JP2009523156A - 癌の処置のためのγ線照射と組み合わせた化合物の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】ＴＰＰＩＩ（トリペプチジルペプチダーゼＩＩ）阻害剤は、γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させるために有用である。適当な化合物には、一般式Ｒ^Ｎ１Ｒ^Ｎ２Ｎ−Ａ^１−Ａ^２−Ａ^３−ＣＯ−Ｒ^Ｃ１のトリペプチド化合物が含まれ、Ｒ^Ｎ１、Ｒ^Ｎ２、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３およびＲ^Ｃ１は本明細書で定義された通りであり、その例としては、例えばトリペプチド配列ＧＬＡおよびＧＰＧが含まれる。γ線照射と併用した処理の間、ＴＰＰＩＩ阻害剤を注射したマウスで、完全なｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍退縮が観察される。
【選択図】

Description

本発明は、癌の処置のためのγ線照射と組み合わせた化合物の使用に関する。

癌療法の分野において、アポトーシス耐性は、通常、照射療法耐性、即ち、癌細胞がγ線照射に遭遇しても死に至らないことの原因となる現象である。癌患者の腫瘍は当初はしばしば処置に応答し、療法への耐性を獲得するのは後になってからのことである。腫瘍細胞の療法耐性は、療法の失敗および患者の死亡の非常に一般的な原因である。

今回、本発明者らは、特定の化合物を用いてγ線照射癌療法を強化できることを発見した。本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ損傷応答およびｉｎ ｖｉｖｏでの癌療法耐性におけるＴＰＰＩＩ（トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ）の役割に関する本発明者らの研究に由来する。ＴＰＰＩＩは、ショウジョウバエからヒトまでの多細胞生物で発現される、独特の１３８ｋＤａサブユニットで構築される。ショウジョウバエからのデータは、ＴＰＰＩＩ複合体が、約６ＭＤａの本来の構造物と２つのねじれた鎖を形成する、反復サブユニットからなることを示唆する。ＴＰＰＩＩは、唯一の既知のサイトゾルサブチリシン様セリンペプチダーゼである。細菌のサブチリシンは完全に研究された酵素であり、結晶構造および酵素機能に関する多数の報告がある（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．、Ｂｅｇ，Ｑ．Ｋ．およびＬｏｒｅｎｚ，Ｐ．、２００２、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１５〜３２）。

したがって、第１の態様から、本発明は、γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させることにおける使用のための化合物を提供し、前記化合物はＴＰＰＩＩ阻害剤である。

本明細書で用いるように、用語「癌療法」は、癌性の病状の処置、ならびに前癌状態の予防療法および治療を含む。

本明細書で用いるように、用語「腫瘍細胞」は、癌性または前癌性の細胞を含む。そのような細胞は、癌性または前癌性の欠陥を有することがある。したがって、細胞は、悪性の進行に特徴的な１つまたはいくつかの変化を獲得していることがある。

本発明は、γ線照射耐性の腫瘍の処置を可能にするだけでなく、γ線照射で処置可能な腫瘍においてさえ、より低い用量のγ線照射の使用を可能にする点で有利である。

さらなる態様から、本発明は、γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させるために用いる化合物を提供し、前記化合物は下記式（ｉ）
（ｉ）Ｒ^Ｎ１Ｒ^Ｎ２Ｎ−Ａ^１−Ａ^２−Ａ^３−ＣＯ−Ｒ^Ｃ１
から選択されるか、その薬学的に許容される塩であり、上式で、Ａ^１、Ａ^２およびＡ^３は、標準の１文字略語または名称に従う以下の定義を有するアミノ酸残基であり：
Ａ^１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ^２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチンまたはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ｒ^Ｎ１およびＲ^Ｎ２は、それぞれペプチドのＮ末端に結合し、同じであるかまたは異なり、それぞれ独立して
Ｒ^Ｎ３、
（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
ＣＯ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
ＣＯ−Ｎ−（（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３）Ｒ^Ｎ４、または
ＳＯ_２−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３
であり、
（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
Ｒ^Ｎ３およびＲ^Ｎ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキル、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
ベンジル、
フェニル、
ナフチル、
単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル
のいずれかであり、Ｒ^Ｎ３および／またはＲ^Ｎ４には、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
ヒドロキシ−、
チオ−、
アミノ−、
カルボン酸、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルオキシ、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルエステル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキルエステル
フェニル、
単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、
非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル、または
ハロゲン
でよく、Ｒ^Ｃ１はトリペプチドのＣ末端に結合され、
Ｏ−Ｒ^Ｃ２、
Ｏ−（リンカー２）−Ｒ^Ｃ２、
Ｎ（（リンカー２）Ｒ^Ｃ２）Ｒ^Ｃ３、または
Ｎ（リンカー２）Ｒ^Ｃ２−ＮＲ^Ｃ３Ｒ^Ｃ４
であり、（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、またはＣ_１〜６アルキルもしくはＣ_２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
Ｒ^Ｃ２、Ｒ^Ｃ３およびＲ^Ｃ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキル、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
ベンジル、
フェニル、
ナフチル、
単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル
のいずれかであり、Ｒ^Ｃ２および／またはＲ^Ｃ３および／またはＲ^Ｃ４には、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
ヒドロキシ−、
チオ−、
アミノ−、
カルボン酸、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルオキシ、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルエステル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキルエステル
フェニル、
ハロゲン、
単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル
の１つまたは複数でよい。

式（ｉ）の一般式で示されるＮおよびＣＯは、それぞれアミノ酸残基Ａ^１の窒素原子およびアミノ酸残基Ａ^３のカルボニル基である。

さらなる態様から、本発明は、γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させる方法であって、それを必要とする患者にＴＰＰＩＩ阻害剤または式（ｉ）から選択される化合物もしくはその薬学的に許容される塩の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。前記γ線照射癌療法に対する耐性を減少させるために、化合物をγ線照射癌療法と組み合わせて投与することができる。

好ましくは、化合物と組み合わせたγ線照射の投与は、腫瘍が治療されるまで、好ましくは腫瘍が消えるまで繰り返す。

同様に、さらなる態様から、本発明は、γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させるための医薬品の製造における、ＴＰＰＩＩ阻害剤または式（ｉ）から選択される化合物もしくはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明は、癌の治療においてＴＰＰＩＩ阻害剤がγ線照射との併用で有用であることを認識すると考えることができる。

さらなる態様から、本発明は、式（ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様から、本発明は、医薬品として使用するための式（ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

さらなる態様から、本発明は、γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させるのに適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む方法を提供する。

本発明は、γ線照射に対する細胞の応答における、ＴＰＰＩＩの必須の役割を認識する。比較的低い用量のγ線照射による処置の間でも、ＴＰＰＩＩ阻害剤を注入したマウスで完全なｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍退縮が観察された。

本出願は、発明者Ｒｉｃｋａｒｄ ＧｌａｓおよびＨｏｎｇ Ｘｕによる「Ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」という名称の２００６年１月１３日に出願の米国特許仮出願６０／７５９０８８の優先権を主張し、その内容は、その出願が癌の処置のためのγ線照射との組合せに関する限り、本明細書で完全に組み込まれる。米国特許仮出願６０／７５９０９９の出願および本出願の間で、本発明者らは、本発明の基礎をなす生物学的機構の理解を深めたさらなる実験を実施した。しかし、γ線照射と組み合わせたＴＰＰＩＩ阻害剤が癌の処置のために有用であるとの認識の点で、およびこの場合に好ましい特定の化学構造を特定する点で、本出願は前の優先権出願と合致している。

理論によって束縛されることを望むものではないが、下記の本発明者らのデータは、その機構のいくつかの点は未解明であるが、ＴＰＰＩＩがＰＩＫＫによるシグナル伝達を制御することを示す。ＴＰＰＩＩは、ＤＮＡ修復病巣への制御因子の補充および／または結合で、直接的または間接的な役割をすることができ、これらの因子がＰＩＫＫと相互作用してそれによって活性化されることを可能にする。例えば、ＴＰＰＩＩはγ線照射後のＡＴＭおよびｐ５３の間の相互作用を制御すると考えられる。ＡＴＭ、ＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓはｐ５３の安定化においてある程度の冗長性を有し、複数のＮ末端部位がｐ５３リン酸化を、また複数のＰＩＫＫが同じ部位を標的にする（Ｂｏｄｅ，ＡＭ、Ｄｏｎｇ，Ｚ．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００４；４：７９３〜８０５）。

ＴＰＰＩＩは、比較的広い範囲の基質を受け入れる。式（ｉ）に含まれるすべての化合物は、ペプチドまたはペプチド類似体である。式（ｉ）の化合物は、当技術分野で知られている方法によって、容易に合成することができ（例えばＧａｎｅｌｌｉｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３，６６４〜６７４を参照）、または市販品を容易に入手することができる（例えばＢａｃｈｅｍ ＡＧから）。好ましい態様では、化合物は式（ｉ）から選択することができる。そのようなトリペプチドおよび誘導体は、特に有効な治療剤である。

本発明に従い、γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させるために用いる化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＰＰＩＩ阻害剤であることが知られている化合物でよい。

例えば、該化合物は、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ２００５、２３、４０９〜４１８においてＴＰＰＩＩ阻害剤として特定された化合物から選択することができる。

それらの化合物は特にＴＰＰＩＩファルマコフォアに適しているので、化合物は以下の式（ｉｉ）：

から選択することができ、上式で、Ｒ’はＨ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３またはＣＨ（ＣＨ_３）_２であり、
Ｒ”は、Ｈ、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＨ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３またはＣ（ＣＨ_３）_３であり、
Ｒ”’は、Ｈ、ＣＨ_３、ＯＣＨ_３、Ｆ、ＣｌまたはＢｒである。

式（ｉｉ）の化合物は、公知の方法によって合成可能である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ２００５、２３、４０９〜４１８およびＢｒｅｓｌｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３、１３、４４６７〜４４７１を参照）。

また、例として、化合物は、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第６３３５３６０号でＴＰＰＩＩ阻害剤として特定された化合物から選択することができる。そのような化合物は、以下の式（ｉｉｉ）のものを含む。

上式で、
各Ｒ^１は同じであるかまたは異なることができ、ハロゲン、ＯＨ；ハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルキル；ハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換された（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルケニル；ハロゲンおよびＯＨ、Ｘ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換された（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキニル（ＸがＳ、ＯまたはＯＣＯであり、アルキルがハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換される）；少なくとも１つのハロゲンで必要に応じて置換されたＳＯ_２（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、ＹＳＯ_３Ｈ、ＹＳＯ_２（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルであって、ＹがＯまたはＮＨであり、アルキルが少なくとも１つのハロゲン、ジラジカル−Ｘ１−（Ｃ_１〜Ｃ_２）アルキレン−Ｘ１−で必要に応じて置換されており、Ｘ_１がＯまたはＳであり；インドリン環と縮合したベンゼン環；
からなる群から選択され、ｎは、０〜４であり、
Ｒ^２は、Ｒ^４がハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基によって置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルキルであるＣＨ_２Ｒ^４；ＺがＯもしくはＳであり、ｐが０〜５であり、ｑが０〜５であり、ただしｐ＋ｑが０〜５である（ＣＨ_２）_ｐＺ（ＣＨ_２）_ｑＣＨ_３；（Ｃ_２〜Ｃ_６）不飽和アルキル；または（Ｃ_３〜Ｃ_６）シクロアルキルであり、
あるいは、Ｒ^２は（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルまたはＯ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルであり、それぞれは少なくとも１つのハロゲンで必要に応じて置換されており、
Ｒ^３はＨ；少なくとも１つのハロゲンで必要に応じて置換された（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル；（ＣＨ_２）_ｐＺＲ^５（式中、ｐが１〜３であり、ＺがＯまたはＳであり、Ｒ^５がＨまたは（Ｃ_１〜Ｃ_３）アルキルである）；ベンジルである。

式（ｉｉｉ）の化合物は、公知の方法によって容易に合成が可能である（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第６３３５３６０号を参照）。

しかし、化合物は、式（ｉ）および（ｉｉ）、より好ましくは式（ｉ）から選択することが好ましい。

化合物が、Ｒ^Ｎ１、Ｒ^Ｎ２およびＲ^Ｃ１が上でまたは下の好ましい実施形態のいずれかで定義された通りであり、
Ａ^１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンまたは２−アリルグリシンであり、
Ａ^２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｋ、Ｒ、ヒスチジン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチン、α，γ−ジアミノ酪酸または４，５−デヒドロ−リジンであり、
Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンまたは２−アリルグリシンである、
式（ｉ）の化合物であることも可能である。

