EA007396B1 - Иммуноконъюгаты для лечения опухолей - Google Patents

Иммуноконъюгаты для лечения опухолей Download PDF

Info

Publication number
EA007396B1
EA007396B1 EA200401446A EA200401446A EA007396B1 EA 007396 B1 EA007396 B1 EA 007396B1 EA 200401446 A EA200401446 A EA 200401446A EA 200401446 A EA200401446 A EA 200401446A EA 007396 B1 EA007396 B1 EA 007396B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ligand
pharmaceutical composition
composition according
tumor
τνρ
Prior art date
Application number
EA200401446A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401446A1 (ru
Inventor
Анджело Корти
Флавио Курнис
Original Assignee
МОЛМЕД СпА
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by МОЛМЕД СпА filed Critical МОЛМЕД СпА
Publication of EA200401446A1 publication Critical patent/EA200401446A1/ru
Publication of EA007396B1 publication Critical patent/EA007396B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6887—Antibody-chelate conjugates using chelates for therapeutic purposes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0495—Pretargeting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Abstract

Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат цитокина и опухоленацеливающий модуль (ТТМ) и фармацевтически приемлемый наполнитель, где цитокин присутствует в количестве, которое не вызывает механизмов негативных ответных реакций.

Description

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции и ее использованию.
Предпосылки создания изобретения
Противоопухолевая активность некоторых цитокинов хорошо известна и описана. Некоторые цитокины уже используются для лечения людей. Например, цитокины, такие как 1Ь-2 и ΙΡΝ-γ, показали хорошую противоопухолевую активность у пациентов с различными типами опухолей, такими как метастатическая карцинома почки, лейкоз ворсистых клеток, саркома Капоши, меланома, множественная миелома и похожих. Другие цитокины, подобные ΙΡΝβ, фактору некроза опухоли (ΤΝΤ)α, ΤΝΤβ, 1Ь-1, 4, 6, 12, 15 и колониестимулирующим факторам (С8Р§), показали определенную противоопухолевую активность на некоторых типах опухолей.
Вообще терапевтическое использование цитокинов сильно ограничено их системной токсичностью. ΤΝΤ, например, был первоначально обнаружен по его способности вызывать геморрагический некроз некоторых опухолей и по его ίη νίΐτο цитотоксическому эффекту на различных опухолевых линиях, но впоследствии доказали, что он имеет сильную провоспалительную активность, которая может при определенных условиях нанести серьезный вред телу человека.
Поскольку системная токсичность является основной проблемой в использовании фармакологически активных количеств цитокинов у человека, оцениваются новые производные и терапевтические стратегии, направленные на уменьшение токсических эффектов этого класса биологических действующих веществ при сохранении их терапевтической эффективности.
Некоторые новые подходы направлены на
a) создание слитых белков, которые могут доставлять ΤΝΤ в опухоль и повышать местную концентрацию. Например, были получены слитые белки, состоящие из ΤΝΤ и опухолево-специфичных антител;
b) разработка мутантов ΤΝΤ, которые сохраняют противоопухолевую активность и имеют пониженную системную токсичность. Таким образом, были получены мутанты, способные селективно распознавать только один рецептор;
c) использование анти-ΤΝΤ антител, способных понижать некоторые токсические эффекты ΤΝΤ без изменения его противоопухолевой активности. Такие антитела уже описаны в литературе;
6) использование производных ΤΝΤ с повышенным периодом полураспада (например, ΤΝΤ конъюгированный с полиэтиленгликолем).
Недавно сообщалось о получении производных ΤΝΤ, обеспечивающих селективное нацеливание на опухолевые сайты. Например, был описан слитый белок, полученный путем слияния гена тяжелой цепи антитрансферринового рецептора тАЬ и гена ΤΝΤ, или слитый белок ΤΝΤ и шарнирной области моноклонального антитела против опухолево-ассоциированного ΤΑΟ72 антигена, или слитый белок Ρν-ΤΝΡ.
В ЕР 251494 раскрыта система для ведения диагностического или терапевтического агента, которая содержит антитело, конъюгированное с авидином или стрептавидином, агент, способствующий комплексообразованию конъюгированного антитела, и вещество, состоящее из диагностического или терапевтического агента, конъюгированного с биотином, которые вводили последовательно и в достаточной мере медленно для того, чтобы сделать возможной локализацию терапевтического или диагностического агента через биотин-стрептавидиновое взаимодействие на клетке-мишени, распознаваемой антителом. Описанные терапевтические или диагностические агенты содержат хелаты металлов, в частности хелаты радионуклидов, и низкомолекулярные противоопухолевые агенты, такие как цисплатин, доксорубицин и т.д.
В ЕР 496074 раскрыт способ, который предлагает последовательное введение биотинилированного антитела, авидина или стрептавидина и биотинилированного диагностического или терапевтического агента. Хотя, в общем, указывается цитотоксичность агентов, подобных рицину, заявка главным образом относится к радиолабильным соединениям.
В \УО 95/15979 раскрыт способ локализации высокотоксичных агентов на клеточных мишенях, основанный на введении первого конъюгата, содержащего специфическую молекулу-мишень, конъюгированную с лигандом или антилигандом, с последующим введением второго конъюгата, состоящего из токсичного агента, связанного с антилигандом или лигандом.
В \УО 99/13329 раскрыт способ направления молекулы к опухолевым ангиогенным сосудам, основанный на конъюгации указанной молекулы с лигандами ΝΟΚ рецепторов. В качестве возможных кандидатов рассматривался ряд молекул, но подробно описан только доксорубицин. Не раскрыто использование лигандов ΝΟΚ рецепторов в качестве носителей цитокинов для вызова иммунного ответа.
В \УО 01/61017 описано, что, как неожиданно найдено изобретателями, терапевтический показатель определенных цитокинов может быть значительно улучшен и их иммунотерапевтические свойства могут быть усилены путем связывания с лигандом рецептора Ν-аминопептидазы (С.П13). С.П13 является трансмембранным гликопротеином в 150 кДа, который хорошо сохраняется в различных видах. Его экспрессировали на нормальных клетках, а также в миелоидные опухолевые линии, в ангиогенный эндотелий и некоторый эпителий. СП 13 рецептор обычно идентифицируется как ΝΟΚ рецептор, так как его пептидные лиганды разделяют аминокислоты звена ΝΟΚ.
