裹。在暗室曝光，显影，定影。

三、表达RAD51基因发夹干扰RNA载体的构建(由上海吉凯基因有限公司完成)

1寡核苷酸的设计

为了实现特异基因的沉默，设计寡核苷酸来源于RAD51基因mRNA的一段长度为19～21个碱基的独特序列，形成一对特定的DNA Oligos。以下链均正义链：

shRNA-A2：5，AATGTACATGGCCTTTCCTTCTTCAAGACGGAAGGAAAGGCCATGTACATT3，

shRNA-F6：5，AATGTACATGGCCTTTCCTTCTTCAAGACGGAAGGAAAGGCCATGTACATT3，目的片段作用于RAD51编码区的728-748位。

2DNA Oligos的退火

(1)将DNA Oligos溶解在灭菌、无核酸酶的水中，终浓度为3mg/ml。

(2)退火反应是将各1μl的正向和反向DNA Oligos与48μl的退火缓冲液混合。

(3)将混合物在90℃温育4min，70℃温育10min。慢慢冷却退火的DNA Oligos至10℃。

3pGCsi3.0载体的线性化

用Hind III和BamH I限制酶将1μl的pGCsi载体线性化。注意不要同时进行酶切，而应该先用Hind III酶切60min，接着加BamH I继续反应2小时，然后加热终止反应(升高温度至65℃，加热20min)。

4线性化载体的纯化

将酶切后的线性化载体在1％琼脂糖凝胶上进行纯化，切胶回收，调整质粒浓度为0.2-0.5ng/ml。

5退火模板与载体的连接

将2μl退火后的DNA Oligos加到T4 DNA连接酶缓冲液中，接着再加1μlpGCsi载体、5μl无核酸酶的水、1μlT4 DNA连接酶。室温下孵育过夜。

6转化细菌扩增和纯化

将重组的pGCsi3.0-shRad51载体转化入感受态宿主细胞株(Top10)。用连接有错拼碱基的发夹DNA Oligos的载体作为阴性对照来检测转化步骤的效率。细菌铺于含有氨苄青霉素的琼脂糖平板，培养过夜，然后挑克隆，在含有青霉素的培养基里进行另一轮培养。用质粒提取试剂盒纯化质粒后，-20℃保存备用。

四、细胞培养

人骨肉瘤细胞株HOS，用含10％胎牛血清的McCOYS 5A培养液在37℃、5％CO₂条件下常规培养，每3天传代一次。

五、细胞转染

1、G418致死剂量的测定

将细胞接种于6孔培养板中，培养细胞至70～80％融合，在培养液中分别加入50mg/mlG418，至终浓度为0、200、400、600和800μg/ml，以14天内细胞全部死亡的浓度为最适G418筛选剂量。得到为800μg/ml。

2、用Lipofectamine 2000转染质粒入人骨肉瘤HOS细胞

2.1瞬时转染

(1)转染前一天在24孔培养板中种植6×10⁴细胞，转染时细胞密度达到80～90％。

(2)准备以下复合体A-将1μg质粒DNA稀释于50μl无血清培养基中，轻轻混匀；复合体B-取1μl Lipofectamine 2000(用前混匀)稀释于无血清培养基中，混匀。室温孵育15min(在30min内将稀释的脂质体与稀释的DNA混合)

(3)将上面的复合物A和B混合，轻轻混匀，室温孵育15min(复合体于室温6小时内会保持稳定)。

(4)将混合后脂质体-DNA复合体100μl加入含无血清培养基的食管癌细胞中，上下左右轻轻混匀。将细胞放入孵箱内继续培养。

2.2稳定转染和阳性克隆筛选

质粒转染细胞24小时后，加入G418 800μg/ml，每3天更换选择培养基一次，培养14天后，挑选单克隆，扩大培养，待细胞生长至40％左右，消化转至培养瓶中，在G418 400μg/ml培养液中继续扩增。

