KR101474333B1 - 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 및 치료용 조성물{A composition for preventing and treating liver cancer comprising hepatocystin}

본 발명은 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

일차 간암은 비정상적인 간세포가 억제되지 않은 성장을 할 때 일어난다. 다른 많은 형태의 암과는 다르게 간암이 발병하여 사망하는 사람들의 숫자는 증가하고 있다. 간경화와 간염을 포함한 만성 간질환을 앓는 많은 환자들은 간암에 걸릴 위험성이 증가한다. 미국에서 일차 간암의 발병률은 1975년에서 1995년 사이에 71퍼센트가 증가했고 간암으로 진단받은 환자들의 숫자도 매년 꾸준히 증가하고 있다. 2002년도에 미국 암학회(American Cancer Society)는 일차 간암과 쓸개관 암의 16,600가지 새로운 사례가 미국에서 진단될 것이고 14,100명의 미국인이 이 질병으로 사망할 것이라고 추정했다.

아이와 성인 모두에게서 볼 수 있는 일차 간암의 가장 일반적인 형태는 간세포성 암이며, 이는 전체 간암의 80에서 90퍼센트를 차지한다. 간세포성 암은 확산형, 열성, 담즙정체성 등을 포함하여 몇몇 별개의 임상 형태를 보인다. 간모세포종은 상대적으로 희귀하고 대부분 종종 어린 아이들에게 영향을 미치는 간암의 또 다른 형태이다.

대부분의 간암에 있어서 예후는 드물다. 현재의 치료요법들은 간암을 치료하는데 있어서 제한된 효과만을 나타내고 있을 뿐이다. 인터페론이 비록 모발상세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병 그리고 흑색종과 같은 다른 형태의 암의 치료에 성공적으로 사용되어오긴 했지만, 간의 고형 종양은 인터페론의 치료에 덜 민감했고 그것은 아마도 인터페론이 혈액으로부터 빠르게 제거되기 때문인 것으로 보인다. 더구나 인터페론 치료는 암 치료에 필요한 수준의 투여량에서 종종 역효과와 독성을 나타낸다. 그리하여 간암을 예방하거나 치료하는 치료제를 개발할 필요성이 존재하여 왔다.

B형 간염 바이러스(HBV) X 단백질 (HBx) HBV-유도 간세포암(HCC) 뿐만 아니라 HBV 복제에서도 중요한 역할을 한다. HBx는 여러 전사 인자의 활성화, 프로테오좀 활성의 저해 및 바이러스 복제에 필요한 세포 주기의 조절을 야기하는 몇 종의 세포 단백질과 상호작용을 한다. 그러나 HBV 감염의 병인 및 숙주-바이러스 상호작용의 기작에 대해서는 거의 알려지지 않았다.

HBV X (HBx) 단백질은 바이러스 및 많은 숙주 세포 유전자의 트랜스액티베이터로서 중요한 역할을 한다. 따라서 HBx는 바이러스 복제에서 중심적인 역할을 하는 것으로 생각되고 감세포암의 발생에 관련된다(Lucifora, J., Arzberger, S., Durantel, D., Belloni, L., Strubin, M., Levrero, M., Zoulim, F., Hantz, O., and Protzer, U. (2011) J Hepatol 55, 996-1003;Keasler, V. V., Hodgson, A. J., Madden, C. R., and Slagle, B. L. (2007) J. Virol 81, 2656-2662;Kremsdorf, D., Soussan, P., Paterlini-Brechot, P., and Brechot, C. (2006) Oncogene 25, 3823-3833).

또 헤파토시스틴은 단백질 kinase C 기질로서 원래는 동정되었다(19). 그것은 C 말단 부위에서 endoplasmic reticulum (ER) retention 신호를 가지는 글루탐산과 아스파틱산이 풍부한 수용성 단백질을 코딩하는 의 조절 소단위체로서 작용한다(Trombetta, E. S., Simons, J. F., and Helenius, A. (1996) J. Biol . Chem . 271, 27509-27516).

관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제10-2005-0083678호는 아시알로-인터페론과 간암의 치료에 관한 것으로 간암의 치료를 위하여 아시알로-인터페론-알파, 아시알로-인터페론-알파2a, 아시알로-인터페론-알파2b, 아시알로-인터페론-베타, 아시알로-인터페론-베타1a, 아시알로-인터페론-베타1b, 그리고 아시알로-인터페론-감마를 포함하는 아시알로인터페론을 준비하고 이용하는 방법을 나타낸다고 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 간암 치료제를 제공하는 것이다'

본 발명의 다른 목적은 HBV 복제를 억제하는 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 B형 간염 바이러스 감염 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 헤파토시스틴은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 서열번호 1에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 및 전좌를 유발하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

또 본 발명은 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 복제 억제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 X 단백질 분해 촉진용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 2에 기재된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 서열번호 2에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 및 전좌를 유발하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

본 발명에서 “간암”이란 비정상적으로 조절되지 않는 증식을 하는 간의 조직 또는 세포(즉, 간세포)의 장애를 의미한다. 그러나 간암이란 간 세포성암에 국한되지 않고 확산 간세포성암, 열성 간세포성암, 담즙정체성 간세포성암, 간모세포종, 간선암종 그리고 국소 결절 과다 형성증 등을 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 주사나 주입 또는 삽입(피하주입, 정맥내 주입, 근육내 주입, 복막내 주입 또는 이와 같은 것)에 의해 약의 형태나 제형 또는 적합한 운반 수단에 의해 혹은 편리하고 비독성이며 제약적으로 받아들일 수 있는 운반체나 보조약을 포함하는 삽입물에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 그러한 조성물의 제형과 준비는 제약 제형 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 제형들은 또한 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra에서 찾을 수도 있다.

비경구적 사용을 위한 조성물들은 단위량 투약 형태(예를 들어 일회 분량의 앰플)나 몇 회분을 포함하는 작은 병 그리고 적절한 부형제가 첨가된 형태(아래에서 보듯이)로 제공되기도 한다. 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 주입 장치 또는 삽입을 위한 운반 장치의 형태로 있을 수도 있고, 사용 전에 물이나 또 다른 적합한 용액에 타서 원래대로 되게 하도록 건조분말 형태로 존재하기도 한다. 활성 있는 본 발명의 단백질과는 별도로, 조성물은 비경구적으로 적합한 운반체들 그리고/또는 첨가제들을 포함하기도 한다. 본 발명의 조성물은 미세구, 미세캡슐, 나노입자, 리포솜 또는 조절된 방출을 위해 그와 비슷한 것들 속으로 편입되기도 한다. 더 나아가 조성물은 현탁시키거나 용해하거나 안정화하거나 pH를 맞추는 물질, 긴장성을 맞추는 물질, 그리고/또는 분산시키는 물질을 포함할 수도 있다.

위에서 가리킨 대로 본 발명에 따른 제약적 조성은 무균상태의 주입에 적합한 형태이다. 그러한 조성물을 준비하기 위해 적합한 활성도를 갖는 본 발명의 단백질이 비경구적으로 적합한 용액에 용해되거나 현탁되어야 한다. 적합한 매개체와 사용되는 용매 사이에는 물이 쓰이는데, 물은 적절한 양의 염산이나 수산화나트륨 또는 적합한 완충용액, 1,3-부탄디올(butandiol), 링거(Ringer) 용액, 그리고 등장성의 염화나트륨 용액과 포도당 용액의 첨가로 알맞은 pH로 맞추어야 한다.