- 1 007396
Однако остается потребность в дальнейшем и в улучшенных фармацевтических композициях, и в способах лечения и диагностики рака.
Краткое описание изобретения
Доставка лекарственных средств и проникновение в неопластические клетки является решающей для эффективности опухолевой химиотерапии. Мы нашли, что неожиданно направленная доставка пикограммовых доз цитокинов усиливает пенетрацию химиотерапевтических лекарственных средств. Более подробно, мы нашли, что доставка очень низких доз цитокинов в опухоли и опухолеассоциированную окружающую среду, включая опухолевую сосудистую систему, представляет новый подход для того, чтобы избежать механизмы негативных ответных реакций и сохранить его способность видоизменять лекарственно-пенетрационные барьеры. Настоящее изобретение, таким образом, представляет новую и неожиданную стратегию для повышения терапевтического индекса химиотерапевтических лекарственных средств. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, мы нашли, используя сосудистое нацеливание, достигаемое путем связывания ΤΝΕ с ΟΝΟΒΟ, пептидом, который определяет опухолевую неоваскуляторность, что эта обработка в 8-10 раз увеличивает терапевтическую эффективность доксорубицина без заметного увеличения токсичности. Аналогично, сосудистое нацеливание увеличивает эффективность мелфалана, различных химиотерапевтических лекарственных средств. Синергия с химиотерапией наблюдалась с 3-5 нг/кг нацеленного ΤΝΕ (ί.ρ.), 106 раз ниже, чем БО5о. и 105 раз ниже, чем доза, требуемая для ненацеленного ΤΝΕ. Кроме того, мы также нашли, что нацеленная доставка низких доз ΤΝΕ в опухолевые сосуды не вызывает высвобождения растворимых ΤΝΕ рецепторов в циркуляцию. Также найдено, что Κ.ΟΌ-ΤΝΕ и ΙΕΝγ-ΝΟΒ активны в пикограммовом интервале. Также показано, что ΝΟΚ.-ΤΝΕ увеличивает эффект цисплатина. Эти результаты показывают, что доставка ультрамалых количеств цитокинов в опухолевые сосуды представляет новый подход для того, чтобы избежать механизмов негативных ответных реакций и сохранить его способность видоизменять лекарственнопенетрационные барьеры. Сосудистое нацеливание на этом пути представляет новую стратегию для усиления терапевтического индекса химиотерапевтических лекарственных средств.
Изложение изобретения
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат цитокина и опухоленацеливающего модуля (ТТМ) и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель, в которой цитокин присутствует в количестве, которое не вызывает механизма негативных ответных реакций. Соответственно цитокин присутствует в количестве, которое не вызывает выпадение растворимого цитокинового рецептора.
Предпочтительно конъюгат присутствует в количестве, обеспечивающем дозиравание в интервале от 0,5 до 500 нг/кг, более предпочтительно 1-50 нг/кг, еще более предпочтительно 5-15 нг/кг.
В одном варианте осуществления изобретения цитокин является воспалительным цитокином.
В другом варианте осуществления изобретения цитокин является химиотерапевтическим цитокином.
Предпочтительно цитокины выбирают из ΤΝΕ, таких как ΤΝΕα, ΤΝΕβ, ΙΕΝα, ΙΕΝβ, ΙΕΝγ, 1Б-1, 2, 4, 6, 12, 15, ΕΜΑΡ II, сосудистого эндотелиального фактора роста (ΥΕΟΕ), ΡΌΟΕ, ΡΌ-ΕΟΟΕ и хемокина.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения цитокин представляет собой ΤΝΕα, ΤΝΕβ или ΙΕΝγ, наиболее предпочтительно ΤΝΕα или ΤΝΕβ.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой связывающий партнер, такой как лиганд или антитело к поверхностной молекуле опухолевой клетки, такой как рецептор, маркер или другой внеклеточный компонент.
В другом варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой опухолево-сосудистый нацеливающий модулем (ΤνΤΜ) и может быть связывающим партнером, таким как лиганд, или антителом к поверхностной молекуле опухолевой сосудистой клетки, такой как рецептор, маркер или другой внеклеточный компонент.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой антитело или его фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой лиганд или его фрагмент.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой пептид, содержащий ΝΟΚ или Κ.ΟΌ звено, или представляет собой Ηΐν-ΙαΙ, аннексин V, остеопонтин, фибронектин, коллаген типа Ι или Ιν, гиалуронат или эфрин, или представляет собой связывающий партнер, такой как антитело к онкофетальному фибронектину, или представляет собой фрагмент любого из вышеуказанных. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит ΝΟΚ. звено. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой ΟΝΟΚΟνδΟΟΑΟΚΟ, ΝΟΚΑΗΛ, ΟΝΟΚ.Ο, циклоСV^N6ΚΜΕС, линейный или циклический ΟΝΟΚΟ.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой пептид, содержащий ΚΟΌ звено.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ нацелен на νΈΟΕΚ, 1СЛМ 1, 2 или 3, РЕСАМ1, СО13, VСΛΜ-1, селектин, ΛοΐΚΙΙ, ΛοΐΚΙΙΒ, ΛοΐΚΙ, ΛοΐΚΙΒ, СЭ44, аминопептидазу А, аминопептидазу Ν (СО13), ανβ3 интегрин, ανβ5 интегрин, ΕΟΕ-1,2,3, или 4, ΙΕ-1Κ, ΕΡΗΒ, ΜΜΡ, ΝΟ2, тенасцин, онкофе- 2 007396 тальный фибронектин, ΡΌ-ЕСОРК, ΤΝΡΚ, ΡΌΟΡΚ или Ρ8ΜΑ.
Комбинации предпочтительных нацеливающих модулей и цитокинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, приведены в нижеследующей таблице.
