CN110862446B - 一种新型肿瘤靶向治疗多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肿瘤靶向多肽，包括：（a）新型肿瘤靶向治疗多肽；（b）由多肽（a）与穿膜肽元件形成的融合蛋白；(c)由多肽（a）或（b）通过添加、缺失、或改变一个或多个氨基酸而衍生的且具有影响RAD51泛素化修饰，核内foci形成，降低DNA修复功能的衍生多肽；（d）氨基酸序列对应于RAD51蛋白的C端（331‑339aa）的多肽，或C端与穿膜肽元件形成的融合蛋白，并且所述多肽或融合蛋白（d）具有影响RAD51泛素化修饰，核内foci形成，降低DNA修复功能。通过给予本发明的多肽，仅影响RAD51的泛素化修饰，从而影响核内foci的形成，副作用小；可以有效降低化疗药物的使用浓度，提高肿瘤细胞的药物敏感性。

Description

一种新型肿瘤靶向治疗多肽及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地涉及一种对肿瘤细胞具有靶向治疗作用的新型多肽及其组合物。
背景技术
癌症是目前威胁人类健康的头号杀手。2018年全球癌症年报表明，中国癌症发病率和死亡率均为全球第一。在我国，每65个人中就有一名癌症患者，每分钟有超过5人死于癌症。药物治疗是癌症治疗的主要手段，然而，肿瘤细胞的耐药性是目前癌症治疗失败的主要原因之一。因此，增强肿瘤的药物敏感性，是抗肿瘤研究领域的一大热点。
肿瘤耐药的产生机制是一个非常复杂的过程。目前研究认为，肿瘤耐药主要的分子生物学机制包括DNA修复系统增强、药物代谢障碍、药物摄取减少和外排增加、凋亡抑制变化等。肿瘤细胞DNA修复能力异常激活和增强是肿瘤耐药的重要分子基础；抑制DNA损伤修复机制，可以增强肿瘤的药物敏感性。
在DNA损伤中，DNA双链断裂(double-strand break,DSB)是最为严重的一种，同源重组(HR，Homologous Recombination)和非同源重组(NHEJ，Non-Homologous EndJoining)是参与DSB应答的两条重要修复通路。HR损伤修复途径由于其高度保守的无错修复，是DSB损伤修复的最佳途径。目前在临床上，大部分的化疗和放疗药物都是通过直接或间接攻击DNA，造成DNA损伤。因此，寻找和开发有效的DDR(DNA damage repair)通路抑制剂，可以提高放化疗的疗效，避免肿瘤产生耐药，提高治疗效果。
发明内容
本发明人发现，DNA损伤修复蛋白RAD51的泛素化修饰是其参与DDR通路的重要调控方式，这一过程是由细胞自噬相关因子ATG7所介导的。阻止RAD51的泛素化修饰，可以抑制DDR通路，避免肿瘤产生耐药，提高化疗药物的疗效。
为实现上述发明目的，本发明提供一种新型肿瘤靶向治疗多肽及其用途。
一种新型肿瘤靶向治疗多肽，氨基酸序列如SEQ.ID.1所示；
上述新型肿瘤靶向治疗多肽来源于人RAD51蛋白第331-339位氨基酸序列。
一种肿瘤靶向多肽，包括：
(a)新型肿瘤靶向治疗多肽；
(b)由多肽(a)与穿膜肽元件形成的融合蛋白；
(c)由多肽(a)或(b)通过添加、缺失、或改变一个或多个氨基酸而衍生的且具有影响RAD51泛素化修饰，核内foci形成，降低DNA修复功能的衍生多肽；
(d)氨基酸序列对应于RAD51蛋白的C端(331-339aa)的多肽，或C端与穿膜肽元件形成的融合蛋白，并且所述多肽或融合蛋白(d)具有影响RAD51泛素化修饰，核内foci形成，降低DNA修复功能。
上述肿瘤靶向多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
一种新型肿瘤靶向治疗药物，包括上述肿瘤靶向多肽。
上述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型，优选剂型为注射制剂。
该药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。
一种药物组合物，包括上述肿瘤靶向多肽和药学上可接受的载体。
一种药物组合物，包括具有肿瘤治疗作用的其他活性成分、上述肿瘤靶向多肽和药学上可接受的载体。
上述具有肿瘤治疗作用的其他活性成分包括但不限于顺铂。
上述肿瘤包括但不限于人子宫内膜癌、肺癌和肝癌。
本发明的有益效果为：
(1)本发明人经过长期深入的研究，首次意外的发现：细胞自噬相关因子ATG7作为E1激活酶，介导了DNA损伤修复蛋白RAD51的泛素化修饰，从而影响其参与DDR通路的应答；并首次证实了：来源于人RAD51蛋白第331-339位氨基酸序列或含有上述序列的RAD51片段，能特异性的增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，避免肿瘤产生耐药，显著的提高治疗效果。