六、RNA干扰效果的鉴定

1半定量RT-PCR

1.1细胞总RNA的提取

稳定转染细胞、阴性对照转染细胞和未转染细胞培养至对数生长期，常规消化，离心收集，计数，每小管约5×106个细胞，按TRIZOL Reagent总RNA分离试剂盒使用说明进行，具体操作步骤如下：

(1)离心收集5×106细胞，加1ml TRIZOL提取液，颠倒混匀15sec，室温放置5min。

(2)加0.2ml氯仿，强烈振荡15sec，室温放置5min。

(3)4℃，12,000rpm，离心15min，取上层水相，转入新的1.5ml离心管中。

(4)加入等体积异丙醇(约400-500μl)，混匀，室温放置10min。

(5)4℃，12,000rpm，离心10min。

(6)弃去上清，加1ml 75％乙醇(用DEPC处理过的去离子水配制)，混匀。

(7)4℃，7500rpm离心5min，弃去上清，空气干燥5-10min(不能干透)。

(8)加10μl DEPC处理水溶解RNA，-80℃冰箱贮存备用。

1.2RNA浓度测定和纯度的鉴定

1.3RT-PCR

采用TAKARA公司生产的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0来进行目的基因扩增，严格按照说明书的操作方法进行，设定退火温度为60℃。具体操作步骤如下：

反转录反应

1.按下列组成配制反转录反应液：

MgCl2                        10μl

10×RT Buffer                5μl

RNase Free dH2O              18.75μl

dNTP Mixture(各10mM)         5μl

RNase Inhibitor              1.25μl

AMV Reverse Transcriptase    2.5μl

Oligo dT-Adaptor             2.5μl

人总RNA                      5.0μl

Total                        50μl/Sample

(将上述配好的反应液用手指轻弹混匀后瞬间高速离心使反应液汇聚至管底)

2.按以下条件进行反转录反应：

42℃    15min

99℃    5min

5℃    10min

反应完毕后的产物即为cDNA，随后分装，标记，-20℃保存。

PCR反应

1.按下列组成配制PCR反应液：

5XPCR Buffer         10μl

dH2O                 28.75μl

TaKaRa Ex Taq HS     0.25μl

F引物                0.5μl

R引物                0.5μl

cDNA                 10μl

                                         

Total                50μl/Sample

(将上述配好的反应液用手指轻弹混匀后瞬间高速离心使反应液汇聚至管底)

2.按以下设定好的程序进行反应：

94℃      2min     1Cycle

94℃      30sec

57.2℃    30sec    30cycle

72℃      1.5min

反应完毕后取一部分行琼脂糖凝胶电泳进行分析，剩余部分分装后冻存于-20℃。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物：

配制琼脂糖凝胶电泳所需的缓冲液和凝胶。每个PCR反应管上样3μl，同时按照说明书操作对DNA Marker上样。加入1×TBE缓冲液，在恒压40V条件下，电泳90min。电泳完毕后，将胶置于紫外分析仪观察目的条带及DNA Marker迁移情况，拍照，对实验结果进行分析评价。

2Western blotting

2.1细胞总蛋白提取  方法同前

2.2蛋白定量        方法同前

2.3SDS-PAGE电泳    方法同前

2.4蛋白免疫印记    方法同前

七、肿瘤细胞生物学行为的测定

1、MTT法测定细胞生长曲线MTT：

实验方法：

(1)将对数生长期的RNA干扰细胞、阴性转染细胞和未转染细胞，用胰酶消化后，用含10％胎牛血清的培养基配成适合浓度的细胞悬液。

(2)接种在96孔培养板中，每孔2000个细胞，设5个平行孔。

(3)经37℃，5％CO2条件下培养24小时。

(4)分别在1、3、5和7天以MTT法检测其570nm的OD值。

(5)到指定时间，取出细胞，弃去上清液，用培养液洗两遍。然后，每孔加入20μl含5mg/ml MTT，在37℃继续培养4小时。

(6)小心弃去上清，并加入200μl DMSO溶解沉淀，用震荡器震荡10min，在酶标仪上用波长570nm测定吸光度值(OD)。

(7)以天数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线。

2、平板克隆形成实验

(1)取对数生长期的各组细胞，用胰酶常规消化制备成单细胞悬液，接种于6孔板中，每皿400个细胞。每组设三个重复培养皿，置于37℃，5％CO2孵箱中培养。当培养到14天，可观察到克隆形成。

