CN105695562B - Mst4基因诊断及细胞治疗感染性疾病的用途及其相关药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分离的MST4基因及其同源序列在制备或筛选感染性疾病治疗药物中的用途。MST4直接与TRAF6相互作用并磷酸化TRAF6的T463和T486，抑制其K63Ub链的自身泛素化及下游信号通路的激活，调控过度免疫反应。MST4敲除的小鼠，在败血症休克中免疫损伤明显加剧，表现为巨噬细胞浸润加剧，小鼠生存率更低。进一步将巨噬细胞内MST4基因表达进行体外改造，并重新输入小鼠体内的相关细胞治疗手段，可有效地影响败血症小鼠的过度免疫反应。本发明可用于败血症、细菌性痢疾以及疟疾的早期诊断指标，通过调控MST4水平改善宿主过度免疫反应而用于败血症等感染性疾病的治疗，该研究将为临床相关的感染性疾病的治疗提供新的技术手段，极具市场价值。

Description

MST4基因诊断及细胞治疗感染性疾病的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及MST4基因诊断及治疗败血症等感染性疾病的用途及其相关药物。

背景技术

过度炎症反应会对机体产生不利影响甚至引起死亡。Toll样受体(TLR)信号通路在细菌感染和组织损伤中都发挥着关键作用。在多种病理条件下，如败血症，TLR信号通路的紊乱会导致过度炎症反应，对机体早场损伤。因而，免疫炎症和免疫耐受之间需要精细的调控。在检测到病原相关分子模式后，多数Toll样受体会激活信号传递的中间分子TRAF6，而后激活下游的NF-kB通路产生促炎细胞因子。因而TRAF6的激活需要被精密调控以维持免疫稳态。

TRAF6是一个E3泛素连接酶，由有一个N端RING结构域，数个锌指结构域，一个卷曲螺旋结构域和一个C端的TRAF结构域(TRAF-C)。TRAF6与上游激活因子的结合模式与TRAF家族其他蛋白不同，K63链的自身泛素化是其激活的关键因素。TRAF6的卷曲螺旋结构域和C端的TRAF结构域介导其自身寡聚，TRAF6进而与K63特异的E2泛素缀合酶Ubc13/Uev1a或UbcH7结合，发生非降解的K63位泛素化。泛素化的TRAF6招募下游的信号分子如TAB1/2和TAK1，进而激活IKK和NF-κB。目前为止，人们已发现了不同的调控因子可以通过K63位去泛素化以及打破TRAF6与Ubc13/Uev1a，MYD88等相互作用分子的结合来调控TRAF6的功能。但TRAF6是否存在泛素化以外的修饰影响其功能还不得而知。

MST4属于生发中心激酶GCKIII亚家族。该亚家族有三个成员，即MST4,MST3和STK25。这三个激酶都有保守的激酶结构域，其C端结构域介导同源二聚或与接头蛋白的异源二聚，但结构不尽相同。MST4是一个大小为55kDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在胰腺、胸腺、淋巴细胞和外周血的粒细胞中高表达。GCKIII家族的其他激酶已被报道在TNFα诱导的NF-κB信号通路中发挥功能，但MST4的生物功能目前还知之甚少。我们之前的研究表明MST4参与细胞极性形成以及细胞生长，并在肿瘤抑制因子LKB1的下游磷酸化Ezrin。此外接头蛋白MO25直接与GCKIII家族激酶的激酶结构域结合，大大增强其激酶活性。最近，研究又发现MST4是STRIPAK复合物中的一个激酶，在信号转导，细胞周期，细胞凋亡、膜泡运输和细胞迁移过程中发挥作用。

发明内容

本发明的目的在于公开MST4基因或其同源序列治疗感染性疾病的用途及其相关药物，其中，MST4直接与TRAF6相互作用，通过磷酸化TRAF6抑制其自身泛素化并下调NF-κB信号通路，抑制过度免疫反应。

本发明首先公开了分离的MST4基因或其同源序列在制备或筛选感染性疾病治疗药物，或者在制备感染性疾病诊断药物中的用途。

较优的，所述感染性疾病选自败血症、细菌性痢疾或疟疾。

MST4基因的核苷酸序列在Genebank中序列号为NM_016542.3的序列。

优选的，所述MST4的同源序列为与Genebank中标号为NM_016542.3所示序列的核苷酸序列在确定的分子长度内，序列显示有至少约50％；优选至少约为75％；更佳至少约为80-85％；尤其佳至少约为90％；最佳至少约为95-98％序列相似性的DNA序列。更优选的，所述MST4的同源序列选自小鼠MST4基因。

所述MST4基因及其同源序列在制备感染性疾病诊断药物中的用途，是指将MST4基因表达水平作为一项诊断指标应用于感染性疾病诊断药物的制备。

所述MST4基因及其同源序列在制备或筛选感染性疾病治疗药物中的用途，是指以MST4基因为目的基因，制备或筛选能上调该基因表达的药物。

所述通过分离的MST4基因制备或筛选获得的感染性疾病治疗药物或者感染性疾病诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述感染性疾病治疗药物的施用量为足够改变人MST4基因的转录或翻译，或者足够改变人MST4蛋白的表达或活性的剂量。

采用前述感染性疾病治疗药物治疗感染性疾病的方法，主要是通过过表达MST4基因，直接与TRAF6相互作用并磷酸化TRAF6的T463和T486，抑制其K63Ub链的自身泛素化及下游信号通路的激活，调控过度免疫反应。具体的，治疗时，将能过表达MST4基因的物质给药于患者。

本发明第二方面公开了一种降低MST4基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与MST4基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与MST4基因杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与MST4基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与MST4基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与MST4基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。

更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与MST4基因中的靶序列基本相同。

优选的，所述MST4基因的靶序列含有SEQ ID NO:69～71所示的序列，具体的：

5’-CAGCAAGTCGTTGCTATTAAAAT-3’(SEQ ID NO：69)；

5’-TTCACCTGTATTCTAGTAAATGT-3’(SEQ ID NO：70)；

5’-GCCTGGGATGCAGAATAATATAG-3’(SEQ ID NO：71)；

所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。

更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：72～74所示，具体为：

5’-GUCGUUCAGCAACGAUAAUUUUA-3’(SEQ ID NO：72)；

5’-AAGUGGACAUAAGAUCAUUUACA-3’(SEQ ID NO：73)；

5’-CGGACCCUACGUCUUAUUAUAUC-3’(SEQ ID NO：74)；

SEQ ID NO：72～74所示的siRNA为以SEQ ID NO:69～71所述的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对MST4基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默MST4基因表达的作用。

进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与MST4基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默细胞中内源MST4基因表达的作用。

更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与MST4基因中的靶序列基本相同。

较佳的，所述正义链片段与MST4基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与MST4基因中19、20或21个连续的核苷酸序列基本相同。

进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。优选的，所述茎环结构为UUCAAGAGA。

更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:75～77所示，具体为：

5’-GGCCGUCGUUCAGCAACGAUAAUUUUAGAGCUCUAAAAUUAUCGAAGCUGAACGACAAAAAC-3’(SEQ ID NO：75)；

5’-GGCCAAGUGGACAUAAGAUCAUUUACAGAGCUCUGUAAAUGAUGUUAUGUGGAGUUAAAAAC-3’(SEQ ID NO：76)；

5’-GGCCCGGACCCUACGUCUUAUUAUAUCGAGCUCGAUAUAAUAAGACGUAGGGUCCGAAAAAC-3’(SEQ ID NO：77)。

shRNA序列中的前两位为保护碱基，防止降解。

shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默内源性MST4基因表达的作用。

编码本发明所述shRNA的基因片段的慢病毒病毒载体含有SEQ ID NO.69～71所示的序列及其互补序列。

所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与MST4基因中的靶序列基本相同，所述MST4基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默MST4基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的MST4基因的片段。

较佳的，所述MST4基因中的靶序列含有SEQ ID NO.69～71所示的序列。

进一步的，所述MST4基因来源于人。

本发明第三方面，公开了一种MST4基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

所述的MST4基因干扰核酸构建体可以是将编码前述MST4基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述MST4基因干扰核酸构建体为MST4基因干扰慢病毒载体。

本发明的MST4基因干扰慢病毒载体是将编码前述MST4基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述MST4基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染组织细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默MST4基因的表达。

进一步的，所述基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明实施例具体列举了以pLKO.1-EGFP为载体构建的MST4基因慢病毒载体。

本发明分离的核酸分子可用于制备降低MST4基因表达的药物。

本发明的MST4基因siRNA可用于降低MST4基因表达。MST4干扰慢病毒载体则可用于制备所述MST4基因siRNA。当用作降低MST4基因表达的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第四方面，公开了一种MST4基因干扰慢病毒，由前述MST4基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染细胞并产生针对MST4基因的小分子干扰RNA，从而降低MST4基因的表达。