Цитокин Нацеливающий модуль
ΤΝΓ-α КСЮ-содержащий пептид
ΤΝΡ-β КСЮ- содержащий пептид
ΙΡΝ-α КСЮ- содержащий пептид
ΙΡΝ-β КСЮ- содержащий пептид
ΙΡΝ-γ КСЮ- содержащий пептид
1Ь-2 КСЮ- содержащий пептид
1Ь-12 КСЮ- содержащий пептид
ΕΜΑΡ II КСЮ- содержащий пептид
УЕОР КСЮ- содержащий пептид
1Ь-1 КСЮ- содержащий пептид
1Ь-6 КСЮ- содержащий пептид
1Ь-12 КСЮ- содержащий пептид
ΡϋΟΡ КСЮ- содержащий пептид
Ρϋ-ЕССР КСЮ- содержащий пептид
СХС хемокин КСЮ- содержащий пептид
СС хемокин КСЮ- содержащий пептид
С хемокин КСЮ- содержащий пептид
1Ь-15 КСЮ- содержащий пептид
ΤΝΡ-α ΝΟΚ- содержащий пептид
ΤΝΡ-β Ν6Κ- содержащий пептид
ΙΡΝ-α Ν6Κ- содержащий пептид
ΙΡΝ-β ΝΟΚ- содержащий пептид
ΙΡΝ-γ ΝΟΚ- содержащий пептид
- 3 007396
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
УЕСГ
1Ь-1
1Б-6
1Б-12
ΡϋΟΓ
Ρϋ-ЕСОГ
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
ΙΕ-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΕ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΕΝ-γ
1Ь-2
1Б-12
ЕМАР II
УЕСГ
1Ь-1
1Б-6
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
ΝΟΚ- содержащий пептид
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
Лиганд УЕОГК
- 4 007396
1Ь-12
ΡϋΟΡ
ΡΏ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΕ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
УЕСР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
РО-ЕССтР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
Лиганд УЕСРК
Лиганд УЕСРК.
Лиганд УЕСРК
Лиганд УЕСРК
Лиганд УЕСРК
Лиганд УЕСРК
Лиганд УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
Ат к УЕСРК
- 5 007396
1Ь-15 Ат к УЕОРК.
ΤΝΡ-α Н1У-1а1
ΤΝΡ-β Н1У-1а1
ΙΡΝ-α Ηΐν-ίαΐ
ΙΡΝ-β Ηΐν-ΐαΐ
ΙΡΝ-γ Ηΐν-ΐαΐ
1Ь-2 Ηΐν-ΐαΐ
1Ь-12 Ηΐν-ίαί
ΕΜΑΡ II Н1У-1а1
УЕОР Ηΐν-Ιαί
1Ь-1 Н1У-1Э1
1Ь-6 Н1У-Ш
1Ь-12 Ηΐν-ίαί
ΡϋΟΡ Ηΐν-ΐαΐ
Ρϋ-ЕСОР Ηΐν-Ш
СХС хемокин Ηΐν-ΐαΐ
СС хемокин Ηΐν-ίαί
С хемокин Ηΐν-ί3ί
1Ь-15 Н1У-!а1
ΤΝΡ-α Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΤΝΡ-β Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΙΡΝ-α Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΙΡΝ-β Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΙΡΝ-γ Лиганд 1САМ 1,2 или 3
- 6 007396
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
УЕСР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕССР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
УЕ6Р
1Ь-1
1Ь-6
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1С АМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Лиганд 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1С АМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1С АМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
- 7 007396
1Б-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕССР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΓ-α
ΤΝΓ-β
ΙΡΝ-α
ΙΕΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Б-12
ΕΜΑΡ II
УЕСР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
РО-ЕССгЕ
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Атк1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Ат к 1САМ 1,2 или 3
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1 /СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СО31
Лиганд РЕСАМ- 1/СОЗ1
Лиганд РЕСАМ-1/СО31
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Птлт^итт РРГАМ.1 /ГПТ1 ζιιιι ъххх/^ х χ^^ζχ ιΐ’ΐ х/ κ_ζχ-ζ«_/ х
Лиганд РЕСАМ-1/СО31
Лиганд РЕСАМ-1/СО31
Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
- 8 007396
1Ь-15 Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΤΝΡ-α Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΤΝΡ-β Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΙΡΝ-α Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΙΡΝ-β Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΙΡΝ-γ Атк РЕСАМ-1/СОЗ 1
1Ь-2 Ат к РЕСАМ-1/СО31
1Ь-12 Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΕΜΑΡ II Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
УЕ6Р Ат к РЕСАМ-1/СО31
1Ь-1 Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
1Ь-6 Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
1Ь-12 Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΡϋΟΡ Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
Ρϋ-ЕСОР Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
СХС хемокин Атк РЕСАМ-1/СОЗ 1
СС хемокин Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
С хемокин Ат к РЕСАМ-1/СО31
1Ь-15 Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΤΝΡ-α Лиганд УСАМ-1
ΤΝΡ-β Лиганд УСАМ-1
ΙΡΝ-α Лиганд УСАМ-1
ΙΡΝ-β Лиганд УСАМ-1
ΙΡΝ-γ Лиганд УСАМ-1
- 9 007396
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
УЕСР
ИМ
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΕ
Ρϋ-ЕССР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
УЕ6Р
1Ь-1
1Ь-6
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Лиганд УСАМ-1
Ат к УСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат к УСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат кУСАМ-1
Ат к УСАМ-1
- 10 007396
1Ь-12 Ат к УСАМ-1
ΡϋΟΡ Ат к УСАМ-1
Ρϋ-ЕССР Ат к УСАМ-1
СХС хемокин Ат кУСАМ-1
СС хемокин Ат кУСАМ-1
С хемокин Ат к УСАМ-1
1Ь-15 Ат кУСАМ-1
ΤΝΡ-α Лиганд Селектина
ΤΝΡ-β Лиганд Селектина
ΙΡΝ-α Лиганд Селектина
ΙΡΝ-β Лиганд Селектина
ΙΡΝ-γ Лиганд Селектина
1Ь-2 Лиганд Селектина
1Ь-12 Лиганд Селектина
ΕΜΑΡ II Лиганд Селектина
УЕСгР Лиганд Селектина
1Ь-1 Лиганд Селектина
1Ь-6 Лиганд Селектина
1Ц-12 Лиганд Селектина
ΡϋΟΡ Лиганд Селектина
Ρϋ-ЕСОР Лиганд Селектина
СХС хемокин Лиганд Селектина
СС хемокин Лиганд Селектина
С хемокин Лиганд Селектина
- 11 007396
1Ь-15 Лиганд Селектина
ΤΝΡ-α Ат к селектину
ΤΝΡ-β Ат к селектину
ΙΡΝ-α Ат к селектину