式（ｉ）の好ましい化合物
式（ｉ）の化合物の様々な基および特定の例が好ましい。

一般に、特にＡ^２位置が天然（Ｌ）立体配置のアミノ酸が好ましい。

一般に、Ｒ^Ｎ１が水素であり、
Ｒ^Ｎ２が、
Ｒ^Ｎ３、
（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
ＣＯ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、または
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３
であり、上式で、
（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであり得、
Ｒ^Ｎ３は、水素または以下の置換されていない基：
飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキル、
ベンジル、
フェニル、または
単環式ヘテロアリール
のいずれかであることが好ましい。

一般に、Ｒ^Ｃ１は、
Ｏ−Ｒ^Ｃ２、
Ｏ−（リンカー２）−Ｒ^Ｃ２、または
ＮＨ−（リンカー２）Ｒ^Ｃ２
であり、上式で、
（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、Ｃ_１〜６アルキルもしくはＣ_２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
Ｒ^Ｃ２は水素または以下の置換されていない基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜５アルキル、
ベンジル、
フェニル、または
単環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール
のいずれかであることが好ましい。

一般には、Ｎ末端の置換基に関して、
Ｒ^Ｎ１は水素であり、
Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３またはＣ（＝Ｏ）−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３であり、
（リンカー１）は、ＣＨ_２またはＣＨ＝ＣＨであり、
Ｒ^Ｎ３は、フェニルまたは２−フリルであることがさらに好ましい。

さらに、
Ｒ^Ｎ１は水素であり、
Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣＨ_２ＰｈまたはＣ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−（２−フリル）であることが好ましい。

Ｎ末端置換基のための他の好ましいグループは、
Ｒ^Ｎ１が水素であり、
Ｒ^Ｎ２が、ベンジルオキシカルボニル、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはＦＡであり、より好ましくはベンジルオキシカルボニルまたはＦＡであるものである。

一般には、Ｃ末端の置換基に関して、
Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、より好ましくはＯＨであることが好ましい。

いくつかの好ましいグループは、以下の通りである。

グループ（ｉ）（ａ）：
Ａ^１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ^２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチンまたはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ｒ^Ｎ１はＨであり、
Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルフェニルである。

グループ（ｉ）（ｂ）：
Ａ^１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
Ａ^２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
Ｒ^Ｎ１はＨであり、
Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニルである。

グループ（ｉ）（ｃ）：
Ａ^１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
Ａ^２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシンまたは２−アリルグリシンであり、
Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
Ｒ^Ｎ１はＨであり、
Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニルである。

グループ（ｉ）（ｄ）：
Ａ^１は、ＧまたはＡであり、
Ａ^２は、Ｌ、Ｉまたはノルロイシンであり、
Ａ^３は、ＧまたはＡであり、
Ｒ^Ｎ１はＨであり、
Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニルである。

特定の好ましい化合物の第１セットは、
Ａ^１がＧであり、
Ａ^２がＬであり、
Ａ^３が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリン、より好ましくはＧまたはＡであり、
Ｒ^Ｎ１が水素であり、
Ｒ^Ｎ２がベンジルオキシカルボニルであり、
Ｒ^Ｃ１がＯＨである化合物である。

特定の好ましい化合物の第２セットは、
Ａ^１がＧであり、
Ａ^２がＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンまたは２−アリルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシンまたは２−アリルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉまたはノルロイシンであり、
Ａ^３がＡであり、
Ｒ^Ｎ１が水素であり、
Ｒ^Ｎ２がベンジルオキシカルボニルであり、
Ｒ^Ｃ１がＯＨである化合物である。

特定の好ましい化合物の第３セットは、
Ａ^１が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくはＧ、Ａまたは２−アミノ酪酸、より好ましくはＧまたはＡであり、
Ａ^２がＬであり、
Ａ^３がＡであり、
Ｒ^Ｎ１が水素であり、
Ｒ^Ｎ２がベンジルオキシカルボニルであり、
Ｒ^Ｃ１がＯＨである化合物である。

好ましくは、配列Ａ^１−Ａ^２−Ａ^３は、ＧＬＡ、ＧＬＦ、ＧＶＡ、ＧＩＡ、ＧＰＡまたはＡＬＡ、最も好ましくはＧＬＡであり、
Ｒ^Ｎ１は水素であり、
Ｒ^Ｎ２はベンジルオキシカルボニルであり、
Ｒ^Ｃ１はＯＨである。

アルキル基が飽和または不飽和と記載される場合、これはアルキル、アルケニルおよびアルキニル炭化水素部分を包含する。

Ｃ_１〜６アルキルは、好ましくはＣ_１〜４アルキル、より好ましくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはブチル（分枝または非分枝）、最も好ましくはメチルである。

Ｃ_３〜１２シクロアルキルは、好ましくはＣ_５〜１０シクロアルキル、より好ましくはＣ_５〜７シクロアルキルである。

「アリール」は、芳香族基、好ましくはフェニルまたはナフチルである。

語の一部としての「ヘテロ」は、１つまたは複数の、好ましくはＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子を含むことを意味する。

「ヘテロアリール」は、好ましくはピリジル、ピロリル、キノリニル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、インドリル、ピラジニル、インダゾリル、ピリミジニル、チオフェネチル、ピラニル、カルバゾリル、アクリジニル、キノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、シノリニルまたはプテリジニルである。

「非芳香族のヘテロシクリル」は、好ましくはピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニルまたは単糖である。

「ハロゲン」は、好ましくはＣｌまたはＦ、より好ましくはＣｌである。

さらなる好ましい式（ｉ）の化合物
一般に、Ａ^１は、好ましくは、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸、より好ましくはＧまたはＡから選択することができる。

一般に、Ａ^２は、好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、Ｋ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、ＰまたはＫ、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、ＰまたはＫ、より好ましくはＬまたはＰから選択することができる。

一般に、Ａ^３は、好ましくは、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリン、より好ましくはＧまたはＡから選択することができる。

一般に、Ｒ^Ｎ１は水素であることが好ましい。

一般に、Ｒ^Ｎ２は、好ましくは、
Ｒ^Ｎ３、
（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
ＣＯ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、または
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３
であり、上式で、
（リンカー１）は存在しない、即ち単結合、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
Ｒ^Ｎ３は、水素または以下の置換されていない基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜４アルキル、
ベンジル、
フェニル、もしくは
単環式ヘテロアリール
のいずれかである。

一般に、Ｒ^Ｎ２は、より好ましくは、水素、ベンジルオキシカルボニル、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはＦＡであり、より好ましくは、水素、ベンジルオキシカルボニルまたはＦＡである。

一般に、Ｒ^Ｃ１が
Ｏ−Ｒ^Ｃ２、
Ｏ−（リンカー２）−Ｒ^Ｃ２、または
ＮＨ−（リンカー２）Ｒ^Ｃ２
であり、上式で、
（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、Ｃ_１〜６アルキルもしくはＣ_２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
Ｒ^Ｃ２は水素または以下の置換されていない基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜５アルキル、
ベンジル、
フェニル、もしくは
単環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール
のいずれかであることが好ましい。

一般に、Ｒ^Ｃ１は、より好ましくは、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ_２、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、より好ましくは、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、ＮＨ_２またはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル、より好ましくは、ＯＨまたはＮＨ_２である。

特に興味がある化合物には、Ａ^２がＰであるものが含まれる。

特に興味がある化合物には、Ｒ^Ｃ１がＮＨ_２であるものが含まれる。

一般に、以下のアミノ酸、Ｆ、Ｗ、Ｄ、ＥおよびＹは、Ａ^３により不適当である。同様に、一般に、Ａ^３は、Ｐおよび／またはＥでないものが選択されることがあるが、それは、これらを含む化合物はより低い活性を示すからである。

好ましい式（ｉｉ）の化合物
式（ｉｉ）の化合物は、好ましくは、
Ｒ’が、ＣＨ_２ＣＨ_３またはＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３であり、
Ｒ”が、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３またはＣＨ（ＣＨ_３）_２であり、
Ｒ”’が、ＨまたはＣｌである化合物である。

好ましい式（ｉｉｉ）の化合物
式（ｉｉｉ）の化合物の様々な好ましいグループおよび特定の例は、別にとられたＳｃｈｗａｒｔｚらのＵＳ６，３３５，３６０Ｂ１の請求項のいずれかに規定される通りである。

式（ｉ）の治療化合物の一例は、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、即ち、Ｎ末端がＺ基で誘導体化され、Ｃ末端が誘導体化されないトリペプチドＧＬＡである。Ｚは、ベンジルオキシカルボニルを表す。これは、Ｒ^Ｎ１がＨ、Ｒ^Ｎ２がＺ、Ａ^１がＧ、Ａ^２がＬ、Ａ^３がＡ、Ｒ^Ｃ１がＯＨである、式（ｉ）の化合物である。この化合物はＢａｃｈｅｍ ＡＧから市販され、真核生物ＴＰＰＩＩの細菌同族体、サブチリシンを抑制することが発見された。Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨは低コストであり、γ線照射による療法に耐性である腫瘍の排除を誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏでよく効く。療法耐性の癌の新規治療法は、公衆衛生上かなり関心がある。

好ましい化合物には、ＧＬＡを含むもの、例えば、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＬＡ−ＯＨ、ＦＡ−ＧＬＡ−ＯＨおよびＨ−ＧＬＡ−ＯＨ、例えばＺ−ＧＬＡ−ＯＨが含まれるが、本発明に従い、本明細書での任意の化合物または化合物群のいかなる開示も、配列Ａ^１Ａ^２Ａ^３はＧＬＡではないとのただし書き、または化合物はＺ−ＧＬＡ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＬＡ−ＯＨ、ＦＡ−ＧＬＡ−ＯＨまたはＨ−ＧＬＡ−ＯＨからなる群から選択されないとのただし書き、または化合物はＺ−ＧＬＡ−ＯＨではないとのただし書きに必要に応じて従うことができる。

標準のγ線照射処置に応答しない腫瘍の処置では、悪性疾患患者でそのような処置を改善するために、例えば、固形腫瘍でそのような処置に対するｉｎ ｖｉｖｏ応答を増加させるために、本明細書で記載されるＺ−ＧＬＡ−ＯＨまたは他の化合物を投与することができる。

他の好ましい化合物には、Ａ^１Ａ^２Ａ^３がＧＰＧであるもの、例えばＧＰＧ−ＮＨ_２またはＺ−ＧＰＧ−ＮＨ_２が含まれる。

当業者は、本明細書で記載される化合物は、任意の適当な方法で投与することができることに気付くであろう。例えば、投与は、非経口的、例えば静脈内もしくは皮下、経口、経皮、鼻腔内、吸入、または経直腸であることができる。好ましい一実施形態では、化合物は注射によって投与される。

本発明の医薬組成物に用いる薬学的に許容される付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの無機酸、ならびに、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸およびアリールスルホン酸などの有機酸に由来するものが含まれる。本明細書で記載される薬学的に許容される賦形剤、例えば、媒体、アジュバント、担体または希釈剤は、当技術分野の技術者に周知であり、容易に入手できる。薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用および毒性を及ぼさないものでよい。医薬製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、１９ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）で見られる。

組成物は任意の投与経路、例えば経口、静脈内、経皮または皮下、経鼻、筋肉内または腹腔内投与のために調製することができる。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路によって決まる。非経口投与のためには、非経口的に許容される水溶液を使用し、それは発熱物質を含まず、必要なｐＨ、等張性および安定性を有する。当業者は適当な溶液を調製する能力が十分あり、多数の方法が文献で記載されている。薬剤送達方法の簡単な総説は、例えば、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）でも見られる。

本発明との関連で、哺乳動物、特にヒトに投与する用量は、相応な時間枠の間哺乳動物で治療反応を実現するのに十分であるべきである。当業者は、投薬量が、患者の年齢、病状および体重、ならびに、疾患の段階／重症度を含めて、様々な因子によって決まることを理解するであろう。用量は、投与の経路（投与形態）、タイミングおよび頻度によっても決まる。経口投与の場合、投薬量は、例えば約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、より好ましくは約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ／日の化合物、またはその薬学的に許容される塩の対応量でよい。

化合物は、γ線照射の前、その間、またはその後に投与することができる。

ＴＰＰＩＩ活性の抑制についてどのように化合物をスクリーニングするべきかは、当業者に明白である。ＴＰＰＩＩタンパク質は第１段階で精製することができ、ＴＰＰＩＩに好ましい蛍光原基質を第２の段階で用いることができる。これは、ＴＰＰＩＩ活性を測定する効果的な方法になる。