本发明第五方面，公开了一种用于降低MST4基因表达的药物组合物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，MST4基因干扰核酸构建体或MST4基因干扰慢病毒中的一种或多种的组合。

进一步的，所述药物组合物含有1～99wt％所述双链RNA、shRNA、MST4基因干扰核酸构建体或MST4基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

本发明还公开了所述药物组合物在制备降低MST4基因表达药物中的应用。

该药物组合物的应用为感染性疾病的相关研究提供了一种方法，具体为一种降低MST4基因表达的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述药物组合物用于降低MST4基因表达时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述MST4基因的表达被抑制。

所述方法的对象可以为人。

本发明第六方面，公开了一种用于降低MST4基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，MST4基因干扰核酸构建体，和/或所述的MST4基因干扰慢病毒。

由上所述，本发明设计了针对MST4基因的RNAi靶点序列，构建相应的MST4RNAi载体，所述RNAi载体能够显著下调MST4基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒作为基因操作工具携带RNAi载体能够靶向地将针对MST4基因的RNAi序列高效导入，降低MST4基因的表达水平。

本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制MST4基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中MST4基因的表达。

本发明第七方面公开了一种感染性疾病诊断试剂盒，其含有针对MST4基因的RT-PCR引物。

优选的，所述针对MST4基因的RT-PCR引物序列如SEQ ID NO：7～8或17～18所示。

优选的，所述试剂盒还含有针对TRAF6基因的RT-PCR引物。

本发明还公开了一种感染性疾病诊断方法，包括对患者的MST4基因表达水平进行检测。

优选的，所述感染性疾病诊断方法还包括对患者的TRAF6基因表达水平进行检测。

较优的，所述感染性疾病选自败血症、细菌性痢疾或疟疾。

本发明通过广泛而深入的研究发现，MST4的表达在特定的感染性疾病中下调。在细菌感染后，MST4的表达，尤其是在巨噬细胞中的表达呈动态变化。MST4直接与TRAF6相互作用并磷酸化TRAF6的T463和T486，抑制其K63Ub链的自身泛素化及下游信号通路的激活，调控过度免疫反应，负调控炎症反应。MST4敲除的小鼠，在败血症休克中免疫损伤明显加剧，表现为巨噬细胞浸润加剧，小鼠生存率更低。进一步将巨噬细胞内MST4基因表达进行体外改造，并重新输入小鼠体内的相关细胞治疗手段，可有效地影响败血症小鼠的过度免疫反应。本发明可用于败血症、细菌性痢疾以及疟疾的早期诊断指标，通过调控MST4水平改善宿主过度免疫反应而用于败血症等感染性疾病的治疗，该研究将为临床相关的感染性疾病的治疗提供新的技术手段，极具市场价值。

本发明公开了MST4基因及其同源基因，或者MST4基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备用于治疗感染性疾病的药物、开发抗炎症药物，制备感染性疾病诊断和预后药物中的用途，极具临床和市场价值。

附图说明

图1：A.MST4的mRNA水平在败血症病人样本中下调。B.MST4的mRNA水平与IL-6的mRNA水平的相关性。C.THP1细胞中，LPS刺激后GCKII(MST1/2)和GCKIII(MST3/4,STK25)的转录水平。D.BMM细胞中，LPS刺激后GCKII和GCKIII的转录水平。E.大肠杆菌感染后，GCKII(MST1/2)和GCKIII(MST3/4,STK25)的转录水平。F.鼠伤寒沙门氏杆菌SL1344感染后，GCKII(MST1/2)和GCKIII(MST3/4,STK25)的转录水平。

图2：A.LPS刺激后，不同时间的MST4,TNFα和IL-6的mRNA水平。B.LPS刺激后，鼠AVEC、AEC、LF、AM细胞中MST4的转录水平。C.鼠伤寒沙门氏杆菌SL1344感染后，MST4的转录水平。D.LPS刺激小鼠后，小鼠体内不同器官中MST4转录水平的变化。

图3：A.过表达MST4的THP1细胞中，LPS刺激后TNFα(A)和I：-6(A’)的相对mRNA水平。THP-1细胞稳转慢病毒空载或表达带有Flag标签MST4的慢病毒载体，TNFα和IL-6的mRNA水平变化已用ACTB(表达β-actin)的mRNA水平平均化，以相对于未LPS刺激的对照组的相对值表示。B.ELISA检测过表达MST4的THP1细胞中，LPS刺激后TNFα和IL-6(B’)的生成。C-D’.转染shMST4的细胞中，LPS刺激后细胞因子的转录和表达。E.过表达MST4的THP1细胞中，大肠杆菌感染后后TNFα和IL-6(E’)的相对mRNA水平。F.过表达MST4的THP1细胞中，鼠伤寒沙门氏菌感染后后TNFα和IL-6(F’)的相对mRNA水平。G.PEM细胞中，大肠杆菌感染后后IL-1β的相对mRNA水平。H.过表达MST4的THP1细胞中，LPS刺激后，免疫印迹检测细胞中IκBα的总量。β-actin作为对照。I.转染shMST4的细胞中，LPS刺激后，免疫印迹检测细胞中IκBα的降解。

图4：THP1细胞中，免疫印迹分析总IκBα。B.过表达MST4的THP-1细胞中TNFα和IL6的转录水平。C.过表达MST4的THP-1细胞中TNFα和IL6的分泌表达。D.MEF细胞中，免疫印迹分析总IκBα。E.细胞转染MST4或其突变体质粒后，LPS刺激对p65转运的影响。F.免疫印迹检测细胞转染Flag-MST4或MST4特异shRNA后，MST4的表达水平。G.免疫印迹检测敲除MST4的细胞中，转染Flag-MST4或其突变体后，MST4的表达水平。H-I’.LPS刺激后，MST4的rescue实验，检测细胞因子的转录水平变化(H,H’)和转录因子的分泌水平(I,I’)。WT代表野生型，TE代表MST4(T178E)突变体，KR代表MST4(K53R)突变体。

图5：A.HEK293细胞中NF-κB报告基因在转染My88,IRAK,TRAF6,IKKα或p65以及不同剂量的MST4后荧光酶素的活性。B.HEK293T细胞中，敲除MST4后，NF-κB的转录激活。C.Traf6-/-MEF细胞中，LPS刺激后，细胞因子的分泌表达。D.Hela细胞中转染MST4后，TNFα,IL-1β或IL-6诱导的NF-κB激活。E.过表达野生型MST4或MST4突变体后，TNFα诱导的IL-6分泌表达。F.HEK293细胞中，过表达MST4或MST4突变体后免疫印迹检测IKKβ磷酸化。G.外源MST4和TRAF6的免疫共沉淀实验。H.内源MST4和TRAF6的免疫共沉淀实验。

I.THP-1细胞中，LPS刺激不同时间后，MST4与TRAF6的相互作用。J-K.LPS刺激不同时间后骨髓(J)和肺(K)中MST4与TRAF6的相互作用。L.THP-1细胞中，LPS刺激后MST4与TRAF6的共定位。M.pull-down实验检测MST4与TRAF6直接相互作用的区域。

图6：A.人MST4和TRAF6的结构域示意图。B-C.免疫共沉淀实验确定MST4与TRAF6相互作用的具体区域。D.pull-down实验检测MST4与TRAF6(TD)的相互作用。TRAF6(TD)表示TRAF6的TRAF-C结构域。E.THP-1细胞中，免疫印迹检测LPS刺激不同时间后TRAF6的泛素化。F.293T细胞中过表达不同剂量的MST4后，TRAF6的泛素化水平。G.转染MST4后，TRAF6突变体TRAF6(C70A)的泛素化水平。H.293T细胞中，敲除MST4后，TRAF6的泛素化水平。I.体外泛素化实验检测MST4对TRAF6泛素化水平的影响。J.细胞中转染MST4或MST4突变体对TRAF6泛素化水平的影响。K.HEK293T细胞中，过表达MST4、MO25对TRAF6泛素化水平的影响。L.过表达MST4或其突变体对NEMO泛素化水平的影响。

图7：A.shMST4敲除MST4的细胞中，转染MST4对TRAF6磷酸化水平的影响。B.LPS刺激小鼠肺部组织后，免疫印迹检测TRAF6磷酸化水平以及MST4的表达水平。C.MST4磷酸化TRAF6的具体结构域。D.体外激酶活性实验检测MST4或其突变体对TRAF6磷酸化水平的影响。E.质谱分析MST4磷酸化TRAF6的位点。F.转染MST4的细胞中TRAF6或TRAF6(2A)突变体的磷酸化水平。G.转染MST4的细胞中TRAF6或TRAF6(2A)突变体的自身泛素化水平。H.转染MST4的细胞中TRAF6或TRAF6(2A)突变体介导的NF-κB转录激活。