ΙΡΝ-β Ат к селектину
ΙΡΝ-γ Ат к селектину
1Ь-2 Ат к селектину
1Ь-12 Ат к селектину
ΕΜΑΡ II Ат к селектину
УЕСгР Ат к селектину
1Ь-1 Ат к селектину
1Ь-6 Ат к селектину
1Ь-12 Ат к селектину
ΡϋΟΡ Ат к селектину
Ρϋ-ЕСОР Ат к селектину
СХС хемокин Ат к селектину
СС хемокин Ат к селектину
С хемокин Ат к селектину
1Ь-15 Ат к селектину
ΤΝΡ-α Лиганд АсЖП, АсСКЛВ, Ас1К1 или Ас1К1В
ΤΝΡ-β Лиганд Ас1КЛ, Ас1К11В, Ас1К1 или Ас1К.1В
ΙΡΝ-α Лиганд Ас1К11, АсЙШВ, Ас1К1 или Ас1К1В
- 12 007396
ΙΡΝ-β Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΙΡΝ-γ Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-2 Лиганд ΑοΐΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-12 Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΕΜΑΡ II Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
УЕСЕ Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-1 Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-6 Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-12 Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΡϋΟΡ Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
Ρϋ-ЕСОР Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
СХС хемокин Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
СС хемокин Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
С хемокин Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-15 Лиганд ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΤΝΡ-α Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΤΝΡ-β Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
- 13 007396
ΙΕΝ-α Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΙΡΝ-β Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΙΡΝ-γ Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-2 Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Б-12 Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΕΜΑΡ II Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
УЕОР Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-1 Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-6 Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-12 Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΡϋΟΡ Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
Ρϋ-ЕСОР Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
СХС хемокин Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
СС хемокин Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
С хемокин Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
1Ь-15 Ат κ ΑοίΚΙΙ, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑοίΚΙΒ
ΤΝΡ-α Аннексии V
ΤΝΡ-β Аннексии V
ΙΡΝ-α Аннексии V
ΙΡΝ-β Аннексии V
ΙΡΝ-γ Аннексии V
1Ь-2 Аннексии V
1Ы2 Аннексии V
ΕΜΑΡ II Аннексии V
- 14 007396
УЕОЕ Аннексии V
1Ь-1 Аннексии V
1Ь-6 Аннексии V
1Ь-12 Аннексии V
ΡϋΟΕ Аннексии V
Ρϋ-ЕСОЕ Аннексии V
СХС хемокин Аннексии V
СС хемокин Аннексии V
С хемокин Аннексии V
1Б-15 Аннексии V
ΤΝΕ-α Лиганд СЭ44
ΤΝΕ-β Лиганд ΟΏ44
ΙΓΝ-α Лиганд Οϋ44
ΙΡΝ-β Лиганд Οϋ44
ΙΕΝ-γ Лиганд Οϋ44
1Ь-2 Лиганд ΟΏ44
ΙΣ-12 Лиганд Οϋ44
ЕМАР II Лиганд Οϋ44
УЕОР Лиганд Οϋ44
1Ь-1 Лиганд СЭ44
1Б-6 Лиганд СЭ44
1Ь-12 Лиганд Οϋ44
ΡϋΟΡ Лиганд Οϋ44
Ρϋ-ЕСОГ Лиганд ΟΏ44
- 15 007396
СХС хемокин Лиганд СО44
СС хемокин Лиганд СО44
С хемокин Лиганд СЭ44
1Ь-15 Лиганд СЭ44
ΤΝΡ-α Ат к СЕ44
ΤΝΡ-β Ат к СО44
ΙΡΝ-α Ат к СО44
ΙΡΝ-β Ат к СО44
ΙΡΝ-γ Ат к С 1)4 4
1Ь-2 Ат к СЭ44
1Ь-12 Ат к СО44
ΕΜΑΡ II Ат к СЕ44
УЕСР Ат к СО44
1Ь-1 Ат к СО44
1Б-6 Ат к СО44
1Ь-12 Ат к СЕ44
Ρϋ6Ρ Ат к СБ44
Ρϋ-ЕССР Ат к СЭ44
СХС хемокин Ат к СЭ44
СС хемокин Ат к СО44
С хемокин Ат к СЭ44
1Ь-15 Ат к СО44
ΤΝΡ-α Остеопонтин
ΤΝΡ-β Остеопонтин
- 16 007396
ΙΓΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
УЕОР
ΙΣ-1
1Ь-6
ΙΣ-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Остеопонтин
Фибронектин
Фибронектин
Фибронектин
Фибронектин
Фибронектин
Фибронектин
Фибронектин
Фибронектин
- 17 007396
УЕОЕ Фибронектин
1Ь-1 Фибронектин
1Ь-6 Фибронектин
1Ь-12 Фибронектин
ΡϋΟΓ Фибронектин
Ρϋ-ЕСОР Фибронектин
СХС хемокин Фибронектин
СС хемокин Фибронектин
С хемокин Фибронектин
1Ь-15 Фибронектин
ΤΝΕ-α Коллаген типа I или IV
ΤΝΕ-β Коллаген типа I или IV
ΙΕΝ-α Коллаген типа I или IV
ΙΕΝ-β Коллаген типа I или IV
ΙΓΝ-γ Коллаген типа I или IV
1Ь-2 Коллаген типа I или IV
1Ь-12 Коллаген типа I или IV
ΕΜΑΡ II Коллаген типа I или IV
УЕОЕ Коллаген типа I или IV
1Ь-1 Коллаген типа I или IV
ΤΤ ή
1\.ил.ти VII шиа ± халхж х ν
1Б-12 Коллаген типа I или IV
ΡϋΟΡ Коллаген типа I или IV
Ρϋ-ЕСОГ Коллаген типа I или IV
- 18 007396
СХС хемокин Коллаген типа I или IV
СС хемокин Коллаген типа I или IV
С хемокин Коллаген типа I или IV
1Ь-15 Коллаген типа I или IV
ΤΝΡ-α Гиалуронат
ΤΝΡ-β Гиалуронат
ΙΡΝ-α Гиалуронат
ΙΡΝ-β Гиалуронат
ΙΡΝ-γ Гиалуронат
1Ь-2 Гиалуронат
1Ь-12 Гиалуронат
ΕΜΑΡ II Гиалуронат
УЕСР Гиалуронат
1Ь-1 Гиалуронат
1Ь-6 Гиалуронат
1Ь-12 Гиалуронат
РОСР Гиалуронат
Ρϋ-ЕССР Гиалуронат
СХС хемокин Гиалуронат
СС хемокин Гиалуронат
С хемокин Гиалуронат
1Ь-15 Гиалуронат
ΤΝΡ-α Лиганд РСР-1, 2, 3 или 4
ΤΝΡ-β Лиганд РСР-1, 2, 3 или 4
- 19 007396
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
УЕОР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
Π?ΝΤ_λ,
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1,2,3 или 4
Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
Лиганд РСР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
Ат к РСР-1, 2, 3 или 4
Ат к РСР-1, 2, 3 или 4
Ат к РСР-1,2, 3 или 4
Ат к РОР-1, 2, 3 или 4
Ат ν Э ιχττττ Л Л Ь Л. ПЖ Л. ) 11ЛХ1 I
Ат к РОР-1, 2, 3 или 4
Ат к РОР-1, 2, 3 или 4
Ат к РСР-1,2, 3 или 4
- 20 007396
- 21 007396
СХС хемокин Лиганд 1Ь-1К
СС хемокин Лиганд 1Ь-1К
С хемокин Лиганд 1Ь-1К
1Ь-15 Лиганд 1Ь-1К.