特に高レベルの精製を達成する必要はなく、スクリーニング法で用いるのに十分な品質のＴＰＰＩＩを得るために、従来の単純な技術を用いることができる。ＴＰＰＩＩの精製の一つの非限定的な例では、、１００×１０^６個の細胞（例えばＥＬ−４細胞）を沈殿させ、ガラスビーズおよびホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ）中でボルテックスすることによって溶解した。細胞溶解物を分画遠心分離にかけた。最初に、細胞のホモジネートを１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次に、上清を超遠心管へ移した。次に、試料を１００，０００×ｇで１時間超遠心分離し、上清（ほとんどの生化学文献ではサイトゾルと表される）を１００，０００×ｇで５時間遠心分離すると、高分子量サイトゾルタンパク質／タンパク質複合体が沈殿した。生じたペレットを５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、３０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＤＴＴに溶解し、１μｇの高分子量タンパク質をペプチダーゼアッセイの酵素として用いた。

ＴＰＰＩＩの活性は、例えば基質ＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて試験することが可能である。これは、例えば、５０ｍＭトリ塩基ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＤＴＴで構成される１００μｌの試験緩衝液中で、１００μＭの濃度で用いることができる。９００μｌの１％ＳＤＳ溶液による希釈を用いて、反応を停止することが可能である。切断活性は、例えば、ＬＳ５０Ｂ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）における、４６０ｎｍでの発光で測定することができる。

本発明で使用する化合物は、（ｉ）マウスへ腫瘍細胞を接種する段階と、（ｉｉ）前記マウスへγ線照射し、前記マウスへ化合物を投与する段階と、（ｉｉｉ）定期間隔で腫瘍サイズを測定する段階とを含むｉｎ ｖｉｖｏモデルで用いたときの、対照実験と比較して部分的または好ましくは完全な腫瘍退縮をもたらすものと定義することができる。γ線照射段階は、対照実験では省略される。腫瘍成長実験のさらなる詳細および実施例は、以下に記す。γ線照射処置の直後に化合物を注入することが好都合であることがわかったが、本発明は、この投与順序に限定されるものと理解すべきではない。

本発明で使用する化合物は、γ線照射と一緒に、例えば本明細書で記載される方法で使用されると、ｉｎ ｖｉｖｏで部分的または好ましくは完全な腫瘍退縮をもたらす。

本発明で用いる化合物は、十分に血清安定性であり、即ちｉｎ ｖｉｖｏで、それらは所望の治療効果を発揮するのに十分長い期間、それらの同一性を保持する。

理論によって束縛されることを望まないが、本発明は、これから要約する添付図面に関して、下記のそれには限定されない実施例でさらに詳細に記載される。
[実施例]

用いた材料および方法は、以下の通りであった。

細胞および培養条件。ＥＬ−４は、Ｃ５７ＢＩ／６マウス系統に由来する、ベンツピレンによって誘導されたリンパ腫細胞系統である。ＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉは、ｐＳＵＰＥＲベクターでトランスフェクトされたＥＬ−４細胞であり（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ、Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ、Ａｇａｍｉ，Ｒ．Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０〜３）、空に対してＴＰＰＩＩに対するｓｉＲＮＡを含有する。ＨｅＬａ細胞は、ヒト子宮頸癌細胞である。ＹＡＣ−１は、Ａ／Ｓｎマウス系統に由来する、モロニー白血病ウイルスによって誘導されたリンパ腫細胞系である。ＡＬＣは、Ｃ５７ＢＩ／６マウス系統に由来する、放射線白血病ウイルスＤ−ＲａｄＬＶによって誘導されたＴ細胞リンパ腫である。ＤＮＡ合成の測定のために、細胞を９６穴プレートに播種し、^３Ｈ−チミジンを１６時間または３６時間後に加え、６時間インキュベートした後に洗浄した。ストレスの誘導のために、細胞を５００〜１０００ラドでγ線照射したか、５０％〜７５％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での増殖によって飢えさせ、３７℃および５．３％ＣＯ_２でインキュベートした。

酵素阻害剤、ＮＬＶＳはキモトリプシンのペプチダーゼ活性を優先的に標的とするプロテアソーム阻害剤であって、生細胞でのプロテアソーム分解を効率的に抑制する。ブタビンダイドは文献で記載される（Ｒｏｓｅ，Ｃ、Ｖａｒｇａｓ，Ｆ、Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｐ、Ｂｏｕｒｇｅａｔ，Ｐ、Ｂａｍｂａｌ，ＲＢ、Ｂｉｓｈｏｐ，ＰＢら．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ １９９６；３８０：４０３〜９）。Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ）は、ＴＰＰＩＩのそれと相同である活性部位を有する細菌酵素、サブチリシン（Ｂａｃｈｅｍ、Ｗｅｉｌ ａｍ Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の阻害剤である。ワートマニン(Wortmannin)は、ＰＩＫＫ（ＰＩ３−キナーゼ関連）−ファミリーキナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の阻害剤である。すべての阻害剤はＤＭＳＯで溶解し、使用時まで−２０℃で保存した。

タンパク質精製、ペプチダーゼアッセイおよびＤＮＡ断片の分析。１００×１０^６個の細胞を沈殿させ、ガラスビーズおよびホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ）中でボルテックスすることによって溶解した。細胞溶解物を分画遠心分離にかけ、そこでは、１００，０００×ｇで１時間の遠心分離からの上清（サイトゾル）を１００，０００×ｇの遠心分離に３〜５時間かけ、高分子量サイトゾルタンパク質／タンパク質複合体を沈殿させた。生じたペレットを５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、３０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＤＴＴに溶解し、１μｇの高分子量タンパク質を、ＴＰＰＩＩ発現のためのペプチダーゼアッセイまたはウェスタンブロットの酵素として用いた。ＴＰＰＩＩの活性を試験するために、５０ｍＭトリ塩基ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＤＴＴで構成される１００μｌの試験緩衝液中で、基質ＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１００μＭの濃度で用いた。切断活性は、ＬＳ５０Ｂ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）における、４６０ｎｍでの発光により測定した。ＤＮＡ断片の分析のために、細胞を１２穴プレートに１０^６細胞数／ｍｌで播種し、アポトーシス誘導剤として通常用いられるＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である、２５μＭのエトポシドに、飢餓（５０％ＰＢＳ）まで曝露させた。細胞を１２穴プレートに１０^６細胞／ｍｌで播種し、示した時間、通常１８〜２４時間インキュベートした。ＥＬ−４対照および適応細胞からのＤＮＡを標準のクロロホルム抽出によって精製し、アポトーシス細胞からＤＮＡを検出するために、２．５μｇのＤＮＡを１．８％アガロースゲルに加えた。

プラスミドおよび遺伝子トランスフェクション。ＴＰＰＩＩ ｓｉＲＮＡを発現するｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ、Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ、Ａｇａｍｉ，Ｒ．Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０〜３）プラスミドは、以下の通りに構築した。非リン酸化ＤＮＡオリゴマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｂａｉｄ、Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、３μｇ／μｌの濃度に再懸濁した。各オリゴ対の１μｌを４８μｌのアニーリング緩衝液（１００ｍＭ ＫＡｃ；３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４；２ｍＭ ＭｇＡｃ）と混合し、９５℃で４分間、７０℃で１０分間加熱し、次に、室温に徐々に冷却した。アニールしたオリゴマーの２μｌを１００ｎｇのｐＳＵＰＥＲプラスミド（ＢｇＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した）と混合し、連結し、形質転換し、既述の通り、Ａｍｐ／ＬＰプレートに平板培養した（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ、Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ、Ａｇａｍｉ，Ｒ．Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０〜３）。コロニーは、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化およびＤＮＡシークエンシングにより、挿入断片の存在についてスクリーニングした。アニールさせたオリゴマー対は以下の通りであり、ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉについては、フォワードプライマーは
5'GATCCCCGATGTATGGGAGAGGCCTTTCAAGAGAAGGCCTCTCCCATACATCTTTTTGGAAA-3'であり、リバースプライマーは
5'AGCTTTTCCAAAAAGATGTATGGGAGAGGCCTTCTCTTGAAAGGCCTCTCCCATACATCGGG-3'であった。

安定したトランスフェクタントの生成のために、５×１０^６個の細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサー内の５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、１０μｇのＤＮＡと９６０μＦで２５０Ｖでパルスし、Ｇ４１８に対する耐性によって選択した。

抗体および抗血清。以下の分子を、指定した抗体によって検出した。ＡｋｔをウサギＡｋｔ抗血清により（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）を１９３Ｈ２ウサギホスホ−Ａｋｔ抗血清により（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；γ−Ｈ２ＡＸをウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸにより（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；Ｍｒｅ１１をポリクローナルウサギ抗ヒトＭｒｅ１１により（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；ｐ２１をＳＸ１１８により（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）；ｐ５３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）；Ｒａｅ−１をモノクローナルラット抗マウスＲａｅ−１、１９９２１５により（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）；ＸＩＡＰをモノクローナルマウス抗ヒトＸＩＡＰ、１１７３２０により（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。ＴＰＰＩＩの検出のために、ニワトリＴＰＰＩＩ抗血清を用いた（Ｉｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ウェスタンブロット法は、標準の技術によって実施した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質検定用試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で測定した。特記されていない場合は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分離のために、レーンにつき５μｇのタンパク質をロードした。

免疫組織化学。細胞を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）を通してガラスカバースリップに付着させ、アセトン：メタノール（１：１）で１時間固定させ、次に、スライドをＢＳＳ緩衝液で１時間再水和した。第１の抗体を加え、ＢＳＳで短時間洗浄するまで１時間そのままにし、その後、二次コンジュゲート体（抗ウサギＦＩＴＣ）を加えて１時間インキュベートした。次に、スライドを洗浄し、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３３２５８で３０分間染色した。最後に、スライドにＤＡＢＣＯマウント緩衝液をマウントし、分析まで４℃に保った。

フローサイトメトリー。細胞表面Ｒａｅ−１抗原の染色のため、０．５〜１．０×１０^６個の細胞を、２０μｇ／ｍｌのＲａｅ−１モノクローナル抗体１９９２１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の５０μｌと一緒にインキュベートし、氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄の後、ビオチン化ポリクローナルラビット抗ラットＩｇ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と逐次的にインキュベートし、各段階の後にはＰＢＳで洗浄した。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒによって定量化した。生細胞のフローサイトメトリー細胞選別は、細胞と２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）との５分間のインキュベーション、ならびに、以降のＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅによるＰＩ^＋およびＰＩ⁻集団への選別によって実施した。

腫瘍増殖実験。腫瘍細胞をＰＢＳで洗浄し、接種につき２００μｌの量で再懸濁した。次に、細胞をマウス当たり１０^６個右側脇腹に接種し、腫瘍の増殖は週２回の測定によって監視した。マウスの抗腫瘍治療の開始は、腫瘍増殖が各マウスで開始した時期に従い、ある程度個体別に調整した。抗腫瘍免疫応答を抑制するために、腫瘍接種前にマウスを４Ｇｙで照射した。腫瘍体積は、（ａ_１×ａ_２×ａ_３）／２（数字ａ_ｉは腫瘍の直径、幅および深さを表す）に従って、腫瘍増殖を有するマウスの平均体積として計算した。第１の触診の時間は、マウスによって異なったが、一般増殖パターンはマウスのすべてで実質的に類似していた。ほとんどの図の中で、小さな腫瘍に対する治療効果、即ち完全な排除の存在をよりよく視覚化するために、対数尺度を用いる。ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＰＰＩＩの抑制のために、体重１ｋｇにつき、２００μｌのＰＢＳに希釈した１３．８ｍｇ（１４μｌの５０ｍＭ溶液／マウス）のズブチリシン阻害剤Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｗｅｉｌ ａｍ Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で週２回腹腔内注射を行った。すべてのγ線照射は、全身照射であった。