图8：A-B.MST4敲除小鼠腹腔注射LPS后不同器官中MST4(A)和IL-6(B)的转录水平。C.MST4敲除小鼠中MST4和IL-6的mRNA水平的相对变化。D-F.LPS刺激(n＝16)(D)、鼠沙门伤寒杆菌SL1344诱导败血症(n＝24)(E)、盲肠结扎穿刺诱导败血症(n＝20)(F)小鼠的生存率。G-H.LPS刺激(G)和鼠沙门伤寒杆菌SL1344感染(H)后小鼠肺部组化染色。I.LPS刺激(n＝5)、鼠沙门伤寒杆菌SL1344诱导败血症(n＝5)、盲肠结扎穿刺诱导败血症(n＝5)小鼠腹膜内巨噬细胞计数。J-L.LPS刺激(J)、鼠沙门伤寒杆菌SL1344诱导败血症(K)、盲肠结扎穿刺诱导败血症(L)小鼠细胞质中细胞因子的表达。

图9：A.MST4敲除小鼠的LPS刺激后敲除巨噬细胞的流程图。B.氯膦酸盐脂质体处理2天后从脾脏中循环系统中分离F4/80+巨噬细胞的流程图。C.LPS刺激后对照小鼠和MST4敲除小鼠敲除巨噬细胞后小鼠的存活率(每组20只)。D.回输shMST4处理的巨噬细胞后，小鼠在LPS刺激后的存活率。带有GFP标签的shMST4和对照的GFP载体处理腹膜腔巨噬细胞48小时，以激活巨噬细胞。通过流式细胞仪分选分离GFP阳性的细胞。LPS刺激前，阳性细胞(10⁷)通过静脉注射回输给小鼠。E.TRAF6+/+和TRAF6+/-小鼠由shMST4处理后进行LPS刺激的流程图。F.LPS刺激后TRAF6+/+对照小鼠、TRAF6+/+MST4敲除小鼠、TRAF6+/-对照小鼠和TRAF6+/-MST4敲除小鼠的生存曲线。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

可从Genebank获得人MST4基因的核苷酸序列(NM_016542.3)及其氨基酸序列(NP_057626.2)。本文中同源基因指种间同源基因，不同物种中起源于一个共同的祖先基因的一些同源基因，这些基因通常保持相同的或相似的功能。根据NCBI网站BLAST的结果，人MST4的同源基因包括小鼠MST4基因(NM_133729.1)，斑马鱼MST4基因(NM_001127477.1)和果蝇GCKIII基因(NM_142339.3)。

或者，可以“同源性”来定义本申请的同源基因。“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分之间的相似性百分数。两条DNA或两条多肽序列在确定的分子长度内，当序列显示有至少约50％，优选至少约为75％、更佳至少约为80-85％、尤其佳至少约为90％、最佳至少约为95-98％序列相似性时，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指与特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。

本文中，将体外改造过的巨噬细胞重新输回体内的细胞治疗手段，以及模拟MST4活性成分的化学制剂以及小分子多肽可用于“抑制败血症等感染性疾病体内的过度免疫反应”。

基本实验方法

1.克隆，纯化及蛋白表达纯化

将人Ubc13和Uev1A从cDNA中扩增并克隆至HT-pET-28a载体中并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中使用IPTG诱导蛋白表达。人野生型MST4以及MST4(K53R)突变体片段克隆至HT-pET-28a载体中，人MST4以及TRAF6的TRAF-C结构域(346-504)克隆至MBP-pET-28a载体中。带有His标签的融合蛋白(连接于HT-pET-28a载体)通过镍柱亲和以及凝胶过滤层析柱HiLoad 16/60Superdex 75/200纯化后。带有MBP标签的蛋白(连接于MBP-pET-28a载体)通过Amylose Resin亲和以及凝胶过滤层析柱HiLoad 16/60Superdex 75/200纯化。

其他融合表达的标签蛋白同样通过体外表达、亲和纯化以及凝胶过滤层析获得。

2.Pull-down实验

MBP或GST融合表达的标签蛋白交联在直链淀粉(Amylose)凝胶或GST凝胶上，与目标蛋白与4℃混合1小时，混合的缓冲液体系为20mM HEPES,200mM NaCl,1mM DTT,pH7.5。之后缓冲液洗三次，使用含有20mM麦芽糖或20mM还原性谷胱甘肽的缓冲液进行洗脱。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色或免疫印迹检测实验结果。

3.细胞培养

HEK293、293T、HeLa、MEF细胞培养于DMEM(Hyclone)培养液中，培养液中添加10％血清，100μg/mL盘尼西林，100μg/mL链霉素。细胞于37℃培养，二氧化碳浓度为5％。动脉血管上皮细胞(AVEC)、肺泡上皮细胞(AEC)、肺成纤维细胞(LF)、肺泡巨噬细胞(AM)从小鼠体内分离，培养于上述培养基中。

THP-1细胞培养于RPMI-1640(Invitrogen公司)培养液中，培养液中添加10％血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素。细胞于37℃培养，二氧化碳浓度为5％。

PEM细胞为小鼠腹腔注射琉基乙醇酸盐诱导获得。在L929-DMEM培养基中培养一周后获得BMM细胞。

4.免疫印迹和免疫沉淀

免疫印迹和免疫沉淀按照文献所述方法进行(Shi,Z.,et al.Structure of theMST4in complex with MO25provides insights into its activationmechanism.Structure 21,449-461，2013)。

将收集的样品加入等量2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃变性5分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，100V恒压电泳90至120分钟。电泳完成后采用Bio-Rad的标准湿式转膜装置和Bio-rad的PVDF膜(货号162-0177)在4℃进行转膜，转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。转膜完毕后，立即把PVDF膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。PBST洗脱液洗去封闭液。参考一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释抗体，一抗孵育一小时。PBST洗脱液洗去一抗。参考二抗的说明书，按照适当比例用二抗稀释液稀释抗体。PBST洗脱液洗去二抗。使用Pierce公司ECL检测试剂(货号32106)和GE公司LAS4000荧光/化学发光成像系统检测样品。

实验用试剂配制方法如下所示：

1)2×SDS上样缓冲液：每10ml含3.55ml去离子水，1.25ml 0.5M Tris-Cl,pH6.8，2.5ml甘油，2.0ml 10％(w/v)SDS，0.2ml 0.5％(w/v)溴酚蓝，0.05mlβ-巯基乙醇。

2)10×Western电泳缓冲液：30.3g Tris base，144g甘氨酸以及10g SDS溶解，加去离子水至1升。

3)10×Western转膜缓冲液：30.3g Tris base，144g甘氨酸，使用时取100ml溶解加去离子水至1升，不用调pH值，使用时将100ml的10×转膜缓冲液稀释至800ml，加入200ml甲醇。

4)PBST洗脱液：用800ml水溶解80g NaCl,2g KCl,14.4g Na2HPO4和2.4g KH2PO4,用HCl调PH值至7.4,加水至1L。使用时取100ml溶解加去离子水至1升，加入500μl Tween20。5)一抗稀释液：称取5g BSA粉末溶于100ml 1×PBS溶液中，再加入0.02％的叠氮钠，4度保存。

6)二抗稀释液：5g脱脂牛奶溶解至100ml PBST中。

7)磷酸缓冲液(10×PBS)：用800ml水溶解80g NaCl,2g KCl,14.4g Na2HPO4和2.4g KH2PO4,用HCl调PH值至7.4,加水至1L，保存于室温使用。

5.免疫组化

组织样本按照BD Pharmingen^TM IHC Zinc Fixative手册(手册编号:550523)，采用锌剂固定(BD Biosciences)并进行石蜡包埋。组织切片(厚度5μm)通过加热固定，切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90％乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris,pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。加入5％脱脂牛奶封闭60分钟。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。适当比例稀释一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，加入PBST，洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。按照适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入PBST洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。选用DAB进行后续检测。DAB染色后进行HE染色。最后进行.脱水，透明，中性树脂封片。

6.荧光

2×10⁵个巨噬细胞接种于带有盖玻片的6孔板中，8小时后，以1μg/ml的LPS刺激。细胞经4％多聚甲醛及预冷的甲醇固定。以MST4和TRAF6抗体对细胞进行染色,再以DAPI复染细胞核，蔡司LSM 710激光共聚焦显微镜检测细胞。

7.质谱

用于质谱检测的样品为体外纯化的TRAF6的TRAF-C蛋白以及被MST4体外磷酸化的TRAF-C蛋白。蛋白片段及纯化方法详见基本实验方法1，MST4体外磷酸化TRAF6的方法详见基本实验方法9。上述样品60ug，样品缓冲液为50mM TRIS-HCL pH7.5，0.1mM EGTA，10mM乙酸镁，通过质谱仪检测分析蛋白质磷酸化位点。

