KR20080085035A

KR20080085035A - 암 치료를 위해 감마-방사선 조사와 병용되는 ｔｐｐｉｉ저해제의 용도

Info

Publication number: KR20080085035A
Application number: KR1020087017003A
Authority: KR
Inventors: 리카르드 글라스; 홍 쉬
Original assignee: 온코레그 아베
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-15
Publication date: 2008-09-22
Also published as: WO2007088099A2; JP2009523156A; EP1971357A2; CN101370509A; AU2007204314A1; EP2160196A2; US20090227521A1; US20100168038A1; WO2007080194A2; WO2007088099A3; JP2009523157A; CA2636533A1; WO2007080194A3

Abstract

TPP II (트리펩티딜-펩티다제 II) 저해제는 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는데 유용하다. 적합한 화합물은 일반식 R^N1R^N2N-A¹-A²-A³-CO-R^C1 (상기 식에서, R^N1, R^N2, A¹, A², A³, 및 R^C1은 본원에서 정의된 바와 같고, 예를 들면, 트리펩티드 서열 GLA 및 GPG를 포함한다)의 트리펩티드 화합물을 포함한다. 감마-방사선 조사와의 병용 치료시 TPP II 저해제를 주사 맞은 마우스에서 종양이 완전하게 퇴행되는 것이 관찰된다.

TPP II, 저해제, 감마-방사선 조사, 암 요법, 병용

Description

암 치료를 위해 감마-방사선 조사와 병용되는 ＴＰＰＩＩ 저해제의 용도{USE OF TPP II INHIBITORS IN COMBINATION WITH GAMMA-IRRADIATION FOR THE TREATMENT OF CANCER}

본 발명은 암 치료를 위해 감마-방사선 조사와 병용되는 화합물의 용도에 관한 것이다.

암 요법 분야에 있어서, 아포프토시스 내성은 일반적으로 방사선 조사 요법-내성의 원인이 되는 현상이며, 즉, 암 세포가 감마-방사선 조사되어도 사멸하지 않는다. 암 환자에서 종양이 대개 초기에는 치료법에 반응하지만, 차후에는 요법에 대한 내성을 획득하게 된다. 종양 세포의 요법-내성이 요법 실패와 환자 사망의 대한 매우 공통된 원인이 된다.

본 발명자는 현재 감마-방사선 조사 암 요법이 특정 화합물을 사용함으로써 강화될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 본 발명은 시험관내 DNA 손상 반응 및 생체내 암 요법에 대한 내성에 있어서 TPP II (트리펩티딜-펩티다제 II)의 역할에 관한 본 발명자의 연구로부터 비롯된 것이다. TPP II는 초파리(Drosophila)부터 호모 사피엔스(Homo Sapiens)까지의 다세포 유기체에서 발현되는 독특한 138 kDa 서브-유니트로 구성된다. 초파리로부터의 데이타를 통해 TPP II 복합체가 약 6 MDa의 천연 구조를 갖는 2개의 꼬인 스트랜드를 형성하는 반복 서브-유니트로 구성된다는 것이 제안되었다. TPP II는 유일하게 알려져 있는 세포질 섭틸리신-유사 세린 펩티다제이다. 세균 섭틸리신은 철저히 연구된 효소로서, 그의 결정 구조와 효소적 기능이 다수 보고된 바 있다 (문헌 [Gupta, R., Beg, Q. K., and Lorenz, P., 2002, "Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications", Appl Microbiol Biotechnol. 59:15-32]).

따라서, 제1 측면으로부터 본 발명은 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는데 사용하기 위한 화합물이며, 여기서, 상기 화합물은 TPP II 저해제인 것을 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "암 요법"이란 용어는 암성 상태의 치료법 뿐만 아니라, 전-암성 상태의 치료법도 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "종양 세포"라는 용어는 암성 또는 전-암성 세포를 포함한다. 그러한 세포는 암성 또는 전-암성 결함을 가질 수 있다. 따라서, 세포는 악성 암 진행의 특징인 하나 또는 수개의 변경을 획득할 수 있다.

본 발명은 감마-방사선 조사-내성 종양을 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 심지어는 감마-방사선 조사로 치료될 수 있는 종양에 있어서도 사용되는 감마-방사선 조사 선량을 감소시킬 수 있다는 잇점을 갖는다.

추가의 측면으로부터 본 발명은 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는데 사용하기 위한 화합물이며, 여기서, 상기 화합물은 하기 화학식(i)로부터 선택되거나, 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물을 제공한다:

R^N1R^N2N-A¹-A²-A³-CO-R^C1

(상기 식에서,

A¹, A² 및 A³이 표준 1-문자 약어 또는 명칭에 따른, 하기의 정의를 갖는 아미노산 잔기이고:

A¹이 G, A, V, L, I, P, 2-아미노부티르산, 노르발린 또는 t-부틸 글리신이고,

A²가 G, A, V, L, I, P, F, W, C, S, K, R, 2-아미노부티르산, 노르발린, 노르류신, t-부틸 알라닌, 알파-메틸 류신, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 알파-메틸 발린, t-부틸 글리신, 2-알릴글리신, 오르니틴 또는 알파, 감마-디아미노부티르산이고,

A³이 G, A, V, L, I, P, F, W, D, E, Y, 2-아미노부티르산, 노르발린, 또는 t-부틸 글리신이고,

R^N1 및 R^N2가 각각 펩티드의 N 말단에 부착되고, 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로

R^N3,

(링커1)-R^N3,

CO-(링커1)-R^N3,

CO-O-(링커1)-R^N3,

CO-N-((링커1)-R^N3)R^N4, 또는

SO₂-(링커1)-R^N3이고,

(링커1)이 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^N3 및 R^N4가 동일하거나 상이하고, 수소 또는 하기의 임의로 치환된 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬;

벤질;

페닐;

나프틸;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴; 또는

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴중 임의의 것이고;

여기서, R^N3 및/또는 R^N4 상에는 0개, 1개, 또는 2개의 (동일하거나 상이한) 임의의 치환체가 존재할 수 있는데, 이는

하이드록시-;

티오-;

아미노-;

카복실산;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬옥시;

N-, O-, 또는 S-아세틸;

카복실산 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬 에스테르;

카복실산 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬 에스테르;

페닐;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴;

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴; 또는

할로겐일 수 있고,

R^C1이 트리펩티드의 C 말단에 부착되고,

O-R^C2,

O-(링커2)-R^C2,

N((링커2)R^C2)R^C3, 또는

N(링커2)R^C2-NR^C3R^C4이고,

(링커2)가 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, C₁ _-6 알킬 또는 C₂ _-4 알케닐일 수 있고, 바람직하게, 단일 결합 또는 CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^C2, R^C3 및 R^C4가 동일하거나 상이하고, 수소 또는 하기의 임의로 치환된 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬;

벤질;

페닐;

나프틸;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴; 또는

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴중 임의의 것이고;

여기서, 각각의 R^C2 및/또는 R^C3 및/또는 R^C4 상에는 0개, 1개, 또는 2개의 (동일하거나 상이한) 임의의 치환체가 존재할 수 있는데, 이는

하이드록시-;

티오-;

아미노-;

카복실산;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬옥시;

N-, O-, 또는 S-아세틸;

페닐;

할로겐;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴;

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴중 하나 이상일 수 있음).

일반 화학식(i)에 나타낸 N 및 CO는 각각 아미노산 잔기 A¹의 질소 원자 및아미노산 잔기 A³의 카보닐기이다.

추가의 측면으로부터 본 발명은 그를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의, TPP II 저해제, 또는 화학식(i)로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 화합물은 감마-방사선 조사 암 요법에 대한 내성을 감소시키기 위하여 상기 감마-방사선 조사 암 요법과 병용하여 투여될 수 있다.

화합물과 병용되는 감마-방사선 조사 투여는 종양이 치료될 때까지, 바람직하게는 종양이 소실될 때까지 반복되는 것이 바람직하다.

유사하게, 추가의 측면으로부터 본 발명은 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는 약제의 제조에서 TPP II 저해제, 또는 화학식(i)로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.

이론으로 제한하고자 하는 것이 아니며, TPP II 저해제가 암 치료법에서 감마-방사선 조사와 병용되는데 유용하다는 것을 인지하는데 본 발명이 고려될 수 있다.

추가의 측면으로부터 본 발명은 화학식(i)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

추가의 측면으로부터 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 화학식(i)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

추가의 측면으로부터 본 발명은 TPP II를, 선별하고자 하는 화합물과 접촉시키고, 화합물이 TPP II의 활성을 저해하는지 여부를 동정하는 것을 포함하는, 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는데 적합한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 감마-방사선 조사에 대한 세포 반응에서 TPP II의 본질적인 역할을 인지한다. 본 발명자들은 심지어 상대적으로 낮은 선량의 감마-방사선 조사로 치료하는 동안에도 TPP II 저해제를 주사 맞은 마우스에서는 생체내 종양이 완전히 퇴행되었음을 관찰하였다.

하기 출원이 암 치료를 위해 감마-방사선 조사와 병용한다는 것에 관한 것이라는 점에서, 본 출원은 발명자 리카드 글라스(Rickard Glas) 및 홍 슈(Hong Xu)에 의해 2006년 1월 13일자로 출원된, 발명의 명칭 "Use of peptides and peptidomimetic compounds"의 US 가특허 출원 번호 제60/759,088호 (그의 개시 내용 전문이 참고로 인용된다)로부터 우선권을 주장한다. US 가특허 출원 번호 제60/759,099호의 출원과 본 출원 사이에 본 발명자들은 본 발명의 기초가 되는 생물학적 기전에 관한 그들의 이해를 증진시키는 추가 실험을 수행하였다. 그러나, 본 출원은 TPP II 저해제가 암 치료를 위해 감마-방사선 조사와 병용되는데 유용하다 는 것을 인지하는데 있어서, 그리고, 그의 용도에 바람직한 특정 화학 구조를 동정하는데 있어서는 조기 우선 출원과 일관된다.

이론으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 비록 하기 기전에서 수개의 특질들이 명확하게 설명되어 있기는 하지만, 하기에 제시한 본 발명자들의 데이타를 통해 TPP II가 PIKK에 의한 신호 전달을 조절한다는 것을 제시한다. TPP II는 DNA 수복 초점에 조절 인자를 동원 및/또는 결합시킴으로써 이들 인자가 PIKK와 상호작용하고 PIKK에 의해 활성화되도록 하는데 직접 또는 간접적인 역할을 할 수 있다. 예를 들면, TPP II는 감마-방사선 조사 이후 ATM과 p53 사이의 상호작용을 조절하는 것으로 여겨진다. ATM, ATR 및 DNA-PKcs는 p53의 안정화에 있어서 p53 인산화를 위한 다중 N-말단 부위와, 그리고, 동일 부위를 표적하는 1 초과의 PIKK와 어느 정도의 중복성을 갖는다 (문헌 [Bode, AM, Dong, Z, Post-translational modification of p53 in tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 2004;4:793-805]).

TPP II는 상대적으로 매우 넓은 범위의 기질을 허용한다. 화학식(i)내 포함되는 모든 화합물은 펩티드 또는 펩티드 유사체이다. 화학식(i)의 화합물은 당업계에 공지된 방법 (예를 들면, 문헌 [Ganellin et al., J. Med . Chem . 2000, 43, 664-674])에 의해 용이하게 합성될 수 있거나, 상업적으로 용이하게 구입할 수 있다 (예를 들면, 바켐 아게(Bachem AG)로부터 구입가능). 바람직한 측면에서, 화합물은 화학식(i)로부터 선택될 수 있다. 그러한 트리펩티드 및 유도체가 특히 유효한 치료제이다.

본 발명에 따라 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세 포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는데 사용하기 위한 화합물은 생체내 TPP II 저해제로 알려진 화합물일 수 있다.

예를 들면, 화합물은 문헌 [Winter et al., Journal of Molecular Graphics and Modelling 2005, 23, 409-418]에서 TPP II 저해제로 동정된 화합물로부터 선택될 수 있다. 화합물은 하기 화학식(ii)로부터 선택될 수 있는데, 그 이유는 이들 화합물이 특히 TPP II 약물작용 발생단에 적합하기 때문이다:

(상기 식에서,

R'이 H, CH₃, CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₃, 또는 CH(CH₃)₂이고,

R"가 H, CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₃, CH(CH₃)₂, CH₂CH₂CH₂CH₃, CH₂CH(CH₃)₂, CH(CH₃)CH₂CH₃ 또는 C(CH₃)₃이고,

R'"이 H, CH₃, OCH₃, F, Cl, 또는 Br임).

화학식(ii)의 화합물은 공지 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들면, 문헌 ([Winter et al., Journal of Molecular Graphics and Modelling 2005, 23, 409- 418] 및 [Breslin et al. Bioorg Med Chem Lett 2003, 13, 4467-4471]) 참조).

또한, 일례로, 화합물은 TPP II 저해제로서 US 6,335,360 (슈와르츠(Schwartz) 등)에서 동정된 화합물로부터 선택될 수 있다. 그러한 화합물로는 하기 화학식(iii)의 것을 포함한다:

(상기 식에서,

각각의 R¹은 동일하거나 상이할 수 있고, 할로겐; OH; 할로겐 및 OH로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 라디칼에 의해 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬; 할로겐 및 OH로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 라디칼에 의해 임의로 치환된 (C₁-C₆) 알케닐; 할로겐 및 OH로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 라디칼에 의해 임의로 치환된 (C₁-C₆) 알키닐, X(C₁-C₆)알킬 (여기서, X는 S, O 또는 OCO이고, 알킬은 할로겐 및 OH로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 라디칼에 의해 임의로 치환된다); 적어도 하나의 할로겐, YSO₃H, YSO₂(C₁-C₆)알킬 (여기서, Y는 O 또는 NH이고, 알킬은 적어도 하나의 할로겐, 2가 라디칼 -X1-(C₁ -C₂)알킬렌- X1- (여기서, X₁은 O 또는 S이다)에 의해 임의로 치환된다); 및 인돌린 환에 융합된 벤젠 환으로 구성된 군으로부터 선택되고;

n은 O 내지 4이고;

R²가 CH₂R⁴ (여기서, R⁴는 할로겐 및 OH로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 라디칼에 의해 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬이다); (CH₂)_pZ(CH₂)_qCH₃ (여기서, Z는 O 또는 S이고, p는 O 내지 5이고, q는 O 내지 5이되, 단, p+q는 O 내지 5이다); (C₂-C₆) 비치환된 알킬; 또는 (C₃-C₆) 사이클로알킬이거나;

R²는 각각 적어도 하나의 할로겐에 의해 임의로 치환된 (C₁-C₆)알킬 또는 O(C₁-C₆)알킬이고;

R³은 H; 적어도 하나의 할로겐에 의해 임의로 치환된 (C₁-C₆)알킬; (CH₂)_PZR⁵ (여기서, p는 1 내지 3이고, Z는 O 또는 S이고, R⁵는 H 또는 (C₁-C₃)알킬이다); 벤질임).