용액 형태의 형성은 하나 혹은 그 이상의 부형제(메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트)를 포함할 수도 있다.

조성물 중 하나가 물에 거의 녹지 않거나 약간만 녹는 경우, 용해도 증가제나 용해제가 첨가될 수도 있고 또는 용매가 프로필렌 글리콜(propylen glycol)및 그와 같은 것의 10-60% w/w를 포함하기도 한다.

본 발명의 조성물의 “유효량(effective amount)”이란 홀로 또는 본 발명에 따른 조합에 따라, 생체 내에서 종양의 성장을 억제하는데 요구되는 물질의 양을 말한다. 종양(즉, 암)의 치료적 처리를 위해 본 발명을 위해 실행하는데 사용되는 활성도 있는 물질의 유효량은 투약 방법, 나이, 체중, 그리고 개인의 일반적인 건강상태에 따라 변한다. 결국 치료하는 의사나 수의사가 적절한 양과 처방 계획을 결정할 것이다. 간암의 치료를 위한 본 발명의 유효성분의 단백질의 유효량은 1회 분량당 0.005, 0.01, 0.02,0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.133mg정도로 적은 양이 되기도하고 1회 분량당 0.15, 0.399, 0.5, 0.57, 0.6, 0.7, 0.8, 1.0,1.25, 1.5, 2.0, 2.5mg정도로 많은 양이 되기도 한다. 투약은 하루에 한 번, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일 또는 21일에 한 번으로 이루어질 수 있다. 간암을 치료하는데 투여되는 단백질의 양은 그들의 활성도에 기초한다.그것은 세포증식이나 종양 크기를 효과적으로 줄이는데 충분한 양이다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 본 발명자들은 HBx 단백질의 분해에서 헤파토시스틴의 새로운 기능을 발견하였다. 헤파토시스틴은 HBx와 상호작용을 하여서 ubiquitin-독립적인 proteasome 경로를 통하여 그것의 분해를 촉진하였다. HBx 및 헤파토시스틴 사이의 상호작용은 HBx-의존적인 HBV 복제를 저해하였다.

본 발명에서는 친화 정제 및 질량 분광법을 간암 세포에서 상호작용을 하는 숙주 인자를 동정하기 위하여 적용하였다. 13종의 단백질을 HBx 결합 파트너로 동정하였다. 그들 중에서, 본 발명자들은 먼저 HBx 및 헤파토시스틴 사이의 상호작용의 기능적 중요성을 결정하는데 초점을 두었다. HBx 및 헤파토시스틴 사이의 물리적 상호작용을 동시면역침전법 및 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다. 면역조직화학은 HBx 및 헤파토시스틴이 원형질에 같이 존재한다는 것을 나타내었다. 양 단백질들의 도메인 맵핑은 HBx C-말단(아미노산 110-154)이 헤파토시스틴의 mannose 6-phosphate 수용체 호모로지 도메인(amino acids, 419-525)에 대한 결합에 관여한다는 것을 보여준다. 번역 및 proteasome 저해제를 사용하여, 본 발명자들은 헤파토시스틴 과발현이 ubiquitin-독립적인 경로를 통해서 HBx 분해를 가속화한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이 효과는 두 단백질들 사이의 상호작용에 의하여 매개된다는 것을 HBx 결손 돌연변이체를 사용하여 나타내었다. 헤파토시스틴 과발현은 HBV DNA 복제를 현저하게 저해하고 HBx 분해에 수반되는 바이러스 항체의 복제 및 발현을 억제하였다. HBx에 결합하는 헤파토시스틴 돌연변이체 구축물을 사용하여, 본 발명자들은 헤파토시스틴이 HBx-의존적 HBV 복제를 저해한다는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 발명자들은 최초로 헤파토시스틴이 HBx 분해를 촉진하여 원형질에서 쉐프론 유사 분자로 작용하고 그것에 의하여 HBV 복제를 저해한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 헤파토시스틴을 유도하는 것이 HBV 감염의 조절을 위한 새로운 치료적 접근방법이라는 것을 시사한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

면역침전 및 MS 에 의한 HBV X-상호작용 단백질의 동정

본 발명자들은 간세포에서 HBV X (HBx) 단백질과 상호작용하는 세포 단백질을 동정하기 위하여 IP-coupled 질량분광법을 채택하였다. HA-tagged HBx (HBx)를 코딩하는 플라즈미드 또는 HA 서열만을 코딩하는 empty 벡터(vector)를 코딩하는 플라즈미드를 세포에 트랜스팩션시켰다. 그 후, HBx 및 그것의 관련 단백질들을 세포 파쇄액으로부터 anti-HA 친화 레진을 사용하여 정제하였다. 그 단백질을 SDS-PAGE 상에서 분리하여 Coommasie Blue 염색으로 관찰하였다. 도 1은 해리된 단백질들의 SDS-PAGE 프로파일을 나타낸다. 벡터 및 HBx 레인 모두에서 공통 밴드로 인하여, HBx 단백질은 SDS-PAGE 상에서 현저하지 않았지만, 본 발명자들은 anti-HA 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅을 사용하여 HBx 단백질 밴드를 확인하였다(데이터 도시 안함). 두 독특한 밴드들이 HBx 레인에서 검출되었다(도 1A). 본 발명자들은 벡터 및 HBx 레인으로부터 그 두 밴드를 잘라서 트립신으로 in-gel 처리를 수반한 LC-MS/MS를 사용하여 그것들을 분석하였다. 이 LC-MS/MS 스펙트럼을 SEQUEST 알고리즘을 사용하여 NCBI human RefSeq 단백질 서열 데이터베이스(date 2012.09.23/34699 단백질 entries)에 대해서 검색하였다. 본 발명자들은 단백질 동정화의 신뢰도를 개선하기 위하여 PeptideProphet 확률 > 95% 및 ProteinProphet 확률 > 99%을 사용하여 펩타이드를 입증하였다. 본 발명자들은 HBx 레인에서 두 특정 밴드로부터 13 단백질들을 동정하였다(표 1). 이들 단백질 대부분은 분자 세프론으로 관련된다. 본 발명자들은 Grp78 및 헤파토시스틴와 같은 ER 세프론을 얻었다(도 1 및 표 2). 본 발명자들은 간세포에서 헤파토시스틴이 풍부하므로 HBx 및 헤파토시스틴 사이에 상호작용을 입증하기 위한 노력을 하였고 이 단백질이 HBV-관련 간 질환에서 병인학적(etiological)인자일 수 있다는 가정을 하였다.

표 1은 IP-질량 분광법에 의한 HBx 와 상호작용하는 단백질을 동정한 표이다.

표 2는 IP-질량 분광법에 의한 HBx 와 상호작용하는 단백질로 헤파토시스틴의 동정 표이다.