ΤΝΡ-α Атк1Ь-1К
ΤΝΡ-β АткПМК.
ΙΡΝ-α Ат к 1Ь-Ш
ΙΡΝ-β Ат к 1Ь-1К.
ΙΡΝ-γ Ат к 1Ь-1К.
1Ь-2 Атк1Ь-1К
1Ь-12 Ат к 1Ь-1К
ЕМАР II Ат к 1Б-1К.
УЕСР Ат к 1Ь-1В.
1Ь-1 АткНМК.
1Ь-6 Ат к 1Ь-1К
1Ь-12 АткПМК.
ΡϋΟΡ АткПМК.
Ρϋ-ЕСОР Ат к 1Ь-1К.
СХС хемокин Атк1Ь-1К
СС хемокин Ат к 1Ь-1К
С хемокин АткПМК.
1Ь-15 Ат к 1ЫК
ΤΝΡ-α Лиганд СОЗ 1
ΤΝΡ-β Лиганд СОЗ 1
- 22 007396
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
Ш-12
ΕΜΑΡ II
УЕСР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
Лиганд СОЗ1
Лиганд СОЗ1
Лиганд СОЗ1
Лиганд СОЗ1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ1
Лиганд СОЗ1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Лиганд СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
- 23 007396
УЕСгР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕССР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
УЕСР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕССР
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Ат к СОЗ 1
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
Лиганд ЕРНК
- 24 007396
СХС хемокин Лиганд ЕРНК
СС хемокин Лиганд ЕРНК.
С хемокин Лиганд ЕРНК
1Ь-15 Лиганд ЕРНК
ΤΝΡ-α Ат к ЕРНК
ΤΝΡ-β Ат к ЕРНК
ΙΡΝ-α Ат к ЕРНК
ΙΡΝ-β Ат к ЕРНК
ΙΡΝ-γ Ат к ЕРНК
1Ь-2 Ат к ЕРНК
1Ь-12 Ат к ЕРНК
ΕΜΑΡ II Ат к ЕРНК
УЕОР Ат к ЕРНК
1Ь-1 Ат к ЕРНК
1Ь-6 Ат к ЕРНК
1Ь-12 Ат к ЕРНК
ΡϋΟΡ Ат к ЕРНК
РО-ЕСОР Ат к ЕРНК
СХС хемокин Ат к ЕРНК
СС хемокин Ат к ЕРНК
С хемокин Ат к ЕРНК
1Ь-15 Ат к ЕРНК
ΤΝΡ-α Эфрин
ΤΝΡ-β Эфрин
- 25 007396
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
ΙΣ-2
1Б-12
ЕМАР II
УЕОР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ЕМАР II
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
Эфрин
ТТ__ А XX ХТЧ лиганд ммг
Лиганд ММР
Лиганд ММР
Лиганд ММР
Лиганд ММР
Лиганд ММР
Лиганд ММР
Лиганд ММР
- 26 007396
УЕ6Р Лиганд ΜΜΡ
1Ь-1 Лиганд ΜΜΡ
1Ь-6 Лиганд ΜΜΡ
1Ь-12 Лиганд ΜΜΡ
Ρϋ6Ρ Лиганд ΜΜΡ
Ρϋ-ЕССР Лиганд ΜΜΡ
СХС хемокин Лиганд ΜΜΡ
СС хемокин Лиганд ΜΜΡ
С хемокин Лиганд ΜΜΡ
1Ь-15 Лиганд ΜΜΡ
ΤΝΡ-α Ат κ ΜΜΡ
ΤΝΡ-β Ат κ ΜΜΡ
ΙΡΝ-α Ат κ ΜΜΡ
ΙΡΝ-β Ат κ ΜΜΡ
ΙΡΝ-γ Ат κ ΜΜΡ
1Ь-2 Ат κ ΜΜΡ
ΙΕ-12 Ат κ ΜΜΡ
ΕΜΑΡ II Ат κ ΜΜΡ
УЕСР Ат κ ΜΜΡ
1Б-1 Ат κ ΜΜΡ
1Б-6 Ат κ ΜΜΡ
1Б-12 Ат κ ΜΜΡ
ΡϋΟΡ Ат κ ΜΜΡ
Ρϋ-ЕССР Ат κ ΜΜΡ
- 27 007396
СХС хемокин Ат к ММР
СС хемокин Ат к ММР
С хемокин Ат к ММР
1Ь-15 Ат к ММР
ΤΝΡ-α Лиганд N02
ΤΝΡ-β Лиганд N02
ΙΡΝ-α Лиганд N02
ΙΡΝ-β Лиганд N02
ΙΡΝ-γ Лиганд N02
1Ь-2 Лиганд N02
1Ь-12 Лиганд N02
ΕΜΑΡ II Лиганд N02
УЕОР Лиганд N02
1Ь-1 Лиганд N02
1Ь-6 Лиганд N02
1Ь-12 Лиганд N02
ΡϋΟΡ Лиганд N02
Ρϋ-ЕСОР Лиганд N02
СХС хемокин Лиганд N02
СС хемокин Лиганд N02
С хемокин Лиганд N02
1Ь-15 Лиганд N02
ΤΝΡ-α Ат к N02
ΤΝΡ-β Ат к N02
- 28 007396
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
УЕОР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Ат к N02
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
- 29 007396
УЕОР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
УЕСР
1Ь-1
ТТ У 1Ь-О
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Лиганд тенасцина
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
Ат к тенасцину
- 30 007396
СХС хемокин Ат к тенасцину
СС хемокин Ат к тенасцину
С хемокин Ат к тенасцину
1Ь-15 Ат к тенасцину
ΤΝΡ-α Лиганд РО-ЕССРК.