화학식(iii)의 화합물은 공지된 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다 (예를 들면, US 6,335,360 (슈와르츠 등) 참조).

그럼에도 불구하고, 화합물은 화학식(i) 및 (ii)로부터 선택되는 것이 바람직하며, 화학식(i)로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 화합물은 R^N1, R^N2 및 R^C1이 상기 또는 하기의 바람직한 예중 임의의 것으로 정의되는 바와 같고, 여기서,

A¹은 G, A, V, L, I, P, S, T, C, N, Q, 2-아미노부티르산, 노르발린, 노르류신, t-부틸 알라닌, 알파-메틸 류신, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 알파-메틸 발린, t-부틸 글리신 또는 2-알릴글리신이고,

A²는 G, A, V, L, I, P, S, T, C, N, Q, F, Y, W, K, R, 히스티딘, 2-아미노부티르산, 노르발린, 노르류신, t-부틸 알라닌, 알파-메틸 류신, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 알파-메틸 발린, t-부틸 글리신, 2-알릴글리신, 오르니틴, 알파, 감마-디아미노부티르산 또는 4,5-데하이드로-리신이고,

A³은 G, A, V, L, I, P, S, T, C, N, Q, D, E, F, Y, W, 2-아미노부티르산, 노르발린, 노르류신, t-부틸 알라닌, 알파-메틸 류신, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 알파-메틸 발린, t-부틸 글리신 또는 2-알릴글리신인 화학식(i)의 화합물일 수 있다.

바람직한 화학식(i)의 화합물

화학식(i)의 화합물의 다양한 기 및 구체적인 일례가 바람직하다.

일반적으로, 천연 (L) 배위의 아미노산, 특히, A² 위치의 것이 바람직하다.

일반적으로, R^N1이 수소이고,

R^N2가

R^N3,

(링커1)-R^N3,

CO-(링커1)-R^N3,

CO-O-(링커1)-R^N3이고,

여기서, (링커1)은 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^N3은 수소 또는 하기의 치환되지 않은 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬;

벤질;

페닐; 또는

모노사이클릭 헤테로아릴중 임의의 것인 것이 바람직하다.

일반적으로, R^C1이

O-R^C2,

O-(링커2)-R^C2, 또는

NH-(링커2)R^C2이고,^,

여기서, (링커2)는 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합, C₁ _-6 알킬 또는 C_2-4 알케닐일 수 있고, 바람직하게, 단일 결합, CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^C2는 수소 또는 하기의 치환되지 않은 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-5 알킬;

벤질;

페닐; 또는

모노사이클릭 C₁ _-10헤테로아릴중 임의의 것인 것이 바람직하다.

일반적으로, N-말단의 치환체와 관련하여, 추가로,

R^N1이 수소이고;

R^N2가 수소, C(=O)-O-(링커1)-R^N3 또는 C(=O)-(링커1)-R^N3이고,

(링커1)이 CH₂ 또는 CH=CH이고,

RN₃이 페닐 또는 2-푸릴인 것이 바람직하다.

추가로,

R^N1이 수소이고;

R^N2가 수소, C(=O)-OCH₂Ph 또는 C(=O)-CH=CH-(2-푸릴)인 것이 바람직하다.

N-말단 상의 치환체에 대하여 바람직한 또다른 기는

R^N1이 수소이고;

R^N2가 벤질옥시카보닐, 벤질, 벤조일, t-부틸옥시카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐 또는 FA, 더욱 바람직하게, 벤질옥시카보닐 또는 FA인 것이다.

일반적으로, C-말단의 치환체와 관련하여,

R^C1이 OH, 0-C₁ _-6 알킬, 0-C₁ _-6 알킬-페닐, NH-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬-페닐, 더욱 바람직하게, OH인 것이 바람직하다.

수개의 바람직한 기는 하기와 같다.

기 (i)(a):

A¹은 G, A, V, L, I, P, 2-아미노부티르산, 노르발린 또는 t-부틸 글리신이고,

A²는 G, A, V, L, I, P, F, W, C, S, K, R, 2-아미노부티르산, 노르발린, 노르류신, t-부틸 알라닌, 알파-메틸 류신, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 알파-메틸 발린, t-부틸 글리신, 2-알릴글리신, 오르니틴 또는 알파, 감마-디아미노부티르산이고,

A³은 G, A, V, L, I, P, F, W, D, E, Y, 2-아미노부티르산, 노르발린 또는 t-부틸 글리신이고,

R^N1은 H이고,

R^N2는 수소, R^N2가 수소, 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-O-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬, 또는 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬이고,

R^C1이 OH, 0-C₁ _-6 알킬, 0-C₁ _-6 알킬-페닐, NH-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬-페닐인 것.

기 (i)(b):

A¹이 G, A 또는 2-아미노부티르산이고,

A²가 L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 2-알릴글리신, P, 2-아미노부티르산, 알파-메틸 류신, 알파-메틸 발린 또는 t-부틸 글리신이고,

A³이 G, A, V, P, 2-아미노부티르산 또는 노르발린이고,

R^N1이 H이고,

R^N2가 수소, 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-O-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬, 또는 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-포 화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬이고,

기 (i)(c):

A¹이 G, A 또는 2-아미노부티르산이고,

A²가 L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신 또는 2-알릴글리신이고,

A³이 G, A, V, P, 2-아미노부티르산 또는 노르발린이고,

R^N1이 H이고,

R^N2가 수소, 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-O-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬, 또는 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬이고,

기 (i)(d):

A¹이 G 또는 A이고,

A²가 L, I 또는 노르류신이고,

A³이 G 또는 A이고,

R^N1이 수소이고,

구체적으로 바람직한 화합물의 제1 세트는

A¹이 G이고,

A²가 L이고,

A³이 G, A, V, L, I, P, F, W, D, E, Y, 2-아미노부티르산, 노르발린 또는 t-부틸 글리신, 더욱 바람직하게, G, A, V, P, 2-아미노부티르산 또는 노르발린, 더욱 바람직하게, G 또는 A이고,

R^N1이 수소이고,

R^N2가 벤질옥시카보닐이고,

R^C1이 OH인 것이다.

구체적으로 바람직한 화합물의 제2 세트는

A¹이 G이고,

A²가 G, A, V, L, I, P, F, W, C, S, 2-아미노부티르산, 노르발린, 노르류신, t-부틸 알라닌, 알파-메틸 류신, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 알파-메틸 발린, t-부틸 글리신 또는 2-알릴글리신, 더욱 바람직하게, L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 2-알릴글리신, P, 2-아미노부티르산, 알파-메틸 류신, 알파-메틸 발린 또는 t-부틸 글리신, 더욱 바람직하게, L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신 또는 2-알릴글리신, 더욱 바람직하게, L, I, 또는 노르류신이고,

A³이 A이고,

R^N1이 수소이고,

R^N2가 벤질옥시카보닐이고,

R^C1이 OH인 것이다.

구체적으로 바람직한 화합물의 제3 세트는

A¹이 G, A, V, L, I, P, 2-아미노부티르산, 노르발린 또는 t-부틸 글리신, 더욱 바람직하게, G, A 또는 2-아미노부티르산, 더욱 바람직하게, G 또는 A이고,

A²가 L이고,

A³이 A이고,

R^N1이 수소이고,

R^N2가 벤질옥시카보닐이고,

R^C1이 OH인 것이다.

바람직하게, 서열 A¹-A²-A³은 GLA, GLF, GVA, GIA, GPA 또는 ALA, 가장 바람직하게, GLA이고,

R^N1이 수소이고,

R^N2가 벤질옥시카보닐이고,

R^C1이 OH이다.

알킬 기가 포화 또는 불포화로서 기술되는 경우, 이는 알킬, 알케닐 및 알키닐 탄화수소 부분을 포함한다.

C₁ _-6 알킬은 바람직하게, C₁ _-4 알킬, 더욱 바람직하게, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 또는 부틸 (분지형 또는 비분지형)이고, 가장 바람직하게는 메틸이다.

C₃ _-12 사이클로알킬은 바람직하게, C₅ _-10 사이클로알킬, 더욱 바람직하게, C₅ _-7 사이클로알킬이다.

"아릴"은 방향족 기, 바람직하게, 페닐 또는 나프틸이고,

한 단어의 일부분으로서 "헤테로"는 바람직하게, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자(들)를 함유한다는 것을 의미한다.

"헤테로아릴"은 바람직하게, 피리딜, 피롤릴, 퀴놀리닐, 푸라닐, 티에닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이소옥사졸릴, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 피리미디닐, 인돌릴, 피라지닐, 인다졸릴, 피리미디닐, 티오페네틸, 피라닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 푸리닐, 신놀리닐, 또는 프테리디닐이다.

"비-방향족 헤테로사이클릴"은 바람직하게, 피롤리디닐, 피페리딜, 피페라지닐, 모르폴리닐, 테트라하이드로푸라닐 또는 모노사카라이드이다.

"할로겐"은 바람직하게, Cl 또는 F, 더욱 바람직하게, Cl이다.

추가의 바람직한 화학식(i)의 화합물

일반적으로, A¹은 바람직하게, G, A 또는 2-아미노부티르산, 더욱 바람직하게, G 또는 A로부터 선택될 수 있다.

일반적으로, A²는 바람직하게, L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 2-알릴글리신, P, K, 2-아미노부티르산, 알파-메틸 류신, 알파-메틸 발린 또는 t-부틸 글리신, 더욱 바람직하게, L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 2-알릴글리신, P 또는 K, 더욱 바람직하게, L, I, 노르류신, P 또는 K, 더욱 바람직하게, L 또는 P로부터 선택될 수 있다.

일반적으로, A³은 바람직하게, G, A, V, P, 2-아미노부티르산 또는 노르발린, 더욱 바람직하게, G 또는 A로부터 선택될 수 있다.

일반적으로, R^N1이 수소인 것이 바람직하다.

일반적으로, R^N2는 바람직하게,

R^N3,

(링커1)-R^N3,

CO-(링커1)-R^N3,

CO-O-(링커1)-R^N3이고,

R^N3이 수소 또는 하기의 치환되지 않은 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬;

벤질;

페닐;

나프틸; 또는

모노사이클릭 헤테로아릴중 임의의 것이다.

일반적으로, R^N2는 더욱 바람직하게, 수소, 벤질옥시카보닐, 벤질, 벤조일, t-부틸옥시카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐 또는 FA, 더욱 바람직하게, 수소, 벤질옥시카보닐 또는 FA이다.

일반적으로, R^C1이

O-R^C2,

O-(링커2)-R^C2, 또는

NH-(링커2)R^C2이고,

여기서, (링커2)는 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, C_1-6 알킬 또는 C₂ _-4 알케닐일 수 있고, 바람직하게, 단일 결합 또는 CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^C2가 수소 또는 하기의 치환되지 않은 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-5 알킬;

벤질;

페닐; 또는

모노사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴중 임의의 것인 것이 바람직하다.

일반적으로, R^C1이 OH, 0-C₁ _-6알킬, 0-C₁ _-6 알킬-페닐, NH₂, NH-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C_1-6 알킬-페닐, 더욱 바람직하게, OH, 0-C₁ _-6 알킬, NH₂, 또는 NH-C₁ _-6 알킬, 더욱 바람직하게, OH 또는 NH₂이다.

특히 관심의 대상이 되는 화합물은 A²가 P인 화합물이다.

특히 관심의 대상이 되는 화합물은 R^C1이 NH₂인 화합물이다.

일반적으로, 하기 아미노산: F, W, D, E 및 Y는 A³에 대하여 덜 바람직하다. 유사하게, 일반적으로 A³은 P 및/또는 E가 아닌 것으로 선택될 수 있는데, 이는 보다 낮은 활성을 나타내는 것을 함유하는 화합물 때문일 수 있다.

바람직한 화학식( ii )의 화합물

화학식(ii)의 화합물은

R'이 CH₂CH₃, 또는 CH₂CH₂CH₃이고,

R"가 CH₂CH₂CH₃, 또는 CH(CH₃)₂이고,

R'"이 H, 또는 Cl인 것이 바람직하다.

바람직한 화학식( iii )의 화합물

화학식(iii)의 화합물의 다양한 기 및 구체적인 일례는 개별적으로 슈와르츠 등의 US 6,335,360 B1의 청구항중 어느 하나에서 정의된 바와 같다.

화학식(i)의 치료학적 화합물의 일례는 Z-GLA-OH, 즉, Z 기를 갖는 N-말단을 유도화되고, C-말단을 유도화되지 않은 트리펩티드 GLA이다. Z는 벤질옥시카보닐을 나타낸다. 이는 R^N1이 H이고, R^N2가 Z이고, A¹이 G이고, A²가 L이고, A³이 A이고, R^C1이 OH인 화학식(i)의 화합물이다. 상기 화합물은 바켐 아게로부터 구입가능하고, 진핵생물 TPP II의 세균 상동체인 섭틸리신을 저해하는 것으로 밝혀졌다. Z-GLA-OH의 가격은 저렴하고, 감마-방사선 조사를 사용하는 요법에 대하여 내성을 띠는 종양의 생체내 거부를 유도하는데 잘 작용한다. 요법에 내성을 띠는 암에 관한 신규한 치료법이 실질적으로 공중 위생에 대한 관심의 대상이 된다.

바람직한 화합물은 본 발명에 따라 GLA를 함유하는 것, Z-GLA-OH, Bn-GLA- OH, FA-GLA-OH 및 H-GLA-OH, 예를 들면, Z-GLA-OH를 포함하고; 본 발명에 따라 본원의 임의이 화합물 또는 화합물의 기에 관한 임의 개시는 서열 A¹A²A³은 GLA1이 아니라는 조건, 또는 화합물은 Z-GLA-OH, Bn-GLA-OH,FA-GLA-OH 또는 H-GLA-OH로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 아니라는 조건, 또는 화합물은 Z-GLA-OH가 아니라는 조건의 대상이 될 수 있다.