(2)固定：取出细胞培养皿，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入新配制的固定液，即甲醇∶冰醋酸(3∶1)约5ml，铺满整个培养皿底面，固定5min。

(3)染色：弃去固定液，待稍干燥后加入5％结晶紫染色液，染色约10min，当克隆着色足够时用水冲洗去残余的染色液，进行克隆计数。每团细胞数大于50个时作为一个克隆。用下列公式求得克隆形成率。

克隆形成率(％)＝集落数/接种细胞数×100％

八、裸鼠体内成瘤性实验

1、取4周龄Balb/C雌或雄性裸鼠(按SPF级动物饲养于动物实验中心)，随机分为对照组，阴性对照组和干扰组，每组5只。SPF级裸鼠由实验员专门饲养。

2、取对数生长期各组细胞，胰酶常规消化，调整细胞浓度为5×10⁷个/ml，取200μl即1×10⁷个细胞接种于每只裸鼠的右上肢背部皮下，观察瘤细胞接种后的生长情况，待6天后可见瘤块，每隔4天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，按公式V＝a×b²/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。接种30天后，断颈法处死裸鼠，取出瘤体、肺、心、肝组织，肉眼观察有无粘连和转移灶，然后用10％甲醛固定，常规石蜡包埋，每个瘤体制作4μm厚的连续切片，免疫组化分析RAD51表达情况。

九、肿瘤细胞放射敏感性测定

(1)取对数生长期的各组细胞，消化细胞成单个，接种细胞于100mm培养皿中，每皿3000个细胞，每组设三个平行皿。

(2)24小时细胞贴壁后，进行137Cs射线照射，照射剂量为1，2，4和8Gy(0.86y/min)，同时未照射组为对照组。

(3)将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱中培养14天，有克隆形成。

(4)固定和染色：倒去上清培养液，用PBS洗涤2次，加入75％甲醇固定液，铺满培养皿底面，固定5min。弃去固定液，待稍干燥后加入0.5％结晶紫(甲醇配制)染色5min，在镜下检查染色程度，当克隆着色足够时用水洗去残余染液，以每团细胞数大于50个时作为一个克隆计数，并拍照。

(5)用下列公式求得克隆形成率。

克隆形成率＝(处理组克隆数/对照组克隆数)×100％

十、肿瘤细胞存活率的测定

(1)将对数生长期的各组细胞，用胰酶消化后，用新的培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。

(2)将各组细胞接种于96孔培养板中，每孔接种200μl，每组设5个平行孔。

(3)经37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。

(4)加入不同浓度的MMC(0.5，1，1.5，2μg/ml)，作用48小时后用MTT法测定OD值。

(5)肿瘤细胞生存率＝(实验组OD/对数组OD)×100％

十一、细胞凋亡的测定

1、DNA ladder法

a.收集约100万个细胞，离心沉淀，弃上清。加入200微升PBS，轻轻吹散或弹散细胞，使细胞重悬于PBS中。

b.加入4微升RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置2分钟。

c.加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。

d.加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。

e.加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。

f.把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！

g.加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。

h.加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需把纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。

i.再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。

j.将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-100微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。

k.取部分抽提得到的DNA，1％琼脂糖凝胶电泳分析。如果细胞发生凋亡，即可观察到典型的DNA ladder。电泳时一定要注意换用新鲜配制的电泳液，DNA凝胶也要用新鲜配制的电泳液配制并新鲜配制后使用。电泳时为获取最佳的电泳效果使ladder充分分开，电泳速度宜适当慢一些，凝胶宜适当长一些，而加样孔宜更加扁平一些。选取适当较薄的梳齿，往往会获得更好的ladder电泳效果。