ΤΝΡ-β Лиганд Ρϋ-ЕССРК
ΙΡΝ-α Лиганд Ρϋ-ЕССРК
ΙΡΝ-β Лиганд Ρϋ-ЕССРК
ΙΡΝ-γ Лиганд Ρϋ-ЕССРК
1Ь-2 Лиганд Ρϋ-ЕССРК
1Ь-12 Лиганд Ρϋ-ЕССРК
ΕΜΑΡ II Лиганд РО-ЕССРК.
УЕСР Лиганд Ρϋ-ЕССРК
1Ь-1 Лиганд РЭ-ЕСОРК
1Ь-6 Лиганд РЭ-ЕСОРК
1Ь-12 Лиганд Ρϋ-ЕССРК
РОСР Лиганд РО-ЕСОРК
Ρϋ-ЕССР Лиганд Ρϋ-ЕССРК
СХС хемокин Лиганд РЭ-ЕСОРК
СС хемокин Лиганд РО-ЕСОРК.
С хемокин Лиганд РО-ЕСОРК
1Ь-15 Лиганд Ρϋ-ЕССРК
ΤΝΡ-α Ат к Ρϋ-ЕССРК
ΤΝΡ-β Ат к Ρϋ-ЕССРК
- 31 007396
ΙΡΝ-α Ат к Ρϋ-ЕСОРК
ΙΡΝ-β Ат к Ρϋ-ЕССРК.
ΙΡΝ-γ Ат к Ρϋ-ЕСОРК
1Ь-2 Ат к Ρϋ-ЕСОРК.
1Ь-12 Ат к Ρϋ-ЕССРК
ΕΜΑΡ II Ат к Ρϋ-ЕССРК
УЕСР Ат к Ρϋ-ЕССРК
1Ь-1 Ат к Ρϋ-ЕСОРК
1Ь-6 Ат к Ρϋ-ЕССРК.
1Ь-12 Ат к РО-ЕССРК
ΡϋΟΡ Ат к Ρϋ-ЕССРК
Ρϋ-ЕССР Ат к Ρϋ-ЕСОРК.
СХС хемокин Ат к Ρϋ-ЕСОРК.
СС хемокин Ат к Ρϋ-ЕССРК
С хемокин Ат к Ρϋ-ЕССРК
1Ь-15 Ат к Ρϋ-ЕССРК
ΤΝΡ-α Лиганд ΤΝΡΚ.
ΤΝΡ-β Лиганд ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-α Лиганд ΤΝΡΚ.
ΙΡΝ-β Лиганд ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-γ Лиганд ΤΝΡΚ.
1Б-2 Лиганд ΤΝΡΚ.
1Ь-12 Лиганд ΤΝΡΚ.
ΕΜΑΡ II Лиганд ΤΝΡΚ
- 32 007396
УЕОР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ΕΟΟΡ
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ы5
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
УЕОР
1Ь-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ.
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ
Лиганд ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
Ат к ΤΝΡΚ
- 33 007396
СХС хемокин Ат к ΤΝΡΚ
СС хемокин Ат к ΤΝΡΚ
С хемокин Ат к ΤΝΡΚ
1Б-15 Ат к ΤΝΡΚ
ΤΝΡ-α Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΤΝΡ-β Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-α Лиганд РОСРК
ΙΡΝ-β Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-γ Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Ь-2 Лиганд ΡϋΟΡΚ
Ιϋ-12 Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΕΜΑΡ II Лиганд ΡϋΟΡΚ
УЕОР Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Ь-1 Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Б-6 Лиганд ΡϋΟΡΚ
Ιϋ-12 Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΡϋΟΡ Лиганд ΡϋΟΡΚ
Ρϋ-ЕСОР Лиганд ΡϋΟΡΚ
СХС хемокин Лиганд ΡϋΟΡΚ
СС хемокин Лиганд ΡϋΟΡΚ
С хемокин Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Б-15 Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΤΝΡ-α Ат к ΡϋΟΡΚ
ΤΝΡ-β Ат к ΡϋΟΡΚ
- 34 007396
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
Ιϋ-2
1Ь-12
ΕΜΑΡ II
УЕОР
Ιϋ-1
1Ь-6
1Ь-12
ΡϋΟΡ
Ρϋ-ЕСОР
СХС хемокин
СС хемокин
С хемокин
1Ь-15
ΤΝΡ-α
ΤΝΡ-β
ΙΡΝ-α
ΙΡΝ-β
ΙΡΝ-γ
1Ь-2
Ιί-12
ΕΜΑΡ II
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ.