HBx 는 원형질에서 헤파토시스틴와 특이적으로 상호작용을 하고 동위치에 존재함

본 발명자들은 HA-tagged HBx를 코딩하는 플라즈미드로 트랜스팩션된 Huh-7 세포로부터 전체 세포 파쇄액을 추출하고,HBx 및 헤파토시스틴 사이에 상호작용을 입증하기 위하여 anti-HA 항체로 웨스턴 블럿팅을 수반하는 anti-헤파토시스틴 항체를 사용하여 IP를 수행하였다. HBx는 세포 파쇄액에서 내생적인 헤파토시스틴와 관련된다(도 2A 상단 패널). 역으로 본 발명자들은 웨스턴 블럿팅을 위하여 anti-헤파토시스틴 및 anti-HA 항체를 사용하여 헤파토시스틴을 검출하였다 (도 2A 중앙 패널).

다음, 본 발명자들은 anti-헤파토시스틴 항체의 잠재적인 비특이적인 활성을 회피할 수 있기 때문에 세포에서 HBx로 상호작용을 확인하기 위하여 Flag-tagged 헤파토시스틴을 코딩하는 플라즈미드를 제조하였다. 본 발명자들은 Flag-tagged 헤파토시스틴 및 HA-tagged HBx를 코딩하는 플라즈미드로 코트랜스팩션된 HepG2 세포로부터 추출된 세포 파쇄액을 사용하여 anti-HA 항체로 웨스턴 블럿팅 및 anti-Flag로 면역침전을 수행하였다. 도 2B에서 나타낸 것과 같이, HBx는 두 단백질들이 HepG2 세포에서 동시발현될 때 헤파토시스틴과 현저하게 상호작용을 하였다. 이러한 결과는 HBx가 헤파토시스틴과 특이적으로 상호작용을 한다는 것을 시사한다.

다음 본 발명자들은 면역형광 현미경법을 사용하여 면역조직화학에 의하여 헤파토시스틴와 HBx의 동위치화를 조사하였다. Flag-tagged HBx를 코딩하는 플라즈미드를 Huh-7 세포에 트랜스팩션하고 그 핵을 DAPI로 염색하였다. HBx는 주로 핵보다는 원형질에 존재하였다(도 2C). HBx의 작지만 뚜렷한 부분이 원형질에서 내생적 헤파토시스틴와 동위치에 존재하였다(도 2C). 본 발명자들은 HA-tagged HBx 및 Flag-tagged 헤파토시스틴의 동시발현 하에서 면역조직화학을 수행하였다. HBx 및 헤파토시스틴의 동시발현 하에서, HBx는 원형질에서 헤파토시스틴과 동위치에 존재하였지만 동시존재 패턴은 작은 수의 트랜스팩션된 세포에서만 관찰되었다(도 2D). HBx의 발현 패턴은 동시발현 세포에서 원형질을 통하여 분산되고 비입자적 분포로 변하였다(도 2D). 이 HBx의 위치화는 헤파토시스틴 및 HBx 사이의 상호작용으로부터 온 것이고, 이 결과들은 원형질에서 HBx와 상호작용하고 동위치에 존재한다는 것을 나타낸다.

헤파토시스틴은 그것의 MRH 도메인을 통하여 HBx 의 C 말단 도메인과 상호작용을 함

IP는 헤파토시스틴: HBx-M1 (51-154), HBx-M2 (1-110), 및 HBx-M3 (51-80의 결손)과 상호작용과 관련된 HBx 결합 도메인을 동정하기 위하여 HBx의 일련의 결손 돌연변이체를 사용하여 수행하였다 (도 3A). HepG2 세포에서 각 돌연변이체와 Flag-tagged 헤파토시스틴 로 코트랜스팩션 연구는 HBx-M2 (1-110)를 제외한 모든 HBx 단백질들이 헤파토시스틴에 결합하는 것을 나타내었다(도 3B). 이 데이터들은 HBx C 말단 도메인(아미노산 110-154)이 헤파토시스틴과 결합에 필요하다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 HBx 상호작용에 필요한 헤파토시스틴 도메인을 정의하기 위하여 결손 돌연변이체를 제조하고 HBx에 대한 그들의 결합 활성을 테스트하였다(도 3C). HepG2 세포에서 각 Flag-tagged 헤파토시스틴 돌연변이체와 HA-tagged HBx로 코트랜스팩션 연구는 모든 헤파토시스틴 돌연변이체는 HBx와 결합하고 특히,헤파토시스틴의 가장 짧은 C 말단 도메인(419-525)이 HBx와 상호작용을 한다는 것을 나타내었다(도 3D). 동시침전된 HBx 단백질의 양은 헤파토시스틴 돌연변이체의 정류상태(steady state) 수준에 비례하였고 그것은 헤파토시스틴 MRH 도메인이 HBx 상호작용에 관련된다는 것을 시사한다.

헤파토시스틴 의 과발현은 HBx 단백질의 분해를 촉진

HBx와 헤파토시스틴 상호작용의 기능적 결론을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 트랜지언트 트랜스팩션된 HepG2 hepatoma 세포에서 발현 수준에 대한 헤파토시스틴의 효과를 조사하였다. 도 4A 상단 패널에서 나타낸 것과 같이,헤파토시스틴 발현은HBx 단백질 레벨을 현저하게 감소시켰지만 트랜스팩션 대조군으로 사용된 GFP 단백질은 그러하지 않았다. 유사한 결과를 Huh-7 hepatoma 세포에서 얻었다(도 4A 하단 패널). 이들 데이터는 헤파토시스틴의 이소성 발현은 HBx 단백질 레벨을 감소시킨다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 내생적인 헤파토시스틴이 HBx 단백질 레벨에 영향을 주는지를 결정하기 위하여 siRNA(small interfering RNA )를 사용하여 내생적인 헤파토시스틴 발현을 넉다운하였다. HA-tagged HBx 발현 벡터 및 헤파토시스틴 siRNA로 코트랜스팩션된 세포에서, 헤파토시스틴 넉다운은 HBx 단백질 레벨을 현저하게 증가시켰지만 , HBx mRNA를 그러하지 않았다(도 4B). 이 결과들은 헤파토시스틴이 전사 후 단계에서 HBx 발현을 조절한다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 헤파토시스틴이 어떻게 HBx 단백질의 레벨을 조절하는지를 조사하기 위하여 새로운 단백질 합성을 봉쇄하는 CHX로 처리 후 헤파토시스틴 을 가지거나 가지지 않은 HBx 단백질의 반감기를 결정하였다. 도 4C에 나타낸 것과 같이, 헤파토시스틴의 동시발현은 대조군 벡터와 비교하여 CHX로 처리한 후 HBx 단백질의 안정성을 크게 감소시켰다. 본 발명자들은 HBx 단백질의 헤파토시스틴-유도된 불안정화에 대한 저해제의 효과를 평가하였다. HBx 및 헤파토시스틴으로 코트랜스팩션된 HepG2 세포를 proteasome 저해제, MG132로 처리한 후, HBx 단백질 레벨을 웨스턴 블럿 분석에 의하여 측정하였다. 헤파토시스틴에 의한 HepG2의 억제는 MG132 처리에 의하여 효과적으로 봉쇄되었다(도 4D). 이 결과들은 헤파토시스틴이 proteasome-매개된 분해 경로를 통하여 HBx 단백질의 분해를 촉진한다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 헤파토시스틴-유도된 HBx 분해가 ubiquitin-의존적인 경로에 의하여 매개되는지를 결정하기 위하여 His-tagged ubiquitin발현 벡터로 트랜스팩션된 세포에서 HBx ubiquitination을 조사하였다. 본 발명자들은 anti-HA 항체로 IP를 수행한 후 anti-His 항체로 웨스턴 블럿 분석을 하였다. 도 4E에 나타낸 것과 같이, 헤파토시스틴 과발현은 ubiquitinated HBx의 추가적인 증가를 야기하지 않았지만 그것은 ubiquitinated 및 전체 HBx 단백질 레벨 모두를 약하게 감소시켰다. 이 결과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 헤파토시스틴-유도된 HBx 분해에 대한 PYR-41(E1 저해제)의 효과를 조사하였다. PYR-41로 처리는 HepG2 세포에서 HBx의 HBx-유도된 분해를 회복하지 못한다(도 4F 상단 패널). 유사한 결과를 Huh-7 세포를 사용한 실험에서 얻었다(도 4F 하단 패널). 주지된 ubiquitination 기질인 IkB-a의 레벨은 양성 대조군에와 같이 증가하였다(도 4G). 이 결과들은 HBx의 헤파토시스틴-매개된 불안정화는 ubiquitination 독립적인 것을 시사한다.