6.转染及荧光酶素检测实验

使用Invitrogen公司(San Diego,CA)的转染试剂

对细胞进行瞬时转染，24小时后检测过表达对细胞的影响，48小时后检测基因敲除对细胞的影响。

荧光酶素检测实验使用双荧光酶素检测试剂盒(Promega)，通过萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比例检测荧光素酶活性。将用于实验的细胞用PBS溶液漂洗后，每1×10⁵细胞加入60μl裂解缓冲液(试剂盒自带)，晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖细胞。-80℃保存30分钟后，室温放置10分钟，将细胞及所有的液体转移至一个离心管中，然后以12000x g离心30秒，将上清液转移至一个新的试管中。将萤光光度计的程序设置为：2秒延迟及10秒萤光素酶活性测量读数。如果有足够的光产生，读数时间可缩短。将100μl萤光素酶检测试剂加入萤光光度计试管中，每管一个样品。然后将20μl细胞裂解液加入装有萤光素酶检测试剂的萤光光度计试管中。吹打或轻微旋涡震荡以混合，将萤光光度计试管置于萤光光度计中并开始读数。

7.实时定量荧光PCR

实时定量荧光PCR采用Applied Biosystems公司两步法实时PCR(Realtime-PCR)系统，检测相对CT值。使用定量荧光PCR预混液(Toyobo公司提供2x

Green RealtimePCR reagent)配置反应体系检测并定量目标基因的表达水平，GAPDH作为内参。

8.体外泛素化实验

体外泛素化实验用于检测TRAF6的自身泛素化。反应缓冲液为300mM HEPES，50mMMgCl2，2mM DTT，pH7.2,30ul。该反应需要0.1ug重组E1激活酶，0.6ug重组Ubc13/Uev1a缀合酶复合物。体外纯化的泛素(2ug)，His标签融合的TRAF6(1ug)，MST(1ug)以及20mM ATP加至反应缓冲液中。转染有Flag标签融合的TRAF6的细胞在50ul细胞裂解液中裂解，取15ul加入2X reaction cocktail(sigma)。泛素化反应在30℃进行，以450rpm的速度反应一小时，反应完成后，以反应缓冲液清洗三次去除未反应的组分。样品变性后采用SDS-PAGE以及免疫印迹的方法检测，泛素化采用Ub抗体检测。

9.体外激酶活性实验

His标签融合的MST4野生型以及His标签融合的MST4失活突变体K53R先与ATP混合使其自身饱和磷酸化。反应体系为40ul，包括10ugMST4蛋白，1mM ATP，缓冲液为50mM TrispH7.5,0.1mM EGTA,10mM乙酸镁，其余体积以双蒸水补足，30℃孵育30分钟。

激酶活性实验的反应体系为40ul，包括4ul of 1ug饱和磷酸化的激酶，[γ³²P]ATP1.5uCi，缓冲液为50mM Tris pH7.5,0.1mM EGTA,10mM乙酸镁TRAF6的TRAF结构域作为反应底物，终浓度为1mg/ml，30℃孵育20分钟。反应产物加入等体积2×SDS上样缓冲液在100℃变性10分钟，SDS-PAGE分离后，通过放射自显影检测。PAGE使用磷屏(GE Healthcare)曝光过夜，在FLA-9000成像仪(GE Healthcare)上检测结果。

10.MST4基因敲除小鼠的构建

Chow-fed，4-6周雄性C57BL/6小鼠(Slac)。MST4shRNA(或对照shRNA，500nM)溶解于200μl含有5％甘油和转染试剂jetPEI(Polyplus，France，Illkirchcedex)的溶液中，shRNA连续7天每天静脉注射。动物培养及动物实验遵照中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所动物管理委员会相关章程和动物福利政策，用户编号为081。

11.疾病小鼠模型的建立

在研究LPS刺激对小鼠影响的实验中，以LPS(5mg/kg)进行腹腔注射。在建立小鼠败血症模型的实验中，以5×10⁴CFU/ml的标准腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌菌株SL13344(North Connaught，Shanghai，China)，诱导细菌性腹膜炎。为建立盲肠结扎穿刺小鼠模型，以80mg/kg的戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，在腹部正中切口，找到盲肠，结扎回盲瓣，而后以针穿刺结扎部位两次，放回肠道，缝合腹部。记录小鼠的生存率，定期收集血清和目的器官。

细菌感染后的小鼠在腹腔注射18小时后，以戊巴比妥处死，在无菌条件下收集血液，肺，脾脏，肾脏以及腹腔灌洗液。组织匀浆，血液和腹腔灌洗液以无菌PBS梯度稀释，分别接种与LB琼脂平板上，37℃培养18小时后，对每个样本的克隆进行计数。

12.小鼠体内巨噬细胞敲除及过继性回输

在LPS刺激48小时前，通过尾静脉向小鼠注射悬浮的氯膦酸盐脂质体或PBS。48小时后采用流式细胞仪检测(BD FACS Caliblur，USA)，以F4/80表达为检测指标，分选巨噬细胞腹膜巨噬细胞转染shMST4-GFP或对照GFP质粒，转染48小时以激活巨噬细胞。通过流式细胞仪分选GFP阳性细胞(BD FACS)，而后在LPS刺激前以静脉注射的方法注入小鼠，注射时细胞密度为10⁷。F4/80抗体购买自eBioscience。

13.细胞和组织中RNA抽提，

1)细胞中RNA的抽提

细胞弃去培养基，并用预冷的PBS将细胞清洗一遍。六孔板的每个孔加入500μlTrizol Reagent，室温处理5分钟。将细胞裂解液转移到1.5ml Eppendorf管中。每份样品加入100μl的氯仿，vortex低速混匀后静置5分钟。4℃，12000g离心15分钟，转移240μl的上层水相至新的Eppendorf管中。每份样品加入240μl的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。4℃，12000g离心15分钟，弃去上清，留下白色的RNA沉淀。每份样品加入500μl的75％乙醇，颠倒混匀。4℃，12000g离心5分钟，弃尽上清。室温晾干。加入适量DEPC处理过的去离子水，充分溶解。用

ND1000测定所提取的RNA的浓度，260nm的吸光值与280nm的吸光值的比值应维持在1.9-2.0之间。将所提取的RNA用于逆转录或直接冻到-80C保存。

所需试剂的配制：

磷酸缓冲盐溶液(PBS)：800ml蒸馏水溶解0.2g KCl，8g NaCl，0.24g KH2PO4和1.44g Na2HPO4。用HCl调节溶液的pH值至7.4，定容至1L。高压蒸汽灭菌或过滤除菌。

2)组织中RNA的抽提

动物组织25-50mg，用液氮研磨成粉末，加入500μl Trizol Reagent，后续处理步骤与细胞中RNA的抽提相同。

13.数据分析

采用SAS数据软件分析包(9.1.3)对数据进行分析，统计数据的平均数±标准差。单因子变异数分析(ANOVA)and Student’s t-test用于分析连续变量。置信区间为P<0.05。

实施例1MST4表达与细菌感染的关系

1.实验目的

本实施例的目的在于研究MST4基因及MST家族同源基因与细菌感染的相关性。

2.实验方法

2.1 人单核细胞系THP-1以及小鼠骨髓来源巨噬细胞BMM细胞中基因表达水平检测

THP-1细胞核BMM细胞抽提总RNA方法如基本实验方法12所述，AMV逆转录酶合成第一链，并以其为模板，在DNA taq酶的作用下用对应的引物进行PCR扩增；THP-1细胞样品扩增PCR引物见表1，BMM细胞样品扩增PCR引物见表2，逆转录体系见表3，逆转录反应程序见表4，Realtime-PCR反应体系见表,5，Realtime-PCR扩增程序见表6。

表1 引物序列

表2 引物序列

表3 逆转录反应体系

表4 逆转录程序

37℃	15min
		50℃	5min
95℃	5min
		4℃	20min

表5 Realtime-PCR反应体系

表6 PCR反应体系程序设定

2.2细胞感染实验

Escherichia coli(E.coli)以MOI＝10感染细胞,Salmonella typhimurium(strain SL1344)鼠伤寒沙门氏菌以MOI＝5感染细胞。

LPS(Escherichia coli,serotype 055:B5)购自Sigma(St.Louis,MO)以PBS溶液配制，处理细胞。

3.实验结果及分析

3.1 MST4与细菌感染性疾病的相关性

为研究MST4在天然免疫中的潜在功能，我们首先研究了MST4与细菌感染相关疾病的关联性。我们比较了26例正常人和36例败血症病人样本，我们发现败血症病人样本中的MST4的mRNA水平在外周血样品中明显下调(p＝0.0163)，MST4的转录水平降低(图1a)。MST4的mRNA水平与IL-6负相关(r＝-0.3477,p＝0.0377)(图1b)。这些结果表明MST4与特定的感染性疾病相关。