レトロウイルス形質導入および移植。実施例７に関して、ｃ−Ｍｙｃの配列は、以下のプライマー5'ACGTGAATTCCACCATGCCCCTCAACGTTAGCTTCおよび3'TACGTCTCGAGCTTACGCACAAGAGTTCCGTAGを用いてＰＣＲによってヒトｃＤＮＡ（脳）から増幅し、レトロウイルス発現ベクターｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＥＹＦＰのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｈＢｃＩ−ｘ_ＬはｐＬＸＩＮ−ｈＢｃＩ−ｘ_Ｌから切り取り（Ｄｊｅｒｂｉ，Ｍ．、Ｄａｒｒｅｈ−Ｓｈｏｒｉ，Ｔ．、Ｚｈｉｖｏｔｏｖｓｋｙ，Ｂ．およびＧｒａｎｄｉｅｎ，Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＦＬＩＣＥ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃｕｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｌｉｐ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４、１８０〜９、２００１）、ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。レトロウイルス粒子の生成、造血幹細胞の濃縮および形質導入、ならびに移植は、既報の通りに実施した（Ｎｙａｋｅｒｉｇａ，Ａ．Ｍ．、Ｄｊｅｒｂｉ，Ｍ．、Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｍ．およびＧｒａｎｄｉｅｎ，Ａ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１、５４５〜５０、２００５）。簡潔には、レトロウイルスベクターを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を用いてＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏパッケジング細胞に一時的にトランスフェクトし、ウイルス粒子を含むウイルス上清を収集し、５−フルオロウラシル処理マウスの骨髄から得た系統陰性細胞に形質導入するのに用いた。その後これらの細胞を、致死的照射を受けたレシピエントマウスに注入した。移植後の７〜１４日の間に、マウスは急性骨髄性白血病様疾患を発症した。そのようなマウスの脾臓からの細胞は、グルタミンおよびウシ胎仔血清を加えた通常のＲＰＭＩ培地で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることができた。

ＧＦＰおよびＹＦＰ発現の検出は、Ｃｙａｎ（商標）ＡＤＰサイトメーター（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施したが、そこでは、４８８ｎｍでの励起の後に、最初にシグナルを分離するために５２５ｎｍロングパス二色性ミラーを使用し、次にＥＧＦＰの検出のために５１０／２１ｎｍバンドパスフィルタを、ＥＹＦＰのために５５０／３０ｎｍバンドパスフィルタを用いた。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を用いて分析した。

略語リスト。ＡＴＭ、毛細血管拡張性運動失調症変異；ＢＲＣＴ、ＢＲＣＡのＣ末端リピート；ＮＬＶＳ、４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニルアセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ビニルスルホン；ＰＩ、ヨウ化プロピジウム；ＰＩＫＫ、ホスホイノシチド−３−ＯＨ−キナーゼ関連キナーゼ；ＴＰＰＩＩ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ；ＦＡ、３−（２−フリル）アクリロイル；ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質、ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質。

本明細書では、化学物質およびアミノ酸のために標準の略語を用いる。

略語 代替略語
Ａ アラニン Ａｌａ
Ｒ アルギニン Ａｒｇ
Ｎ アスパラギン Ａｓｎ
Ｄ アスパラギン酸 Ａｓｐ
Ｃ システイン Ｃｙｓ
Ｅ グルタミン酸 Ｇｌｕ
Ｑ グルタミン Ｇｌｎ
Ｇ グリシン Ｇｌｙ
Ｈ ヒスチジン Ｈｉｓ
Ｉ イソロイシン Ｉｌｅ
Ｌ ロイシン Ｌｅｕ
Ｋ リジン Ｌｙｓ
Ｍ メチオニン Ｍｅｔ
Ｆ フェニルアラニン Ｐｈｅ
Ｐ プロリン Ｐｒｏ
Ｓ セリン Ｓｅｒ
Ｔ スレオニン Ｔｈｒ
Ｗ トリプトファン Ｔｒｐ
Ｙ チロシン Ｔｙｒ
Ｖ バリン Ｖａｌ
本発明は、いくつかの非天然αアミノ酸も利用する。

略語 側鎖
Ａｂｕ ２−アミノ酪酸 ＣＨ_２ＣＨ_３
Ｎｖａ ノルバリン ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３
Ｎｌｅ ノルロイシン ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３
ｔｅｒｔ−ブチルアラニン ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）_３
α−メチルロイシン （ＣＨ_３）（ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ_３）
４，５−デヒドロ−ロイシン ＣＨ_２Ｃ（＝ＣＨ_２）ＣＨ_３
アロ−イソロイシン ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３
α−メチルバリン （ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）
ｔｅｒｔ−ブチルグリシン Ｃ（ＣＨ_３）_３
２−アリルグリシン ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２
Ｏｒｎ オルニチン ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２
Ｄａｂ α，γ−ジアミノ酪酸 ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２
４，５−デヒドロ−リジン ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＮＨ_２

γ線照射によって誘導される細胞周期停止は、ＴＰＰＩＩ発現に依存する。

ＴＰＰＩＩ発現は数種類のストレスによって増加するので、これがＰＩＫＫによって制御されるのか否かを試験した。ＴＰＰＩＩ抗血清によるＴ細胞リンパ腫系ＥＬ−４のウェスタンブロット分析により、ＴＰＰＩＩ発現はγ線照射によって増加することがわかった。さらに、この増加は、ＰＩＫＫ阻害剤である１μＭワートマニンで処理したγ線照射ＥＬ−４細胞では見られず、それはむしろＴＰＰＩＩ発現を減少させた（図１Ａ）。プロテアソーム阻害剤であるＮＬＶＳによる処理は、ワートマニン処理γ線照射ＥＬ−４細胞でＴＰＰＩＩの下方制御を抑制し、ＴＰＰＩＩが、ＰＩＫＫシグナル伝達の非存在下で、プロテアソームによって分解されることを示唆した（図１Ａ）。ＴＰＰＩＩがＰＩＫＫによって媒介される細胞応答でなんらかの役割を果たすか否かをさらに研究するために、ｐＳＵＰＥＲベクターによってコードされる、ＴＰＰＩＩに対してｓｉＲＮＡを発現する安定したＥＬ−４トランスフェクタントを作製した（ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉと表される、［Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ、Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ、Ａｇａｍｉ，Ｒ．Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０〜３］）。ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞は、ＥＬ−４．ｗｔ細胞（空のｐＳＵＰＥＲベクターでトランスフェクトされる、図１Ｂ）と比較して、ＴＰＰＩＩの発現および活性をともに抑制していた。ＰＩＫＫファミリーメンバーのメンバーがシグナル伝達を制御する細胞ストレス応答を誘発するために、γ線照射（５Ｇｙ）を用いた。ＴＰＰＩＩは、以前、溶解性のサイトゾルペプチダーゼと報告された（Ｒｅｉｔｓ，Ｅ、Ｎｅｉｊｓｓｅｎ，Ｊ、Ｈｅｒｂｅｒｔｓ，Ｃ、Ｂｅｎｃｋｈｕｉｊｓｅｎ，Ｗ、Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｌ、Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ，ＪＷら．Ａ ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＴＰＰＩＩ ｉｎ ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００４；２０：４９５〜５０６）が、今回、γ線照射ＥＬ−４細胞（図１Ｃ）の核内へのＴＰＰＩＩの急速な移行が発見された。これは、ＴＰＰＩＩの免疫組織化学的分析によって検出された通り、ＥＬ−４細胞のγ線照射曝露から１時間後にすでに明白であった。類似した応答が、ＡＬＣおよびＹＡＣ−１リンパ腫ならびにルイスの肺癌（ＬＬＣ）細胞で観察された。

ＤＮＡ損傷に応じてＤＮＡ合成を停止させるために、ＰＩＫＫの活性化が必要とされる（Ｂａｋｋｅｎｉｓｔ，ＣＪ、Ｋａｓｔａｎ ＭＢ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ ２００４；１１８：９〜１７）（ＭｃＫｉｎｎｏｎ，ＰＪ．ＡＴＭ ａｎｄ ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２００４；５：７７２〜６）。ＤＮＡ合成が、γ線照射ＥＬ−４．ｗｔ対照で抑制されることが観察されたが、曝露後３６時間まで、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞で高レベルのγ線照射耐性ＤＮＡ合成が見られた（^３Ｈ−チミジン取り込みで測定、図１Ｄ）。これらのデータは、ＴＰＰＩＩが、γ線照射に応じてＥＬ−４細胞のＤＮＡ合成を停止させるために重要なことを示唆した。ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞はγ線照射曝露の後、Ｇ２／Ｍでほとんど一様に停止したが、ＥＬ−４．ｗｔ対照細胞はＧ１およびＧ２／Ｍの停止を示し、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞でのＧ１／Ｓチェックポイントの非存在が示唆された（図１Ｅ）。しかし、γ−Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９−リン酸化Ｈ２ＡＸ、図１Ｆ）のウェスタンブロット法で測定されたように、γ線照射ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞でＤＮＡ損傷の初期検出はまだ見られた。Ｈ２ＡＸはＡＴＭ活性化に応じてリン酸化され、それは、ＤＮＡ修復巣の形成を誘発する（Ｂａｋｋｅｎｉｓｔ，ＣＪ、Ｋａｓｔａｎ ＭＢ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ ２００４；１１８：９〜１７）。ゆえに、ＴＰＰＩＩはγ線照射曝露後急速に核内に移行し、ＥＬ−４細胞でＤＮＡ合成を効率的に停止させるために必要であるが、Ｈ２ＡＸのリン酸化のためには必要ではない。

ＴＰＰＩＩ発現が抑制された細胞でのｐ５３の安定化の失敗。

転写因子ｐ５３は多種のストレスに応じて細胞周期停止を開始し、その発現はＰＩＫＫによる直接リン酸化によって制御される。γ線照射ＥＬ−４．ｗｔ細胞の細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって、ｐ５３レベルの上昇を認めたが、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞のそれらは低レベルを示した（図２Ａ）。しかし、ＮＬＶＳによる処理はγ線照射ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞のｐ５３発現を増加させ、ｐ５３はまだ合成されていたものの、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞のプロテアソームによって分解されたことが示唆される。ｐ５３の転写標的であるｐ２１は、γ線照射曝露の後、ＥＬ−４．ｗｔ対照細胞と比較して、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞で弱く発現された（図２Ｂ）。さらに、ＴＰＰＩＩを安定して過剰発現するＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ−ＴＰＰＩＩ細胞は、ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３細胞と比較して、γ線照射曝露後にｐ５３レベルの増加を示した（Ｗａｎｇ，ＥＷ、Ｋｅｓｓｌｅｒ，ＢＭ、Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ａ、Ｃｒａｖａｔｔ，ＢＦ、Ｂｏｇｙｏ，Ｍ、Ｐｌｏｅｇｈ，ＨＬら．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ ｗｉｔｈ ａ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００；９７：９９９０〜５）（図２Ｃ）。ｐ５３およびＴＰＰＩＩが物理的に連結するか否かを試験するために、次に、ｐ５３のＮ末端に対する抗血清を用いて免疫共沈降実験を実施し、その後、ＴＰＰＩＩのウェスタンブロット分析を実施した。ＥＬ−４−ｐＳＵＰＥＲ細胞の溶解物からのｐ５３免疫沈降物において、γ線照射によって増加したＴＰＰＩＩ^ｉレベルを検出した（図２Ｄ、上）。これは、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞からの溶解物および１μＭワートマニンで処理したＥＬ−４．ｗｔ細胞の溶解物では観察されなかった（図２Ｄ）。これらのデータは、ＴＰＰＩＩとｐ５３との間の、γ線照射によって誘導された物理的リンクを裏付けるものであった。ｐ５３発現は、γ線照射ＹＡＣ−１およびＡＬＣリンパ腫細胞でＴＰＰＩＩ依存性であることも発見され、そこでは、ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉの安定的発現の後、ｐ５３は実質的に検出不可能であった（図２Ｅ）。ルイスの肺癌（ＬＬＣ）細胞でｐ５３の発現を発見することはできなかった（図２Ｅ）。γ線照射への曝露より前にも本発明者らの対照腫瘍細胞系のいくつかでかなりのレベルのｐ５３に気づいたが、これは、形質転換細胞でのしばしば上方制御されるＤＮＡ損傷応答と同調する現象である（Ｂａｒｔｋｏｖａ，Ｊ、Ｈｏｒｅｊｓｉ，Ｚ、Ｋｏｅｄ，Ｋ、Ｋｒａｍｅｒ，Ａ、Ｔｏｒｔ，Ｆ、Ｚｉｅｇｅｒ，Ｋら．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５；４３４：９０７〜１３）（Ｂａｒｔｋｏｖａ，Ｊ、Ｈｏｒｅｊｓｉ，Ｚ、Ｋｏｅｄ，Ｋ、Ｋｒａｍｅｒ，Ａ、Ｔｏｒｔ，Ｆ、Ｚｉｅｇｅｒ，Ｋら．ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５；４３４：８６４〜７０）。ｐ５３の効率的な安定化のために、ＴＰＰＩＩの発現が必要であると結論した。