(2)筛选出增加肿瘤药物敏感性的多肽：本发明在细胞水平和动物实验均进行了大量的筛选和验证，同时利用临床患者的类器官进行了验证，证实了本发明的多肽构成的核心区对肿瘤药物敏感性的增强作用，推动了肿瘤治疗药物的开发。
(3)通过给予本发明的多肽，仅影响RAD51的泛素化修饰，从而影响核内foci的形成，因此副作用小。
(5)通过给予本发明的多肽，可以有效降低化疗药物的使用浓度，提高肿瘤细胞的药物敏感性。
附图说明
图1显示了DNA损伤修复蛋白RAD51的泛素化修饰是其参与DDR通路的重要调控步骤，这一过程是由细胞自噬相关因子ATG7所介导的；其中，图1A：显示了与WT(MEF-Atg7+/+)相比，在KO(MEF-Atg7-/-)中，RAD51的泛素化带消失，结果表明，RAD51的泛素化修饰是由ATG7所介导的；图1B显示，ATG7具有E1活性；图1C和D显示，ATG7作为E1，介导了RAD51的泛素化修饰；图1E显示，RAD51的泛素化修饰是参与DDR通路的重要调控方式。
图2显示了RAD51的泛素化修饰影响了核内foci的形成，而核内foci是RAD51参与DDR通路的主要形式；图2A显示，与WT(MEF-Atg7+/+)相比，在KO(MEF-Atg7-/-)中，RAD51在核内foci的形成明显降低；图2B为统计结果；图2C显示，在细胞中过表达N-端带有Flag，C端带有Myc标签的RAD51，核内检测到Flag标签的foci，而Myc标签在核内无法检测到，提示RAD51泛素化修饰发生在C端；图2D和2E显示，与foci形成相关的RAD51泛素化修饰位点在C端338位。
图3显示本发明多肽Rap辅助化疗药物Cisplatin(顺铂)促进肿瘤细胞发生灾难性死亡，抑制DDR通路，促进肿瘤细胞凋亡；图3A显示，本发明多肽Rap减低DDR通路引发的RAD51泛素化修饰；图3B显示，本发明多肽Rap抑制了DDR通路，促进了肿瘤细胞凋亡通路；图3C：Rap促进肿瘤细胞发生灾难性死亡，图3D为统计结果；图3E：流式细胞术检测细胞凋亡，表明Rap降低了化疗药物的使用量，明显增加了肿瘤细胞的药物敏感性；图3F为统计结果。
图4显示本发明多肽Rap在裸鼠成瘤实验中，增强化疗药物Cisplatin(顺铂)的敏感性。
图5显示本发明多肽Rap在患者来源的类器官中(A，非小细胞肺癌；B，肝癌)，增强化疗药物Cisplatin(顺铂)的敏感性。
图6为实施例5中药物稀释方案图。
具体实施方式
下面通过实验结合附图对本发明给与进一步的说明，以下所述仅为本发明的优选实施例，它们不应被用来解释或限制本发明的范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
本发明人经过长期深入的研究，首次意外的发现：细胞自噬相关因子ATG7作为E1激活酶，介导了DNA损伤修复蛋白RAD51的泛素化修饰，从而影响其参与DDR通路的应答。
本发明人首次证实了：来源于人RAD51蛋白第331-339位氨基酸序列或含有上述序列的RAD51片段，能特异性的增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，避免肿瘤产生耐药，显著的提高治疗效果，并且副作用小。
在上述发明基础上，本发明人完成了本发明。
RAD51是RecA/RAD51蛋白家族的核心成员，在同源重组反应中，参与单链入侵，同源配对及DNA单链交换过程。研究表明，RAD51在多种人类肿瘤中如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等中出现异常表达，并与肿瘤的放化疗耐受密切相关。
如本文所用，术语“本发明多肽”指一类特别有用的多肽，该多肽是对应人RAD51的第331-339位氨基酸(331-339aa)活性片段(简称为“核心区”)，如SEQ ID NO.1所示，或含所述核心区的RAD51突变体，或含所述核心区的融合蛋白、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”、“类似物”是指基本上保持抑制炎症功能或活性的多肽。本发明多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
优选的本发明多肽是含有来自人的RAD51蛋白第331-339位氨基酸序列(331-339aa)的活性片段或蛋白。应理解，该含有上述核心区的活性片段的长度可以不局限于21个氨基酸(多肽的构成一般是由核心区加上穿膜肽，我们的核心区是9个aa，穿膜肽一般都是公认的序列，大概在13个，因此多在21个aa左右)，还可以含有额外的来源于RAD51蛋白的侧翼氨基酸序列，通常该活性片段的长度为20-100个，较佳的21-70个，更佳的21-40个氨基酸。在本发明中，活性片段不包括全长的RAD51蛋白。
本发明的研究表明，本发明多肽可特异性的影响RAD51泛素化修饰，核内foci形成，降低DNA修复功能，从而提高肿瘤细胞的药物敏感性。本发明多肽的显著优点在于，它仅影响RAD51的泛素化修饰，从而影响核内foci的形成，因此副作用小。