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Ат к ΡϋΟΡΚ
Лиганд Ρ8ΜΑ
Лиганд Ρ8ΜΑ
Лиганд Ρ8ΜΑ
Лиганд Р8МА
Лиганд Р8МА
Лиганд Р8МА
Лиганд Р8МА
Лиганд Р8МА
- 35 007396
- 36 007396
СХС хемокин Ат к Р8МА
СС хемокин Ат к Р8МА
С хемокин Ат к Р8МА
Ш-15 Ат к Р8МА
ΤΝΡ-α Витронектин
ΤΝΡ-β Витронектин
ΙΡΝ-α Витронектин
ΙΡΝ-β Витронектин
ΙΡΝ-γ Витронектин
Ш-2 Витронектин
Ш-12 Витронектин
ΕΜΑΡ II Витронектин
УЕОР Витронектин
1Ь-1 Витронектин
1Ь-6 Витронектин
Ш-12 Витронектин
Ρϋ6Ρ Витронектин
РЭ-ЕССР Витронектин
СХС хемокин Витронектин
С С хемокин Витронектин
хсмикин оитронектин
Ш-15 Витронектин
ΤΝΡ-α Ламинин
ΤΝΡ-β Ламинин
- 37 007396
ΙΡΝ-α Ламинин
ΙΡΝ-β Ламинин
ΙΡΝ-γ Ламинин
1Ь-2 Ламинин
ΙΣ-12 Ламинин
ΕΜΑΡ II Ламинин
УЕСР Ламинин
1Ь-1 Ламинин
1Ь-6 Ламинин
1Ь-12 Ламинин
ΡϋΟΡ Ламинин
Ρϋ-ЕСОР Ламинин
СХС хемокин Ламинин
СС хемокин Ламинин
С хемокин Ламинин
1Ь-15 Ламинин
ТТыГЯИП АТПГПгЬрТЯТТКИАГА Л>ы6пАИРИ“Г1ТИЯ
* А 11 кЛ
ΤΝΡ-β Лиганд онкофетального фибронектина
ΙΡΝ-α Лиганд онкофетального фибронектина
ΙΡΝ-β Лиганд онкофетального фибронектина
ΙΡΝ-γ Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-2 Лиганд онкофетального фибронектина
ΙΣ-12 Лиганд онкофетального фибронектина
ΕΜΑΡ II Лиганд онкофетального фибронектина
- 38 007396
УЕОР Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-1 Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-6 Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-12 Лиганд онкофетального фибронектина
ΡϋΟΡ Лиганд онкофетального фибронектина
Ρϋ-ЕСОР Лиганд онкофетального фибронектина
СХС хемокин Лиганд онкофетального фибронектина
СС хемокин Лиганд онкофетального фибронектина
С хемокин Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-15 Лиганд онкофетального фибронектина
ΤΝΡ-α Ат к онкофетальному фибронектину
ΤΝΡ-β Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΡΝ-α Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΡΝ-β Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΡΝ-γ Ат к онкофетальному фибронектину
1Ь-2 Ат к онкофетальному фибронектину
1Ь-12 Ат к онкофетальному фибронектину
ΕΜΑΡ II Ат к онкофетальному фибронектину
УЕОР Ат к онкофетальному фибронектину
1Ь-1 Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΕ-б Ат к онкофетальному фибронектину
1Ь-12 Ат к онкофетальному фибронектину
ΡϋΟΡ Ат к онкофетальному фибронектину
РЭ-ЕСОР Ат к онкофетальному фибронектину
СХС хемокин Ат к онкофетальному фибронектину
СС хемокин Ат к онкофетальному фибронектину
С хемокин Ат к онкофетальному фибронектину
1Ь-15 Ат к онкофетальному фибронектину
Следует отметить, что в вышеуказанной таблице термин Ат означает антитело и что антитела и лиганды включают их фрагменты.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат содержит ΤΝΕα или
- 39 007396
ΤΝΡβ и ΝΟΚ-содержащий пептид, или ΤΝΡα или ΤΝΡβ и ΒΟΌ-содержащий пептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат представлен в форме слитого белка.
В другом варианте осуществления изобретения конъюгат представлен в форме нуклеиновой кислоты.
В другом варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит другой противоопухолевый агент или диагностическое опухоле-визуализирующее вещество. Предпочтительно дополнительным противоопухолевым агентом является доксорубицин, мелфалан или цисплатин.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается использование конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для приготовления лекарственного средства для лечения или диагностики рака.
Другими словами, настоящее изобретение предлагает способ лечения или диагностики рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или диагностике, конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в эффективном количестве, причем указанное количество не вызывает механизма негативной ответной реакции.
Некоторые ключевые преимущества изобретения
Для того чтобы достигнуть раковых клеток в твердых опухолях, химиотерапевтические лекарственые средства должны проникнуть в кровеносные сосуды опухоли, пересечь сосудистую стенку и окончательно мигрировать через интерстициому. Гетерогенная опухолевая перфузия, сосудистая проницаемость и клеточная плотность, и увеличенное интерстициональное давление могут представлять существенные барьеры, что может ограничить проникновение лекарственного средства в неопластичные клетки, отдаленные от опухолевых сосудов и, следовательно, эффективность химиотерапии (1). Стратегии, направленные на улучшение пенетрации лекарственного средства в опухоль, представляют, таким образом, большой экспериментальный и клинический интерес.
Растущий объем данных показывает, что фактор некроза опухоли α (ΤΝΓ) и воспалительный цитокин, наделенный потенциальной противоопухолевой активностью, могут использоваться для этой цели. Например, добавление ΤΝΓ к регионарной изолированной перфузии конечности мелфаланом или доксорубицином привело к более высоким показателям отклика у пациентов с завершающей стадией саркомы мягких тканей или меланомы, чем полученным с единственным химиотерапевтическим лекарственным средством (2-6). Вызываемое ΤΝΓ изменение эндотелиальной барьерной функции, снижение опухолевого интерстициального давления, увеличение пенетрации химиотерапевтического лекарственного средства и повреждения опухолевых сосудов подтверждают важность механизмов синергии между ΤΝΓ и химиотерапией (3, 4, 7-10). К сожалению, системное введение ΤΝΓ сопровождается чрезмерной токсичностью, максимально допустимая доза (8-10 мкг/кг) в 10-50 раз ниже, чем предполагаемая эффективная доза (11, 12). По этой причине отказались от системного введения ΤΝΓ и клиническое применение этого цитокина ограничено местно-регионарным лечением. Тем не менее, некоторые особенности активности ΤΝΓ, в частности селективность опухоле-ассоциированных сосудов и синергия с химиотерапевтическими лекарственными средствами, продолжают поддерживать надежды относительно более широкого терапевтического применения (13).