표준 감마-방사선 조사 치료에 대하여 반응하지 못한 종양 치료시, 악성 질환을 앓는 환자에서 상기 치료를 개선시키기 위하여, 예를 들면, 고형 종양에서 상기 치료에 대한 생체내 반응을 증가시키기 위하여 Z-GLA-OH또는 본원에 기술된 다 른 화합물을 투여할 수 있다.

다른 바람직한 화합물은 A¹A²A³이 GPG, 예로서, GPG-NH₂ 또는 Z-GPG-NH₂인 것을 포함한다.

숙련인은 본원에 기술된 화합물이 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 비경구, 예로서, 정맥 또는 피하, 경구, 경피, 비내, 흡입에 의해, 또는 직장 투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 화합물은 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 약제학적으로 허용가능한 부가염의 일례는 무기산, 예로서, 염화 수소산, 브롬화 수소산, 염산, 메타인산, 질한 및 황산, 및 유기산, 예로서, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 클로콘산, 숙신산, 및 아릴설폰산으로부터 유도된 것을 포함한다. 본원에 기술된 약제학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들면, 비히클, 애주번트, 담체 또는 희석제는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 공공연히 쉽게 이용될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 활성 화합물에 화학적으로 불활성이고, 사용 조건하에서 유해한 부작용 또는 독성을 갖지 않는 것일 수 있다. 약제학적 제형은 예컨대, 문헌 [Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995)]에서 찾아볼 수 있다.

조성물은 임의의 투여 경로, 예컨대, 경구, 정맥, 피부 또는 피하, 비강, 근 육내, 또는 복강내 투여용으로 제조될 수 있다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질이 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 비경구 투여의 경우, 발열성 물질 무함유 물이고, 필요한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는, 비경구적으로 허용가능한 수용액이 사용될 수 있다. 당업자는 적합한 용액을 잘 제조할 수 있고, 다수의 방법이 문헌에 기재되어 있다. 약물 전달 방법에 관한 간단한 리뷰는 또한 예컨대, 문헌 [Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]에서도 찾아볼 수 있다.

본 발명과 관련하여 포유동물, 특히 인간에게 투여되는 투여량은 적당한 시간 내에 포유동물에서 치료학적 반응을 일으키기에 충분하여야 한다. 당업자는 투여량이 환자의 연량, 증상 및 체중 뿐만 아니라, 질환의 단계/중증도를 비롯한 다양한 인자에 의존한다는 것을 인지할 것이다. 투여량은 또한 투여 경로 (투여 형태)의 시간 조절 및 빈도에 의해 결정될 것이다. 경구 투여의 경우, 투여량은 예를 들면, 약 0.01 mg 내지 약 10 g, 바람직하게, 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg, 더욱 바람직하게, 약 10 mg 내지 약 1000 mg/일의 화합물, 또는 상응하는 양의 그의 약제학적으로 허용가능한 염으로 다양할 수 있다.

화합물은 감마-방사선 조사 이전, 그 동안, 또는 그 이후에 투여될 수 있다.

TPP II의 활성을 저해하는 것에 관하여 화합물을 스크린하는 방법은 숙련인에게 명확하다. TPP II 단백질은 제1 단계에서 정제될 수 있고, TPP II-선호 형광성 기질이 제2 단계에서 사용될 수 있다. 이로써 TPP II 활성을 측정하는 효과적인 방법을 얻게 되었다.

특별히 고수준으로 정제할 필요는 없으며, 스크리닝 방법에서 사용하기에 충 분한 양의 TPP II를 수득하기 위하여 종래의 간단한 기법이 사용될 수 있다. TPP II를 정제하는 비-제한적인 일례로, 100 x 10⁶개의 세포 (예로서, EL-4 세포)를 침전시키고, 유리 비드 및 균질화 완충액 (50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 250 mM 수크로스, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT)에서 와동시킴으로써 용해시켰다. 세포 용해물을 차등 원심분리시키는데; 먼저 세포 균질액을 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 초원심분리관으로 옮겼다. 이어서, 샘플을 100,000 x g에서 1시간 동안 초원심분리하고, 상등액 (대부분의 생화학 문헌에서는 세포질으로서 나타냄)을 100,000 x g에서 5시간 동안 원심분리함으로써, 이는 고분자량의 세포질 단백질/단백질 복합체로 침전되었다. 50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 30% 글리세롤, 5 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT에 용해된 생성된 펠릿, 및 1 ug의 고분자량의 단백질을 펩티다제 검정법에서 효소로서 사용하였다.

예를 들면, 기질 AAF-AMC (미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마(Sigma))를 사용하여 TPP II의 활성을 측정할 수 있다. 50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 5 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT로 구성된, 100 ul의 시험 완충액중 100 uM의 농도로 사용될 수 있다. 900 ul 1% SDS 용액으로 희석시켜 반응을 종결시킬 수 있다. 절단 활성은 예를 들면, LS50B 발광 분광광도계 (매사추세츠주 보스톤 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에서 460 nm에서의 발광에 의해 측정될 수 있다.

(i) 종양 세포를 마우스 내로 접종하는 단계; (ii) 상기 마우스에 감마선을 조사하고, 상기 마우스에 화합물을 투여하는 단계; 및 (iii) 일정한 시간 간격을 두고 종양 크기를 측정하는 단계를 포함하는 생체내 모델에서 사용될 때 본 발명에서 사용되는 화합물은, 대조군 실험과 비교하여 부분적으로, 또는 바람직하게는 완전히 종양을 퇴행시키는 것으로서 정의될 수 있다. 감마-방사선 조사 단계는 대조군 실험에서는 생략된다. 종양 성장 실험의 추가의 상세한 설명 및 일례는 하기에 기술되어 있다. 본 발명자들은 감마-방사선 조사 치료법을 적용한 이후 즉시 화합물을 주사하는 것이 편리하다는 것을 발견하게 되었지만, 본 발명은 이러한 투여 순서로 제한하고자 하는 것이 아니라는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 사용되는 화합물은 감마-방사선 조사, 예를 들면, 본원에 기술된 방법으로, 감마-방사선 조사와 병용하여 적용될 때 생체내에사 부분적으로 또는 바람직하게는 완전하게 종양 퇴행을 일으킨다.

본 발명에서 사용되는 화합물은 충분히 혈청-안정성이고, 즉, 생체내에서 원하는 치료학적 효과를 발휘하기에 충분히 긴 시간 동안 그의 본질을 유지한다.

이론으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명은 이에 요약되는 첨부 도면을 참고로 하여 비제한적인 하기 실시예에서 더욱 상세히 기술될 것이다.

도 1. 감마-방사선 조사 노출에 의한 성장 정지 조절에서 TPP II. (A) 1 μM 워트마닌의 존재 또는 부재하에 1000 Rad의 감마-방사선 조사에 노출된 EL-4 세포로부터의 세포 용해물의 항-TPP II를 이용한 웨스턴 블롯팅 분석과; 25 μM NLVS의 존재하에 추후 워트마닌에 노출된 것의 상기와 같은 웨스턴 블롯팅 분석(우측 래인). (B) 공 pSUPER 벡터 (EL-4.wt로 표시, 흰색 막대(empty bars)) 또는 pSUPER-TPP IIⁱ (항-TPP II siRNA, EL-4.TPP IIⁱ로 표시, 검은색 막대(filled bars))로 안정하게 형질감염된 EL-4 세포로부터의, 고분자량의 세포질 단백질에 의해 측정된 TPP II 활성 (AAF-AMC의 효소적 절단, 상단) 및 발현 (항-TPP II를 이용한 웨스턴 블롯팅, 하단). AAF-CMK는 세린 펩티다제 저해제이다. (C) 처리하지 않은 채로 남겨두거나 (좌측 패널), 감마-방사선 조사를 하고 (5 Gy), 1시간 후에 분석을 한, EL-4.wt (상단) 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포 (하단)에서의 TPP II의 면역-세포 화학적 분석. DAPI는 핵 염색에 대한 대조군으로서 사용되었다. (D) ³H-티미딘 혼입에 의해 측정된 1000 Rad에 노출된 이후의 감마-방사선 조사받은 EL-4.wt (개방형 기호) 및 EL-4. TPP IIⁱ 세포 (폐쇄형 기호)의 DNA 합성 (막대는 ± 표준 편차를 표시한다). (E) 10 Gy의 감마-방사선 조사에 노출되기 이전 또는 노출 후 20시간이 경과한 이후의 EL-4.wt (상단) 대 EL-4. TPP IIⁱ 세포 (하단)의 세포 주기 분석. (F) 2.5 Gy of 감마-방사선 조사에 노출된 EL-4.wt 대조군 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서의 포스포-Ser139-H2AX (감마-H2AX) 발현.

도 2. TPP II 발현이 p53 안정화에 필요시 된다. 지시한 세포를 감마-방사선 조사 (10 Gy)에 노출시킨 이후, 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석: (A) EL-4.wt 대조군 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서의 p53 발현. (B) EL-4.wt 대조군 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서의 p21 발현. (C) EL-4.pcDNA3 대조군 대 EL-4.pcDNA3-TPP IIⁱ 세포에서의 p53 발현. (D) EL-4.wt 대 EL-4. TPP IIⁱ 세포의 용해물로부터의 p53-면역침전물 (상단); 또는 1 μM 워트마닌로 처리된 EL-4.wt 세포로부터의 p53-면역침전물 대 비처리군 (하단)을 사용한, TPP II의 웨스턴 블롯팅 분석. 래인에서 "+"로 표지한 것은 감마-방사선 조사받은 세포를 나타내는 반면, "-"는 비처리군을 나타낸다 (용해 이전에 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션시킴). (E) 감마-방사선 조사에 노출된 ALC.pcDNA3 대 ALC.pSUPER-TPP IIⁱ (좌측), YAC-1 대 YAC-1.pSUPER-TPP IIⁱ (중간), 및 LLC.pSUPER 대조군 대 LLC.TPP IIⁱ 세포 (우측)에서의 p53 발현.

도 3. TTPP II 는 PIKK 신호 전달에 반응하는 경로를 조절한다. (A) EL-4.wt 대조군 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포 (상단), 또는 EL-4.pcDNA3 대 EL-4.pcDNA3-TPP II IIⁱ (하단)에서 Akt 키나제 발현, 전체 Akt 및 Ser473-인산화된 (p-Akt)의 웨스턴 블롯팅 분석. (B) 혈청 함량이 높거나 (5%, 좌측), 낮은 (1 %, 우측) 세포 배양 배지에서 EL-4.wt 및 EL-4.TPP IIⁱ 세포의 시험관내 성장. 살아있는 세포 (흰색 원(empty circle)) 및 죽은 세포 (검은색 원(filled circle))를 계수하였다. (C) 혈청 함량이 높거나 (5%, 흰색 원), 낮은 (0.5%, 검은색 원) 세포 배양 배지에서 EL-4.pcDNA3 및 EL-4.pcDNA3-TPP II 세포의 시험관내 성장. (D) 25 μM 에토포시드에 노출된 EL-4.wt 대조군 세포 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서의 웨스턴 블롯팅 분석 에 의한 XIAP 발현. (E) 유동 세포 분석법에 의해 분석된 것으로, pSUPER-TPP IIⁱ 플라스미드를 발현하거나 (우측 패널), 발현시키지 못한 (좌측 패널) EL-4 (좌측) 및 YAC-1 (우측) 림프종 세포의 세포 표면 Rae-1 발현. 여백이 채워진 곡선은 단지 접합체만으로 염색된 세포를 나타낸다.

도 4. TPP II 는 p53 안정화를 매개하는 상호작용을 조절한다.

(A) BRCA1 (마우스), 53BP1 (인간), MDC1 (인간), C19G10 7 (S. 폼베(S. pombe)) 및 Rev1 (S. 세레비지애(S. cerevisiae))에서, 앞서 기술된 BRCA C-말단 반복부 도메인을 갖는 마우스 대 인간 TPP II (a. a. 715-813)의 서열 정렬. U는 소수성 아미노산을 표시한다 (문헌 [Bork, P, Hofmann, K, Bucher, P, Neuwald, AF, Altschul, SF, Koonin, EV. A superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins. FASEB J. 1997;11:68-76]). (B) 1000 Rad 감마-방사선 조사에 노출되거나, 비처리 상태로 남겨진, EL-4.TPP II^wt 또는 EL-4.TPP II^wt/G725E 세포로부터의 세포 용해물을 사용한 TPP II의 웨스턴 블롯팅 분석. (C) 1000 Rads의 감마-방사선 조사에 노출된 EL-4.TPP II^wt 또는 EL-4.TPP II^wt/G725E 세포에서의 p53 발현. (D) 1000 Rad 감마-방사선 조사에 노출되거나, 비처리 상태로 남겨진, EL-4.TPP II^wt 또는 EL-4.TPP II^wt/G725E 세포로부터의 p53-면역침전물을 사용한 TPP II의 웨스턴 블롯팅 분석. (E) (좌측) ATM, (중간) Mre11, (우측) 53BP1에 특이적인 항-혈청을 사용하여, NLVS로 처리된 것 대 비처 리군으로서, EL-4.wt 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포의 용해물로부터 p53-면역침전물의 웨스턴 블롯팅 분석. 래인에서 "+"로 표지한 것은 감마-방사선 조사받은 세포를 나타내는 반면, "-"는 비처리군을 나타낸다.

도 5. TPP II 는 감마-방사선 조사에 대한 생체내 종양 내성에 필요시 된다. (A, B). 화살표로 표시한 시점에 4 Gy의 감마-방사선을 조사받은 동계 C57Bl/6 마우스에서 10⁶개의 EL-4.wt (A) 또는 EL-4.TPP IIⁱ 세포 (B)의 종양 성장. (C) 비처리 상태로 남겨지거나 (상단), 화살표로 표시한 시점에 4 Gy의 감마-방사선을 조사받은 (하단) 동계 C57Bl/6 마우스에서 5 x 10⁶개의 EL-4.ATMⁱ 세포의 종양 성장. (D) 비처리 상태로 남겨지거나 (상단), 감마-방사선 조사받은 (하단) 동계 C57Bl/6 마우스에서 5 x 10⁶개의 EL-4.TPP II^wt/G725E 세포의 종양 성장.