2.Annexin V-PITC/PI双染法

1.细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性)；

2.用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集5×10⁵细胞；

3.加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；

4.加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；

5.室温、避光、反应5～15min；

6.在1hour内，进行流式细胞仪的观察和检测

7.用流式细胞仪检测，激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝530nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测。

实施例3

实验结果

1、RAD51在骨肉瘤组织中的表达情况

为了了解RAD51在骨肉瘤组织中的表达情况。本发明采用免疫组织化学的方法，检测了RAD51在骨肉瘤及瘤旁正常组织中的表达。如图2所示。RAD51蛋白在骨肉瘤组织中表达明显增强，胞核呈现强阳性着色，而在骨肉瘤癌旁组织中呈弱阳性或不表达。在26例食管癌标本中，有19例标本(73％)RAD51蛋白胞核呈强阳性着色，7例标本(27％)呈弱阳性。因此在26例骨肉瘤标本中RAD51蛋白高表达的阳性率为100％，；相比之下，在26例癌旁组织标本中，仅有1例(10％)显示了中度染色，其余的(90％)为弱或阴性染色。统计学分析发现RAD51蛋白在骨肉瘤组织中呈明显的高度表达(P＜0.05)。

同时本发明人就RAD51表达情况同患者年龄、性别、骨肉瘤临床分期及病理分型间的相关性进行了分析。如表1所示：RAD51高表达和低表达二组之间，性别、年龄、临床分期、和病理组织学类型间均无显著性差异(P＞0.05)。

表1.RAD51的表达与骨肉瘤临床及病理特征的关系

临床特征	例数	RAD51低表达	RAD51高表达	P值
					病例数	26	19(73％)	7(27％)	＜0.05
性别				＞0.05
					女	10	1(14％)	9(47％)
男	16	6(86％)	10(53％)
					年龄	13-53	15-53	13-45	＞0.05
均值	26.62±12.65	33.29±17.59	25.57±10.78
					临床分期				＞0.05
I	5	0(0％)	5(26％)
					II	9	3(43％)	6(31％)
III	12	4(57％)	8(43％)
					组织分型				＞0.05
成骨细胞型	9	1(14％)	8(42％)

软骨细胞型	6	1(14％)	5(26％)
					成纤维细胞	3	1(14％)	2(11％)
小圆细胞型	4	2(29％)	2(11％)
					其它	4	2(29％)	2(11％)

2、RAD51在肿瘤细胞系中的表达情况

为了进一步了解RAD51在骨肉瘤细胞水平的表达，并初步探索RAD51水平升高的原因，本发明人分别采用western blotting和RT-PCR方法从蛋白水平和mRNA水平检测了人不同骨肉瘤细胞系与人宫颈癌细胞系Hela、人胚皮肤成纤维细胞系ccc-esf-1中的RAD51表达水平。如图3所示，western blotting结果显示，RAD51蛋白在人不同骨肉瘤细胞系(HOS、saos-2、MG-63和U-2 OS)中的表达水平均显著高于人胚皮肤成纤维细胞系ccc-esf-1。RT-PCR结果同western blotting相一致，提示RAD51在骨肉瘤中的高表达可能同转录水平的升高有关，从此水平抑制RAD51可作为降低其表达的一个有效手段。因此挑选骨肉瘤细胞系HOS做后续实验。

3、射线及药物对RAD51表达的影响

为了观察射线是否对RAD51的表达水平产生影响。用8gyγ射线(剂量率0.79gy/分)照射后，分别于照射后6h、24h、48h、72h提取细胞总蛋白，检测RAD51的蛋白的变化，如图4所示，western blotting结果表明，RAD51表达水平在72h内随着时间的延长而逐渐升高(β-actin作为内参)。本发明人选用24h这个时间点为基准，又从蛋白水平观察了不同照射剂量对RAD51表达的影响。结果显示，随着照射剂量的升高，RAD51的表达水平也逐渐升高。结果经quantity one4.6.2软件分析。