3.2 MST家族基因在细菌感染后表达水平的变化

为研究MST4是否在细菌感染中发挥作用，我们采用人单核细胞系THP-1检测内毒素对该细胞蛋白表达的影响。我们检测了MST4以及与MST4进化关系上比较接近的生发中心激酶MST1、MST2、MST4和STK25。

结果显示1μg/ml LPS刺激THP-1细胞使MST4的mRNA水平显著增高，而MST1/2以及STK25的mRNA水平无显著变化。MST3由于与MST4在序列上有很高的同源性,MST3的没RNA水平也有所上升(图1c)。在小鼠骨髓来源巨噬细胞BMM细胞系中我们也获得了相似的实验结果(图1d)。鼠伤寒沙门氏菌SL1344株以及大肠杆菌等革兰氏阴性菌处理，也获得了相似的实验结果(图1e，1f)。因而，MST4在不同生理和病理条件下可能发挥不同的功能。

实施例2 MST4在细菌感染后表达水平的变化

1.实验目的

本实施例目的在于研究细菌感染后MST4表达水平对炎症细胞因子表达水平的影响，以及MST4在免疫相关组织或细胞中其表达水平的变化。

2.实验方法

2.1 LPS刺激后，THP-1细胞中基因表达水平检测

提总RNA方法如基本实验方法12所述，样品扩增及检测方法如实施例1所述。MST4基因扩增PCR引物见表1，TNFα及IL-6扩增PCR引物见表7。

表7 引物序列

2.2 小鼠动脉血管上皮细胞(AVEC)、肺泡上皮细胞(AEC)、肺成纤维细胞(LF)、肺泡巨噬细胞(AM)中以及小鼠器官中基因表达水平检测的实验方法如实施例1所述，MST4基因扩增PCR引物见表2。

3.实验结果及分析

3.1 LPS刺激后炎症细胞因子TNFα以及IL-6转录水平的变化

由于MST4在免疫相关的巨噬细胞中表达水平受到LPS以及细菌感染的调控，我们进一步研究了LPS的刺激下，THP-1细胞中，MST4的mRNA水平以及参与炎症反应的细胞因子TNFα、IL-6的转录水平(Fig.2a)。结果显示，LPS刺激后，TNFα的转录水平迅速上调，其mRNA水平在刺激后3小时达到峰值。与此同时，MST4的mRNA水平有所下降。在其后的12小时，TNFα的mRNA水平逐步下降恢复至正常水平，而MST4的mRNA水平迅速上调。在随后的48小时内，TNFα的mRNA维持正常水平，MST4的mRNA水平缓慢下降。IL-6的mRNA水平变化模式与TNFα及MST4类似，但其变化滞后数小时，其mRNA水平在6小时内上升约25％，在24小时后达到峰值。因而LPS刺激引起的MST4的mRNA水平变化及细胞因子表达与炎症反应有很强的关联性。

3.2 MST4表达水平的变化在免疫细胞中最为明显

为进一步验证MST4在免疫反应中的作用，我们检测了小鼠不同原发细胞系中LPS刺激引起的MST4的mRNA水平变化，包括动脉血管上皮细胞(AVEC)，肺泡上皮细胞(AEC)，肺成纤维细胞(LF)和肺泡巨噬细胞(AM)(Fig.2b)。与THP-1细胞中的结果一样，LPS刺激后3小时内，肺泡巨噬细胞中的MST4转录水平急剧下降，而后急剧上升，在12小时转录水平升高至8倍达到峰值，然后48小时内缓慢下降。相较于巨噬细胞，动脉血管上皮细胞(AVEC)，肺泡上皮细胞(AEC)和成纤维细胞(LF)的MST4转录水平在LPS刺激24小时后增加了约4倍，增幅较缓，而后缓慢下降。SL1344菌株感染小鼠后，其MST4转录水平也有类似变化(Fig.2c)。肺泡巨噬细胞中MST4的转录水平在感染后急剧下降约50％，而后急剧上升至9倍。动脉血管上皮细胞(AVEC)，肺泡上皮细胞(AEC)和成纤维细胞(LF)的MST4转录水平上升2-4倍，增幅较缓。以上结果印证了在LPS刺激和细菌感染的情况下，MST4的表达水平会发生明显改变，这种变化在免疫细胞，特别是巨噬细胞中尤为突出。

3.3 MST4表达水平在免疫器官中有明显改变

我们还分析了LPS刺激下，小鼠器官中MST4的表达水平(Fig.2d)。结果表明，MST4的表达水平在骨髓、脾脏和胸腺等免疫器官中有明显变化。肺部、胰腺、肝脏和淋巴结中的MST4表达水平变化较小。此外，LPS刺激后，MST4在其他实质器官如脑，心脏，肠道和肾脏的表达水平无明显改变。

说明MST4基因的表达水平可用于败血症、细菌性痢疾以及疟疾的早期诊断指标，通过调控MST4水平改善宿主过度免疫反应而用于败血症等感染性疾病的治疗。

实施例3 MST4负调控LPS或细菌诱导的TLR信号通路

1.实验目的

本实施例目的在于研究MST4对于免疫相关促炎症细胞因子表达的影响及信号通路的调控作用。

2.实验方法

2.1 慢病毒重组shMST4的制备

设计一段21个碱基的靶序列(shRNA)分别敲除MST4的编码区和非编码区，该序列可以形成反向互补的发卡状结构，沉默相关基因表达。MST4shRNA以及对照shRNA(scramble)连接至慢病毒载体pLKO.1-puro。shRNA(scramble)为对照。

人shMST4oligo-1(针对MST4编码区)

F

5′-CCGGCAGCAAGTCGTTGCTATTAAAATCTCGAGATTTTAATAGCTTCGACTTGCTGTTTTTG-3′(SEQ ID NO：63)

R

5′-AATTCAAAAACAGCAAGTCGTTGCTATTAAAATCTCGAGATTTTAATAGCTTCGACTTGCTG-3′(SEQ ID NO：64)

人shMST4oligo-2(针对MST4非编码区)

F

5′-CCGGTTCACCTGTATTCTAGTAAATGTCTCGAGACATTTACTACAATACACCTCAATTTTTG-3′(SEQ ID NO：65)

R

5′-AATTCAAAAATTCACCTGTATTCTAGTAAATGTCTCGAGACATTTACTACAATACACCTCAA-3′.(SEQ ID NO：66)

小鼠shMST4

F

5′-CCGGGCCTGGGATGCAGAATAATATAGCTCGAGCTATATTATTCTGCATCCCAGGCTTTTTG-3′(SEQ ID NO：67)

R

5′-AATTCAAAAAGCCTGGGATGCAGAATAATATAGCTCGAGCTATATTATTCTGCATCCCAGGC-3′(SEQ ID NO：68)

0.01M的正向和反向DNA链混合，稀释至50ul，经过如下反应：

95℃	5min
		70℃	10min
55℃	30min
		37℃	30min

退火连接为双链。双链DNA与pLKO.1-puro(EcoRI/AgeI双酶切)载体连接，转化DH5α，鉴定得到的阳性克隆经测序验证后提取质粒。将质粒转染293细胞，用2μg/ml puromycin筛选基因组稳定整合shRNA序列的细胞，48-72小时后，使用Vivaspin 20ml(SartoriusStedim Biotech,Aubagne,France)以3000g的离心力，离心50min，浓缩病毒液。

pLKO.1-puro质粒从中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所季红斌研究员处获得，为市售的构建RNAi的常用载体，可从Addgene公司购得。

将MST4的cDNA克隆至自失活慢病毒载体pLKO.1-EGFP中，过表达MST4，带有EGFP的空载体作为对照。

过表达的真核MST4载体Flag-MST4质粒从中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所赵允研究员处获得，质粒信息参见Shi Z,et al.(2013)Structure ofthe MST4in complex with MO25provides insights into its activationmechanism.Structure 21(3):449-461.。

2.2 基因转录水平的检测

THP-1细胞和PEM细胞提取总RNA方法如基本实验方法所述，样品扩增及检测方法如实施例1所述。THP-1细胞样品IL-6基因扩增PCR引物见表5，PEM细胞样品中TNFα、IL-6、IL-1基因扩增PCR引物见表8：

表8 引物序列

2.3 IKB表达水平的检测

采用免疫印迹的方法检测细胞中的IκBα的蛋白水平，免疫印迹的实验方法如基本实验方法4所述，IκBα抗体购自Cell Signaling(Danvers,MA)。IκBα蛋白水平的变化以免疫印迹结果的灰度值表征。

3.实验结果及分析

3.1 THP-1细胞中MST4对于促炎症细胞因子表达的影响

为检测MST4是否会促进促炎症细胞因子的产生以及NF-κB的激活，我们在THP-1细胞中过表达MST4或shMST4的重组慢病毒转染THP-1细胞。我们发现，过表达MST4使TNFα以及IL-6的mRNA及蛋白水平下调(Fig.3a-b’)。相反的，敲除MST4(shMST4的重组慢病毒转染)大大促进TNFα和IL-6的表达(Fig.3c-d’)。