도 6. 섭틸리신 저해제 Z- Gly - Leu - Ala - OH 는 TPP II 를 저해하고, 생체내 종양을 효과적으로 방사선 감작시킨다 . (A) 형광측정법에 의해 측정된 Z-GLA-OH 또는 부타빈디드의 존재하의 부분적으로 정제된 TPP II 효소에 의한 AAF-AMC 절단. (B) 비처리 상태로 남겨지거나 (8마리의 마우스, 흰색 원), 감마-방사선 조사 처리되거나 (7마리의 마우스, 검은색 원, 4 Gy의 선량을 화살표로 표시), Z-GLA-OH 주사 (13.8 mg/kg, +로 표시) 뿐만 아니라, 감마-방사선 조사도 처리된 (8마리의 마우스, 십자 모양을 갖는 원) 동계 C57Bl/6 마우스에서 10⁶개의 EL-4 림프종 세포의 종양 성장. 데이타는 평균 종양 크기를 나타낸다. (C) Z-GLA-OH 주사와 병용하여 3 Gy, 2 Gy 또는 1 Gy의 감마-방사선 조사 선량으로 처리된 동계 C57Bl/6 마우스 (좌측 패널), 대 4 Gy의 감마-방사선 조사 선량만으로 처리되거나, Z-GLA-OH만으로 처리된 동계 C57Bl/6 마우스, 및 비처리된 동계 C57Bl/6 마우스 (중간 패널)에서 10⁶개의 EL-4 림프종 세포의 종양 성장. 3 Gy의 감마-방사선 조사 선량과 지시된 용량의 Z-GLA-OH로 처리된, C57Bl/6 마우스로 접종된 10⁶개의 EL-4 림프종 세포의 종양 성장 (우측 패널). C에서는 크기가 보다 큰 종양에서 차이를 보다 잘 시각화시키기 위해 선형 스케일을 사용하였다. (D) Z-GLA-OH의 존재 (하단) 또는 부재 (상단)하에 비처리 상태로 남겨지거나 (흰색 사각형), 감마-방사선 조사 처리된 (4 Gy의 선량을 화살표로 표시) 동계 C57Bl/6 마우스에서 10⁶개의 루이스 폐 암종 (LLC) 세포의 종양 성장. C와 D에서 모든 데이타 점은 4마리 이상의 마우스로부터 얻은 데이타를 나타낸다. (F) 비처리 상태로 남겨지거나 (흰색 원), Z-GLA-OH를 주사 맞거나 (흰색 사각형), Z-GLA-OH를 주사 맞고 감마-방사선 조사 처리된 (검은색 원, 1회 선량당 1.5 Gy, 화살표로 표시, 검은색 원) CB.17 SCID 마우스에서 5 x 10⁶개의 HeLa 세포 (인간 자궁경부 암종)의 종양 성장.

도 7. 새로 형질전환된 백혈병 세포의 생체내 방사선- 감작화

(A) pMSCV-Bcl-xL-IRES-EGFP 및 pMSCV-c-Myc-IRES-EYFP로 형질도입된 줄기 세포의 이식 후 13일째 DBA/2 비장 세포의 유동 세포 분석. (B) 감마-방사선 조사 처리 및 Z-GLA-OH의 존재 또는 부재하의 DBA/2-c-myc/Bcl-xL 세포의 생체내 종양 성장. (C-G) 비처리된 종양-수반 마우스 (C-E) 대 처리된 (감마-방사선 조사 및 Z-GLA-OH) 마우스 (F, G)로부터 유래된 조직내 벡터 코딩된 YFP (c-Myc+) 및 GFP (Bcl-xL+)의 유동 세포 분석적 검출, 사용된 조직은 피하 종양 (C), 폐 (D, F), 및 비장 (E, G)이었다. 상단 패널에 나타낸 게이트는 하단 패널에서 GFP/YFP-형광에 대한 분석된 세포에 상응한다. (H-J) 처리되지 않았거나 (H), 감마-방사선 조사 처리되었거나 (I), 감마-방사선 조사 및 Z-GLA-OH, 둘 모두가 처리된 (J) DBA/2-c-Myc/Bcl-xL 세포를 접종받은 마우스로부터의 얻은 간의 조직학적 단면. 화살표는 종양 세포로 충진된 동굴 모양의 혈관을 나타낸다.

도 8. 감마-방사선 조사와 병용된 GPG - NH ₂ 또는 Z- GPG - NH ₂ 를 사용한 생체 처리에 대한 강한 반응

감마-방사선 조사만으로 처리되거나, Z-GLA-OH, GPG-NH₂ 및 Z-GPG-NH₂, 각각과 병용하여 감마-방사선 조사 처리된, EL-4 종양을 수반하는 마우스에서 시간에 따른 (가로축, 경과일수) 종양 크기 (세로축, ㎣).

도 9. TPP II 의 저해가 Mre11 초점 형성에 영향을 준다

추가의 면역세포 화학적 실험 결과는 나타낸다. 루이스 폐 암종 (LLC, A), ALC (B) 및 YAC-1 (C) 세포를 pSUPER-TPP IIⁱ, 또는 공 pSUPER 벡터로 안정적으로 형질감염시키고, 5 Gy의 감마-방사선 조사에 노출시켰다. 도에 제시되어 있는 바와 같이, TPP II 및 Mre11의 면역세포 화학적 발현을 측정하였고, DAPI는 핵 대조군 염색을 위해 사용하였다.

사용된 재료 및 방법은 하기와 같았다:

세포 및 배양 조건. EL-4는 C57Bl/6 마우스계로부터 유래된, 벤즈피렌-유도 림프종 세포주이다. EL-4.wt 및 EL-4.TPP IIⁱ는 공 pSUPER 벡터 대 TPP II에 대한 siRNA를 함유하는 pSUPER 벡터 (문헌 [Brummelkamp, TR, Bernards, R, Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 2002;296:550-3])로 형질감염된 EL-4 세포이다. HeLa 세포는 인간 자궁경부 암종 세포이다. YAC-1는 A/Sn 마우스계로부터 유래된, 몰로니 백혈병 바이러스-유도 림프종 세포주이다. ALC는 C57Bl/6 마우스계로부터 유래된, 방사선 백혈병 바이러스 D-RadLV에 의해 유도된 T 세포 림프종이다. DNA 합성을 측정하기 위하여 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 16 또는 36시간 후에 ³H-티미딘을 가하고, 6시간 동안 인큐베이션시킨 후 세척하였다. 스트레스를 유도하기 위하여 세포에 500 - 1000 Rad's로 감마선 조사하거나, 50%-75% 인산염 완충처리된 염수(PBS)에서 성장에 굶주리게 하고; 37℃ 및 5.3% CO₂에서 인큐베이션시켰다.

효소 저해제. NLVS는 키모트립신형 펩티다제 활성을 우선적으로 표적하고, 살아있는 세포에서 프로테오좀 분해를 효과적으로 저해하는, 프로테오좀 저해제이다. 부타빈디드(Butabindide)는 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Rose, C, Vargas, F, Facchinetti, P, Bourgeat, P, Bambal, RB, Bishop, PB, et. al. Characterization and inhibition of a cholecystokinin-inactivating serine peptidase. Nature 1996;380:403-9]). Z-Gly-Leu-Ala-OH (Z-GLA-OH)는 TPP II의 것과 상동성인 활성 부위를 갖는 세균 효소인 섭틸리신의 저해제 (독일 바일 암 라인에 소재하는 바켐)이다. 워트마닌(Wortmannin)은 PIKK (PI3-키나제-관련)-계열 키나제 (미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마)의 저해제이다. 모든 저해제를 DMSO에 용해시키고, 사용시까지 -2O℃에 저장하였다.

단백질 정제, 펩티다제 검정법 및 DNA 단편화 분석. 100 x 10⁶개의 세포를 침전시키고, 유리 비드 및 균질화 완충액 (50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 250 mM 수크로스, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT)에서 와동시킴으로써 용해시켰다. 세포 용해물을 차등 원심분리시키는데, 이 경우, 1시간 동안 100,000 x g에서 원심분리하여 얻은 상등액 (세포질)은 3-5시간 동안 100,000 x g에서 원심분리함으로써, 이는 고분자량의 세포질 단백질/단백질 복합체로 침전되었다. 50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 30% 글리세롤, 5 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT에 용해된 생성된 펠릿, 및 1 ㎍의 고분자량의 단백질을 TPP II 발현에 관한 펩티다제 검정법 또는 웨스턴 블롯팅에서 효소로서 사용하였다. TPP II의 활성을 시험하기 위하여 본 발명자들은 50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 5 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT로 구성된, 100 ㎕의 시험 완충액중 100 μM 농도의 기질 AAF-AMC (미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마)를 사용하였다. 절단 활성은 LS50B 발광 분광광도계 (매사추세츠주 보스톤 소재의 퍼킨 엘머)에서 460 nm에서의 발광에 의해 측정하였다. DNA 단편화 분석을 위하여 세포를 10⁶개 세포/ml로 12-웰 플레이트에 시딩하고, 아포프토시스-유도화제로서 통상 사용되는 DNA 토포아이소머라제 II 저해제인, 25 μM 에토포시드에 노출시켜 굶주리게 하였다 (50% PBS). 세포를 10⁶개 세포/ml로 12-웰 플레이트에 시딩하고, 지정된 시간, 일반적으로 18-24시간 동안 인큐베이션시켰다. EL-4 대조군 및 적응된 세포를 표준 클로로포름 추출에 의해 정제하고, 아포프토시스 세포로부터의 DNA 검출을 위해 2.5 ㎍의 DNA를 1.8% 아가로스 겔 상에 로딩하였다.

플라스미드 및 유전자 형질감염. TPP II siRNA-발현 pSUPER (문헌 [Brummelkamp, TR, Bernards, R, Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells Science 2002,296 550-3]) 플라스미드를 하기와 같이 작제하였다. 인산화되지 않은 DNA 올리고머 (독일 울름에 소재하는 써모 하이베이스(Thermo Hybaid))를 3 ㎍/㎕의 농도로 재현탁시켰다. 1 ㎕의, 각각의 올리고 쌍 올리고 쌍을 48 ㎕의 어닐링 완충액 (100 mM KAc; 30 mM HEPES-KOH pH 7.4; 2 mM MgAc)과 혼합하고, 95℃로 4분 동안, 70℃로 10분 동안 가열하고, 서서히 실온으로 냉각시켰다. 앞서 기재되어 있는 바와 같이 (문헌 [Brummelkamp, TR, Bernards, R, Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells Science 2002,296 550-3]), 2 ㎕의 어닐링된 올리고머를 100 ng의 pSUPER 플라스미드 (BgIII 및 HindIII로 분해됨)와 혼합하고, 결찰시키고, 형질전환하고, Amp/LP 플레이트 상에 플레이팅시켰다. EcoRI-HindIII 분해 및 DNA 서열 분석에 의해 삽입체의 존재에 관하여 콜로니를 스 크리닝하였다. pSUPER-TPP IIⁱ에 대한 어닐링된 올리고머 쌍은 하기와 같았다: 전방 프라이머:

5'GATCCCCGATGTATGGGAGAGGCCTTTCAAGAGAAGGCCTCTCCCATACATCTTTTT GGAAA-3'; 역 프라이머:

5'AGCTTTTCCAAAAAGATGTATGGGAGAGGCCTTCTCTTGAAAGGCCTCTCCCATACA TCGGG-3'

안정적인 형질감염체를 생성하기 위하여 5 x 10⁶개 세포를 PBS에서 세척한 후, 바이오-래드(Bio-Rad)-유전자-펄스기중 500 ㎕ PBS에 재현탁시키고, 250 V, 960 μF로 10 ㎍ DNA를 사용하여 펄스를 가하고; G418 항체 및 항혈청에 대한 내성에 대하여 선별하였다.

항체 및 항혈청. 하기 분자들은 언급되는 항체에 의해 검출하였다: 래빗 항-Akt 혈청(매사추세츠주 비벌리에 소재하는 셀 시그날링 테크놀러지(Cell Signaling Technology))에 의한 Akt; 193H2 래빗 항-포스포-Akt 혈청 (매사추세츠주 비벌리에 소재하는 셀 시그날링 테크놀러지)에 의한 포스포-Akt (Ser 473); 래빗 항-감마-H2AX (매사추세츠주 비벌리에 소재하는 셀 시그날링 테크놀러지)에 의한 감마-H2AX; 다중클론 래빗 항-인간 Mre11 (매사추세츠주 비벌리에 소재하는 셀 시그날링 테크놀러지)에 의한 Mre11; SX118 (미네소타주 미니애폴리스에 소재하는 R & D 시스템즈(R & D Systems))에 의한 p21; p53 (미네소타주 미니애폴리스에 소재하는 R & D 시스템즈); 단일클론 Rat 항-마우스 Rae-1, 199215 (미네소타주 미니애폴리스에 소재하는 R & D 시스템즈)에 의한 Rae-1; 단일클론 마우스 항-인간 XIAP, 117320 (미네소타주 미니애폴리스에 소재하는 R & D 시스템즈)에 의한 XIAP. TPP II 검출을 위해 본 발명자들은 닭 항-TPP II 혈청 (스웨덴 웁살라에 소재하는 이뮨시스템(Immunsystem))을 사용하였다. 표준 기법에 의해 웨스턴 블롯을 실시하였다. BCA 단백질 검정법 시약 (피어스 케미칼 코포레이션(Pierce Chemical Co.))에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 달리 언급하지 않는 한, 분리용 레인 1개당 5 ㎍의 단백질을 로딩하였다.

면역조직학적화학법. 사이토스핀을 통해 세포를 유리 커버 슬립에 부착시키고, 1시간 동안 아세톤 메탄올 (1 ℓ)에서 고정시킨 후, 슬라이드를 1시간 동안 BSS 완충액중에서 재수화시켰다. 1차 항체를 가하고, BSS에서 간단히 세척할 때까지 1시간 동안 방치한 후, 2차 접합체 (항-래빗-FITC)를 가하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 슬라이드를 세척하고, 30분 동안 훽스트 333258로 염색하였다. 마지막으로, DABCO 부착용 완충액을 사용하여 슬라이드에 고정시키고, 분석시까지 4℃에서 보관하였다.