药物组合物和治疗用途
本发明多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于癌症的治疗。在使用本发明多肽时，还可同时使用其他治疗剂。
本发明多肽当在治疗上进行施用(给药)时，可提供一种或多种以下效果：(a)治疗肿瘤；(b)降低RAD51的泛素化修饰；和(c)减少RAD51核内foci的形成。此外，本发明多肽不仅可取得良好的治疗效果，而且其副作用小，基本上不影响RAD51的其他功能(见图3)。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为5-8。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌肉、静脉内、皮下、皮内或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明多肽及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖或其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0.5mg/kg体重。此外，本发明的多肽，可以有效降低化疗药物的使用浓度，提高肿瘤细胞的药物敏感性。
使用药物组合时，是将安全有效量的本发明多肽施用于患者，其中该安全有效量通常为0.5mg/kg体重。当然具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况、化疗药物的选择等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
编码本发明多肽的多聚核苷酸也可用于治疗或预防目的，例如通过基因治疗方式。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboraryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
通用方法
1.Atg7敲除鼠的原代胚胎成纤维(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)细胞的培养
Atg7杂合鼠交配后，怀孕母鼠(E14)取胚胎小鼠，去掉头部和内脏，胰酶消化后，培养48小时后，按实验需求传代接种。
2.体内泛素化检测实验
细胞在RIPA裂解液中，4度裂解30分钟，将裂解液在13000rpm，4度，离心20分钟，分离后取上清液。BCA法测定样品蛋白浓度，定量取上清液加入相应抗体，4度孵育过夜后，加入protein A/G-beads，4度孵育4小时。免疫沉淀反应后，4度3000g离心5分钟，弃上清，protein A/G-beads洗3次，最后加入2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟，Western blotting检测分析。
3.蛋白免疫印迹(Western blotting)和免疫荧光
细胞在RIPA裂解液中，4度裂解30分钟，将裂解液在13000rpm，4度，离心20分钟，分离后取上清液。BCA法测定样品蛋白浓度并调整至相同浓度。加入上样缓冲液，混匀后95度加热10分钟，蛋白变性后，经过蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜，用5％的脱脂牛奶室温封闭1小时，用抗体稀释液稀释一抗至合适浓度,杂交过夜。PBS洗3次后，二抗室温孵育2小时，PBS洗3次，ECL显影。
细胞接种至玻片后，4％PFA(多聚甲醛)固定，PBS洗3次，0.5％TritonX100打孔后，10％普通山羊血清室温封闭1小时，随即加入5％普通山羊血清稀释的一抗，4度过夜，次日PBS洗3次后，加入相应的荧光二抗避光孵育2小时，PBS洗3次,Dapi染色5分钟后，PBS洗3次，用封片剂固定后，荧光显微镜下观察。
4.细胞培养和转染
1人结直肠癌HCT-116细胞株用10％FBS的IMDM培养液培养，HEK293细胞株，人子宫内膜癌KLE细胞株和Hela细胞株用10％FBS的DMEM培养液培养。所有转染均用Lipofectamin3000(Invitrogen)完成。
实验所用抗体，试剂盒和药品
实验所用商业化抗体分别来自以下公司：
CST的兔抗RAD51抗体，抗caspase-3，8和9抗体，兔抗Ub抗体；
Santa Cruz的兔抗RAD51抗体；
Sigma的抗α-tubulin抗体，兔抗ATG7抗体；
Thermo的荧光二抗；
abcam的泛素化检测试剂盒；
eBioscience的流式凋亡检测试剂盒；
除非特别说明，其他药品及试剂均来自Sigma公司；
由上海强耀生物科技有限公司直接合成本发明的新型肿瘤靶向治疗多肽(Rap肽)。