同理，观察化疗药物顺铂、阿霉素是否对RAD51的表达具有时间和剂量依赖关系。在细胞贴壁24h后分别加入顺铂(2μg/ml)和阿霉素(0.1μg/ml)作用2h后，弃去药物代替以新鲜培养基继续培养，分别在6h、24h、48h后提取蛋白，观察RAD51水平的变化。如图5所示，阿霉素作用组，RAD51蛋白表达水平在48h内逐渐增高。图6所示顺铂作用组中，RAD51蛋白水平于24h达到高峰，随后下降。因此，RAD51的表达同顺铂及阿霉素间有时间和剂量依赖关系。

4、pGCsi-U6/neo/GFP-shRAD51载体的构建

利用RNA干扰技术可特异性地抑制RAD51在细胞中的表达。为选择有效的RNA干扰片段，根据GenBank中的RAD51cDNA设计了靶序列，将一对正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi-U6/neo/GFP，得到shRNA-2经测序后显示载体构建成功。

shRNA-2的测序结果：

GGaCTaTCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGGTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG

CGGGATCCAATGTACATGGCCTTTCCTTC

GAAGGAAAGGCCATGTACATTTTTTTTAAGCTT

CCCGGGACGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTA

TTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACA

ATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACA

AATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATCCGGTGGATCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACA

GCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGT

TGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGA

TGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGT

TCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCT

TGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGC

CCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTACTTGCCGTCGTCATGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGACGTAC

CCTTCGGGCATGAGGACTTGAGAGTCGTGCTGCTTCATGTGTCGGGTAGCGGCTGAGCACTGCACGCGTACG

TCAGTGTCACGAGTGGTCAGGCACGGCAGCTGCCGTGGTGCAGATGACTTCAGGTCAGCCTGCCGTA

其中画单线代表：正义链和反义链，方框内的字母代表：茎环(stem-loop)结构。

5、稳定的RAD51基因沉默骨肉瘤细胞系的建立

为选择有效的RNA干扰载体，我们首先瞬时转染HOS细胞系，在转染的24h用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况以判断质粒载体效率，同时提取细胞总RNA，用RAD51特异引物进行半定量RT-PCR，对shRNA转染后的mRNA情况进行了鉴定。如图7所示：发夹RNA载体可成功转染至HOS细胞，但转染效率在40％左右，因此有必要筛选稳定表达的细胞克隆以完成后续实验；RT-PCR结果显示2号和3号序列在转染后24h都造成了RAD51下降，表明RAD51mRNA已被shRNA特异有效地抑制。而且其中2号序列下降更明显，因此我们选择2号序列作为RAD51基因功能研究的有效干扰片段。

将构建好的质粒载体shRNA-2和阴性对照载体shRNA-5分别转染人骨肉瘤细胞系HOS。在转染48h后在培养液中用G418(800μg/ml)进行细胞筛选。经过14天筛选，未转染成功的细胞死亡，剩余的细胞经胰酶消化采用有限稀释法将单个细胞种植于96孔培养板中，在倒置荧光显微镜下挑选出单克隆进行扩大培养。培养液中含G418(400μg/ml)继续传代培养。然后，对不同的细胞克隆通过Western blotting和RT-PCR方法对RAD51蛋白和mRNA水平进行鉴定，筛选出二个细胞系HOS-shA2和HOS-shF6。如图8所示，对比亲本HOS、阴性载体对照细胞克隆，HOS-shA2和HOS-shF6 RAD51蛋白表达明显下降，约为66.7％和39.7％，然后，本发明人对选定的HOS-shA2和HOS-shF6细胞克隆进行半定量RT-PCR和检测，发现它们RAD51 mRNA水平对比亲本HOS和阴性对照细胞克隆也明显降低，约为46％和39％。传二代后，再次提取细胞RNA和蛋白质做检测，RAD51 RNA和蛋白水平基本没有变化，因此RAD51基因沉默的稳定细胞系已成功建立。