HBx 단백질의 헤파토시스틴 -유도된 분해는 물리적인 상호작용에 의하여 매개되고 헤파토시스틴의 N 말단 CR 도메인이 필요로 함

본 발명자들은 헤파토시스틴 및 HBx 사이의 상호작용이 HBx 분해의 가속화에 관여하는지를 조사하였다. 다른 헤파토시스틴 결합 친화도를 나타내는 HA-tagged HBx 돌연변이체를 사용하여(도 3B), 본 발명자들은 웨스턴 블럿 분석에 의하여 각 HBx 단백질의 안정성을 조사하였다. 헤파토시스틴 발현은 전장 HBx 및 M1 돌연변이체의 레벨을 현저하게 감소시켰다. 그러나 헤파토시스틴과 상호작용하지 아니하는 M2 HBx 돌연변이체의 레벨은 헤파토시스틴 과발현에 의하여 영향이 없었다(도 5A). 이 결과는 HBx 분해는 헤파토시스틴 및 HBx 사이의 물리적인 상호작용에 의하여 매개된다는 것을 시사한다 .

HBx 분해 촉지에 관여하는 헤파토시스틴 도메인을 결정하기 위하여, 여러 Flag-tagged 헤파토시스틴 돌연변이체를 HA-tagged HBx 벡터와 HepG2 세포로 코트랜스팩션시켰다. 도 5B에 나타낸 것과 같이, HBx 단백질 레벨은 전장 헤파토시스틴의 발현에 의하여서만 현저하게 억제되고, N-말단 결손 헤파토시스틴 돌연변이체(M1 및 M2)의 발현에 의하여서는 그러하지 아니하였다. 이 데이터는 비록 헤파토시스틴 MRH 도메인이 HBx와 상호작용에 관여하지만(도 3D), CR(complement-like repeated )을 포함한 N-말단 헤파토시스틴 부위는 HBx 분해에 중요하다는 것을 시사한다.

헤파토시스틴의 과발현은 HBx -의존적 HBV 복제를 저해함

HBx는 마우스 모델, 1차 간세포 및 HepG2 세포에서 HBV 복제에 필수적이다. 본 발명자들은 HBx 단백질들을 불안정화한다는 것을 보였다; 따라서 본 발명자들은 HBx-의존적 HBV 복제에서 헤파토시스틴의 역할을 조사하였다.플라즈미드 기반 HBV 복제 분석을 위해서 HBx-결손 HBV1.2 (X-) 벡터를 HBx-반응성 HepG2 세포주에 트랜스팩션시켰다. HBx 발현의 결손은 HBV DNA 복제 및 HBs 발현에서 현저한 감소를 야기하였고 이것은 HBx를 동시발현시켜서 거의 야생형 수준으로 회복되었다(도 6A). 전장 헤파토시스틴의 과발현은 HBx-assisted HBV 복제를 HBx 분해를 수반하는 HBx-결손 바이러스 수준으로 감소시켰다 (도 6A). 이 결과는 HBx의 헤파토시스틴-유도된 불안정화가 HBx-의존적 HBV 복제의 저해를 야기한다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 헤파토시스틴의 항바이러스 효과가 야생형 HBV 감염에 대한 생리적인 유의성을 가지는지를 결정하기 위하여 replication-competent 야생형 HBV 구축물 HBV1.2mer 플라즈미드를 사용하여 헤파토시스틴의 항바이러스 효과를 조사하였다. 헤파토시스틴의 과발현은 야생형 HBV의 복제 및 HB 항원의 발현을 크게 감소시켰고(도 6B), 헤파토시스틴-유도된 항바이러스 반응은 천연 HBV 감염 동안 생리적인 관련성을 가진다는 것을 시사한다.

헤파토시스틴 넉다운이 HBx 단백질의 수준을 증가시켰기 때문에 본 발명자들은 HBV 복제에 대한 내생적 헤파토시스틴 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 헤파토시스틴 siRNA 및 야생형 HBV로 트랜스팩션된 HepG2 세포를 사용하여 서던 블럿 분석을 수행하였다. 헤파토시스틴의 다운 조절은 야생형 HBV 단독에서와 비교하여 야생형 HBV 복제의 추가적인 증가를 야기하지 않았다. 이 결과는 야생형 바이러스로부터 발현된 HBx 수준이 이 시스템에서 최대 HBV 복제에 충분하다는 것을 시사한다.

본 발명에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 헤파토시스틴이 HBV에 대한 항바이러스 치료제로 적용될 수 있다는 증거를 제공한다. 본 발명을 통하여 헤파토시스틴이 그것의 상호작용을 통하여 HBx 단백질을 불안정화한다는 것을 알 수 있다. 본 발명은 현재 뉴크레오타이드 유사체에 대한 저항성을 극복할 수 있는 새로운 항바이러스제의 개발에 도움이 될 것이다.