유동 세포 분석법. 세포 표면 Rae-1 항원을 염색하기 위하여 본 발명자들은 0.5-1.0 x 10⁶개의 세포를 20 ㎍/ml의 Rae-1 단일클론 항체 199215 (미네소타주 미니애폴리스에 소재하는 R & D 시스템즈) 50 ㎕와 함께 인큐베이션시키고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. PBS에서 세척한 후, 본 발명자들은 순차적으로 비오티닐화된 다중클론 래빗 항-Rat Ig (덴마크 글로스트룹에 소재하는 다코 사이코마티온(Dako Cytomation)) 및 스트렙트아비딘-FITC (캘리포니아주 샌디에고에 소 재하는 파르미고겐(Pharmingen))와 함께 인큐베이션시켰는데, 여기서, 각 단계 후에는 PBS로 세척하였다. FACScalibur에 의해 형광을 정량하였다. 세포를 2 ㎍/ml의 프로피디움 요오드화물 (PI)과 함께 5분 동안 인큐베이션시킨 후, FACSvantage를 사용하여 PI⁺ 및 PI^- 군집으로 분류함으로써 살아있는 세포의 유동 세포 분석적 세포 분류를 실시하였다.

종양 성장 실험. 종양 세포를 PBS에서 세척하고, 접종물당 200 ㎕의 용량에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 마우스 1마리당 10⁶개로 우측 옆구리에 접종하고, 1주일에 2회씩 측정하여 종양 성장을 모니터하였다. 마우스의 항-종양 치료법의 개시는 각 마우스에서 종양이 성장하기 시작하는 시점에 따라 어느 정도까지는 개별적으로 이루어졌다. 항-종양 면역 반응을 저해하기 위하여 종양 접종 이전에 4 Gy로 마우스에 방사선 조사하였다. 종양 부피는 (a₁ x a₂ x a₃)/2 (수를 표시하는 기호는 종양 직경, 폭, 및 깊이를 나타낸다)에 따라, 종양이 성장함에 따른 마우스에서의 평균 부피로서 계산하였다. 성장의 일반적인 패턴은 사실상 모든 마우스에서 유사하지만, 최초 촉진 시기는 상이한 마우스 간에는 서로 상이하였다. 대부분의 도표에서는 작은 종양에 대한 치료학적 효과를, 즉, 완전히 거부되었음을 보다 잘 시각화시키기 위하여 로그 스케일을 사용한다. 생체내 TPP II의 저해를 위해 본 발명자들은 13.8 mg/kg (체중) (14 ㎕의 50 mM 용액/마우스)의 섭틸리신 저해제 Z-Gly-Leu-Ala-OH (Z-GLA-OH, 독일 바일 암 라인에 소재하는 바켐)를 주당 2회씩 복강내 주사하고, 200 ㎕ PBS로 희석하였다. 모든 감마-방사선 조사를 전 신체에 노 출시켰다.

레트로바이러스 형질도입 및 이식. 실시예 7을 참고하여, 하기 프라이머 5'ACGTGAATTCCACCATGCCCCTCAACGTTAGCTTC 및 3'TACGTCTCGAGCTTACGCACAAGAGTTCCGTAG를 사용함으로써 PCR에 의해 c-Myc에 대한 서열을 인간 cDNA (뇌)로부터 증폭시키고, 레트로바이러스 발현 벡터 pMSCV-IRES-EYFP의 EcoRI 부위로 삽입하였다. pLXIN-hBcl-x_L로부터 hBcl-x_L을 절제하고 (문헌 [Djerbi, M., Darreh-Shori, T., Zhivotovsky, B & Grandien, A Characterization of the human FLICE-inhibitory protein locus and comparison of the anti-apoptotic activity of four different flip isoforms Scand J Immunol . 54 180-9, 2001]), pMSCV-IRES-EGFP의 EcoRI 부위로 삽입하였다. 레트로바이러스 입자 생산, 조혈 줄기 세포의 농축 및 이식은 앞서 기재된 바와 같이 실시하였다 (문헌 [Nyakeriga, A. M., Djerbi, M., Malinowski, M.M & Grandien, A. Simultaneous expression and detection of multiple retroviral constructs in haematopoietic cells after bone marrow transplantation Scand J Immunol . 61, 545-50, 2005]). 간략하면, 리포펙트아민 2000 시약(LipofectAMINE 2000 Reagent) (영국 페이즐리에 소재하는 인비트로겐 라이프 테크놀러지 인코포레이티드(Invitrogen Life Technologies Inc.)를 피닉스-에코(Phoenix-Eco) 패키징 세포내로 레트로바이러스 벡터를 일시적으로 형질감염시키고, 바이러스 입자를 함유하는 바이러스 상등액을 수확하고, 5-플루오로우라실 처리된 마우스의 골수로부터 수득한 계통 음성 세포를 형질도입시키기는데 사용하였 다. 이후 치사 방사선 조사를 받은 수혜자 마우스에 이들 세포를 주사하였다. 이식 후 7일 내지 14일 사이에 마우스에서는 급성 골수성 백혈병-유사 질환이 발병하였다. 상기 마우스의 비장으로부터 유래된 세포를 글루타민 및 우태아 혈청으로 보충된 정규 RPMI 배지에서 시험관내 배양을 할 수 있었다.

488 nm에서의 여기 후, 초기에 EGFP의 검출을 위한 510/21-nm 대역패스 필터에 따른 신호와 EYFP의 검출을 위한 550/30-nm 대역패스 필터에 따른 신호를 분리하기 위하여 525-nm 롱-패스 이색성 거울을 사용하는 Cyan™ ADP 세포분석기 (덴마크 글로스트룹에 소재하는 다코)를 사용함으로써 GFP 및 YFP 발현 검출을 실시하였다. 플오루조 소프트웨어 (캘리포니아주 산카를로스에 소재하는 트리 스타 인코포레이티드(Tree Star, Inc.))를 사용하여 데이타를 분석하였다.

약어 목록: ATM, 혈관확장성 운동실조증과 관련하여 돌연변이된 유전자 산물(Ataxia telangiectasia mutated); BRCT, BRCA C-말단 반복부; NLVS, 4-하이드록시-S-요오도-S-니트로페닐아세틸-Leu-Leu-Leu-비닐 설폰; PI, 프로피디움 요오드화물; PIKK, 포스포이노시티드-3-OH-키나제-관련 키나제; TPP II, 트리펩티딜-펩티다제 II; FA, 3-(2-푸릴)아크릴로일; YFP, 황생 형광 단백질; GFP, 녹색 형광 단백질;

본원의 화학 물질 및 아미노산에 대하여 표준 약어가 사용된다.

약어 대체 약어

A 알라닌 Ala

R 아르기닌 Arg

N 아스파리긴 Asn

D 아스파라긴산 Asp

C 시스테인 Cys

E 글루탐산 Glu

Q 글루타민 Gln

G 글리신 Gly

H 히스티딘 His

I 이소류신 Ile

L 류신 Leu

K 리신 Lys

M 메티오닌 Met

F 페닐알라닌 Phe

P 프롤린 Pro

S 세린 Ser

T 트레오닌 Thr

W 트립토판 Trp

Y 티로신 Tyr

V 발린 Val

본 발명은 또한 수개의 비천연 알파-아미노산을 사용한다.

약어 측쇄

Abu 2-아미노부티르산 CH₂CH₃

Nva 노르발린 CH₂CH₂CH₃

Nle 노르류신 CH₂CH₂CH₂CH₃

t-부틸 알라닌 CH₂C(CH₃)₃

알파-메틸 류신 (CH₃)(CH₂C(CH₃)CH₃)

4,5-데하이드로-류신 CH₂C(=CH₂)CH₃

알로-이소류신 CH(CH₃)CH₂CH₃

알파-메틸 발린 (CH₃)CH(CH₃)(CH₃)

t-부틸 글리신 C(CH₃)₃

2-알릴글리신 CH₂CH=CH₂

Om 오르니틴 CH₂CH₂CH₂NH₂

Dab 알파, 감마-디아미노부티르산 CH₂CH₂NH₂

4,5-데하이드로-리신 CH₂CH=CHCH₂NH₂

실시예 1 및 도 1

감마-방사선 조사-유도성 세포 주기 정지는 TPP II 발현에 따라 달라진다.

TPP II 발현은 여러 유형의 스트레스에 의해 증가하기 때문에 본 발명자는 TPP II 발현이 PIKK에 의해 조절되는지 여부를 시험하였다. TPP II 항-혈청을 사용하는 T 세포 림프종계 EL-4의 웨스턴 블롯팅 분석에 의해서 본 발명자들은 TPP II 발현이 감마-방사선 조사에 의해 증가되었다는 것을 발견하게 되었다. 추가로, PIKK 저해제인 1 μM 워트마닌으로 처리한 것으로, 감마-방사선 조사받은 EL-4 세포에서는 상기와 같은 증가가 없었고, 대신 TPP II 발현이 감소하였다 (도 1A). 프로테오좀 저해제인 NLVS로 처리한 경우, 워트마닌으로 처리하고, 감마-방사선 조사받은 EL-4 세포에서의 TPP II의 하향 조절을 저해하였으며, 이는 TPP II가 PIKK 신호 전달 부재하에 프로테오좀에 의해서 분해된다는 것을 제안한다 (도 1A). TPP II가 PIKK에 의해 매개되는 세포 반응에서 임의의 역할을 하는지 여부를 추가로 연구하기 위하여 본 발명자들은 pSUPER 벡터에 의해 코딩되는, TPP II에 대한 siRNA를 발현시키는 안정적인 EL-4 형질감염체를 생성하였다 (EL-4.TPP IIⁱ로 표시됨, 문헌 [Brummelkamp, TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells Science 2002;296:550-3]). EL-4.TPP IIⁱ 세포는 EL-4.wt 세포 (공 pSUPER 벡터로 형질감염된 것, 도 1B)와 비교할 때, TPP II의 발현 및 활성, 둘 모두가 감소되었다. PIKK 계열의 구성원들이 신호 전달을 조절하는 세포 스트레스 반응을 유발하기 위하여 본 발명자들은 감마-방사선 조사 (5 Gy)를 사용하였다. TPP II는 앞서 가용성 세포질 펩티다제로서 보고되어 있지만 (문헌 [Reits, E, Neijssen, J, Herberts, C, Benckhuijsen, W, Janssen, L, Drijfhout, JW1 et al. A major role for TPP II in trimming proteasomal degradation products for MHC class I antigen presentation Immunity 2004;20:495-506]), 본 발명자들은 여기서 TPP II가 감마-방사선 조사받은 EL-4 세포의 핵으로 신속하게 전위되는 것을 발견하게 되었다 (도 1C). 이는, TPP II의 면역조직학적화학 분석법에 의해 검출된 바, EL-4 세포의 감마-방사선 조사 노출 후 1시간째에 이미 명확하게 나타났다. ALC 및 YAC-1 림프종에서 뿐만 아니라, 루이스 폐 암종 (LLC) 세포에서도 유사한 반응이 관찰되었다.

DNA 손상에 반응하여 DNA 합성이 중단되는 데는 PIKK의 활성화가 요구된다.(문헌 [Bakkenist, CJ, Kastan MB Initiating cellular stress response Cell 2004;118 9-17], [McKinnon, PJ ATM and ataxia telangiectasia EMBO Rep 2004;5:772-6]). 본 발명자들은 감마-방사선 조사받은 EL-4.wt 대조군에서는 DNA 합성이 저해된 것을 관찰하였지만, EL-4.TPP IIⁱ 세포에서는 노출 이후 36시간째까지도 고수준의 감마-방사선 조사-내성 DNA 합성을 확인하게 되었다 (³H-티미딘 혼입에 의한 측정, 도 1D). 이러한 데이타는 TPP II가 감마-방사선 조사에 반응하여 EL-4 세포의 DNA 합성을 중단시키는데 중요하였다는 것을 제안하였다. EL-4.TPP IIⁱ 세포는 감마-방사선 조사에 노출된 이후 G2/M에서 거의 균일하게 정지한 반면, EL-4.wt 대조군 세포는 G1 및 G2/M, 둘 모두에서 정지된 것으로 나타났고, 이는 EL-4.TPP IIⁱ 세포에 G1/S 체크포인트가 없음을 제안하는 것이다 (도 1E). 그러나, 감마-H2AX의 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 바 (Ser139-인산화된 H2AX, 도 1F), 감마-방사선 조사받은 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서도 초기의 DNA 손상은 검출되었다. H2AX는 ATM 활성화에 반응하여 인산화됨으로써 DNA 수복 초점의 형성을 유발한다 (문헌 [Bakkenist, CJ, Kastan MB Initiating cellular stress response Cell 2004;118:9-17]). 따라서, TPP II는 감마-방사선 조사-노출 이후 핵으로 신속하게 전위되고, H2AX의 인산화가 아닌, EL-4 세포에서의 DNA 합성을 효과적으로 중단시키는데 필요하다.