6、RAD51基因沉默抑制骨肉瘤细胞的体外增殖

将HOS、阴性对照细胞control和两株HOS-shA2、HOS-shF6细胞常规胰酶消化分别以每孔5×10³种植于96孔板中，在种植细胞后的第1、3、5、7天采用MTT法检测细胞生长情况，画出生长曲线。如图9A所示，发现在种植后的第3天HOS-shA2和HOS-shF6细胞生长速度明显减慢(P＜0.05)，而亲本HOS和阴性对照细胞的生长速度基本一致。结果显示RAD51基因沉默后对骨肉瘤细胞生长有抑制作用。

为了进一步研究RAD51对骨肉瘤细胞生长增殖能力的影响，本发明人又观察了不同组别的细胞平板克隆形成情况。将HOS、阴性对照细胞和两株HOS-shA2、HOS-shF6细胞分别按每孔400个细胞接种于六孔板中，两周后观察细胞形成克隆的数量和大小，计数≥50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。如图9B，9C所示，HOS、阴性对照细胞和两株HOS-shA2、HOS-shF6细胞克隆形成数分别为187.25±12.56、179.08±20.41、115.00±24.56、87.18±19.24。与对照组细胞相比，两株HOS-shA2、HOS-shF6细胞克隆形成率明显降低，差异有显著性(P＜0.05)，且所形成的克隆形态大小也小于亲本细胞和阴性对照细胞。

7、RAD51基因沉默对骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

取裸鼠15只，随机分三组，将HOS、阴性对照细胞control和HOS-shA2细胞各1×10⁷接种于其右后肢皮下，共饲养4周。肿瘤细胞接种后，经1周的潜伏期生长，以后每隔每隔1天测量肿瘤长径和短径，按下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长径X短径²/2，绘制生长曲线。各组的成瘤率为100％。饲养第23天HOS组开始出现死亡鼠，第25天HOS和HOS-shA2组均出现死亡鼠，4周后处死所有裸鼠进行解剖，取出肿瘤组织称重。如图8C所示，接种后的第8天起，HOS-shA2干扰组肿瘤大小为235.99±99.85mm³，肿瘤生长速度即开始明显慢于亲本HOS组和阴性对照组，有显著差异性(P＜0.05)。随着饲养的继续，HOS-shA2干扰组瘤体明显较对照组及阴性对照组小。实验前死亡及最后处死动物，均剥离肿瘤称重。如图10，对照组瘤重为0.98±0.38g，HOS-shA2干扰组瘤重为0.34±0.14g，HOS-shA2干扰组肿瘤平均重量明显轻于亲本HOS组和阴性对照组，二者比较有显著性差异(P＜0.01)。HOS-shA2干扰组的抑瘤率约为66％，结果表明RAD51基因沉默后明显抑制了食管癌细胞的体内生长。

8、RAD51基因沉默提高射线敏感性

为了判定RAD51蛋白表达与骨肉瘤射线敏感性的关系，将HOS细胞、阴性对照细胞和shRNA-A2、shRNA-F6细胞暴露于不同剂量的γ-射线(剂量率0.79gy/min)，后继续培养72h。如图11A：MTT结果显示shRNA-A2、shRNA-F6细胞对射线敏感性变化很显著(P＜0.05)，IC₅₀由亲本细胞的73gy下降为26.1gy和40.1gy，尤其shRNA-A2降低了3倍.然而，阴性对照细胞对射线敏感性无明显变化。同时，还发现放射敏感反应与RAD51蛋白表达水平的高低相关。为进一步验证这种相关性，又选用RAD51表达水平均增高但又有差异的三个骨肉瘤细胞系saoa-2、MG63和HOS分别按上述方法对其放射敏感性进行比较发现，结果如图11B，随着RAD51表达水平的逐渐升高，各细胞系的IC₅₀也逐渐升高(25.3gy、38.8gy、73gy)。