도 1은 IP-MS 분석에 의한 HBx-상호작용 단백질들의 동정을 나타내는 그림. A, HA-tagged HBx (HBx)를 코딩하는 플라즈미드 또는 pcDNA empty 벡터(vector)로 트랜스팩션된 Huh-7 세포를 anti-HA 친화 레진을 사용하여 면역침전을 위하여 사용하였다. 용출된 단백질들을 12% SDS-PAGE로 분리하고 Coomassie Blue 염색을 수행하였다. 예측한 HBx 밴드를 검은색 화살표로 표시하였다. HBx 레인에 특이적인 두 밴드를 1 및 2로 표시하였다. 분자량 마커들(in kDa)의 상대적인 이동을 왼쪽에 나타내었다. B, MS 분석에 의하여 동정된 그것의 펩타이드(밑줄)를 가지는 헤파토시스틴 서열(NCBI 유전자 no. 48255889)의 배열. C, 헤파토시스틴의 ETMVTSTTEPSR 펩타이드에 해당하는 precursor 이온의 MS/MS 스펙트럼.해당 피크 값을 가지는 b 및 y 이온을 표시함.
도 2는 원형질 내에서 HBx 가 헤파토시스틴과 상호작용하고 동위치에 존재한다는 것을 나타내는 그림. A, 내생적인 헤파토시스틴과 HBx의 Co-IP. HA-tagged HBx를 코딩하는 플라즈미드 또는 pcDNA3.1 empty 벡터(vector)를 Huh-7 세포에 트랜스팩션한 후 24시간 후, 세포 파쇄액(Lysate)을 anti-80K-H 항체 항체(상단 패널) 또는 anti-HA 항체(중앙 패널)로 면역침전하였다. 단백질들을 좌측에 기재된 항체로 웨스턴 블럿(WB)에 의하여 검출하였다. 하단 패널은 세포 파쇄액에서 각 단백질의 발현 수준을 나타낸다. B, Flag-tagged 헤파토시스틴과 HA-tagged HBx의 Co-IP. 기재된 플라즈미드를 HepG2 세포에 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포 파쇄액을 anti-Flag 항체로 면역침전시켰다(상단 패널). 단백질들을 좌측에 기재된 항체로 웨스턴 블럿(WB)에 의하여 검출하였다. 세포 파쇄액을 트랜스팩션된 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 탐침하였다(하단 패널). C, 내생적인 헤파토시스틴과 HBx의 동위치화를 나타낸 그림. HA-tagged HBx를 코딩하는 플라즈미드 또는 pcDNA 벡터(vector)를 Huh-7 세포에 트랜스팩션한 후 24시간 후, 세포들을 anti-80K-H 및 anti-Flag 항체를 사용하여 내생적인 헤파토시스틴 (녹색) 및 Flag-tagged HBx (적색)(상단에 나타냄)를 검출하기 위하여 면역조직화학을 수행하였다. 핵의 위치는 DAPI (청색)에 의하여 나타내고, 합쳐진 이미지는 우측 패널에 나타내었다. D, Flag-tagged 헤파토시스틴과 HA-tagged HBx의 동위치화를 나타냄. 기재된 플라즈미드를 HepG2 세포에 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포 를 anti-HA (녹색) 및 anti-Flag (적색)항체(상단에 나타냄)로 면역염색하였다.합쳐진 이미지는 우측 패널에 나타내었다.
도 3은 HBx 및 헤파토시스틴 사이에 상호작용에 대한 도메인 맵핑
A, 본 발명에 사용된 HBx 및 그것의 잘린 돌연변이체의 도식적인 묘사. 모든 돌연변이체를 그들의 C말단에서 HA tag와 융합하였다. 헤파토시스틴에 대한 HBx의 결합 활성을 우측에 나타냄. B, HA-tagged HBx 돌연변이체와 Flag-tagged 헤파토시스틴의 Co-IP. 기재된 플라즈미드를 HepG2 세포에 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포 파쇄액을 anti-Flag 항체로 면역침전시켰다(상단 패널).단백질들을 기재된 항체로 WB에 의하여 검출하였다. 세포 파쇄액을 트랜스팩션된 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 탐침하였다(하단 패널). C, 본 발명에 사용된 헤파토시스틴 및 그것의 잘린 돌연변이체의 도식적인 묘사. signal peptide (SP), complement-like repeated (CR), mannose 6-phosphate receptor homology (MRH), 및 C-terminal HDEL ER retention 신호 펩타이드에 대한 헤파토시스틴 도메인을 나타냄. 모든 클론을 그들의 C 말단에서 Flag tag으로 융합하였다. HBx과 헤파토시스틴의 결합 활성을 우측편에 나타냄. D, Flag-tagged 헤파토시스틴의 여러 돌연변이체와 HA-tagged HBx의 Co-IP. 기재된 플라즈미드를 HepG2 세포에 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포 파쇄액을 anti-Flag 항체로 면역침전시켰다(상단 패널).단백질들을 기재된 항체로 WB에 의하여 검출하였다. 세포 파쇄액을 트랜스팩션된 유전자들의 발현 수준을 확인하기 위하여 탐침하였다.
도 4는 헤파토시스틴이 proteasome-의존 경로를 통하여 HBx 단백질 분해를 촉진한다는 것을 나타낸 그림. A, HBx 단백질의 안정성에 대한 헤파토시스틴 과발현의 효과. HepG2 (상단 패널) 및 Huh-7 (하단 패널) 세포들을 HA-tagged HBx 및 Flag-tagged 헤파토시스틴으로 코트랜스팩션시켰다. EGFP 발현 벡터를 트랜스팩션 효율을 모니터하기 위하여 내부 대조군으로 코트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포를 파쇄하고, 기재된 항체로 WB에 의하여 검출하였다. B, HBx 단백질의 안정성에 대한 내생적 헤파토시스틴의 효과. HepG2 세포를 HA-tagged HBx, 대조군 GFP siRNA, 및 헤파토시스틴 siRNA로 코트랜스팩션시켰다(상단에 도시). 트랜스팩션 48시간 후 HepG2 세포 일부로부터 분리된 전체 RNA를 헤파토시스틴, HBx, 및 GAPDH에 대한 프라이머 쌍으로 RT-PCR로 분석하였다(상단 패널). HepG2 세포의 또 다른 부분은 파쇄하고, 기재된 항체로 웨스턴 블럿에 의하여 분석하였다(하단 패널). C, 헤파토시스틴이 HBx 단백질의 턴오버를 가속한다는 것을 나타내는 그림. HepG2 세포를 HA-tagged HBx 및 Flag-tagged 헤파토시스틴으로 코트랜스팩션킨 다음 24시간 후, 세포를 기재된 시간 간격 동안 CHX (50 mg/ml)로 처리하고 Western 불럿을 수행하였다. 그래프는 software Multi Gauge (Version 3.2)를 사용한 베타-액틴에 대하여 표준화한 후 잔존 HBx 수준의 정량을 나타낸다. D, 헤파토시스틴-유도된 HBx 분해에 대한 proteasome 저해제 MG132의 효과. HepG2 세포를 HA-tagged HBx 및 Flag-tagged 헤파토시스틴으로 코트랜스팩션시켰다. EGFP 발현 벡터를 트랜스팩션 효율을 모니터하기 위하여 내부 대조군으로 코트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포를 대조군 DMSO (-) 또는 25 mM MG132 (+)으로 추가적으로 5시간 동안 처리하였다. 세포를 파쇄하고, 기재된 항체로 WB에 의하여 분석하였다. E, HBx ubiquitination에 대한 헤파토시스틴의 효과. His-tagged ubiquitin, HA-tagged HBx, 및 Flag-tagged 헤파토시스틴에 대한 플라즈미드를 HepG2 세포로 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 48시간 후, 세포를 대조군 DMSO (-) 또는 25 mM MG132 (+)으로 추가적으로 5시간 동안 처리하였다. 세포를 1% SDS 존재하에서 5분간 가열하여 파쇄하였다. 그 변성된 파쇄액을 anti-HA 항체로 면역침전하였다. 그 후 그 면역침전체를 anti-His 항체(상단 패널)을 사용하여 WB에 의하여 분석하였다. F, HBx ubiquitination에 대한 ubiquitin-활성화 효소의 저해제인 PYR-41의 효과. HepG2 (상단 패널) 및 Huh-7 (하단 패널) 세포를 HA-tagged HBx 및 Flag-tagged 헤파토시스틴으로 코트랜스팩션킨 다음 24시간 후, 세포를 5시간 동안 PYR-41 (25 mg/ml)로 처리하고 기재된 항체를 사용하여 Western 불럿을 수행하였다. G, 양성대조군으로 IkB-a 안정성에 대한 PYR-41의 효과.
도 5는 헤파토시스틴의 N말단 도메인이 HBx 단백질의 분해에 필요하다는 것을 나타낸 그림. A, HBx 단백질의 헤파토시스틴-유도된 분해는 단백질들 사이의 상호작용에 이하여 매개되는 것을 나타냄. HA-tagged HBx 돌연변이체 및 Flag-tagged 헤파토시스틴에 대한 플라즈미드를 HepG2 세포에 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포를 파쇄하고, 기재된 항체로 WB에 의하여 분석하였다. B, HBx 분해의 촉진에 관여하는 헤파토시스틴 기능적 도메인의 맵핑. Flag-tagged 헤파토시스틴 돌연변이체 및 HA-tagged HBx에 대한 플라즈미드를 HepG2 세포에 트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 24시간 후, 세포를 파쇄하고, 기재된 항체로 WB에 의하여 분석하였다.
도 6은 헤파토시스틴이 HBx-의존 HBV 복제를 저해한다는 것을 나타낸 그림. A, HepG2 세포를 HBx-negative HBV1.2 (X-), HA-tagged HBx, 및 Flag-tagged 헤파토시스틴 플라즈미드로 코트랜스팩션시켰다. 트랜스팩션 4일 후, HBV DNA 복제 중간체를 원형질 nucleocapsid로부터 분리하여 동위원소 표지 HBV DNA 프로브를 사용한 서던 블럿에 의하여 분석하였다. relaxed circular (RC), double stranded (DS) DNA, 및 single-stranded (SS) DNA에 대한 위치를 표시하였다. 단백질들을 기재된 항체를 사용하여 Western 불럿에 의하여 조사하였다. B, HepG2 세포를 야생형 HBV1.2mer 및 Flag-tagged 헤파토시스틴 플라즈미드로 코트랜스팩션시켰다. HBV DNA 복제 및 단백질 발현을 실시예에 기재된 것과 같이 결정하였다. Large HB 항원(LHBs), middle HB (MHBs), 및 small HBs (SHBs)를 우측에 표시하였다(하단 패널).