实施例1 RAD51的泛素化修饰及foci检测
1.1原代MEF细胞培养，参见通用方法1。
1.2体内泛素化修饰实验，参见通用方法2。
结果显示：与WT(MEF-Atg7+/+)相比，在KO(MEF-Atg7-/-)中，RAD51的泛素化带消失，RAD51的泛素化修饰是由ATG7所介导的，见图1A。
1.3泛素激活酶E1活性检测实验。
1.3.1 his-ATG7蛋白纯化。
1.3.1.1细胞转染实验。
HEK293细胞转染his-ATG7质粒，按通用方法将HEK293接种于10cm培养皿，密度接近80％，转染his-ATG7质粒8μg每个培养皿，48小时后，细胞在RIPA裂解液中，4度裂解30分钟，将裂解液在13000rpm，4度，离心20分钟，分离后取上清液。
1.3.1.2 GE His标签蛋白纯化预装柱纯化his-ATG7蛋白。
将His标签蛋白纯化预装柱用binding buffer进行平衡，上清液用bindingbuffer稀释后，上柱；washing buffer洗柱子；elution buffer洗柱子，收集洗脱液。
1.3.1.3透析浓缩纯化后的his-ATG7蛋白。
将洗脱液装于透析袋中，PEG8000浓缩。浓缩后的洗脱液，在生理盐水中，4度透析过夜，通用方法测定蛋白浓度。
1.3.2 E1活性检测
实验体系见表1，混合后，37度孵育1小时，按通用方法3Western blotting检测。
表1
组分 His His-ATG7
体积/μl
dH2O 24 26.5
10×UbiquitinyLation buffer 5 5
IPP(100U/ml) 10 10
DTT(50mM) 1 1
Mg-ATP(0.1M) - 2.5
EDTA(50mM) 5 -
20×E1(2μM) 2.5 2.5
20×Ub(50μM) 2.5 2.5
结果表明，ATG7具有E1活性，见图1B。
1.4 HCT-116细胞过表达myc-ATG7-WT和myc-ATG7-CM(C571S，E1活性位点突变)质粒，体内泛素化实验检测，通用方法2。
结果表明，ATG7作为E1，介导了RAD51的泛素化修饰，见图1C和D。
人子宫内膜癌KLE细胞株按通用方法培养，接种于10cm培养皿，密度接近80％，给予Cisplatin(顺铂)刺激，24小时后，按通用方法2和3，检测RAD51的泛素化水平和DDR通路指标。
结果表明，RAD51的泛素化修饰是参与DDR通路的重要调控方式，见图1E。
实施例2 RAD51核内foci的检测
1.1 ATG7缺失对RAD51核内foci的影响。
通用方法1培养Atg7敲除鼠的MEF细胞，按通用方法3免疫荧光检测RAD51核内形成的foci。
结果表明，与WT(MEF-Atg7+/+)相比，在KO(MEF-Atg7-/-)中，RAD51在核内foci的形成明显降低，ATG7介导了，RAD51核内foci的形成，见图2A，图2B为统计结果。
2.2 RAD51泛素化修饰位点的验证。
2.2.1 RAD51泛素化修饰位置
构建N-端带有Flag，C端带有Myc标签的Flag-RAD51-Myc标签的质粒，使用通用方法4接种和转染Hela细胞株，通用方法3免疫荧光检测。
结果表明核内检测到Flag标签的foci，而Myc标签在核内无法检测到，RAD51泛素化修饰发生在C端，见图2C。
2.2.2 RAD51泛素化修饰位点
利用在线软件UbPred预测RAD51的泛素化修饰位点，结果如表2。
表2
peptide position Score Threshold
EAVAYAPKKELINIK 57 1.09 0.3
AVAYAPKKELINIKG 58 1.09 0.3
IKCISEAKADKILAE 70 0.77 0.3
ISEAKADKILAEAAK 73 1.42 0.3
KILAEAAKLVPMGFT 80 0.77 0.3
IQITTGSKELDKLLQ 107 0.87 0.3
TGSKELDKLLQGGIE 111 0.84 0.3
DRGGGEGKAMYIDTE 156 0.88 0.3
AMFAADPKKPIGGNI 284 0.55 0.3
TTRLYLRKGRGETRI 304 0.66 0.3
ADGVGDAKD＊＊＊＊＊＊ 338 3.60 0.3
根据图2C和表2的结果，我们构建了GFP-RAD51-285(K285A)和GFP-RAD51-338(K338A)位点突变质粒，使用通用方法4，3和2，检测核内foci和泛素化修饰。
结果表明，RAD51的338位泛素化修饰位点是介导其核内foci形成的位点，见图2D和E。
实施例3本发明多肽Rap辅助化疗药物的作用
3.1人子宫内膜癌KLE细胞株按通用方法4培养，接种于10cm培养皿，密度接近80％，给予Cisplatin(顺铂)和Rap刺激，24小时后，按通用方法2和3，检测RAD51的泛素化水平。
结果表明，Rap降低了RAD51的泛素化修饰，见图3A.