9、RAD51基因沉默提高骨肉瘤对顺铂和阿霉素的敏感性

同上，为了判定RAD51蛋白表达与骨肉瘤对顺铂和阿霉素敏感性的关系，将HOS细胞、阴性对照细胞和shRNA-A2、shRNA-F6细胞暴露于不同浓度的顺铂和阿霉素，作用2h后，代替以新鲜培养基继续培养72h，MTT法检测存活细胞数。结果显示shRNAH2、F6细胞对药物敏感性变化很显著(P＜0.05)，阿霉素的IC₅₀由亲本细胞的1ug/ml降为0.1ug/ml和0.4ug/ml，顺铂的IC₅₀由亲本细胞的15.5ug/ml下降为9.4ug/ml和11.9ug/ml，阴性对照细胞均无明显变化，并且药物的敏感反应与RAD51蛋白表达水平的高低相关(P＜0.05)，如图12A，12B。同时，RAD51表达水平均增高但又有差异的三个骨肉瘤细胞系HOS、MG-63和saoa-2分别按上述方法对其药物敏感性进行比较发现，结果如图12C、12D，随着RAD51表达水平的逐渐增高，各细胞系的IC50也逐渐升高(ADM：1、0.65、0.2；DDP：15.5、11.64、8.79)。

10、RAD51基因沉默促进射线或化疗药物诱导的细胞凋亡

通过本实验欲了解Ku80基因沉默提高射线和化疗药物的敏感性，是否与其促进细胞的凋亡有关。

分别采用Annexin V-PITC/PI双染法和DNA ladder法检测了HOS、control和HOS-shA2三株细胞系的凋亡情况。结果如图13，16gyγ射线作用组，HOS-SHA2凋亡细胞比例(5.5％)明显高于对照细胞(1.1％)和亲本细胞(1.0％)；0.1g/ml阿霉素作用组与2g/ml顺铂作用组HOS-SHA2凋亡细胞比例(5.9％、7.0％)也明显高于对照细胞(2.5％、4.4％)和亲本细胞(1.8％、2.7％)；DNA ladder结果也与Annexin V-PITC/PI双染结果一致。

序列表

<110>中国医学科学院放射医学研究所

<120>DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤表达方面的应用

<160>3

<210>1

<211>1002bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt tatatatctt     60

gtggaaagga cgcgggatcc aatgtacatg gcctttcctt cttcaagacg gaaggaaagg    120

ccatgtacat tttttttaag cttcccggga cgcgttaaga tacattgatg agtttggaca    180

aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc    240

tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt    300

tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa    360

atgtggtatg gctgattatg atcagttatc tagatccggt ggatctcgag atctgagtcc    420

ggacttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag    480

gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta    540

gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc    600

ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc    660

gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt    720

gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac    780

cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tacttgccgt cgtcatgaag    840

aagatggtgc gctcctgacg tacccttcgg gcatgaggac ttgagagtcg tgctgcttca    900

tgtgtcgggt agcggctgag cactgcacgc gtacgtcagt gtcacgagtg gtcaggcacg    960

gcagctgccg tggtgcagat gacttcaggt cagcctgccg ta                      1002

<220>

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aatgtacatg gcctttcctt c                                              21

<220>

<221>PRT

<222>(1)..(7)

<400>3

Glu Gly Lys Ala Met Tyr Ile

1                 5

Claims (5)

1.一种DNA修复蛋白RAD51 pGCsi3.0-shRAD51的干扰载体，其特征在于分别将一对正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi3.0上，得到真核细胞RNA干扰质粒，见图1。

2.权利要求1所述的DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖及增强放化疗敏感性表达方面的应用。

3.权利要求2所述的应用，其中所述的放、化疗敏感性药物包括：射线、顺铂、氮芥、苯丁酸氮芥、阿霉素、丝裂霉素C、羟基脲或吉西他滨。

4.权利要求2所述的应用，其中的DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖表达方面的应用。

5.权利要求2所述的应用，其中的DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤放化疗耐受力方面的应用。

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