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

하기 항체를 본 발명에 사용하였다: anti-HA 항체(Sigma, St. Louis, MO, USA), anti-헤파토시스틴 항체 (Proteintech, Chicago, IL, USA), anti-Flag M2 항체 (Sigma), anti-actin 항체 (Sigma), anti-HBV surface (HBs) 항체 (Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-GFP 항체 (Clontech/Takara Bio, Mountain View, CA, USA), 및 anti-His 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2차 항체 및 Alexa fluor 546 goat anti-mouse IgG 2차 항체는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. horseradish peroxidase 부착된 Anti-mouse 및 anti-rabbit 항체는 Sigma로부터 구입하였다. proteasome 저해제 MG132는 Calbiochem (La Jolla, CA)로부터 구입하였다. DAPI 핵 염색 시약은 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)로부터 구입하였다. 단백질 번역 저해제 cycloheximide (CHX) Sigma로부터 구입하였다.. HA-tagged 및 Flag tagged HBx를 코딩하는 HBx-HA 및 HBx-Flag 플라즈미드는 pcDNA3.1 vector (Invitrogen)에 Lim, K. H., Kim, K. H., Choi, S. I., Park, E. S., Park, S. H., Ryu, K., Park, Y. K., Kwon, S. Y., Yang, S. I., Lee, H. C., Sung, I. K., and Seong, B. L. (2011) PLoS One. 6, e22258에 기재된 것과 같이 삽입하였다. C-말단 HA-tag를 가지는 HBx 결손 돌연변이체(M1, M2, 및 M3)는 주형으로 HBx-HA를 사용하여 도 3A에 기재된 것과 같이 pcDNA 3.1 벡터로 서브클로닝하였다. 인간 헤파토시스틴 유전자는 hepatoma Huh-7 cell cDNA 라이브러리를 사용하여 증폭하였다. C-말단 Flag-tag를 가지는 결손 돌연변이체(M1, M2, 및 M3) 및 전장 야생형 헤파토시스틴를 도 3C에 기재된 것과 같이 pcDNA 3.1 벡터의 BamH I/Xba I 부위로 삽입하였다. EGFP-N1 플라즈미드는 Clontech/Takara Bio로부터 구입하였다. His-Ub 플라즈미드는 pcDNA 3.1 벡터로 ubiquitin 유전자 잘편을 삽입하여 구축하였다. 복제-competent HBV 구축물, HBV1.2 (strain ayw) 및 HBx-결손 HBV 구축물, HBV1.2 (X-)은 Cha, M. Y., Ryu, D. K., Jung, H. S., Chang, H. E., and Ryu, W. S. (2009) J. Gen . Virol . 90, 978-986은 기재되었고, 연세대학교 Dr W.S. Ryu로부터 제공받았다. 모든 플라즈미드는 엔도톡신-free 플라즈미드 Midi prep kit (Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan)을 사용하여 정제하고 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 헤파토시스틴 (GGAAGAAGUCUCUGGAAGATT) 및 GFP에 대한 미리 고안된 음성 대조군 siRNA는 ST Pharm Co. (Seoul, Korea)에 의하여 합성하였다.

실시예 1:세포 배양 및 트랜스팩션

인간 hepatoma 세포주(HepG2 및 Huh-7)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. . Huh-7 및 HepG2 세포들은 10% 열 불활성화된 우태아 혈청, penicillin, 및 streptomycin이 보충된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 5% CO₂ 환경에서 37℃에서 유지하였다. 트랜지언트 트랜스팩션 또는 코트랜스팩션을 제조업자의 지시에 따라서 Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)을 사용하여 50-70% 컨프루언시에서 수행하였다. 플라즈미드 DNA의 양은 모든 트랜스팩션 실험에서 empty 벡터를 사용하여 표준화하였다.

실시예 2:면역침전법

상기 언급된 구축물로 트랜지언트하게 트랜스팩션된 모든 세포를 면역침전(IP) 파쇄 버퍼( 프로에이즈 저해제 칵테일을 포함하는 50 mM Tris-HCl at pH 7.2, 10 mM NaCl, 1% NP-40)로 파쇄하였다. 파쇄액을 단백질 G agarose (Sigma)로 4℃에서 1시간 동안 미리정제하였다. 그 정제된 파쇄액을 anti-Flag M2 (Sigma), anti-헤파토시스틴 (Santa Cruz Biotechnology), 또는 anti-HA (Sigma) 항체로 4℃에서 오버나잇 배양한 후 4시간 동안 단백질 G agarose로 4℃에서 처리하였다. 그 agarose를 IP 파쇄 버퍼로 3회 세척하고 가열하였다. 그 가열된 샘플을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하고 Western blot 분석 또는 질량 분광기(MS) 분석을 수행하였다. 세포를 수집하기 전에 모든 IP 과정에서 세포를 5시간 동안 25 μM MG132로 처리하였다.