3.2 PEM细胞中MST4对于促炎症细胞因子表达的影响

我们检测了小鼠腹腔巨噬细胞(PEM)被细菌感染后MST4的作用。与LPS刺激相同，感染大肠杆菌或SL1344菌株后，过表达MST4可以使PEM细胞中TNFα，IL-6和IL-1的转录水平明显下调(Fig.3e-g’)。

3.3 MST4参与调控天然免疫反应

我们检测了MST4对LPS刺激诱导的NF-κB激活的调控作用。我们检测了IKB的水平，发现在THP-1细胞中，过表达MST4使IKB的降解略有减少(Fig.3h,h’)。相反，敲除MST4，在LPS刺激后，IKB快速降解(Fig.3i,i’)。以上数据显示MST4很有可能负调控LPS和细菌诱导的天然免疫反应。

实施例4 MST4抑制LPS诱导的免疫应答的功能与其激酶活性相关

1.实验目的

本实施例目的在于研究MST4对免疫反应的调控是否与其激酶活性相关

2.实验方法

2.1 MST4突变体T187E及K53R的构建

MST4突变体K53R以Flag-MST4为模板，采用表9中SEQ ID NO：31～32所示引物进行PCR扩增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突变的野生型MST4模板，扩增获得带有特定位点突变的带有MST4基因的载体片段，将PCR产物转化DH5α感受态细胞，通过抗性筛选，获得的阳性克隆。

MST4突变体T178E以Flag-MST4为模板，采用表9中SEQ ID NO：33～34所示引物进行PCR扩增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突变的野生型MST4模板，扩增获得带有特定位点突变的带有MST4基因的载体片段，将PCR产物转化DH5α感受态细胞，通过抗性筛选，获得的阳性克隆。

表9 引物序列

2.2 shMST4沉默MEF细胞中MST4的表达的实验方法如实施例3所述。

2.3 TNFα、IL-6分泌表达的检测

收集细胞及培养液进行ELISA(酶联免疫吸附实验)检测细胞因子。人THP-1细胞中TNFα和IL-6的转录和分泌水平采用eBioscience试剂盒检测。小鼠MEF细胞中TNFα和IL-6的转录和分泌水平采用BD Bioscience试剂盒检测。检测方法按产品手册所述。

3.实验结果及分析

3.1 MST4突变体对于炎症细胞因子的表达及信号通路的影响

为研究MST4的激酶活性是否与其抑制LPS诱导的免疫应答有关，我们基于已解析的MST4结构及生化信息，构建了两个MST4突变体，即激酶激活突变体T178E(TE)激酶失活突变体K53R(KR)。通过检测THP-1细胞中TNFα和IL-6的转录和分泌水平，我们发现，相较于野生型，T178E突变体对于LPS诱导的NF-κB信号通路有着更强的抑制作用，IKB的降解也更多(Fig.4a,a’)。相对地，激酶失活突变体K53R对LPS诱导的NF-κB信号通路没有抑制作用，TNFα，IL-6以及IKB的水平与转染野生型没有显著差别(Fig.4b-c’)。我们进一步在小鼠胚胎成纤维细胞中证实了IKB的降解和p65的转运(Fig.4d,e)。以上实验结果说明，MST4的激酶活性对于其抑制LPS介导的NF-κB激活是必须的。

3.2 Rescue实验验证MST4突变体对于炎症细胞因子的表达及信号通路的影响

为研究MST4在天然免疫中的作用，我们在MEF细胞中转染了MST4的shRNA，沉默内源的MST4表达(Fig.4f)。该shRNA针对MST4的非编码区，不影响外源的野生型或突变型的MST4(Fig.4g)。MEF细胞中转染shMST4促进TNFα和IL-6的转录和分泌(Fig.4h-i’)。Rescue实验中，共同转染shMST4和T187E突变体抑制LPS诱导的细胞因子，其抑制效果比共同转染shMST4和野生型MST4更强，而K53R突变体对shMST4产生的抑制作用没有影响。以上实验结果说明，MST4的激酶活性对于其抑制LPS介导的NF-κB激活是必须的。

实施例5 MST4作用于TRAF6负调控免疫应答

1.实验目的

本实施例目的在于研究MST4通过TRAF6调控免疫应答。

2.实验方法

2.1 NF-κB荧光酶素报告体系

Flag-MyD88、Flag-IKKα、HA-p65和Flag-IRAK4从中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所王琛研究员处获得，质粒信息参见Sun S，et al.(2007)UXTis a novel and essential cofactor in the NF-κB transcriptionalenhanceosome.JCB 178(2)：231-244。

荧光酶素检测实验如基本实验方法6所述。

2.2 TRAF6-/-、TRAF6+/+的MEF细胞的构建

TRAF6-/-、TRAF6+/+的MEF细胞从北京大学蒋争凡教授处获得，细胞信息参见Jiang Z，et al.(2004)Toll-like receptor 3-mediated activation of NF-κB andIRF3diverges at Toll-IL-lreceptor domain-containing adapter inducing IFN-B.PNAS 101(10)：3533-3538。

2.3 载体构建

1)myc-TRAF6、His-TRAF6、myc-TRAF6(1-110)，myc-TRAF6(111-280)，myc-TRAF6(281-350)，myc-TRAF6(351-522)质粒的构建：以Flag-TRAF6为模板，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR

的作用下用对应的引物进行PCR扩增；PCR引物见表10，PCR反应体系见表11，PCR扩增程序见表12。

表10 引物序列

表11 PCR反应体系

表12 PCR扩增程序

扩增获得的片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳，确认大小与目的条带相同，切下胶，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP209)。TRAF6片段使用限制性内切酶EcoRI和XholI(thermo scientific)进行双酶切，酶切反应体系如表13所示，反应在37度进行2小时。

表13 片段酶切反应体系

酶切后，通过普通产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP204)，纯化获得酶切后的片段。His-TRAF6片段(NcoI/XholI双酶切)与HT-pET-28a(NcoI/XholI双酶切)，其余TRAF6片段(EcoRI/XholI双酶切)与pCDNA3.1载体(购自Addgene公司)(EcoRI/XholI双酶切)进行连接，连接体系表14所示，连接反应在室温(25℃)进行2小时。载体双酶切反应体系如表15所示，反应在37℃进行4小时。反应完成后使用天根普通产物纯化试剂盒纯化获得酶切后的载体。连接后的产物转化DH5α感受态细胞，通过抗性筛选，获得的阳性克隆。

表14 连接反应体系

表15 载体酶切反应体系

TRAF6(2A)突变体以野生型Myc-TRAF6为模板，采用表16中SEQ ID NO：47～50所示引物进行PCR扩增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突变的野生型MST4模板，扩增获得带有特定位点突变的带有TRAF6基因的载体片段，将PCR产物转化DH5α感受态细胞，通过抗性筛选，获得的阳性克隆。

表16 引物序列

2)MBP-MST4、Flag-MST4(1-297)，Flag-MST4(297-416)

MBP-MST4、MST4(1-297)、MST4(297-416)以Flag-MST4为模板，载体构建方法参见实施例5,2.4载体构建。PCR引物见表17，PCR反应体系见表11，PCR扩增程序见表12。

表17 引物序列

MBP-TRAF6片段(NcoI/XholI双酶切)与MBP-pET-28a(NcoI/XholI双酶切)，其余MST4片段(HindIII/SalI双酶切)与pCDNA3.1载体(购自Addgene公司)(HindIII/SalI双酶切)进行连接。

连接体系表14所示，连接反应在室温(25℃)进行2小时。载体双酶切反应体系如表15所示，反应在37℃进行4小时。反应完成后使用天根普通产物纯化试剂盒纯化获得酶切后的载体。连接后的产物转化DH5α感受态细胞，通过抗性筛选，获得的阳性克隆。

3)体外泛素化实验中Ub、UBE1、Ubc13和Uev1A从人cDNA中扩增获得，PCR引物见表18，PCR反应体系见表11，PCR扩增程序见表12。

表18 引物序列

上述片段(NcoI/XholI双酶切)与His-pET-28a(NcoI/XholI双酶切)。连接体系表14所示，连接反应在室温(25℃)进行2小时。载体双酶切反应体系如表15所示，反应在37℃进行4小时。反应完成后使用天根普通产物纯化试剂盒纯化获得酶切后的载体。连接后的产物转化DH5α感受态细胞，通过抗性筛选，获得的阳性克隆。体外表达上述蛋白用于体外泛素化实验。蛋白表达纯化方法如基本实验方法1所诉。

4)MBP-pET-28a以及His-pET-28a载体为实验室自行构建，质粒信息参见(Shi,Z.,et al.Structure of the MST4in complex with MO25provides insights into itsactivation mechanism.Structure 21,449-461，2013)