3.2人子宫内膜癌KLE细胞株按通用方法4培养，给予Cisplatin(顺铂)和Rap刺激，24小时后，按通用方法3检测DDR通路。
结果表明，Rap抑制了DDR通路，见图3B。
3.3人子宫内膜癌KLE细胞株按通用方法4培养，给予Cisplatin(顺铂)和Rap刺激，24小时后，按通用方法3免疫荧光实验检测细胞灾难性死亡。
结果表明，Rap促进了肿瘤细胞发生灾难性死亡，见图3C，3D为统计结果。
3.4人子宫内膜癌KLE细胞株按通用方法4培养，给予Cisplatin(顺铂)和Rap刺激，24小时后，用流式凋亡试剂盒(Annexin V—FITC)检测细胞凋亡，具体使用步骤参见说明书.
结果显示，Rap降低了化疗药物的使用量，明显增加了肿瘤细胞的药物敏感性见图3E，图3F为统计结果。
实施例4裸鼠成瘤实验检测Rap是否可以增强肿瘤对化疗药物的敏感性
实验用裸鼠4周龄，皮下注射人子宫内膜癌细胞KLE使其成瘤，当肿瘤长至100mm3，按组给予药物，每3天测量一次肿瘤大小，按照公式：V＝d1×d2×d2/2，计算肿瘤体积。
肿瘤体积在以下各组中的比较：
a.Ctrl(生理盐水，n＝5)
b.Rap(0.5mg/kg，n＝6)
c.Cisplatin(1mg/kg，n＝5)
d.Cisplatin+Rap(Cisplatin:1mg/kg；Rap:0.5mg/kg,n＝9)
结果表明，本发明多肽Rap在裸鼠成瘤实验中，增强化疗药物Cisplatin(顺铂)的敏感性，见图4。
实施例5患者来源的类器官中检测Rap是否可以增强肿瘤对化疗药物的敏感性
选取肝癌和非小细胞肺癌类器官各一例，进行化疗药物Cisplatin(顺铂)和Rap联用的药效学实验。
具体稀释方案如图6。
图5显示本发明多肽Rap在患者来源的类器官中(A，非小细胞肺癌；B，肝癌)，增强了化疗药物Cisplatin(顺铂)的敏感性。
序列表
<110> 中国医科大学
<120>一种新型肿瘤靶向治疗多肽及其用途
<130>
<140>
<160>9
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Ala Asp Gly Val Gly Asp Ala Lys Asp
1 5

Claims (8)

1.一种新型肿瘤靶向治疗多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示；
所述新型肿瘤靶向治疗多肽来源于人RAD51蛋白第331-339位氨基酸序列。
2.一种肿瘤靶向多肽，包括：
（a）权利要求1所述新型肿瘤靶向治疗多肽；
（b）由多肽（a）与穿膜肽元件形成的融合蛋白；
所述多肽（a）或融合蛋白（b）具有影响RAD51泛素化修饰，核内 foci形成，降低DNA修复功能。
3.根据权利要求2所述肿瘤靶向多肽，其特征在于，具有以下用途：
（a）制备增加肿瘤药物敏感性的药物的用途；
（b）制备RAD51 DNA损伤修复功能的抑制剂的用途。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。
5.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。
6.根据权利要求2所述的肿瘤靶向多肽，其特征在于，所述肿瘤为子宫内膜癌、肺癌和肝癌。
7.一种药物组合物，包括具有肿瘤治疗作用的其他活性成分、权利要求2所述的肿瘤靶向多肽和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述具有肿瘤治疗作用的其他活性成分为顺铂。
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