실시예 2 및 도 2

TPP II 발현이 저해된 세포에서 p53 을 안정화시키지 못한다

전사 인자 p53은 많은 유형의 스트레스에 대한 반응으로 세포 주기 정지를 개시하고, 그의 발현은 PIKK에 의한 직접적인 인산화에 의해 조절된다. 감마-방사선 조사받은 EL-4.wt 세포의 세포 용해물에서 웨스턴 블롯팅 분석한 결과, 본 발명자들은 p53 수준이 증가하였지만, EL-4.TPP IIⁱ 세포에서는 p53이 낮은 수준으로 나타났다는 것을 발견하게 되었다 (도 2A). 그러나, NLVS로 처리한 경우, 감마-방사선 조사받은 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서 p53 발현은 증가하였고, 이는 p53이 여전히 합성되기는 하나, EL-4.TPP IIⁱ 세포내 프로테오좀에 의해 분해된다는 것을 제안한다. p53의 전사 표적인 p21은 EL-4.wt 대조군 세포와 비교할 때, 감마-방사선 조사 노출 이후 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서 약하게 발현되었다 (도 2B). 추가로, TPP II를 안 정적으로 과다-발현시키는 EL-4.pcDNA-TPP II 세포에서는 EL-4.pcDNA3 세포와 비교할 때, 감마-방사선 조사 노출 이후 p53의 수준이 증가한 것으로 나타났다 (문헌 [Wang, EW, Kessler, BM, Borodovsky, A, Cravatt, BF, Bogyo, M, Ploegh, HL, et. al. Integration of the ubiquitin-proteasome pathway with a cytosolic oligopeptidase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:9990-5]) (도 2C). p53과 TPP II이 물리적으로 연관되어 있는지 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 이어서, p53의 N-말단에 대한 항-혈청을 사용하여 공-면역-침전 실험을 실시한 후, TPP II에 대한 웨스턴 블롯 분석법을 실시하였다. EL-4-pSUPER 세포의 용해물로부터의 p53 면역-침전물에서 본 발명자들은 TPP II을 검출하였는데, 그 수준은 감마-방사선 조사에 의해 증가되었다 (도 2D, 상단). EL-4.TPP IIⁱ 세포로부터의 용해물, 또는 1 μM 워트마닌으로 처리된 EL-4.wt 세포의 용해물로부터는 상기 결과가 관찰되지 않았다 (도 2D). 이러한 데이타가 TPP II와 p53 사이의 감마-방사선 조사-유도성 물리적 연관을 입증하였다. 본 발명자들은 p53 발현이 또한 감마-방사선 조사받은 YAC-1 및 ALC 림프종 세포에서 TPP II-의존성이며, 사실상 p53은 pSUPER-TPP IIⁱ의 안정적인 발현 이후에는 검출될 수 없었다는 것을 발견하게 되었다 (도 2E). 본 발명자들은 루이스 폐 암종 (LLC) 세포에서 p53의 발현을 관찰하지 못했다 (도 2E). 형질전환된 세포에서 빈번하게 상향-조절된 DNA 손상 반응에 따른 현상으로, 감마-방사선 조사 이전에도 본 발명자들의 대조군 종양 세포주에서는 상당 수준의 p53이 존재하는 것에 본 발명자들은 주목하였다 (문헌 [Bartkova, J, Horejsi, Z, Koed, K, Kramer, A, Tort, F, Zieger, K, et. al. Activation of the DNA damage checkpoint and genomic instability in human precancerous lesions. Nature 2005;434:907-13], [Bartkova, J, Horejsi, Z, Koed, K, Kramer, A, Tort, F, Zieger, K, et. al., DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 2005;434:864-70]). 본 발명자들은 p53의 효과적인 안정화를 위해서는 TPP II가 발현되어야 한다고 결론지었다.

실시예 3 및 도 3

TPP II는 PIKK 신호 전달에 의존하는 여러 경로의 활성화를 조절한다.

p53의 안정화를 위해서는 TPP II 발현이 요건이 되는 바, 본 발명자들은 또한 EL-4.wt 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서의 그들의 상태를 비교함으로써 PIKK 신호전달에 의존하는 기타 스트레스-유도성 경로를 시험하였다 (문헌 [Viniegra. JG, Martinez, N, Modirassari, P, Losa, JH, Parada Cobo. C, Lobo, VJ, et. al. Full activation of PKB/Akt in response to insulin or ionizing radiation is mediated through ATM. J Biol Chem. 2005;280:4029-36], [Feng, J. Park, J, Cron. P, Hess. D, Hemmings, BA. Identification of a PKB/Akt hydrophobic motif Ser-473 kinase as DNA-dependent protein kinase. J Biol Chem 2004;279:41189-96], [Sarbassov, DD Guertin, DA, Ali SM, Sabatini, DM. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex Science 2005;307:1098-101]). Akt 키나제의 Ser473 인산화는 ATM, DNA-PK 또는 mTOR에 의한 PIKK 신호전달을 필요로 하며, 이의 기전적 설명은 논의된 바 있다 (문헌 [Vmiegra, JG, Martinez, N, Modirassari, P, Losa, JH, Parada Cobo C, Lobo, VJ et al. Full activation 5 of PKB/Akt in response to insulin or ionizing radiation is mediated through ATM J Biol Chem 2005;280:4029-36], [Feng, J, Park, J, Cron, P, Hess, D, Hemmings, BA Identification of a PKB/Akt hydrophobic motif Ser-473 kinase as DNA-dependent protein kinase J Biol Chem 2004;279:41189-96], [Sarbassov, DD, Guertin, DA, Ali, SM, Sabatini, DM Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. Science 2005;307:1098-101). 본 발명자들은 EL-4.wt 세포의 용해물에서 상당 수준의 포스포-Ser473-Akt를 검출하였다. 그러나, EL-4.TPP IIⁱ 세포에서는 매우 낮은 수준의 포스포-Ser473-Akt가 나타난 반면, 전체 Akt의 발현은 유사하였다 (도 3A). 추가로, 본 발명자들은 EL-4.pcDNA3 대조군 세포와 비교하여 EL-4.pcDNA3-TPP II에서 Akt의 Ser473-인산화가 증가하였다는 것을 확인하게 되었고, 이는 추가로, TPP II 발현이 Akt-Ser473-인산화를 조절한다는 것을 입증한다 (도 3B). Akt 키나제는 세포 생존 신호의 신호전달에 중요하며, 이는 다수의 종양에서는 과다-활성화된다. 일반 배지에서 (5% 혈청) EL-4.TPP IIⁱ 세포는 EL-4.wt와 비교할 때 증식 속도가 증가한 것으로 나타났고, 그 뿐만 아니라, 죽은 세포의 축적도 증가시키는 것으로 나타났다 (도 3C). 추가로, 혈청 농도를 1%로 저하시킴으로써 상기의 축적은 EL-4.wt 세포와 비교할 때 가속화되었는데, 이는 세포 생존 기전이 TPP II의 부재하에서 손상되었음을 제안하는 것이다 (도 3C). 추가로, EL-4.pcDNA3-TPP II 세포는 EL-4.pcDNA3 세포가 수행하지 못한, 0.5% 혈청내 제한된 성장을 수행할 수 있다 (도 3D). 이러한 표현형은 TPP II 발현이 시험관내 배양시 Akt Ser473 인산화 및 세포 생존에 중요하다는 것을 시사한다. Akt 키나제의 직접적인 기질인 XIAP (문헌 [Dan, HC, Sun, M, Kaneko, S, Feldman, RI, Nicosia, SV, Wang, HG, et al. Akt phosphorylation and stabilization of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) J Biol Chem. 2004;279:5405-12])는 IAP 계열의 분자들중의 구성원으로서 이는 종양 세포에서 통상 과다-발현되는 내인성 카스파제 저해제이다. TPP II를 상향-조절할 경우, EL-4.pcDNA3-TPP II 세포에서 c-IAP-1 및 XIAP 분자의 발현이 증가한다. 에토폭시드로 처리할 경우에 XIAP 발현은 EL-4.TPP IIⁱ 세포와 비교할 때 EL-4.wt 세포에서 상당히 더욱 높았고, 분해 속도는 느렸다 (도 3E). 추가로, ATM 및 ATR 키나제의 활성화가 NKG2D 리간드의 발현을 매개하고, 이로써 면역계는 DNA 손상 반응이 진행중인 세포를 검출할 수 있게 된다 (문헌 [Gasser, S, Orsulic, S, Brown, EJ, Raulet, DH The DNA damage pathway regulates innate immune system Iigands of the NKG2D receptor Nature 2005;436:1186-90]). 유동 세포분석 측정에 의해, 본 발명자들은 EL-4.wt 세포 상에서 Rae-1의 발현을 검출한 반면, 극소량의 Rae-1 발현을 EL-4.TPP IIⁱ 세포에서 검출하였다 (도 3F). 본 발명자들은 ALC 림프종 세포 상에서 Rae-1 리간드의 발현을 검출하지 못했지만, 안정적인 pSUPER-TPP IIⁱ 형질감염체 (YAC-1.TPP IIⁱ)는 세포 표면에서 극소량의 Rae-1 리간드를 발현시키는 바 (도 3G), 마우스 YAC-1 림프종 분석을 통해서도 Rae-1 발현이 TPP II 발현에 의존한 것으로 나타났다. 이러한 데이타는 PIKK에 의해 활성화된 수개의 스트레스-유도성 경로가 TPP II 발현을 필요로 한다는 것을 나타낸다.

실시예 4 및 도 4

감마-방사선 조사에 따른 반응으로 p53 을 안정화시키는데 필요한 TPP II 의 BRCT-유사 모티프

BRCA C-말단 반복부 (BRCT)-도메인은 대개 DNA 손상 신호전달 경로를 조절하는 단백질내 함유되어 있는데, 이는 ATM 기질과의 상호작용을 조절한다 (문헌 [Bork, P, Hofmann, K, Bucher, P, Neuwald, AF, Altschul, SF, Koonin, EV. A superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins. FASEB J. 15 1997;11:68-76], [Manke, IA, Lowery, DM, Nguyen, A, Yaffe, MB. BRCT repeats as phosphopeptide-binding modules involved in protein targeting. Science 2003;302:636-9], [Yu, X, Chini, CC, He, M, Mer, G, Chen, J. The BRCT domain is a phospho-protein binding domain. Science 2003;302:639-42]). 본 발명자들은 BRCT 모티프의 요건에 대체로 부합하되, 전부 부합되는 것은 아닌, 725번 위치의 GG-이중선 주위에 집중된 TPP II의 한 부위를 확인하였다 (도 4A). 본 발명자들은 다수의 BRCT 서열에 존재하는 특징적인 Gly-Gly-이중항 (*로 표시, 도 4A)의 지정부위 돌연변이 유발을 실시하여 상기를 본 발 명의 pcDNA3-TPP II 벡터내 Gly-Glu로 돌연변이화시켰다. EL-4.TPP IIⁱ 세포에서 상기 플라스미드가 발현될 수 있도록 하기 위하여 본 발명자들은 725번 위치의 돌연변이 (TPP II^wt/G725E로 표시) 이외에, pSUPER-TPP IIⁱ-코딩 siRNA와 상호작용하는 뉴클레오티드 중 TPP II의 3' 부위에 3개의 침묵 돌연변이를 삽입하였다(이러한 플라스미드를 TPP II^wt로 표시). 본 발명자들은 TPP II^wt 뿐만 아니라, TPP II^wt/G725E 돌연변이체 분자, 둘 모두 pSUPER-TPP IIⁱ로 공-형질감염된 EL-4 세포에서 안정적으로 발현되었다는 것을 발견하게 되었다 (도 4B). 추가로, 감마-방사선 조사에 노출된 EL-4.TPP II^wt 및 EL-4.TPP II^wt/G725E 형질감염체 세포에서 p53의 발현에 대하여 분석하였다. 본 발명자들은 EL-4.TPP II^wt 대조군 세포와 비교하여 EL-4.TPP II^wt/G725E 세포에서 p53의 발현이 훨씬 더 감소되었다는 것을 발견하게 되었다 (도 4C). 추가로, 본 발명자들은 감마-방사선 조사의 존재 및 부재, 둘 모두에서 EL-4.TPP II^wt/G725E 세포의 용해물로부터의 p53-면역침전물중 TPP II를 검출하지 못한 반면, EL-4.TPP II^wt 대조군 세포에서는 TPP II를 검출하였다 (도 4D). 본 발명자들은 TPP II가 DNA 손상 신호 전달에 중요한 BRCT-유사 도메인을 갖고 있다고 결론지었다.

조절 인자를 DNA 손상 부위에 함께 국지화시켜 하류 반응이 활성화될 수 있 도록 한다 (문헌 [Al Rashid, ST, Dellaire, G, Cuddihy, A, Jalali, F, Vaid, M, Coackley, C, et. al. Evidence for the direct binding of phosphorylated p53 to sites of DNA breaks in vivo. Cancer Res. 2005;65: 10810-21], [Lisby, M, Barlow, JH, Burgess, RC, Rothstein, R. Choreography of the DNA damage response: spatiotemporal relationships among checkpoint and repair proteins. Cell. 2004;118:699-713]). TPP II 발현이 저해된 세포에서 p53이 안정화되지 못하는 것에 관한 이면에서 가능한 이유는 p53이 상기 부위로 동원되지 못했기 때문이다. 본 발명자들은 EL-4.wt 대 EL-4.TPP IIⁱ 세포로부터의 p53 면역-침전물내 DNA 수복 초점 성분의 존재 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 웨스턴 블롯팅으로 측정한 후, EL-4.TPP IIⁱ 세포로부터의 것을 제외한, EL-4.wt로부터의 p53 면역-침전물내에서 ATM을 검출하였다 (도 4E). 본 발명자들은 또한 EL-4.TPP IIⁱ 세포가 아닌 EL-4.wt에서 감마-방사선 조사시 p53-연관된 단백질중 DNA 수복 초점 단백질 53BP1 및 Mre11을 검출하였다 (도 4F, G). 추가로, NLVS-처리된 EL-4.TPP IIⁱ 세포 또한 p53-면역침전물중 ATM, 53BP1 및 Mre11을 나타내지 못했다 (도 4E-G). p53 및 ATM이 DNA 수복 초점 성분에 인접한 위치에서 발견된다는 사실은 특정 p53 이소폼이 이들 초점에 축적되고, 여기서, ATM 키나제와 상호작용할 수 있다는 것과 일치한다 (문헌 [Al Rashid, ST, Dellaire, G, Cuddihy, A, Jalali, F, Vaid, M, Coackley, C, et. al. Evidence for the direct binding of phosphorylated p53 to sites of DNA breaks in vivo. Cancer Res. 2005;65: 10810-21]). 본 데이타는 p53과 ATM 사이의 물리적 연관성 뿐만 아니라, DNA 수복 초점 성분 53BP1 및 Mre11도 TPP II를 필요로 한다는 것을 입증한다.

실시예 5 및 도 5

TPP II 발현이 생체내 EL-4 종양의 감마-방사선 조사 내성을 조절한다.