5)TRAF6-/-MEF细胞，细胞信息参见Jiang Z,et al.(2004)Toll-like receptor3-mediated activation of NF-κB and IRF3diverges at Toll-IL-1receptor domain-containing adapter inducing IFN-β.PNAS 101(10):3533-3538。

从北京大学蒋争凡教授处获得。

3.实验结果及分析

3.1 MST4通过TRAF6调控NF-κB信号通路

为进一步研究MST4的调控机制，我们在HEK293T细胞中转染了NF-κB荧光酶素报告基因，并转染不同剂量的MST4。MST4大大抑制了NF-κB的激活，并呈现剂量依赖的效果。NF-κB信号通路可以通过MyD88和TRAF6激活，IRAK、IKKα或p65也对该通路有少量的激活作用。这说明MST4可以通过MyD88或TRAF6，影响NF-κB的激活(Fig.5a)。TRA6作为MyD88的下游基因，对于MST4的激活作用比MyD88更强，因而我们研究了TRAF6是否对MST4的功能有影响。我们首先检测了MST4对于TRAF6诱导的NF-κB转录激活功能。TRAF6促进NF-κB的转录激活，而用特异的shRNA敲除MST4大大促进了这种激活效应(Fig.5b)。而后，我们研究了在TRAF6存在和缺失的不同条件下，MST4在MEF细胞中的功能。TRAF6-/-的MEF细胞在LPS的刺激下，TNFα和IL-6表达量明显减少，而TRAF6+/+的MEF细胞，在LPS刺激下，上述细胞因子有高表达(Fig.5c,c’)。

3.2 MST4的酶活影响其通过TRAF6对信号通路的调控作用

在TRAF6存在的情况下，过表达野生型的MST4或其激活状态的突变体T178E，而不是失活突变体K53R，在LPS刺激后，大大抑制TNFα和IL-6的分泌。但是，在缺失TRAF6的情况下，野生型的MST4或T178E突变体对于NF-κB通路的调控作用并没有明显差异(Fig.5c,c’)。以上结果说明TRAF6是MST4调控的LPS刺激引起的NF-κB通路激活以及细胞因子生成过程中不可或缺的关键因子。由于TRAF6是介导TLR，IL-1R，TNFR等多条重要通路的关键信号，我们检测了除LPS以外的其他刺激是否会激发MST4的调控作用。结果显示，MST4也可以抑制TNFα，IL-1和IL-6引起的NF-κB激活(Fig.5d)。此外，MST4的激酶活性对已抑制TNFα诱导的IL-6生成和KK磷酸化也是必须的(Fig.5e,f)。

3.3 MST4与TRAF6直接相互作用

为研究MST4是否直接与TRAF6相互作用，我们采用免疫共沉淀的方法和免疫印迹的方法。在293T细胞中，Myc抗体免疫沉淀外源的myc-TRAF6，并进一步共沉淀转染至细胞的Flag-MST4，而不能共沉淀载体(Fig.5g)。同样的，在THP-1细胞中，抗TRAF6的抗体，而不是对照的IgG抗体免疫沉淀内源的TRAF6，并与MST4蛋白相互作用，这说明内源的MST4可以与TRAF6相互作用(Fig.5h)。在LPS刺激下，MST4与TRAF6的相互作用增强，这与LPS刺激引起的MST4表达改变是一致的(Fig.5i)。此外，我们还检测了LPS刺激后小鼠体内MST4与TRAF6的相互作用。与THP-1细胞中的结果一致，在小鼠骨髓和肺部，内源的TRAF6与MST4相互作用(Fig.5j,k)。LPS注射后，MST4与TRAF6的相互作用增强，这与小鼠体内收到LPS刺激后MST4表达模式的变化也是一致。通过半定量的免疫荧光实验，我们进一步证明了体内MST4和TRAF6在THP-1细胞中存在相互作用(Fig.5l,l’)。

为进一步研究MST4与TRAF6的相互作用，我们纯化了带有MBP标签的MBP-MST4蛋白和带有His标签的His-TRAF6蛋白进行体外的pull-down实验。MSP-MST4蛋白先与MBP填料混合，再与His-TRAF6蛋白混合。MBP蛋白作为对照同样先与MBP填料混合，再与His-TRAF6蛋白混合。最后洗脱的蛋白通过SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色，发现MST4直接pull downTRAF6(Fig.5m)。以上结果说明，MST4直接与TRAF6相互作用。

3.4 MST4与TRAF6相互作用的具体区域

MST4具有三个结构域：激酶结构域(1-297)，连接区(298-346)和C端二聚化结构域(347-416)(Fig.6a,upper panel)。我们分别克隆了全长的MST4以及三个不同结构域的MST4的片段，连接至pCMV-C-Flag载体中，并转染293T细胞。采用Myc抗体检测细胞裂解液，我们发现全长的MST4以及(1-297)激酶结构域的MST4可以与TRAF6免疫共沉淀，而连接区(298-346)和C端二聚化结构域(347-416)的MST4不能(Fig.6b)。这说明MST4的激酶结构域与TRAF6相互作用。

TRAF6有四个结构域：N端的RING-finger结构域(1-110)，锌指结构域(111-280)，卷曲螺旋结构域(281-350),和C端TRAF结构域(351-522)(Fig.6a,lower panel)。我们分别构建了TRAF6四个不同结构域的载体，检测其与MST4的结合。这个TRAF6的载体与FLAG-MST4共同转染293T细胞。免疫共沉淀实验显示，野生型的TRAF6以及C端TRAF结构域可以与MST4相互作用，而其他的TRAF6结构域不能与MST4相互作用(Fig.6c)。

为进一步验证TRAF结构域与MST4的相互作用，我们采用体外pull-down实验，使用纯化的MST4蛋白和TRAF6的TRAF结构域蛋白。His-TRAF结构域蛋白与Ni-NTA填料混合再与MST4蛋白混合，最后洗脱的蛋白通过SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色。结果表明TRAF6的TRAF结构域可以直接pull down MST4蛋白(Fig.6d)。

以上结果说明，MST4与TRAF6可以直接相互作用，这两者相互作用的具体区域是MST4的激酶结构域和TRAF6的TRAF结构域。

3.5 MST4影响TRAF6的自身泛素化水平，该作用于MST4的激酶活性相关

如前所述，TRAF6的K63链自身泛素化是TRAF6激活的关键调控原件。我们研究了MST4是否影响TRAF6的泛素化水平。我们用1μg/ml的LPS处理THP-1细胞，分别处理不同的时间，免疫共沉淀TRAF6,然后采用免疫印迹的方法用特异的泛素化抗体检测。结果表明LPS处理10小时内，细胞内的TRAF6呈现不同程度的多泛素化，其中LPS处理45分钟后多泛素化的水平最高(Fig.6e)。而后，我们在HEK293细胞中转染了HA标签的K63链Ub和Myc标签的TRAF6。采用HA抗体，检测在转染和不转染Flag-MST4的情况下，TRAF6的泛素化水平。在未转染MST4的情况下，使用Myc抗体，采用免疫共沉淀和免疫印迹的手段检测发现，TRAF6有着较高的泛素化水平，而在转染MST4的情况下，TRAF6的泛素化水平明显下降(Fig.6f)。相应地，过表达MST4并不能影响TRAF6E3失活的C70A突变体的泛素化水平，这说明MST4影响TRAF6的自身泛素化(Fig.6g)。同样，敲除MST4可以促进TRAF6的泛素化(Fig.6h)。为排除MST4对于TRAF6泛素化水平的影响是由于HEK293细胞内其他因素造成。我们采用纯化的TRAF6蛋白在体外检测其自身泛素化水平。体外实验中采用Ubc13/Uev1A激活TRAF6的自身泛素化，MST4会降低TRAF6的自身泛素化水平，并呈现剂量依赖效应(Fig.6i)。其次我们检测了MST4对于TRAF6泛素化水平的调节是否与其激酶活性相关。结果表明，野生型的MST4会降低TRAF6的自身泛素化水平，而MST4激活突变体T178E作用更为明显。而激酶失活突变体K53R不会降低TRAF6的泛素化水平(Fig.6j)。这说明，MST4的激酶活动对于TRAF6泛素化水平的调节是必须的。此外，能激活MST4的蛋白MO25可以进一步增强MST4对TRAF6自身泛素化的抑制作用(Fig.6k)。同样，TRAF6下游激活IKK的重要底物NEMO的泛素化也被MST4抑制，且与MST4的激酶活性相关(Fig.6l)。以上结果说明MST4直接抑制TRAF6的自身泛素化，这种抑制作用依赖于MST4的激酶活性。