ＴＰＰＩＩは、ＰＩＫＫシグナル伝達に依存するいくつかの経路の活性化を制御する。

ＴＰＰＩＩ発現はｐ５３の安定化のための要件であったので、本発明者らはＥＬ−４．ｗｔ対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞でのそれらの状態を比較することによって、ＰＩＫＫシグナル伝達に依存する他のストレス誘発性経路も試験した（Ｇａｓｓｅｒ，Ｓ、Ｏｒｓｕｌｉｃ，Ｓ、Ｂｒｏｗｎ，ＥＪ、Ｒａｕｌｅｔ，ＤＨ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５；４３６：１１８６〜９０）（Ｖｉｎｉｅｇｒａ，ＪＧ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｎ、Ｍｏｄｉｒａｓｓａｒｉ，Ｐ、Ｌｏｓａ，ＪＨ、Ｐａｒａｄａ Ｃｏｂｏ，Ｃ、Ｌｏｂｏ，ＶＪら．Ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＫＢ／Ａｋｔ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｓｕｌｉｎ ｏｒ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＡＴＭ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５；２８０：４０２９〜３６）（Ｆｅｎｇ，Ｊ、Ｐａｒｋ，Ｊ、Ｃｒｏｎ，Ｐ、Ｈｅｓｓ，Ｄ、Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，ＢＡ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＰＫＢ／Ａｋｔ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｔｉｆ Ｓｅｒ−４７３ ｋｉｎａｓｅ ａｓ ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：４１１８９〜９６）（Ｓａｒｂａｓｓｏｖ，ＤＤ、Ｇｕｅｒｔｉｎ，ＤＡ、Ａｌｉ，ＳＭ、Ｓａｂａｔｉｎｉ，ＤＭ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ／ＰＫＢ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｔｏｒ−ｍＴＯＲ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５；３０７：１０９８〜１０１）。ＡｋｔキナーゼのＳｅｒ４７３リン酸化は、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫまたはｍＴＯＲによるＰＩＫＫシグナル伝達を必要とするが、そのメカニズムの詳細は論争されている（Ｖｉｎｉｅｇｒａ，ＪＧ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｎ、Ｍｏｄｉｒａｓｓａｒｉ，Ｐ、Ｌｏｓａ，ＪＨ、Ｐａｒａｄａ Ｃｏｂｏ，Ｃ、Ｌｏｂｏ，ＶＪら．Ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＫＢ／Ａｋｔ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｓｕｌｉｎ ｏｒ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＡＴＭ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５；２８０：４０２９〜３６）（Ｆｅｎｇ，Ｊ、Ｐａｒｋ，Ｊ、Ｃｒｏｎ，Ｐ、Ｈｅｓｓ，Ｄ、Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，ＢＡ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＰＫＢ／Ａｋｔ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｔｉｆ Ｓｅｒ−４７３ ｋｉｎａｓｅ ａｓ ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：４１１８９〜９６）（Ｓａｒｂａｓｓｏｖ，ＤＤ、Ｇｕｅｒｔｉｎ，ＤＡ、Ａｌｉ，ＳＭ、Ｓａｂａｔｉｎｉ，ＤＭ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ／ＰＫＢ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｔｏｒ−ｍＴＯＲ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５；３０７：１０９８〜１０１）。ＥＬ−４．ｗｔ細胞の溶解物で、かなりのレベルのホスホ−Ｓｅｒ４７３−Ａｋｔを検出した。しかし、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞は非常に低いレベルのホスホ−Ｓｅｒ４７３−Ａｋｔを示し、一方、Ａｋｔの総発現は類似していた（図３Ａ）。さらに、本発明者らはＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３対照細胞と比較して、ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３−ＴＰＰＩＩでＡｋｔのＳｅｒ４７３リン酸化の増加が見られ、ＴＰＰＩＩ発現がＡｋｔ−Ｓｅｒ−４７３リン酸化を制御することをさらに裏付ける（図３Ｂ）。Ａｋｔキナーゼは細胞生存シグナルの形質導入にとって重要であり、多くの腫瘍で過度に活性化される。正常な培地（５％血清）では、ＥＬ−４．ｗｔと比較して、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞は増殖速度の増加を示したが、死細胞の蓄積増加も示した（図３Ｃ）。さらに、血清濃度を１％まで低下させることによって、ＥＬ−４．ｗｔ細胞と比較してこの蓄積は促進され、細胞生存機構がＴＰＰＩＩの非存在下で損なわれたことが示唆される（図３Ｃ）。さらに、ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３−ＴＰＰＩＩ細胞は、０．５％血清で限定的な増殖を達成することができたが、ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３細胞はそうでなかった（図３Ｄ）。これらの表現型は、ＴＰＰＩＩ発現が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中のＡｋｔ Ｓｅｒ４７３リン酸化および細胞生存にとって重要なことを示す。Ａｋｔキナーゼの直接の基質であるＸＩＡＰ（Ｄａｎ，ＨＣ、Ｓｕｎ，Ｍ、Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ、Ｆｅｌｄｍａｎ，ＲＩ、Ｎｉｃｏｓｉａ，ＳＶ、Ｗａｎｇ，ＨＧら．Ａｋｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＸＩＡＰ）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４；２７９：５４０５〜１２）は、ＩＡＰファミリーの分子、即ち、腫瘍細胞で通常過剰発現する内因性のカスパーゼ阻害剤のメンバーである。ＴＰＰＩＩの上方制御は、ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３−ＴＰＰＩＩ細胞で、ｃ−ＩＡＰ−１およびＸＩＡＰ分子の発現の増加を引き起こす。エトポシドによる処理により、ＸＩＡＰの発現は、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞と比較して、ＥＬ−４．ｗｔ細胞でかなり高く、分解速度が遅いことがわかった（図３Ｅ）。さらに、ＡＴＭおよびＡＴＲキナーゼの活性化はＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を媒介し、それによって、免疫系に対して進行中のＤＮＡ損傷応答を有する細胞を検出させる（Ｇａｓｓｅｒ，Ｓ、Ｏｒｓｕｌｉｃ，Ｓ、Ｂｒｏｗｎ，ＥＪ、Ｒａｕｌｅｔ，ＤＨ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５；４３６：１１８６〜９０）．フローサイトメトリー計測により、本発明者らはＥＬ−４．ｗｔ細胞上でＲａｅ−１の発現を検出したが、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞上ではわずかな量のＲａｅ−１発現が検出された（図３Ｆ）。ＡＬＣリンパ腫細胞上でＲａｅ−１リガンドの発現を検出することはできなかったが、安定的ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉトランスフェクタント（ＹＡＣ−１．ＴＰＰＩＩ^ｉ）が細胞表面でわずかなレベルのＲａｅ−１リガンドを発現するので、マウスＹＡＣ−１リンパ腫の分析もＲａｅ−１発現がＴＰＰＩＩ発現依存性であることを示した（図３Ｇ）。これらのデータは、ＰＩＫＫによって活性化されるいくつかのストレス誘発経路は、ＴＰＰＩＩ発現を必要とすることを示す。

ＴＰＰＩＩのＢＲＣＴ様モチーフは、γ線照射に応じてｐ５３の安定化を必要とした。

ＢＲＣＡのＣ末端のリピート（ＢＲＣＴ）−ドメインは、ＤＮＡ損傷シグナル伝達経路を制御するタンパク質内にしばしば含まれ、そこでそれらは、ＡＴＭ基質との相互作用を制御する（Ｂｏｒｋ，Ｐ、Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ、Ｂｕｃｈｅｒ，Ｐ、Ｎｅｕｗａｌｄ，ＡＦ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ、Ｋｏｏｎｉｎ，ＥＶ．Ａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９７；１１：６８〜７６）（Ｍａｎｋｅ，ＩＡ、Ｌｏｗｅｒｙ，ＤＭ、Ｎｇｕｙｅｎ，Ａ、Ｙａｆｆｅ，ＭＢ．ＢＲＣＴ ｒｅｐｅａｔｓ ａｓ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；３０２：６３６〜９）（Ｙｕ，Ｘ、Ｃｈｉｎｉ，ＣＣ、Ｈｅ，Ｍ、Ｍｅｒ，Ｇ、Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｔｈｅ ＢＲＣＴ ｄｏｍａｉｎ ｉｓ ａ ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；３０２：６３９〜４２）。すべてではないが最もＢＲＣＴモチーフの要件に合致する、位置７２５のＧＧ−二重項を中心とするＴＰＰＩＩの１領域を本発明者らは発見した（図４Ａ）。本発明者らは多くのＢＲＣＴ配列に存在する特徴的なＧｌｙ−Ｇｌｙ二重項（^＊で表示、図４Ａ）の部位特異的突然変異誘発を実施し、それを、本発明者らのｐｃＤＮＡ３−ＴＰＰＩＩベクターにおいてＧｌｙ−Ｇｌｕに変異させた。ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞でこのプラスミドを発現させるために、位置７２５の突然変異（ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅと表した）に加えて、３つのサイレント突然変異を、ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉでコードされたｓｉＲＮＡと相互作用するヌクレオチドの間のＴＰＰＩＩの３’領域に挿入した（このプラスミドはＴＰＰＩＩ^ｗｔと表した）。ＴＰＰＩＩ^ｗｔおよびＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ突然変異分子が、ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉでコトランスフェクトしたＥＬ−４細胞で安定して発現されることがわかった（図４Ｂ）。さらに、ｐ５３の発現を、γ線照射に曝露させたＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅトランスフェクタント細胞で分析した。ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ細胞が、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ対照細胞と比較して、ｐ５３のかなり低い発現を示すことがわかった（図４Ｃ）。さらに、γ線照射の存在下および非存在下の両方で、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ細胞の溶解物からのｐ５３免疫沈降物でＴＰＰＩＩを検出することができなかったが、ＴＰＰＩＩは、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ対照細胞を用いると検出された（図４Ｄ）。本発明者らはＴＰＰＩＩは、ＤＮＡ損傷シグナル伝達にとって重要なＢＲＣＴ様ドメインを有すると結論した。

制御因子はＤＮＡ損傷部位に共存して、下流側応答を活性化させる（Ａｌ Ｒａｓｈｉｄ，ＳＴ、Ｄｅｌｌａｉｒｅ，Ｇ、Ｃｕｄｄｉｈｙ，Ａ、Ｊａｌａｌｉ，Ｆ、Ｖａｉｄ，Ｍ、Ｃｏａｃｋｌｅｙ，Ｃら．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐ５３ ｔｏ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５；６５：１０８１０〜２１）（Ｌｉｓｂｙ，Ｍ、Ｂａｒｌｏｗ，ＪＨ、Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＲＣ、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ．２００４；１１８：６９９〜７１３）。ＴＰＰＩＩ発現が抑制された細胞でのｐ５３安定化の失敗の背後にある可能な理由は、ｐ５３をそのような部位に補充することができないということである。ＥＬ−４．ｗｔ対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞からのｐ５３免疫沈降物での、ＤＮＡ修復巣成分の存在を調べた。ウェスタンブロット法で測定されたように、本発明者らはＥＬ−４．ｗｔからのｐ５３免疫沈降物でＡＴＭを検出したが、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞からは検出しなかった（図４Ｅ）。本発明者らはまたＥＬ−４．ｗｔにおいて、γ線照射後にｐ５３結合タンパク質でＤＮＡ修復巣タンパク質５３ＢＰ１およびＭｒｅ１１も検出されたが、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞では検出されなかった（図４Ｆ、Ｇ）。さらに、ＮＬＶＳ処理ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞も、ｐ５３免疫沈降物でＡＴＭ、５３ＢＰ１およびＭｒｅ１１を示すことができなかった（図４Ｅ〜Ｇ）。ｐ５３およびＡＴＭがＤＮＡ修復巣成分と近接して見られる事実は、あるｐ５３アイソフォームがこれらの巣に集積することと一致し、そこでは、それらはＡＴＭキナーゼと相互作用することができる（Ａｌ Ｒａｓｈｉｄ，ＳＴ、Ｄｅｌｌａｉｒｅ，Ｇ、Ｃｕｄｄｉｈｙ，Ａ、Ｊａｌａｌｉ，Ｆ、Ｖａｉｄ，Ｍ、Ｃｏａｃｋｌｅｙ，Ｃら．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐ５３ ｔｏ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５；６５：１０８１０〜２１）。本発明者らのデータは、ｐ５３とＡＴＭ、ならびにＤＮＡ修復巣成分５３ＢＰ１およびＭｒｅ１１との間の物理的リンクが、ＴＰＰＩＩを必要とすることを裏付ける。