PIKK가 신규한 암 요법의 개발을 위해 가능한 표적 분자이다 (문헌 [Choudhury, A, Cuddihy, A, Bristow, RG. Radiation and new molecular agents part I: targeting ATM-ATR checkpoints, DNA repair, and the proteasome. Semin Radiat Oncol 2006;16:51-8]). TPPII-매개 성장 조절이 생체내 종양 성장에 중요한지 여부를 다루기 위하여 본 발명자들은 10⁶개의 EL-4.wt 대조군 또는 EL-4.TPP IIⁱ 세포를 동계 C57Bl/6 마우스에 접종하였다. EL-4.wt 및 EL-4.TPP IIⁱ 세포, 둘 모두에서 종양이 확립되었고, 대략 동등한 속도로 성장하였다는 것을 본 발명자들은 발견하게 되었는데, 이는 그것만 따로 생각해 볼 때 TPP II가 생체내 EL-4 종양 성장에는 중요하지 않았음을 제안하는 것이다 (도 5A, B, 대조군으로 표지된 패널). 그러나, 본 발명자들은 또한 EL-4.wt 또는 EL-4. TPP IIⁱ 세포 종양을 수반하는 마우스를 2-4회 선량의 4 Gy (400 Rad's) 감마-방사선 조사로 처리하였다. 감마-방사선 조사에도 불구하고 계속하여 성장하는 10⁶개의 EL-4.wt 세포로 접종한 후, 본 발명자들은 이러한 감마-방사선 조사 처리가 종양 크기에 작은 효과를 미친다는 것을 발견하게 되었다 (도 5A, 감마-방사선 조사는 화살표로 표시). 대조적으로, EL-4.TPP IIⁱ 세포 종양을 수반하는 마우스는 감마-방사선 조사 처리에 반응하였고, 확립된 종양은 완전히 퇴행된다 (도 5B). 이러한 데이타는 EL-4.ATMⁱ 또는 EL-4.TPP II^wt/G725E 세포의 종양을 사용한 경우 관찰된 결과와 유사하였는데, 이 또한 생체내 감마-방사선 조사에 대한 내성을 갖지 않았기 때문이었다 (도 5C, D). 상기 데이타는 TPP II가 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는 표적임을 입증시켜 준다.

실시예 6 및 도 6

트리-펩티드-기초 TPP II 저해제가 생체내 종양을 방사선 감작시킨 다 .

TPP II는 세균 섭틸리신에 상동성인 촉매 도메인을 갖는, 섭틸리신-형 세린 펩티다제이다 (문헌 [Tomkinson, B, Wernstedt, C, Hellman, U, Zetterqvist, O. Active site of tripeptidyl peptidase II from human erythrocytes is of the subtilisin type. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84:7508-12]). 본 발명자들은 기질 AAF-AMC의 TPP II 절단이 저해되는 것에 관한 관찰을 통해 트리-펩티드 섭틸리신 저해제 Z-Gly-Leu-Ala-OH (Z-GLA-OH)가 효과적으로 TPP II를 저해하였고, 여기서, K_i50은 약 10 nM이었으며, 이는 부타빈디드에 대해 관찰된 것 (K_i50은 7 nM이다)보다 약간 덜 효과적이라는 것을 발견하게 되었다 (도 6A). 게다가, Z-GLA-OH는 혈청에서 상대적으로 안정적이었다.

생체내 종양 감마-방사선 조사시 촉매적 TPP II 저해 효과를 시험하기 위하여 본 발명자들은 EL-4 종양이 확립된 C57Bl/6 마우스를 4 Gy의 감마-방사선 조사 선량 (주당 1회 선량)에 노출시키고, 주당 2회씩 Z-GLA-OH를 주사하였다 ((13.8 mg/kg (체중)). 주당 4 Gy의 감마-방사선 조사 선량은 C57Bl/6 대조군 마우스에서 확립된 EL-4 종양 성장에 별 영향을 미치지 못했지만, 대조적으로 Z-GLA-OH를 주사한 후에는 3-4회의 400 Rad 감마-방사선 조사 선량 이후 시험한 마우스에서 종양이 완전히 퇴행된 것을 본 발명자들은 관찰하게 되었다 (도 6B). 이들 종양을 더 이상이 촉진할 수 없을 때 처리를 중지하였고, 전 관찰 기간 동안 (3개월간에 걸쳐) 종양이 재-성장하는 것은 관찰하지 못했다. Z-GLA-OH 주사 존재하에 감마-방사선 조사 선량의 역가 측정시에는 또한 3 Gy의 선량에 노출된 마우스에 EL-4 종양의 완전한 퇴행을 나타낸 반면, 보다 낮은 선량의 감마-방사선 조사는 종양 성장을 감소시켰고, 또한 일부에서는 완전한 거부를 나타내었다 (2 Gy, 5마리의 마우스중 2마리; 1 Gy, 4마리의 마우스중 1마리, 도 6C). Z-GLA-OH 화합물의 역가 측정시, 6.9 mg/kg의 Z-GLA-OH를 접종한 후 대부분의 마우스에서는 감마-방사선 조사에 대한 반응으로 종양을 완전히 거부한 반면 (4마리중 3마리), 종양 퇴행과 관련하여 3.5 mg/kg 이하의 용량은 부분적인 효과만을 제공하였다 (4마리중 2마리: 3 Gy의 감마-방사선 조사 선량 사용; 도 6C, 우측 패널).

감마-방사선 조사에 대한 생체내 내성을 비롯한, 종양 요법 내성에 관한 이면에서 한가지 공통된 이유는 p53 돌연변이이다 (문헌 [El-Deiry, WS. The role of p53 in chemosensitivity and radiosensitivity Oncogene 2003;22:7486-95). p53- 돌연변이화된 종양 또한 TPP II 저해제의 존재하에 감마-방사선 조사에 대하여 반응하는지 여부를 시험하기 위하여 본 발명자들은 유사하게 동계 C57Bl/6 마우스에 10⁶개의 루이스 폐 암종 (LLC) 세포를 접종하였다. 본 발명자들은 LLC 종양이 사실상 4 Gy의 반복된 감마-방사선 조사 선량에 대하여 비감수성이고, Z-GLA-OH만을 사용하는 것도 (감마-방사선 조사 부재) 어떤 효과를 발휘하지 못하였음을 발견하였다 (도 6D). 대조적으로, Z-GLA-OH를 주사 맞은 마우스에서는 감마-방사선 조사에 대하여 확립된 종양이 완전히 퇴행된 것을 본 발명자들은 관찰하게 되었다 (도 6D). 본 발명자들은, 보호성 디-펩티드 Z-GL-OH가 TPP II 저해와 LLC 종양의 방사선-감작, 둘 모두에 있어서 효과가 없는 반면, 엄격히 말해 N-말단 보호 Z-기는 생체내 항-종양 효과에 꼭 필요시 되는 것은 아니라는 것을 발견하게 되었다. TPP II는 인간과 마우스 간의 아미노산 수준이 96%의 동일성을 갖는, 진화론적 보존 효소이며, 본 발명자들은 감마-방사선 조사에 대한 반응으로 Z-GLA-OH-처리된 SCID 마우스에서 인간 HeLa 자궁경부 암종 세포 또한 강력하게 종양 퇴행을 나타내는 것을 관찰하게 되었다 (도 6E). SCID 마우스에서의 방사선-내성은 실질적으로 더 작기 때문에 감소된 선량의 감마-방사선 조사 (1회 선량당 1.5 Gy)를 사용하였다.

Z-GLA-OH는 예비 연구에서 100 mg/kg 이하 용량의 단일 제제와 같이 생체내에서 효과가 없다고 독성 연구를 통해 제시되었다. 추가로, 본 마우스는 연구 이후에도 장기간 동안 생존하였다. 본원에서 사용된 감마-방사선 조사 프로토콜은 전적으로 신체 전체를 노출시키는 것으로 하기 때문에 Z-GLA-OH가 분포하는 조직 모두를 병용된 감마-방사선 조사 및 Z-GLA-OH에 노출시켰다. 이는 병용 치료법에 관하여 취급하기 손쉬운 독성을 제안한다.

실시예 7 및 도 7

새로 형질전환된 백혈병 세포의 생체내 방사선- 감작화

1차 종양과 더 많이 유사한 종양 세포를 확립시키기 위하여 본 발명자들은 c-Myc 및 BCl-x_L (pMSCV-Bcl-x_L-IRES-EGFP 및 pMSCV-c-Myc-IRES-EYFP)를 코딩하는 별도의 벡터 2개와 함께 레트로바이러스 발현 시스템을 사용하였다. 레트로바이러스를 사용하여 DBA/2 골수 세포를 이들 Bcl-x_L- 및 c-Myc-발현 벡터로 감염시키고, 감마-방사선 조사받은 동계 마우스에 이식하였다. 벡터-코딩 녹색 형광 단백질 (GFP) 대 황색 형광 단백질 (YFP)을 통해 레트로바이러스 유전자 발현을 모니터할 수 있었다 (문헌 [Nyakeriga, A.M., Djerbi, M., Malinowski, M.M & Grandien, A. Simultaneous expression and detection of multiple retroviral constructs in haematopoietic cells after bone marrow transplantation. Scand J Immunol . 61., 545-50, 2005]). 이식 후 7-14일이 경과한 후, 본 발명자들은 비장 및 골수에서 대량의 YFP⁺/GFP⁺ 골수성 (CD11b⁺Gr1⁺) 모세포가 축적되었음을 관찰하였다 (도 7A, 비장에 대하여 나타냄). 본 발명자들은 이들 DBA/2-c-Myc/Bcl-x_L 세포를 동계 DBA/2 마우스에 피하 접종하고, 본 발명자들은 약 3주후, 추가의 2-3주 이내에 크기가 1000 ㎣를 초과하는 수준으로 성장한 것으로 촉진할 수 있는 종양을 관찰하였다 (도 7B). 본 발명자들은 고정 조직의 조직학적 분석에 의해 관찰한 바, DBA/2- c-Myc/Bcl-x_L 세포를 접종 받은 모든 마우스에서는 종양이 간으로 파종되었음을 발견하게 되었다 (도 7H). 비장, 폐 및 간에서 YFP⁺/GFP⁺를 나타내는 이들 악성 세포는 또한 대조군 (도 7C-G)으로서 1차 종양으로부터 얻은 세포를 사용하여 유동 세포 분석법을 통해 검출하였다. 감마-방사선 조사로 처리함으로써 (1회 선량당 4 Gy, 주당 1회 선량), 본 발명자들은 성장이 약간 감소는 했지만, DBA/2-c-Myc/Bcl-x_L 종양은 비록 1주 미만의 시간이 지연되기는 하였지만 여전히 그 크기가 1000 ㎣을 초과하는 크기에 달하였고, 또한 간 전이도 존재하였음을 관찰하게 되었다 (도 7B). 대조적으로, DBA/2-c-Myc/Bcl-x_L 종양이 확립된 마우스에서 Z-GLA-OH (13.8 mg/kg(체중))를 받은 경우, 4 Gy-선량의 감마-방사선 조사에 대한 반응으로 종양은 완전히 퇴행되었다 (도 7B). 추가로, 본 발명자들은 이들 Z-GLA-OH-처리 마우스의 폐, 비장 또는 간, 어디에서도 종양 세포를 발견하지 못했다 (도 7F, G, J). Z-GLA-OH만을 받은 마우스에서는 종양 크기 감소가 관찰되지 않은 바 (도 7B), 이러한 치료 반응을 위해서 감마-방사선 조사가 필요시 되었다. 이러한 데이타는, Z-GLA-OH로부터 관찰된 방사선-감작 효과는, 특이적인 종양 결함에 의존할 수 있는 것이 아니라, 증식 및 아포프토시스를 탈조절하는 간단한 2개의 성공적인 전략법에 의해 새로 형질전환된 세포에서 관찰될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 8

디- 및 트리-펩티드 및 유도체의 시험관내 시험

표 1은 여러 농도의 화합물에 의한 AAF-AMC (H-Ala-Ala-7-아미도-4-메틸쿠마 린)의 절단 저해에 관한 것으로, 상대적인 임의적 형광 단위로 나타낸 시험관내 데이타를 포함한다. 시험한 화합물 대부분에서 몇몇의 유익한 효과가 관찰된다.

TPP II 단백질을 농축시킨 후, TPP II-선호 형광성 기질 AAF-AMC를 사용하였다. 100 x 10⁶개의 세포를 침전시키고, 유리 비드 및 균질화 완충액 (50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 250 mM 수크로스, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT)에서 와동시킴으로써 용해시켰다. 세포 용해물을 차등 원심분리시키는데; 먼저 세포 균질액을 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 초원심분리관으로 옮겼다. 이어서, 샘플을 100,000 x g에서 1시간 동안 초원심분리하고, 상등액 (대부분의 생화학 문헌에서는 세포질로서 나타냄)을 100,000 x g에서 5시간 동안 원심분리함으로써, 이는 고분자량의 세포질 단백질/단백질 복합체로 침전되었다. 생성된 펠릿을 50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 30% 글리세롤, 5 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT에 용해하고, 1 ug의 고분자량의 단백질을 펩티다제 검정법에서 효소로서 사용하였다.

TPP II의 활성을 시험하기 위하여 본 발명자들은 기질 및 AAF-AMC (미주리주 세인트루이스에 소재한 시그마)를 50 mM 트리스 염기 pH 7.5, 5 mM MgCl₂ 및 1 mM DTT로 구성된, 100 ul의 시험 완충액중 100 uM의 농도로 사용하였다. 반응을 종결시키기 위하여 본 발명자들은 900 ul 1% SDS 용액으로 희석시켰다. 절단 활성은 LS50B 발광 분광광도계 (매사추세츠주 보스톤 소재의 퍼킨 엘머)에서 460 nm에서의 발광에 의해 측정하였다.

FA = 3-(2-푸릴)아크릴로일; PBS = 인산염-완충처리된 염수. 각 화합물 명 칭의 첫 텍스트 (Z, FA, H 등)은 N-말단에 존재하는 치환체이고; H는 N-말단이 유리 NH₂임을 나타낸다. 각 화합물 명칭의 마지막 텍스트 (OH, NBu 등)은 C-말단에 존재하는 치환체이고; OH는 C-말단이 유리 CO₂H임을 나타낸다.

실시예 9

디- 및 트리-펩티드 및 유도체의 생체내 시험

표 2는 LLC (루이스 폐 암종)를 앓는 4마리의 마우스 군의 종양 부피(㎣)를 나타내는 생체내 데이타를 포함한다. 종양 부피가 1000 ㎣를 초과할 경우 마우스 를 희생시켰다. 몇몇 마우스는 오직 화합물만을 투여받았고; 나머지는 추가로 방사선 조사도 투여받았다. 마우스는 7, 10, 14, 18 및 21일째 화합물을, 그리고, 몇몇 경우에는 감마선 조사 (400 Rad)도 함께 받았다. 방사선 조사와 병용하였을 때 몇몇 화합물은 탁월한 결과를 나타내었다. 디펩티드 유도체 Z-GL-OH는 시험관내에서 뿐만 아니라, 생체내에서도 불충분하게 작용한다는 사실이 시험관내 결과가 생체내 효과로 외삽법에 의해 추정될 수 있다는 이론을 입증한다.