3.6 MST4磷酸化TRAF6的T463和T486

基于以上发现，我们推断MST4可能直接磷酸化TRAF6。我们在HEK293细胞中转染了Myc标签的TRAF6和Flag标签的MST4。转染后24小时，使用lambda蛋白磷酸酶处理细胞裂解液1小时，使用myc抗体进行免疫共沉淀。采用免疫印迹的方法和丝氨酸/苏氨酸磷酸化抗体，检测TRAF6的磷酸化水平。结果表明MST4可以提高TRAF6的磷酸化水平并呈现剂量依赖的效果，ambda蛋白磷酸酶可以抑制TRAF6的磷酸化。此外，敲除MST4降低TRAF6的磷酸化水平，敲除MST4后再过表达MST4可以恢复TRAF6的磷酸化(Fig.7a)。与细胞中的实验结果一致，小鼠中LPS刺激后TRAF6的丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平的变化与MST4的表达水平变化类似(Fig.7b)。接下来，我们研究了MST4影响TRAF6的具体区域。结果表明，MST4促进TRAF结构域的磷酸化水平，而对RING结构域的磷酸化水平没有影响。细胞内TRAF6的RING结构域的磷酸化受其他蛋白调控(Fig.7c)。

为研究MST4是否直接磷酸化TRAF6，我们采用体外激酶实验检测纯化的MST4是否能磷酸化TRAF6的TRAF结构域。TRAF6的TRAF结构域蛋白与Mg离子、[γ^-32P]ATP以及MST4孵育，孵育后的样品通过SDS-PAGE分离，再进行放射自显影检测。结果表明，MST4存在的情况下，TRAF结构域发生磷酸化。相反地，仅有Mg离子、[γ^-32P]ATP的TRAF6的TRAF结构域蛋白并未发生磷酸化(Fig.7d)。此外，MST4的失活突变体K53R不能磷酸化TRAF结构域。我们通过质谱检测磷酸化的TRAF结构域蛋白，确认其T463和T486两个位点为主要的磷酸化位点(Fig.7e,e’)。为验证这两个位点的磷酸化并研究其磷酸化对其细胞功能的影响，我们以TRAF6全长为模板设计了的T463A/T486A突变体，即TRAF6(2A)突变体。

免疫印迹的结果显示，相对于野生型的TRAF-C，在细胞中过表达TRAF-C(2A)突变体会减少TRAF6的丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平(Fig.7f)。值得注意的是，MST4并未改变转染至细胞的TRAF6(2A)的自身泛素化水平(Fig.7g)。随后，我们分析了，野生型和TRAF6(2A)突变体对NF-κB转录激活的影响。

3.7 MST4对TRAF6的磷酸化与其对TRAF6相关信号通路的调控作用有关

荧光酶素报告实验表明，在转染了TRAF6(2A)突变体的细胞中，MST4对NF-κB转录激活的抑制作用低于转染了野生型TRAF6的细胞(Fig.7h)。此外，TRAF6(2A)突变体的自身泛素化的催化活性和对NF-κB的激活均高于野生型TRAF6(Fig.7g,h)。为进一步验证MST4磷酸化TRAF6的T463和T486对于其功能的影响，我们检测TRAF6-/-MEF细胞中炎症细胞因子的生成。LPS刺激后，在TRAF6-/-MEF细胞中转染野生型TRAF，炎症细胞因子的生成仍被MST4抑制，而在TRAF6-/-MEF细胞中转染TRAF6(2A)突变体，TNFα和IL-6的表达并未受到影响(Fig.6i,i’)。综上所述，MST4通过直接磷酸化TRAF6的T463和T486，抑制TRAF6的信号通路激活。

TRAF6的TRAF结构域的自身寡聚对于TRAF6的自身磷酸化是必须的，根据之前解析的TRAF6和TRAF3结构，我们模拟了TRAF6TRAF-C结构域形成三体的结构，发现T463和T486邻近形成三体的界面，因而可以推断出T463和T486的磷酸化将影响TRAF6自身寡聚，进而影响TRAF6的自身磷酸化。

以上结果说明，在正常情况下，MST4的本底表达可以抑制TRAF6信号通路；在病毒感染的情况下，MST4的表达首先下调，使TRAF6激活(激活状态)，而后表达上调抑制过度的促炎症反应(抑制状态)。

实施例6 敲除MST4加剧感染性休克小鼠的免疫损伤

1.实验目的

本实施例目的在于研究MST4在小鼠模型中对免疫应答的调控。

2.实验方法

小鼠败血症模型的建立如基本实验方法11。肺部H&E染色实验方法如基本实验方法5所述。

3.实验结果及分析

3.1 小鼠败血症模型的建立

在前期实验中，我们对小鼠进行标准的静脉注射，持续7天注入慢病毒，以感染肺部和肝脏。但无法有效感染其他组织。为提高感染效率，我们改变了病毒载体，采用阳离子脂质体in

(Ployplus)将带有shRNA(所述shRNA的序列同实施例3)的病毒感染老鼠。该方法通常可以感染肝、肺、脾脏和其他组织。LPS诱导的小鼠败血症模型中，shRNA采用腹腔注射。

MST4的敲除效率在不同器官中有所差异，在肺，淋巴结核脾脏中有较好的敲除效率(Fig.8a),而且这种差异大致与IL-6在上述器官中的上调水平相近(Fig.8a-c)。这与我们之前观察到的MST4对于TRAF6信号通路的抑制具有剂量依赖效应是一致的，并进一步证实MST4在LPS诱导的免疫反应中的重要作用。

目前常见的在动物模型中诱导败血症的方法主要有三种:(1)采用外源毒素，如LPS(2)采用病原，如细菌和病毒(3)改变动物外部保护屏障，如盲肠结扎和穿刺(CLP)。

3.2 MST4敲除小鼠在感染性休克发生时，免疫炎症反应更为严重

为进一步验证MST4在体内对于炎症的负调控作用，我们采用了三种不同的败血症模型，分别采用LPS，SL1344和CLP建立败血症小鼠模型，MST4敲除均加剧上述小鼠的败血症(Fig.8d-f)。对肺部H&E染色进行组化分析发现，LPS和SL1344注射后，小鼠肺部形态学上出现明显的肺损伤，包括肺泡壁破坏和wide spread alveolar wall增厚伴随水肿和免疫细胞浸润(Fig.8g,h)。这些异常在MST4敲除的小鼠中更为严重。腹膜中巨噬细胞浸润在MST4敲除的小鼠中也更为严重，浸润的巨噬细胞数目明显增高LPS升高1.42倍,SL1344升高1.56倍,而CLP升高1.31倍(Fig.8i)。此外，MST4敲除小鼠中血液中细胞因子的表达，包括TNFα，IL-1和IL-6在LPS,SL1344和CLP刺激后均有升高趋势(Fig.8j-l)。

实施例7MST4在巨噬细胞中作用于TRAF6减少免疫损伤

1.实验目的

本实施例目的在于研究MST4在巨噬细胞免疫调节中的作用。

2.实验结果及分析

3.1 巨噬细胞的敲除

如前所述，MST4的表达水平会响应TLR信号通路，尤其是在诸如巨噬细胞的免疫细胞中。为进一步研究MST4在巨噬细胞中的重要性，我们通过巨噬细胞敲除实验检测了LPS刺激后，MST4敲除小鼠的生存情况(Fig.9a)。采用氯膦酸盐脂质体敲除巨噬细胞，2天后，用流式细胞仪通过检测F4/80的表达确定敲除效果。F4/80是目前已知的小鼠巨噬细胞和血液单核细胞最好的标记分子，结果显示氯膦酸盐脂质体敲除了脾脏中约90％的巨噬细胞(Fig.9b)。

3.2 MST4通过巨噬细胞和TRAF6减少免疫损伤

敲除巨噬细胞从根本上抑制了LPS诱导的MST4敲除小鼠的促炎症反应，细胞敲除小鼠与mock以及MST4敲除小鼠的生存没有显著差别。(p＝0.0720)(Fig.9c)。而与保留巨噬细胞的小鼠有明显差异(p＝0.0119),这表明巨噬细胞与LPS刺激引起的MST4抗炎症反应有关。我们进一步通过细胞过继移植的方法研究shMST4构建的小鼠模型中巨噬细胞的作用。(Fig.9d)无意义对照组小鼠LPS刺激后的生存率为32％，而shMST4处理巨噬细胞的实验组小鼠LPS刺激后生存率仅为7％。因而，以上结果说明MST4主要通过巨噬细胞调控炎症反应。为进一步验证MST4通过TRAF6调控TLR诱导的免疫应答，我们用TRAF6+/-小鼠研究MST4在败血症休克中的功能(Fig.9e,f)。我们的结果表明与TRAF6+/+MST4KD敲除小鼠相比，TRAF6+/-MST4敲除小鼠在LPS刺激后并未出现更为严重的症状，这说明MST4通过TRAF6发挥免疫调控功能。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (1)

1.分离的MST4基因在制备或筛选败血症治疗药物中的用途。

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