ＴＰＰＩＩ発現は、ＥＬ−４腫瘍のγ線照射耐性をｉｎ ｖｉｖｏで制御する。

ＰＩＫＫは、新規癌療法の開発のための可能な標的分子である（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ａ、Ｃｕｄｄｉｈｙ，Ａ、Ｂｒｉｓｔｏｗ，ＲＧ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔｓ ｐａｒｔ Ｉ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＡＴＭ−ＡＴＲ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ，ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｓｅｍｉｎ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ ２００６；１６：５１〜８）。ＴＰＰＩＩ媒介性の成長調節がｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖にとって重要であるか否かを調べるために、同系のＣ５７ＢＩ／６マウスに、１０^６個のＥＬ−４．ｗｔ対照またはＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞を接種した。本発明者らはＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞の両方がほぼ同じ速度で腫瘍を確立し、成長することを見出し、単独で考慮すると、ＴＰＰＩＩがｉｎ ｖｉｖｏでのＥＬ−４腫瘍の増殖にとって重要ではないことが示唆される（図５Ａ、Ｂ、対照と表示されたパネル）。しかし、加えて、本発明者らはＥＬ−４．ｗｔまたはＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞の腫瘍を有するマウスを、４Ｇｙ（４００ラド）のγ線照射で２〜４回処理した。これは、γ線照射にもかかわらず成長し続けた１０^６個のＥＬ−４．ｗｔ細胞を接種した後の腫瘍サイズに、わずかな影響を及ぼすことを本発明者は見出した（図５Ａ、γ線照射は矢印で示した）。対照的に、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞の腫瘍を有するマウスはγ線照射処理に応答して、定着腫瘍の完全な退縮がもたらされた（図５Ｂ）。これらのデータは、ＥＬ−４．ＡＴＭ^ｉまたはＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ細胞の腫瘍で得られたものに類似していたが、その訳は、これらも、ｉｎ ｖｉｖｏでγ線照射に耐えることができなかったからである（図５Ｃ、Ｄ）。該データは、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのγ線照射感受性を増加させる標的としての、ＴＰＰＩＩを支持する。

トリ−ペプチド−ベースのＴＰＰＩＩ阻害剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を放射線増感させる。

ＴＰＰＩＩは、細菌のズブチリシンと相同性の触媒ドメインを有する、ズブチリシン型のセリンペプチダーゼである（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ，Ｂ、Ｗｅｒｎｓｔｅｄｔ，Ｃ、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｕ、Ｚｅｔｔｅｒｑｖｉｓｔ，Ｏ．Ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＩ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｔｙｐｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８７；８４：７５０８〜１２）。基質ＡＡＦ−ＡＭＣのＴＰＰＩＩ切断の抑制で観察されるように、約１０ｎＭのＫ_ｉ５０を有するトリ−ペプチドズブチリシン阻害剤Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ）は、効率的にＴＰＰＩＩを抑制し、その効率はブタビンダイド（７ｎＭのＫ_ｉ５０を有する）で観察されたよりもわずかに低いことがわかった（図６Ａ）。さらに、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨは、血清中で比較的安定していた。

ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍のγ線照射の間の触媒性ＴＰＰＩＩ抑制の影響を試験するために、確立されたＥＬ−４腫瘍を有するＣ５７ＢＩ／６マウスを、４Ｇｙのγ線照射線量（１線量／週）および毎週２回のＺ−ＧＬＡ−ＯＨによる注射（１３．８ｍｇ／ｋｇ体重）に曝露させた。毎週の４Ｇｙのγ線照射線量は、Ｃ５７ＢＩ／６対照マウスの確立されたＥＬ−４腫瘍の増殖に、わずかな影響を及ぼした。これに対して、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨを注射後、３〜４回の４００ラドの線量のγ線照射の後に、すべての試験マウスで完全な腫瘍退縮が観察された（図６Ｂ）。これらの腫瘍がもはや明瞭でなくなったとき、処理を中止したが、腫瘍の再成長は全観察期間（３カ月間）観察されなかった。Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ注射の存在下で、γ線照射線量の滴定(titration)も、３Ｇｙの線量に曝露させたマウスでＥＬ−４腫瘍の完全な退縮を示したが、より低い線量のγ線照射も腫瘍増殖を減少させ、一部の完全な排除を認めた（２Ｇｙでは５匹中２匹のマウス、１Ｇｙでは４匹中１匹、図６Ｃ）。Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ化合物の滴定は、６．９ｍｇ／ｋｇのＺ−ＧＬＡ−ＯＨを接種した後、ほとんどのマウス（４匹中３匹）でγ線照射に応じた完全な腫瘍排除を示したが、３．５ｍｇ／ｋｇ以下の用量は、腫瘍退縮という点で部分的効果（４匹中２匹、３Ｇｙのγ線照射線量を用いた、図６Ｃ、右パネル）を示した。

γ線照射に対するｉｎ ｖｉｖｏ耐性を含む、腫瘍治療抵抗性の背後にある一般的な理由の１つは、ｐ５３突然変異である（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，ＷＳ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３；２２：７４８６〜９５）。ｐ５３突然変異腫瘍もＴＰＰＩＩ阻害剤の存在下でγ線照射に応答するか否かを試験するために、本発明者らは同系のＣ５７ＢＩ／６マウスに１０^６個のルイスの肺癌（ＬＬＣ）細胞を同様に接種した。ＬＬＣ腫瘍は、４Ｇｙの反復γ線照射線量に実質的に非感受性であることがわかり、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ単独は（γ線照射がない場合）いかなる影響も及ぼさなかった（図６Ｄ）。対照的に、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨを注射したマウスで、γ線照射に対する確立されたＬＬＣ腫瘍の完全な退縮が観察された（図６Ｄ）。保護された−ジペプチドＺ−ＧＬ−ＯＨは、ＬＬＣ腫瘍のＴＰＰＩＩ抑制および放射線増感に関して無効であることがわかったが、Ｎ末端の保護Ｚ基は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果のために必ずしも厳密に必要ではなかった。ＴＰＰＩＩは、ヒトおよびマウスの間でアミノ酸レベルで９６％の同一性を有する進化上保存された酵素であり、γ線照射に応じて、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ処理ＳＣＩＤマウスで、ヒトＨｅＬａ子宮頸癌細胞の強い腫瘍退縮も観察された（図６Ｅ）。低い線量のγ線照射（１．５Ｇｙ／線量）を用いたが、その訳は、ＳＣＩＤマウスはかなり低い放射線抵抗性を有するからである。

毒性研究は、予備研究で、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨが１００ｍｇ／ｋｇまでの用量で、単剤としてわずかな影響をｉｎ ｖｉｖｏで及ぼしたことを示す。さらに、本発明者らのマウスは、研究の後、長期間生存した。ここで用いたγ線照射プロトコルはもっぱら全身照射であったので、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨが分布したすべての組織は、γ線照射およびＺ−ＧＬＡ−ＯＨの組合せに曝露させられた。これは、併用処理の対処可能な毒性を示唆する。

新たに形質転換された白血病細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの放射線増感。

原発腫瘍により類似する腫瘍細胞を確立するために、本発明者らはｃ−ＭｙｃおよびＢｃＩ−ｘ_Ｌをコードする２つの別々のベクター（ｐＭＳＣＶ−ＢｃＩ−ｘ_Ｌ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰおよびｐＭＳＣＶ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ＥＹＦＰ）を有するレトロウイルス発現系を用いた。ＤＢＡ／２骨髄細胞を、レトロウイルスによりこれらのＢｃＩ−ｘ_Ｌおよびｃ−Ｍｙｃを発現するベクターに感染させ、γ線照射同系マウスに移植した。ベクターによってコードされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）は、レトロウイルス遺伝子発現の監視を可能にした（Ｎｙａｋｅｒｉｇａ，Ａ．Ｍ．、Ｄｊｅｒｂｉ，Ｍ．、Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｍ．およびＧｒａｎｄｉｅｎ，Ａ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１、５４５〜５０、２００５）。移植から７〜１４日後、本発明者らは脾臓および骨髄にＹＦＰ^＋／ＧＦＰ^＋骨髄（ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^＋）芽細胞の大量の蓄積を観察した（脾臓について示す、図７Ａ）。これらのＤＢＡ／２−ｃ−Ｍｙｃ／ＢｃＩ−ｘ_Ｌ細胞を同系のＤＢＡ／２マウスの皮下に接種し、約３週後に、さらなる２〜３週内に１０００ｍｍ^３を超えるサイズに成長した明瞭な腫瘍を観察した（図７Ｂ）。ＤＢＡ／２−ｃ−Ｍｙｃ／ＢｃＩ−ｘ_Ｌ細胞を接種したすべてのマウスにおいて、固定臓器の組織学的分析によって観察されたように、肝臓への腫瘍拡散を認めた（図７Ｈ）。これらの悪性細胞は、原発腫瘍からの細胞を対照として用いて、脾臓、肺および肝臓のＹＦＰ^＋／ＧＦＰ^＋細胞を示すフローサイトメトリーによっても検出された（図７Ｃ〜Ｇ）。γ線照射（４Ｇｙ／線量、１線量／週）による処理により、わずかに減少した増殖が観察されたが、ＤＢＡ／２−ｃ−Ｍｙｃ／ＢｃＩ−ｘ_Ｌ腫瘍はまだ１週未満の遅れで１０００ｍｍ^３を超えるサイズに到達し、肝転移も存在した（図７Ｂ）。対照的に、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ（１３．８ｍｇ／ｋｇ体重）を投与された確立したＤＢＡ／２−ｃ−Ｍｙｃ／ＢｃＩ−ｘ_Ｌ腫瘍を有するマウスは、４Ｇｙ線量のγ線照射に応じて完全な腫瘍退縮を示した（図７Ｂ）。さらに、これらのＺ−ＧＬＡ−ＯＨ処理マウスの肺、脾臓および肝臓で、腫瘍細胞を発見することはできなかった（図７Ｆ、Ｇ、Ｊ）。Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨだけを投与されたマウスでは腫瘍サイズの減少が観察されなかったので、この治療応答のためにγ線照射が必要とされた（図７Ｂ）。これらのデータは、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨから観察される放射線増感効果が特定の腫瘍の欠陥に依存する可能性は低いことを裏付けるが、増殖およびアポトーシスを脱制御する単純な２ヒット戦略によって新たに形質転換された細胞で観察することができる。

ジ−ペプチド、トリ−ペプチドおよび誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験。

表１は、任意であるが相対的である蛍光定量的ユニットにおける、ＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−７−アミド−４−メチルクマリン）のいくつかの濃度の化合物による切断の抑制に関するｉｎ ｖｉｔｒｏデータを含む。試験した大部分の化合物で、多少の有益効果が見られる。

ＴＰＰＩＩタンパク質を濃縮し、次に、ＴＰＰＩＩに好ましい蛍光原基質ＡＡＦ−ＡＭＣを用いた。１００×１０^６個の細胞を沈殿させ、ガラスビーズおよびホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ）中でボルテックスすることによって溶解した。細胞溶解物を、分画遠心分離にかけた。最初に、細胞のホモジネートを１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次に、上清を超遠心管へ移した。次に、試料を１００，０００×ｇで１時間超遠心分離し、上清（ほとんどの生化学文献ではサイトゾルと表される）を１００，０００×ｇで５時間遠心分離すると、高分子量サイトゾルタンパク質／タンパク質複合体が沈殿した。生じたペレットを５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、３０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＤＴＴに溶解し、１μｇの高分子量タンパク質をペプチダーゼアッセイの酵素として用いた。

ＴＰＰＩＩの活性を試験するために、５０ｍＭトリベースｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＤＴＴで構成される１００μｌの試験緩衝液中で、基質およびＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１００μＭの濃度で用いた。反応を停止するために、９００μｌの１％ＳＤＳ溶液による希釈を用いた。切断活性は、ＬＳ５０Ｂ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）における、４６０ｎｍでの発光により測定した。

ＦＡ＝３−（２−フリル）アクリロイル；ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水。各化合物名の最初のテキスト（Ｚ、ＦＡ、Ｈ、その他）は、Ｎ末端の置換基である；Ｈは、Ｎ末端が遊離のＮＨ_２であることを示す。各化合物名の終わりのテキスト（ＯＨ、ＮＢｕ、その他）は、Ｃ末端の置換基である；ＯＨは、Ｃ末端が遊離のＣＯ_２Ｈであることを示す。

ジ−ペプチド、トリ−ペプチドおよび誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ試験。

表２は、ＬＬＣ（ルイスの肺癌）を有する４匹のマウスの群における、ｍｍ^３で表した腫瘍体積を示すｉｎ ｖｉｖｏデータを含む。腫瘍体積が１０００ｍｍ^３を超えたとき、マウスを屠殺した。一部のマウスには、化合物を単独で投与し、他には、さらに放射線を投与した。７、１０、１４、１８および２１日後に、マウスに化合物を投与し、一部にはγ線照射（４００ラド）も投与した。照射と併用すると、一部の化合物は優れた結果を示した。ジペプチド誘導体Ｚ−ＧＬ−ＯＨがｉｎ ｖｉｖｏと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで性能が劣る事実は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果をｉｎ ｖｉｖｏでの結果に外挿することができるという理論を支持する。

Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨのさらなるｉｎ ｖｉｖｏ試験
表３は、上記のＥＬ−４腫瘍モデルに従う、７〜８匹のマウスの群におけるｍｍ^３で表した腫瘍体積を示す、さらなるｉｎ ｖｉｖｏデータを含む。０日目に、１，０００，０００個のＥＬ−４リンパ腫細胞を皮下に接種した。２２日後まで、明瞭な腫瘍は観察されなかった。各処理時（週２回）、明瞭な腫瘍を有するマウスに、４００ラド照射を単独で、または１４μｌのＺ−ＧＬＡ−ＯＨの５０ｍＭ溶液と併用して投与した。明瞭な腫瘍をもたないマウスは処理せず、即ち、腫瘍が排除されたマウスにおいては処理を中止し、マウスを経過観察した。表３は、優れた結果を、即ち、単なる腫瘍増殖の停止、容積の減少および腫瘍増殖の遅れではなく、確立腫瘍の完全な排除を示す。

すべてのマウスは、０日目に４００ラド（１Ｇｙ＝１００ラド）でγ線照射したが、これは、腫瘍受容を向上させる標準手順である。化合物は腹腔内に接種したが、腫瘍は常に皮下に接種した。

Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨと同じ方法で、ＧＰＧ−ＮＨ_２およびＺ−ＧＰＧ−ＮＨ_２を試験した。これらを、腫瘍担持マウスに１３．８ｍｇ／ｋｇで週２回注射し、ｉｎ ｖｉｖｏでγ線照射増感を媒介するそれらの能力について、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨと比較した。ＧＰＧ−ＮＨ_２およびＺ−ＧＰＧ−ＮＨ_２は、γ線照射後、確立ＥＬ−４腫瘍の完全な退縮を媒介することがわかった。

ＴＰＰＩＩは、Ｍｒｅ１１巣形成のために必要とされる
図１Ｃで示し、実施例１で述べるように、ＴＰＰＩＩはγ線照射細胞の核に迅速に移行する。さらなる免疫細胞化学的実験の結果を、図９に示す。ＴＰＰＩＩは巣を形成しないようであり、代わりに、点状の外観を示したようである（図９、抑制されたＴＰＰＩＩ発現、ＬＬＣ、ＡＬＣおよびＹＡＣ−１を有する細胞について示す）。ＴＰＰＩＩ発現が抑制された細胞が、γ線照射曝露後にＭｒｅ１１巣を集めることができなかったこの失敗は、本発明でのＴＰＰＩＩ阻害剤の使用を、さらに裏付ける。

γ線照射曝露による増殖停止調節におけるＴＰＰＩＩ。（Ａ）１μＭワートマニン(wortmannin)の存在下または非存在下で１０００ラドのγ線照射に曝露させ、その後、２５μＭ ＮＬＶＳ（右レーン）の存在下でワートマニンへ曝露させたＥＬ−４細胞からの細胞溶解物の抗ＴＰＰＩＩを用いた、ウェスタンブロット分析。（Ｂ）空のｐＳＵＰＥＲベクター（ＥＬ−４．ｗｔで表す、空のバー）またはｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉ（抗ＴＰＰＩＩ ｓｉＲＮＡ、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉで表す、黒バー）で安定してトランスフェクトしたＥＬ−４細胞からの高分子量サイトゾルタンパク質を試験することで測定した、ＴＰＰＩＩ活性（ＡＡＦ−ＡＭＣの酵素切断、上）および発現（抗ＴＰＰＩＩによるウェスタンブロット法による、下）。ＡＡＦ−ＣＭＫは、セリンペプチダーゼ阻害剤である。（Ｃ）ＥＬ−４．ｗｔ（上）対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞（下）のＴＰＰＩＩの免疫細胞化学的分析であり、未処理（左パネル）またはγ線照射（５Ｇｙ）をして１時間後に分析した。核染色の対照として、ＤＡＰＩを用いた。（Ｄ）^３Ｈ−チミジンの組込みで測定した、１０００ラドへの曝露後のγ線照射ＥＬ−４．ｗｔ（開放記号）およびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞（閉鎖記号）のＤＮＡ合成（バーは、＋／−標準偏差を示す）。（Ｅ）１０Ｇｙγ線照射への曝露の前または２０時間後の、ＥＬ−４．ｗｔ（上）対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞（下）の細胞周期分析。（Ｆ）２．５Ｇｙγ線照射に曝露させたＥＬ−４．ｗｔ対照対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞におけるホスホ−Ｓｅｒ１３９−Ｈ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）発現。 ｐ５３の安定化のために、ＴＰＰＩＩの発現が必要とされる。示した細胞のγ線照射（１０Ｇｙ）への曝露の後の、細胞溶解物のウェスタンブロット分析。（Ａ）ＥＬ−４．ｗｔ対照対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞におけるｐ５３の発現。（Ｂ）ＥＬ−４．ｗｔ対照対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞におけるｐ２１の発現。（Ｃ）ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３対照対ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３−ＴＰＰＩＩ細胞におけるｐ５３の発現。（Ｄ）ＥＬ−４．ｗｔ対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞の溶解物（上）、または１μＭワートマニンで処理したＥＬ−４．ｗｔ細胞対未処理（下）からのｐ５３免疫沈降物を用いたＴＰＰＩＩのウェスタンブロット分析。「＋」と標識されたレーンはγ線照射された細胞を示し、「−」は未処理である（溶解の前に、３７℃で１６時間インキュベートした）。（Ｅ）γ線照射に曝露した、ＡＬＣ．ｐｃＤＮＡ３対ＡＬＣ．ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉ（左）、ＹＡＣ−１対ＹＡＣ−１．ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉ（中央）およびＬＬＣ．ｐＳＵＰＥＲ対照対ＬＬＣ．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞（右）におけるｐ５３の発現。 ＴＰＰＩＩは、ＰＩＫＫシグナル伝達に応答する経路を制御する。（Ａ）ＥＬ−４．ｗｔ対照対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞（上）またはＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３対ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３−ＴＰＰＩＩ細胞（下）における、Ａｋｔキナーゼ発現、総ＡｋｔおよびＳｅｒ４７３−リン酸化（ｐ−Ａｋｔ）のウェスタンブロット分析。（Ｂ）高（５％、左）または低（１％、右）血清含有量の細胞培養培地における、ＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖。生細胞（空の円）および死細胞（黒円）を数えた。（Ｃ）高（５％、空の円）または低（０．５％、黒円）血清含有量の細胞培養培地における、ＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３およびＥＬ−４．ｐｃＤＮＡ３−ＴＰＰＩＩ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖。（Ｄ）２５μＭエトポシドに曝露させたＥＬ−４．ｗｔ対照細胞対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞におけるウェスタンブロット分析によるＸＩＡＰ発現。（Ｅ）フローサイトメトリーによって分析した、ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉプラスミドの発現を有する（右パネル）および有しない（左パネル）、ＥＬ−４（左）およびＹＡＣ−１（右）リンパ腫細胞の細胞表面Ｒａｅ−１発現。塗りつぶした曲線は、コンジュゲート体だけで染色された細胞を表す。 ＴＰＰＩＩは、ｐ５３安定化を媒介する相互作用を制御する。（Ａ）ＢＲＣＡ１（マウス）、５３ＢＰ１（ヒト）、ＭＤＣ１（ヒト）、Ｃ１９Ｇ１０．７（Ｓ．ポンベ）およびＲｅｖ１（Ｓ．セレビシエ）で前に記載された、ＢＲＣＡのＣ末端のリピートドメインを有するマウス対ヒトＴＰＰＩＩ（ａ．ａ．７１５〜８１３）の配列のアラインメント。Ｕは、疎水性アミノ酸を表す（Ｂｏｒｋ，Ｐ、Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ、Ｂｕｃｈｅｒ，Ｐ、Ｎｅｕｗａｌｄ，ＡＦ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ、Ｋｏｏｎｉｎ，ＥＶ．Ａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９７；１１：６８〜７６）。（Ｂ）１０００ラドγ線照射に曝露させたか、未処理のＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔまたはＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ細胞からの細胞溶解物を用いた、ＴＰＰＩＩのウェスタンブロット分析。（Ｃ）１０００ラドのγ線照射に曝露させたＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ細胞におけるｐ５３の発現。（Ｄ）１０００ラドγ線照射に曝露させたか、未処理のＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔまたはＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ細胞からのｐ５３免疫沈降物を用いた、ＴＰＰＩＩのウェスタンブロット分析。（Ｅ）（左）ＡＴＭ、（中央）Ｍｒｅ１１、（右）５３ＢＰ１特異的抗血清を用いた、ＮＬＶＳ処理対未処理のＥＬ−４．ｗｔ対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞の溶解物からのｐ５３免疫沈降物のウェスタンブロット分析。「＋」と標識されたレーンはγ線照射された細胞を示し、「−」は未処理である。 ＴＰＰＩＩは、γ線照射に対する腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ耐性に必要とされる。（Ａ、Ｂ）矢印で示す時点で４Ｇｙでγ線照射された、同系のＣ５７ＢＩ／６マウスにおける１０^６個のＥＬ−４．ｗｔ（Ａ）またはＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｉ細胞（Ｂ）の腫瘍増殖。（Ｃ）未処理（上）または矢印で示す時点で４Ｇｙでγ線照射された（下）、同系のＣ５７ＢＩ／６マウスにおける５×１０^６個のＥＬ−４．ＡＴＭ^ｉ細胞の腫瘍増殖。（Ｄ）未処理（上）またはγ線照射された（下）、同系のＣ５７ＢＩ／６マウスにおける５×１０^６個のＥＬ−４．ＴＰＰＩＩ^ｗｔ／Ｇ７２５Ｅ細胞の腫瘍増殖。 ズブチリシン阻害剤Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨは、ＴＰＰＩＩを抑制して、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の効率的な放射線増感を可能にする。（Ａ）蛍光定量法で測定された、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨまたはブタビンダイドの存在下での部分精製ＴＰＰＩＩ酵素によるＡＡＦ−ＡＭＣの切断。（Ｂ）未処理（８匹のマウス、空の円）、γ線照射（７匹のマウス、黒丸、４Ｇｙの線量を矢印で示す）した、またはＺ−ＧＬＡ−ＯＨ注射（１３．８ｍｇ／ｋｇ、＋で示す）で処理した、ならびに、γ線照射処理（８匹のマウス、十文字の円）した同系のＣ５７ＢＩ／６マウスにおける１０^６個のＥＬ−４リンパ腫細胞の腫瘍増殖。データは、平均腫瘍サイズを表す。（Ｃ）４Ｇｙのγ線照射線量またはＺ−ＧＬＡ−ＯＨ単独および未処理（中央パネル）に対しての、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ注射と併用した３Ｇｙ、２Ｇｙまたは１Ｇｙのγ線照射線量で処理した（左パネル）同系のＣ５７ＢＩ／６マウスにおける１０^６個のＥＬ−４リンパ腫細胞の腫瘍増殖。３Ｇｙのγ線照射線量およびＺ−ＧＬＡ−ＯＨの示す用量で処理した、Ｃ５７ＢＩ／６マウスに接種した１０^６個のＥＬ−４リンパ腫細胞の腫瘍増殖（右パネル）。Ｃでは、より大きな腫瘍サイズでよりよく差を視覚化するために、線形目盛を用いた。（Ｄ）Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨの存在下（下）または非存在下（上）での、未処理の（白い四角）またはγ線照射（矢印で示す４Ｇｙの線量）処理した、同系のＣ５７ＢＩ／６マウスにおける１０^６個のルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞の腫瘍増殖。ＣおよびＤのすべてのデータポイントは、少なくとも４匹のマウスからのデータを表す。（Ｆ）未処理の（白い円）、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨを注射した（白い四角）、またはＺ−ＧＬＡ−ＯＨを注射してγ線照射で処理した（黒円、線量１．５Ｇｙ、矢印で示す、黒円）、ＣＢ．１７ＳＣＩＤマウスにおける５×１０^６個のＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌）の腫瘍増殖。 新たに形質転換した白血病細胞のｉｎ ｖｉｖｏ放射線増感。（Ａ）ｐＭＳＣＶ−ＢｃＩ−ＸＬ−ＩＲＥＳ−Ｅ−ＧＦＰおよびｐＭＳＣＶ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−Ｅ−ＹＦＰを形質導入した幹細胞の移植から１３日後の、ＤＢＡ／２脾細胞のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）γ線照射処理およびＺ−ＧＬＡ−ＯＨの存在下または非存在下での、ＤＢＡ／２−ｃ−ｍｙｃ／ＢｃＩ−ｘＬ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖。（Ｃ〜Ｇ）未処理（Ｃ〜Ｅ）対処理（Ｆ、Ｇ）マウス（γ線照射およびＺ−ＧＬＡ−ＯＨ）からの腫瘍担持マウスに由来する組織での、ＤＢＡ−ｃ−Ｍｙｃ／ＢｃＩ−ｘＬ細胞からのＹＦＰ（ｃ−Ｍｙｃ＋）およびＧＦＰ（ＢｃＩ−ｘＬ＋）をコードするベクターのフローサイトメトリー検出、用いた組織は、皮下腫瘍（Ｃ）、肺（Ｄ、Ｆ）および脾臓（Ｅ、Ｇ）からのものであった。上パネルで示すゲートは、下パネルのＧＦＰ／ＹＦＰ蛍光について分析した細胞に対応する。（Ｈ〜Ｊ）いかなる処理も受けなかった（Ｈ）、γ線照射を受けた（Ｉ）またはγ線照射およびＺ−ＧＬＡ−ＯＨの両方を受けた（Ｊ）、ＤＢＡ／２−ｃ−Ｍｙｃ／ＢｃＩ−ｘＬ細胞を接種したマウスからの肝臓の組織学的切片。矢印は、腫瘍細胞で満たされた類洞(sinusoid)を示す。 γ線照射と組み合わせたＧＰＧ−ＮＨ_２またはＺ−ＧＰＧ−ＮＨ_２によるｉｎ ｖｉｖｏ処理への強い応答。γ線照射単独で、ならびに、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、ＧＰＧ−ＮＨ_２およびＺ−ＧＰＧ−ＮＨ_２のそれぞれと組み合わせたγ線照射で処理したＥＬ−４腫瘍を有するマウスにおける、時間（水平軸、日数）に対する腫瘍サイズ（縦軸、ｍｍ^３）。 ＴＰＰＩＩの抑制は、Ｍｒｅ１１病巣形成に影響を及ぼす。さらなる免疫細胞化学実験の結果を示す。ルイスの肺癌（ＬＬＣ、Ａ）、ＡＬＣ（Ｂ）およびＹＡＣ−１（Ｃ）細胞を、ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩ^ｉまたは空のｐＳＵＰＥＲベクターで安定的にトランスフェクトし、５Ｇｙのγ線照射に曝露させた。図で示すように、ＴＰＰＩＩおよびＭｒｅ１１の免疫細胞化学的発現を測定し、核対照染色のためにＤＡＰＩを用いた。