실시예 10

Z- GLA - OH 의 생체내 추가 시험

표 3은 상기 기술된 EL-4 종양 모델에 따른 7-8마리의 마우스 군의 종양 부피(㎣)를 나타내는 추가의 생체내 데이타를 포함한다. 0일째 1,000,000개의 EL-4 림프종 세포를 피하 접종하였다. 22일째까지 촉진할 수 있는 종양은 관찰되지 않 았다. 각각의 처리시 (주당 2회), 촉진할 수 있는 종양을 갖는 마우스에게 400 Rads 방사선 조사만을 투여하거나, 14 ㎕의 5O mM Z-GLA-OH 용액과 병용하여 투여하였다. 촉진할 수 있는 종양을 갖지 않는 마우스는 처리하지 않았고, 즉, 종양이 거부된 마우스에서의 처리는 종결시켰고, 마우스를 주의깊게 관찰하였다. 표 3은은 탁월한 결과는 나타내는데, 다시 말해, 종양 성장이 단지 정지, 부피가 감소, 또는 종양 성장이 지연된 것이 아니라, 확립된 종양이 완전히 거부되었다.

종양 수용능을 개선시키기 위한 표준 방법으로서 0일째 마우스 모두에 400 Rad (1 Gy = 100 Rad) 감마-방사선을 조사하였다. 화합물은 복강내 접종하였고, 종양은 항상 피하 접종하였다.

실시예 11 및 도 8

본 발명자들은 Z-GLA-OH와 동일한 방식으로 GPG-NH₂ 및 Z-GPG-NH₂를 시험하였다. 종양을 수반하는 마우스에 상기를 13.8 mg/kg으로 주당 2회씩 주사하고, 생체내에서 감마-방사선 조사에 대한 감작성을 매개할 수 있는 그들에 능력에 관하여 Z-GLA-OH와 비교하였다. 본 발명자들은 GPG-NH₂ 및 Z-GPG-NH₂, 둘 모두가 감마-방사선 조사 이후의 확립된 EL-4 종양의 완전한 퇴행을 매개하였다는 것을 발견하였다.

실시예 12 및 도 9

TPP II 가 Mre11 초점 형성에 필요시 된다.

도 1C에 나타내고, 실시예 1하에 논의된 바와 같이, TPP II는 감마-방사선 조사받은 세포의 핵으로 신속하게 전위된다. 추가의 면역세포 화학적 실험 결과를 도 9에 나타낸다. TPP II는 초점을 형성하는 것으로 보이지 않았는데, 이는 아마도 대신 점 모양으로 나타났을 것이다 (도 9, TPP II 발현이 저해된 세포, LLC, ALC 및 YAC-1에 대하여 나타냄). TPP II 발현이 저해된 세포는 감마-방사선 조사 노출시 Mre11 초점를 조립하지 못했다는 것이 본 발명에서 TPP II 저해제의 용도를 입증하는 것이다.

Claims

감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는데 사용하기 위한, TPP II 저해제인 화합물.
제1항에 있어서, 화합물이 하기 화학식(i)로부터 선택되거나, 그의 약제학적으로 허용가능한 염인, 사용을 위한 화합물:

<화학식 i>

R^N1R^N2N-A¹-A²-A³-CO-R^C1

(상기 식에서,

A¹, A² 및 A³이 표준 1-문자 약어 또는 명칭에 따른, 하기의 정의를 갖는 아미노산 잔기이고:

A¹이 G, A, V, L, I, P, 2-아미노부티르산, 노르발린 또는 t-부틸 글리신이고,

A²가 G, A, V, L, I, P, F, W, C, S, K, R, 2-아미노부티르산, 노르발린, 노르류신, t-부틸 알라닌, 알파-메틸 류신, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 알파-메틸 발린, t-부틸 글리신, 2-알릴글리신, 오르니틴 또는 알파, 감마-디아미노부티르산이고,

A³이 G, A, V, L, I, P, F, W, D, E, Y, 2-아미노부티르산, 노르발린, 또는 t-부틸 글리신이고,

R^N1 및 R^N2가 각각 펩티드의 N 말단에 부착되고, 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로

R^N3,

(링커1)-R^N3,

CO-(링커1)-R^N3,

CO-O-(링커1)-R^N3,

CO-N-((링커1)-R^N3)R^N4, 또는

SO₂-(링커1)-R^N3이고,

(링커1)은 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^N3 및 R^N4는 동일하거나 상이하고, 수소 또는 하기의 임의로 치환된 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬;

벤질;

페닐;

나프틸;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴; 또는

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴중 임의의 것이고;

여기서, R^N3 및/또는 R^N4 상에는 0개, 1개, 또는 2개의 (동일하거나 상이한) 임의의 치환체가 존재할 수 있는데, 이는

하이드록시-;

티오-;

아미노-;

카복실산;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬옥시;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬;

N-, O-, 또는 S-아세틸;

카복실산 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬 에스테르;

카복실산 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬 에스테르;

페닐;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴;

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴; 또는

할로겐일 수 있고;

R^C1이 트리펩티드의 C 말단에 부착되며, 이는

O-R^C2,

O-(링커2)-R^C2,

N((링커2)R^C2)R^C3, 또는

N(링커2)R^C2-NR^C3R^C4이고,

(링커2)는 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, C₁ _-6 알킬 또는 C₂ _-4 알케닐일 수 있고, 바람직하게는, 단일 결합 또는 CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^C2, R^C3 및 R^C4는 동일하거나 상이하고, 수소 또는 하기의 임의로 치환된 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬;

벤질;

페닐;

나프틸;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴; 또는

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴중 임의의 것이고;

여기서, 각각의 R^C2 및/또는 R^C3 및/또는 R^C4 상에는 0개, 1개, 또는 2개의 (동일하거나 상이한) 임의의 치환체가 존재할 수 있는데, 이는

하이드록시-;

티오-;

아미노-;

카복실산;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬옥시;

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬;

N-, O-, 또는 S-아세틸;

카복실산 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-6 알킬 에스테르;

카복실산 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₃ _-12 사이클로알킬 에스테르;

페닐;

할로겐;

모노- 또는 바이사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴;

비-방향족 C₁ _-10 헤테로사이클릴중 하나 이상일 수 있음).
제2항에 있어서, 화학식(i)의 화합물이

R^N1이 수소이고,

R^N2가 수소, 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-O-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬, 또는 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬이고,

R^C1이 OH, 0-C₁ _-6 알킬, 0-C₁ _-6 알킬-페닐, NH-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬-페닐인, 사용을 위한 화합물.
제3항에 있어서, 화학식(i)의 화합물이

A¹이 G, A 또는 2-아미노부티르산이고,

A²가 L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 2-알릴글리신, P, 2-아미노부티르산, 알파-메틸 류신, 알파-메틸 발린 또는 t-부틸 글리신이고,

A³이 G, A, V, P, 2-아미노부티르산 또는 노르발린이고,

R^N1이 H이고,

R^N2가 수소, 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-O-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬, 또는 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬이고,

R^C1이 OH, 0-C₁ _-6 알킬, 0-C₁ _-6 알킬-페닐, NH-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬-페닐인, 사용을 위한 화합물.
제4항에 있어서, 화학식(i)의 화합물이

A¹이 G, A 또는 2-아미노부티르산이고,

A²가 L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신 또는 2-알릴글리신이고,

A³이 G, A, V, P, 2-아미노부티르산 또는 노르발린이고,

R^N1이 H이고,

R^N2가 수소, 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-O-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬, 또는 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬이고,

R^C1이 OH, 0-C₁ _-6 알킬, 0-C₁ _-6 알킬-페닐, NH-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬-페닐인, 사용을 위한 화합물.
제5항에 있어서, 화학식(i)의 화합물이

A¹이 G 또는 A이고,

A²가 L, I 또는 노르류신이고,

A³이 G 또는 A이고,

R^N1이 수소이고,

R^N2가 수소, 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-O-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬, 또는 임의로 페닐 또는 2-푸릴로 치환된 C(=O)-포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬이고,

R^C1이 OH, 0-C₁ _-6 알킬, 0-C₁ _-6 알킬-페닐, NH-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬-페닐인, 사용을 위한 화합물.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

R^N1이 수소이고,

R^N2가 수소, C(=O)-OCH₂Ph 또는 C(=O)-CH=CH-(2-푸릴)이고,

R^C1이 OH, 0-C₁ _-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬인, 사용을 위한 화합물.
제7항에 있어서, 화학식(i)의 화합물이 Z-GLA-OH, Bn-GLA-OH, FA-GLA-OH 또는 H-GLA-OH인, 사용을 위한 화합물.
제8항에 있어서, 화학식(i)의 화합물이 Z-GLA-OH인, 사용을 위한 화합물.
제2항에 있어서, A¹이 G, A 또는 2-아미노부티르산인, 사용을 위한 화합물.
제10항에 있어서, A¹이 G 또는 A인, 사용을 위한 화합물.
제2항, 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, A²가 L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 2-알릴글리신, P, K, 2-아미노부티르산, 알파-메틸 류신, 알파-메틸 발린 또는 t-부틸 글리신인, 사용을 위한 화합물.
제12항에 있어서, A²가 L, I, 노르류신, V, 노르발린, t-부틸 알라닌, 4,5-데하이드로-류신, 알로-이소류신, 2-알릴글리신, P 또는 K인, 사용을 위한 화합물.
제13항에 있어서, A²가 L, I, 노르류신, P 또는 K인, 사용을 위한 화합물.
제14항에 있어서, A²가 L 또는 P인, 사용을 위한 화합물.
제15항에 있어서, A²가 P인, 사용을 위한 화합물.
제2항, 및 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, A³이 G, A, V, P, 2-아미노부티르산 또는 노르발린인, 사용을 위한 화합물.
제17항에 있어서, A³이 G 또는 A인, 사용을 위한 화합물.
제2항, 및 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R^N1이 수소인, 사용을 위한 화합물.
제2항, 및 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,

R^N2가

R^N3,

(링커1)-R^N3,

CO-(링커1)-R^N3, 또는

CO-O-(링커1)-R^N3이고,

여기서, (링커1)은 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^N3이 수소 또는 하기의 치환되지 않은 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-4 알킬;

벤질;

페닐;

나프틸; 또는

모노사이클릭 헤테로아릴중 임의의 것인, 사용을 위한 화합물.
제20항에 있어서, R^N2가 수소, 벤질옥시카보닐, 벤질, 벤조일, t-부틸옥시카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐 또는 FA인, 사용을 위한 화합물.
제21항에 있어서, R^N2가 수소, 벤질옥시카보닐 또는 FA인, 사용을 위한 화합물.
제2항, 및 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,

R^C1이

O-R^C2,

O-(링커2)-R^C2, 또는

NH-(링커2)R^C2이고,

여기서, (링커2)는 존재하지 않을 수 있거나, 즉, 단일 결합일 수 있거나, C_1-6 알킬 또는 C₂ _-4 알케닐일 수 있고, 바람직하게는, 단일 결합 또는 CH₂, CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂CH₂ 또는 CH=CH일 수 있고,

R^C2가 수소 또는 하기의 치환되지 않은 기:

포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형 C₁ _-5 알킬;

벤질;

페닐; 또는

모노사이클릭 C₁ _-10 헤테로아릴중 임의의 것인, 사용을 위한 화합물.
제23항에 있어서, R^C1이 OH, 0-C_1-6알킬, 0-C_1-6 알킬-페닐, NH₂, NH-C_1-6 알킬, 또는 NH-C₁ _-6 알킬-페닐인, 사용을 위한 화합물.
제24항에 있어서, R^C1이 OH, 0-C₁ _-6알킬, NH₂, 또는 NH-C₁ _-6 알킬인, 사용을 위한 화합물.
제25항에 있어서, R^C1이 OH 또는 NH₂인, 사용을 위한 화합물.
제26항에 있어서, R^C1이 NH₂인, 사용을 위한 화합물.
제2항에 있어서, 화합물이 GPG-NH₂, Z-GPG-NH₂, Bn-GPG-NH₂, FA-GPG-NH₂, GPG-OH, Z-GPG-OH, Bn-GPG-OH, 또는 FA-GPG-OH인, 사용을 위한 화합물.
제28항에 있어서, 화합물이 GPG-NH₂인, 사용을 위한 화합물.
제2항에 있어서, 화합물이 ALG-NH₂, Z-ALG-NH₂, Bn-ALG-NH₂, FA-ALG-NH₂, ALG-OH, Z-ALG-OH, Bn-ALG-OH 또는 FA-ALG-OH인, 사용을 위한 화합물.
제30항에 있어서, 화합물이 ALG-NH₂인, 사용을 위한 화합물.
제2항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, A³이 F, W, D, E 또는 Y가 아닌, 사용을 위한 화합물.
제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, A³이 P가 아닌, 사용을 위한 화합물.
제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, A³이 E가 아닌, 사용을 위한 화합물.
그를 필요로 하는 환자에게, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에서 정의된 치료학적 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는 방법.
화합물이 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에서 정의된 화합물인, 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키기 위한 약제의 제조에서 상기 화합물의 용도.
TPP II를, 선별하고자 하는 화합물과 접촉시키고, 화합물이 TPP II의 활성을 저해하는지 여부를 동정하는 것을 포함하는, 감마-방사선 조사 암 요법의 효능을 강화시키거나, 종양 세포의 생체내 감마-방사선 조사 감수성을 증가시키는데 적합한 화합물을 동정하는 방법.
제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에서 정의된 화학식(i)의 구조를 갖는 화합물, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에서 정의된 구조를 갖는 화합물, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하고, 상기 화합물이 신나모일-IFP-에틸아미드, GPE-OH, GGF-OH, GVF-OH, AAA-OH 또는 IPI-OH가 아닌 약제학적 조성 물.
제38항 또는 제39항에 있어서, A³이 프롤린이 아닌 것을 조건으로 하는 약제학적 조성물.
제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 GPE-OH가 아닌 것을 조건으로 하는 약제학적 조성물.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, R^C1이 NH₂가 아닌 것을 조건으로 하는 약제학적 조성물.
약제로서 사용하기 위한 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에서 정의된 화합물.