실시예 3: In - gel digestion 및 액체 크로마토그래피- electrospray ionization tandem MS ( LC - ESI - MS / MS ) 분석

각 면역침전된 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 Coommasie Blue Staining Reagent으로 염색하였다. 단백질 밴드들을 젤로부터 잘라서 Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., and Mann, M. (2006) Nat. Protoc. 1, 2856-2860에 기재에 따라서 in-gel 트립신 처리를 수행하였다. in-gel 트립신 처리에 의하여 생성된 트립신 절단된 펩타이드를 Eksigent-Nano-Ultra-UPLC (Eksigent Technologies, Dublin, CA, USA)와 연결된LTQ-XL MS (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA)로 분석하였다. 트립신 절단된 펩타이드를 C₁₈ regular 5 ㎛ 크기 레진이 충진된 trap 컬럼(100 ㎛ x 1.5 cm; 직접제작)에 로딩하고 그 펩타이드를 20분간 300 nL/min의 유속으로 선형 구배 5-40 % 용매 B (0.1 % formic acid in ACN)로 용출하였다. 그 용출된 펩타이드를 분석 컬럼(75 ㎛ x 10 cm;직접제작)으로 분리하고 그 분리된 펩타이드 이온을 2.0 kV electrospray 전압을 가지는 나노-ESI 소스로 분사하였다. 모든 MS/MS 스펙트럼을 35% 표준화된 충돌 에너지를 가지는 full MS 스캔으로부터 사용된 세 가장 풍부한 스펙트럼을 데이터-독립적인 스캔 모드에서 얻었다. 동적 배제에 대한 반복 duration은 30 s, 반복 카운트는 1로 세팅, 동적 배제 duration은 180 s에 세팅, 동적 배제 리스트는 50, 그리고 배제 mass width는 1.5 Da이었다.

실시예 4:단백질 및 펩타이드의 동정

얻어진 MS/MS 스펙트럼을 Bioworks software (v. 3.3.1)내 Extract_Msn으로 생성하고 하기 파라미터: 효소 = 트립신, 전구체 tolerance = 2 Da, 절편 tolerance = 1 Da, Met에 대한 산화(+16 Da), Cys에 대한 알킬화(+57 Da), missed 절단의 수 = 2를 사용한 Bioworks software (v. 3.3.1)내 SEQUEST로NCBI 인간 RefSeq 단백질 서열 데이터베이스(date 2012.09.23/34699 단백질 entries)에 대해서 검색하였다. 결과 MS/MS 스펙트럼을 입증하고 펩타이드를 확률 threshold에 기반한 Scaffold 3 (Proteome Software, Portland, OR, USA)을 사용하여 동정하였다. 본 발명자들은 > 95% PeptideProphet probability 및 99% ProteinProphet probability을 가지는 펩타이드 리스트를 얻었다(Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. (2002) Anal. Chem. 74, 5383-5392).

실시예 5: 웨스턴 블럿 분석

세포를 SDS 파쇄 버퍼(100 mM Tris at pH 8.0, 10% glycerol, 및 1% SDS)에서 수집하였다. 세포를 5분 동안 가열해서 파쇄하였고, 그 파쇄액을 -80℃에서 동결하거나 즉시 사용하였다. 단백질 농축물을 bicinchoninic acid 방법(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 정량화하였다. 단백질들을 1X 샘플 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 6.8, 1% SDS, 5% glycerol, 0.05% bromophenol blue, 및 1% 베타mercaptoethanol)에서 5분간 가열하고 SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 단백질들을 Immobilon-P 막(Millipore Corp., Bedford, MA, USA)으로 전달하고 기재된 항체로 0.05% Tween 20 및 1% 탈지분유를 포함하는 Tris-buffered 식염수에서 4℃에서 오버나잇 블럿팅하였다. 막을 상온에서 1시간 동안 horseradish peroxidase-부착된 항체로 배양하고 그 신호를 enhanced chemiluminescence (Pierce)를 사용하여 검출하였다. 그 밴드 신호를 LAS-4000 Luminescent Image Analyzer를 사용하여 검출하고 Multi Gauge 소프트웨어(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석하였다.

실시예 6:면역조직화학

Huh-7 세포를 Flag-tagged HBx 플라즈미드 또는 HA-tagged HBx 및 Flag-tagged 헤파토시스틴 플라즈미드 모두로 트랜스팩션하였다. 트랜스팩션 48시간 후, 그 세포들을 상온에서 3.7% paraformaldehyde (Sigma)로 15분간 고정하고 PBS로 세척한 후, 콜드 챔버에서 5분간 0.1% Triton X-100 용액으로 흡수시켰다. Flag-tagged HBx 단백질과 내생적인 헤파토시스틴의 동위치화를 조사하기 위하여 그 세포를 상온에서 1시간 동안 anti-헤파토시스틴 항체 (1:500 희석; Proteintech) 및 anti-Flag 항체 (1:500 희석)로 배양하였다. HA-tagged HBx와 코트랜스팩션된 Flag-tagged 헤파토시스틴의 동위치화를 조사하기 위하여 그 세포를 상온에서 1시간 동안 anti-Flag 항체 및 anti-HA 항체 (1:500 희석)로 배양하였다. PBS로 3회 세척 후 그 세포를 Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG 2차 항체 (1:500 희석) 및 Alexa Fluor 546 anti-mouse IgG 2차 항체 (1:500 희석)으로 상온에서 40분간 배양하였다. PBS로 3회 세척 후, DAPI 용액(1 mg/ml)을 핵 염색에 사용하였다. 형광 이미지를 얻었고 Carl Zeiss Axiovert 200 현미경 및 소프트웨어 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 사용하여 분석하였다.

실시예 7: RNA 분리 및 역전사 중합효소 연쇄반응( RT - PCR )

전체 RNA를 제조업자의 지시에 따라서 HepG2 및 Huh-7 세포로부터 Trizol reagent (Invitrogen)을 사용하여 분리하였다. 그 cDNA를 oligo-dT 프라이머(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 M-MLV reverse transcriptase (Intron Biotechnology, Daejeon, Korea)로 4 마이크로그램의 전체 RNA으로부터 합성하였다. 하기 PCR 프라이머를 사용하였다. 헤파토시스틴 유전자 증폭용: 5'-GGC GTC TCC CTC ACC AAT CAT C-3' (sense), 5'-TCT CCT CCC GTG CCT TCT TCC AGT-3' (anti-sense). HBx 유전자 증폭용: 5'-AAA AAG TTG CAT GGT GCT GGT GAA C-3' (sense), 5'-GCG CGG GAC GTA CTT TGT-3' (anti-sense).GAPDH 유전자 증폭용: 5'-CGT CTT CAC CAC CAT GGA GA-3' (sense), 5'-CGG CCA TCA CGC CAC AGT TT -3' (antisense). 헤파토시스틴 및 GAPDH를 증폭하기 위하여 수행된 PCR은 24 사이클의 변성 95℃, 30 s, 어닐링 60℃, 30 s, 그리고 확장 72℃, 60 s. HBx 증폭용 : 35 사이클의 변성 95℃, 30 s, 어닐링 62℃, 30 s, 및 확장 72℃, 60 s. 그 PCR 산물은 1.5% agarose 젤 상에서 전기영동으로 조사하였다 .