Claims (43)

1. γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させるための使用のための化合物であって、ＴＰＰＩＩ阻害剤である化合物。
2. 前記化合物が、式（ｉ）から選択されるか、その薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の使用のための化合物
   （ｉ）Ｒ^Ｎ１Ｒ^Ｎ２Ｎ−Ａ^１−Ａ^２−Ａ^３−ＣＯ−Ｒ^Ｃ１
   ［式中、Ａ^１、Ａ^２およびＡ^３は、標準の１文字略語または名称に従う以下の定義を有するアミノ酸残基であり：
   Ａ^１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
   Ａ^２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチンまたはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
   Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
   Ｒ^Ｎ１およびＲ^Ｎ２は、それぞれペプチドのＮ末端に結合し、同じであるかまたは異なり、それぞれ独立して
   Ｒ^Ｎ３、
   （リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
   ＣＯ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
   ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
   ＣＯ−Ｎ−（（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３）Ｒ^Ｎ４、または
   ＳＯ_２−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３
   であり、（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
   Ｒ^Ｎ３およびＲ^Ｎ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキル、
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
   ベンジル、
   フェニル、
   ナフチル、
   単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、または
   非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル
   のいずれかであり、Ｒ^Ｎ３および／またはＲ^Ｎ４には、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
   ヒドロキシ−、
   チオ−、
   アミノ−、
   カルボン酸、
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルオキシ、
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
   Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
   カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルエステル、
   カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキルエステル
   フェニル、
   単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、
   非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル、または
   ハロゲン
   であってもよく、Ｒ^Ｃ１は、トリペプチドのＣ末端に結合し、
   Ｏ−Ｒ^Ｃ２、
   Ｏ−（リンカー２）−Ｒ^Ｃ２、
   Ｎ（（リンカー２）Ｒ^Ｃ２）Ｒ^Ｃ３、または
   Ｎ（リンカー２）Ｒ^Ｃ２−ＮＲ^Ｃ３Ｒ^Ｃ４、
   であり、（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、またはＣ_１〜６アルキルもしくはＣ_２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
   Ｒ^Ｃ２、Ｒ^Ｃ３およびＲ^Ｃ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキル、
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
   ベンジル、
   フェニル、
   ナフチル、
   単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、または
   非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル
   のいずれかであり、Ｒ^Ｃ２および／またはＲ^Ｃ３および／またはＲ^Ｃ４のそれぞれには、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
   ヒドロキシ−、
   チオ−、
   アミノ−、
   カルボン酸、
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルオキシ、
   飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキル、
   Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
   カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜６アルキルエステル、
   カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_３〜１２シクロアルキルエステル
   フェニル、
   ハロゲン、
   単環式または二環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール、または
   非芳香族Ｃ_１〜１０ヘテロシクリル
   の１つまたは複数でよい］。
3. 式（ｉ）の前記化合物が、
   Ｒ^Ｎ１は水素であり、
   Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換され、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換され、
   Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルフェニルである、請求項２に記載の使用のための化合物。
4. 式（ｉ）の前記化合物が、
   Ａ^１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
   Ａ^２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
   Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
   Ｒ^Ｎ１はＨであり、
   Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換され、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換され、
   Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルフェニルである、請求項３に記載の使用のための化合物。
5. 式（ｉ）の前記化合物が、
   Ａ^１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
   Ａ^２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシンまたは２−アリルグリシンであり、
   Ａ^３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
   Ｒ^Ｎ１はＨであり、
   Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換され、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換され、
   Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニルである、請求項４に記載の使用のための化合物。
6. 式（ｉ）の前記化合物が、
   Ａ^１は、ＧまたはＡであり、
   Ａ^２は、Ｌ、Ｉまたはノルロイシンであり、
   Ａ^３は、ＧまたはＡであり、
   Ｒ^Ｎ１は水素であり、
   Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ_１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
   Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニルである、請求項５に記載の使用のための化合物。
7. Ｒ^Ｎ１は水素であり、
   Ｒ^Ｎ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣＨ_２ＰｈまたはＣ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−（２−フリル）であり、
   Ｒ^Ｃ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルである、
   請求項２から６のいずれかに記載の使用のための化合物。
8. 式（ｉ）の前記化合物が、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＬＡ−ＯＨ、ＦＡ−ＧＬＡ−ＯＨまたはＨ−ＧＬＡ−ＯＨである、請求項７に記載の使用のための化合物。
9. 式（ｉ）の前記化合物がＺ−ＧＬＡ−ＯＨである、請求項８に記載の使用のための化合物。
10. Ａ^１が、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸である、請求項２に記載の使用のための化合物。
11. Ａ^１がＧまたはＡである、請求項１０に記載の使用のための化合物。
12. Ａ^２が、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、Ｋ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンである、請求項２、１０または１１のいずれかに記載の使用のための化合物。
13. Ａ^２が、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、ＰまたはＫである、請求項１２に記載の使用のための化合物。
14. Ａ^２がＬ、Ｉ、ノルロイシン、ＰまたはＫである、請求項１３に記載の使用のための化合物。
15. Ａ^２がＬまたはＰである、請求項１４に記載の使用のための化合物。
16. Ａ^２がＰである、請求項１５に記載の使用のための化合物。
17. Ａ^３が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンである、請求項２または１０から１６のいずれかに記載の使用のための化合物。
18. Ａ^３がＧまたはＡである、請求項１７に記載の使用のための化合物。
19. Ｒ^Ｎ１が水素である、請求項２または１０から１８のいずれかに記載の使用のための化合物。
20. Ｒ^Ｎ２が、
    Ｒ^Ｎ３、
    （リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、
    ＣＯ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３、または
    ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−Ｒ^Ｎ３
    であり、上式で、
    （リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
    Ｒ^Ｎ３は、水素または以下の置換されていない基
    飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜４アルキル、
    ベンジル、
    フェニル、または
    単環式ヘテロアリール
    のいずれかである、請求項２または１０から１９のいずれかに記載の使用のための化合物。
21. Ｒ^Ｎ２が、水素、ベンジルオキシカルボニル、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはＦＡである、請求項２０に記載の使用のための化合物。
22. Ｒ^Ｎ２が、水素、ベンジルオキシカルボニルまたはＦＡである、請求項２１に記載の使用のための化合物。
23. Ｒ^Ｃ１が、
    Ｏ−Ｒ^Ｃ２、
    Ｏ−（リンカー２）−Ｒ^Ｃ２、または
    ＮＨ−（リンカー２）Ｒ^Ｃ２
    であり、上式で、
    （リンカー２）は存在しない、即ち単結合、Ｃ_１〜６アルキルもしくはＣ_２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
    Ｒ^Ｃ２は、水素または以下の置換されていない基：
    飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ_１〜５アルキル、
    ベンジル、
    フェニル、または
    単環式Ｃ_１〜１０ヘテロアリール
    のいずれかである、請求項２または１０から２２のいずれかに記載の使用のための化合物。
24. Ｒ^Ｃ１が、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ_２、ＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキル−フェニルである、請求項２３に記載の使用のための化合物。
25. Ｒ^Ｃ１が、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜６アルキル、ＮＨ_２またはＮＨ−Ｃ_１〜６アルキルである、請求項２４に記載の使用のための化合物。
26. Ｒ^Ｃ１がＯＨまたはＮＨ_２である、請求項２５に記載の使用のための化合物。
27. Ｒ^Ｃ１がＮＨ_２である、請求項２６に記載の使用のための化合物。
28. 前記化合物が、ＧＰＧ−ＮＨ_２、Ｚ−ＧＰＧ−ＮＨ_２、Ｂｎ−ＧＰＧ−ＮＨ_２、ＦＡ−ＧＰＧ−ＮＨ_２、ＧＰＧ−ＯＨ、Ｚ−ＧＰＧ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＰＧ−ＯＨまたはＦＡ−ＧＰＧ−ＯＨである、請求項２に記載の使用のための化合物。
29. 前記化合物がＧＰＧ−ＮＨ_２である、請求項２８に記載の使用のための化合物。
30. 前記化合物が、ＡＬＧ−ＮＨ_２、Ｚ−ＡＬＧ−ＮＨ_２、Ｂｎ−ＡＬＧ−ＮＨ_２、ＦＡ−ＡＬＧ−ＮＨ_２、ＡＬＧ−ＯＨ、Ｚ−ＡＬＧ−ＯＨ、Ｂｎ−ＡＬＧ−ＯＨまたはＦＡ−ＡＬＧ−ＯＨである、請求項２に記載の使用のための化合物。
31. 前記化合物がＡＬＧ−ＮＨ_２である、請求項３０に記載の使用のための化合物。
32. Ａ^３が、Ｆ、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＹではない、請求項２から３１のいずれかに記載の使用のための化合物。
33. Ａ^３がＰではない、請求項２から３２のいずれかに記載の使用のための化合物。
34. Ａ^３がＥではない、請求項２から３３のいずれかに記載の使用のための化合物。
35. γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させる方法であって、それを必要とする患者に請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の治療有効量を投与することを含む、方法。
36. γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させる医薬の製造での化合物の使用であって、前記化合物が請求項１から３４のいずれかに記載のものである使用。
37. γ線照射癌療法の効力を強化するか、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏγ線照射感受性を増加させるのに適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む、方法。
38. 請求項２から３４のいずれかに記載の式（ｉ）の構造を有する化合物、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。
39. 請求項２から３４のいずれかに記載の構造を有する化合物、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物であって、前記化合物が、シンナモイル−ＩＦＰ−エチルアミド、ＧＰＥ−ＯＨ、ＧＧＦ−ＯＨ、ＧＶＦ−ＯＨ、ＡＡＡ−ＯＨまたはＩＰＩ−ＯＨではない医薬組成物。
40. Ａ^３がプロリンではない、請求項３８または３９に記載の医薬組成物。
41. 化合物がＧＰＥ−ＯＨではない、請求項３８から４０のいずれかに記載の医薬組成物。
42. Ｒ^Ｃ１がＮＨ_２ではない、請求項３８から４１のいずれかに記載の医薬組成物。
43. 医薬として使用するための、請求項３８から４２のいずれかに記載の化合物。

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