실시예 8:인 비보 ubiquitination 분석

HepG2 세포를 His-tagged ubiquitin, HA-tagged HBx, 및 Flag-tagged 헤파토시스틴 발현 플라즈미드로 트랜스팩션시켰다. proteasome 저해제 MG132 (25 mM) (Calbiochem)을 세포 수집 5시간 전에 첨가하였다. 그 다음 세포를 SDS 파쇄 버퍼로 파쇄하고 5분간 가열하였다. 그 파쇄액을 1 mM DTT (Sigma)를 포함하는 IP 파쇄 버퍼로 1:5로 희석하였다. 샘플을 anti-HA 항체로 IP를 수행하고 anti-His 항체를 사용하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다.

실시예 9:서던 블럿 분석

HBV1.2 또는 HBV1.2 (X-)를 Lipofectamine 2000 reagent을 사용하여 HBx-responsible HepG2 세포로 트랜스팩션하였다. 세포를 트랜스팩션 4일 후 스크래핑하여서 모으고 HEPES 버퍼(10 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 1% NP-40)로 파쇄하였다. 그 세포 파쇄액을 트랜스팩션된 플라즈미드 DNA를 제거하기 위하여 반응 버퍼(500 mM CaCl₂ 및 800 mM MgCl₂)에서 37℃에서 DNase I (1.5 U; Clontech/Takara) 및 mung bean nuclease (7.5 U; Clontech/Takara)으로 15분간 처리하였다. 코어 입자를 polyethylene glycol (PEG) 용액(1.2 M NaCl, 60 mM EDTA, 30% sucrose, 26% PEG 8000)으로 침전시켰다. 이 단계를 얼음에서 2시간 배양 후 반복한 후 그 캡시드를 Proteinase K (20 mg/ml; Roche Applied Science, Indianapolis, IN)로 37℃에서 2시간 동안 SDS의 존재하에서 처리하였다. HBV DNA를 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 정제된 DNA를 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. 막으로 옮긴 후, HBV DNA를 고 순도 랜덤화된 HBV 프로브로 검출하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A composition for preventing and treating liver cancer comprising hepatocystin <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Met Cys Trp Ala Val Glu 1 5 10 15 Val Lys Arg Pro Arg Gly Val Ser Leu Thr Asn His His Phe Tyr Asp 20 25 30 Glu Ser Lys Pro Phe Thr Cys Leu Asp Gly Ser Ala Thr Ile Pro Phe 35 40 45 Asp Gln Val Asn Asp Asp Tyr Cys Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu 50 55 60 Pro Gly Thr Ala Ala Cys Pro Asn Gly Ser Phe His Cys Thr Asn Thr 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Pro Leu Tyr Ile Pro Ser Asn Arg Val Asn Asp Gly Val 85 90 95 Cys Asp Cys Cys Asp Gly Thr Asp Glu Tyr Asn Ser Gly Val Ile Cys 100 105 110 Glu Asn Thr Cys Lys Glu Lys Gly Arg Lys Glu Arg Glu Ser Leu Gln 115 120 125 Gln Met Ala Glu Val Thr Arg Glu Gly Phe Arg Leu Lys Lys Ile Leu 130 135 140 Ile Glu Asp Trp Lys Lys Ala Arg Glu Glu Lys Gln Lys Lys Leu Ile 145 150 155 160 Glu Leu Gln Ala Gly Lys Lys Ser Leu Glu Asp Gln Val Glu Met Leu 165 170 175 Arg Thr Val Lys Glu Glu Ala Glu Lys Pro Glu Arg Glu Ala Lys Glu 180 185 190 Gln His Gln Lys Leu Trp Glu Glu Gln Leu Ala Ala Ala Lys Ala Gln 195 200 205 Gln Glu Gln Glu Leu Ala Ala Asp Ala Phe Lys Glu Leu Asp Asp Asp 210 215 220 Met Asp Gly Thr Val Ser Val Thr Glu Leu Gln Thr His Pro Glu Leu 225 230 235 240 Asp Thr Asp Gly Asp Gly Ala Leu Ser Glu Ala Glu Ala Gln Ala Leu 245 250 255 Leu Ser Gly Asp Thr Gln Thr Asp Ala Thr Ser Phe Tyr Asp Arg Val 260 265 270 Trp Ala Ala Ile Arg Asp Lys Tyr Arg Ser Glu Ala Leu Pro Thr Asp 275 280 285 Leu Pro Ala Pro Ser Ala Pro Asp Leu Thr Glu Pro Lys Glu Glu Gln 290 295 300 Pro Pro Val Pro Ser Ser Pro Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 305 310 315 320 Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ser Glu 325 330 335 Val Gln Gly Glu Gln Pro Lys Pro Ala Ser Pro Ala Glu Glu Asp Lys 340 345 350 Met Pro Pro Tyr Asp Glu Gln Thr Gln Ala Phe Ile Asp Ala Ala Gln 355 360 365 Glu Ala Arg Asn Lys Phe Glu Glu Ala Glu Arg Ser Leu Lys Asp Met 370 375 380 Glu Glu Ser Ile Arg Asn Leu Glu Gln Glu Ile Ser Phe Asp Phe Gly 385 390 395 400 Pro Asn Gly Glu Phe Ala Tyr Leu Tyr Ser Gln Cys Tyr Glu Leu Thr 405 410 415 Thr Asn Glu Tyr Val Tyr Arg Leu Cys Pro Phe Lys Leu Val Ser Gln 420 425 430 Lys Pro Lys Leu Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Gly Thr Trp Gly Ser 435 440 445 Trp Ile Gly Pro Asp His Asp Lys Phe Ser Ala Met Lys Tyr Glu Gln 450 455 460 Gly Thr Gly Cys Trp Gln Gly Pro Asn Arg Ser Thr Thr Val Arg Leu 465 470 475 480 Leu Cys Gly Lys Glu Thr Met Val Thr Ser Thr Thr Glu Pro Ser Arg 485 490 495 Cys Glu Tyr Leu Met Glu Leu Met Thr Pro Ala Ala Cys Pro Glu Pro 500 505 510 Pro Pro Glu Ala Pro Thr Glu Asp Asp His Asp Glu Leu 515 520 525 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Val Tyr Arg Leu Cys Pro Phe Lys Leu Val Ser Gln Lys Pro Lys 1 5 10 15 Leu Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Gly Thr Trp Gly Ser Trp Ile Gly 20 25 30 Pro Asp His Asp Lys Phe Ser Ala Met Lys Tyr Glu Gln Gly Thr Gly 35 40 45 Cys Trp Gln Gly Pro Asn Arg Ser Thr Thr Val Arg Leu Leu Cys Gly 50 55 60 Lys Glu Thr Met Val Thr Ser Thr Thr Glu Pro Ser Arg Cys Glu Tyr 65 70 75 80 Leu Met Glu Leu Met Thr Pro Ala Ala Cys Pro Glu Pro Pro Pro Glu 85 90 95 Ala Pro Thr Glu Asp Asp His Asp Glu Leu 100 105

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 복제 억제용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 헤파토시스틴은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 복제 억제용 조성물.
5. 헤파토시스틴을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 감염 치료용 약학 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 헤파토시스틴은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 감염 치료용 약학 조성물.
7. 서열번호 2에 기재된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간암 예방 및 치료용 약학 조성물.
   

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