Сосудистые эффекты ΤΝΓ обеспечивают рациональное развитие стратегии сосудистого нацеливания, направленной на увеличение локальной эффективности и на возможность системного введения терапевтических доз. Недавно мы показали, что направленная доставка ΤΝΓ в опухолевые сосуды может быть достигнута путем связывания этого белка с СЫСЯС пептидом, лигандом аминопептидазы Ν (СЭ13), который определяет опухолевую неоваскулярность (14). В настоящей работе мы исследовали, может ли сосудистое нацеливание малых доз этого конъюгата, названного ΝΟΒ- ΤΝΓ, увеличить пенетрацию химиотерапевтических лекарственных средств в опухоль и улучшить их эффективность. Мы показали, что системное введение пикограммовых доз ΝΟΒ- ΤΝΕ (3-5 нг/кг) мышам, величина на шесть порядков меньшая, чем ЬЭ50. достаточно для повышения противоопухолевой активности мелфалана и доксорубицина без заметного увеличения токсичности. Кроме того, мы подтвердили, что сосудистое нацеливание ΝΟΒ- ΤΝΡ может ослабить лекарственно-пенетрационные барьеры и увеличить количество доксорубицина, которое достигает раковых клеток. И, наконец, мы показали, что доставка ультрамалых количеств ΝΟΒ- ΤΝΓ в опухолевые сосуды решает другую важную проблему, связанную с системным введением относительно высоких доз ΤΝΓ, т.е. индукцию растворимых ΤΝΓ ингибиторов.
Подробное описание изобретения
Теперь будут описаны различные предпочтительные особенности и варианты осуществления изобретения в виде нелимитирующих примеров.
Хотя, в основном, используемые здесь методики хорошо известны из уровня техники, можно сделать ссылки, в частности, на БатЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1опшд, А ЬаЬога1огу Мапиа1 (1989) апб Аи5иЬе1 с1 а1., Б1юй РгоЮсок ш Мо1еси1аг Вю1оду (1999) 411' Еб, 1окп \УПеу & Бопк, 1пс. (а также полная версия Сиггеп1 РгоЮсоЕ ш Мо1еси1аг Вю1оду).
Механизмы негативных ответных реакций.
Механизмы негативных ответных реакций известны из уровня техники и могут включать выпаде
- 40 007396 ние растворимого рецептора и индукцию других цитокинов, гормонов или биологических агентов на системном или местном уровне так, что они прямо или опосредованно уменьшают активность нацеливаемого цитокина по настоящему изобретению. Индукция растворимых ингибиторов или ложных рецепторов являются примерами прямых ингибиторов. 1Ь-10, ТСЕ-β или другие противовоспалительные цитокины могут опосредованно предотвращать каскад событий, инициированных воспалительными цитокинами.
Выпадение рецептора.
Этот термин относится к способности клеток расщеплять внеклеточный домен цитокинового рецептора и высвобождать его в циркуляцию как растворимый продукт. Во многих случаях эти расщепленные продукты все еще способны к связыванию их лигандов. Однако, наоборот, остающаяся часть мембранно-связанного рецептора не связывает лиганды сколько-нибудь длиннее и поэтому клетки становятся десенсибилизируемыми действием конкретного цитокина. Такие растворимые рецепторы описаны для различных цитокинов, включая 1Ь-4, 6, 6, ЮР, ΤΝΡ-α и ΙΡΝ-γ.
Конъюгат.
Настоящее изобретение относится к конъюгату, который представляет собой молекулу, содержащую по меньшей мере один нацеливающий белок, связанный, по крайней мере, с цитокином, образованный через генетическое слияние или химическое сдваивание. Под термином связанный мы подразумеваем, что первая и вторая последовательности ассоциированы так, что вторая последовательность способна транспортироваться первой последовательностью к клетке-мишени. Таким образом, конъюгаты включают слитые белки, в которых транспортный белок связан с цитокином через их полипептидные скелеты посредством генетической экспрессии молекулы ДНК, кодирующей эти белки, непосредственно синтезированные белки и спаренные белки, в которых первоначально образуемая последовательность ассоциирована структурирующим агентом. Этот термин также включает ассоциаты, такие как агрегаты, цитокина с нацеливающим белком. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения вторая последовательность может содержать полинуклеотидную последовательность. Этот вариант осуществления может рассматриваться как комплекс белок/нуклеиновая кислота.
Вторая последовательность может быть того же вида, что и первая последовательность, но в конъюгате по настоящему изобретению, в некоторой степени, различны с природной ситуацией, или последовательности могут быть разного вида.
Конъюгаты по настоящему изобретению способны направляться к клетке так, что может иметь место эффекторная функция, соответствующая полипептидной последовательности спаренной с транспортной последовательностью.
Пептид может быть спарен прямо с цитокином или опосредованно через спейсер, которым может быть единичная аминокислота, аминокислотная последовательность или органический остаток, такой как 6-аминокаприл-№гидроксисукцинимид.
Пептидный лиганд предпочтительно связан с Ν-концом цитокина, минимизируя таким образом любое вмешательство в связывание модифицированного цитокина с его рецептором. И наоборот, пептид может быть связан с аминокислотными остатками, которые являются амидо- или карбоксильносвязанными акцепторами, которые могут быть на молекуле от природы или искусственно вставленными с помощью методов генной инженерии. Модифицированный цитокин преимущественно получают с использованием кДНК, содержащей 5'-прилегающую последовательность, кодирующую пептид.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагается продукт конъюгации между ΤΝΡ и СЛСКС последовательностью, в котором аминный конец ΤΝΡ связан с СЛСКС пептидом через спейсер С (глицин).
Цитокины.
Пенетрация лекарственного средства в неопластичные клетки является основной для эффективности твердо-опухолевой химиотерапии. Для того чтобы достать раковые клетки в твердых опухолях, химиотерапевтические лекарственые средства должны проникнуть в кровеносные сосуды опухоли, пересечь сосудистую стенку и окончательно мигрировать через интерстициому. Гетерогенная опухолевая перфузия, сосудистая проницаемость и клеточная плотность и увеличенное интерстициональное давление могут представлять существенные барьеры, что может ограничить проникновение лекарственного средства в неопластичные клетки, отдаленные от опухолевых сосудов, и следовательно, эффективность химиотерапии. Цитокины, которые влияют на подавление этих факторов и используются в настоящем изобретении. Нелимитирующий список цитокинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включает: ΤΝΡα, ΤΝΡβ, ΙΡΝα, ΙΡΝβ, ΙΡΝγ, 1Б-1, 2, 4, 6, 12, 15, ΕΜΑΡ II, сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕСР), РЭСГ. РЭ-ЕССГ или хемокин.
ΤΝΡ.
ΤΝΡ действует как воспалительный цитокин и влияет на изменение эндотелиальной барьерной функции, снижение опухолевого интерстициального давления и увеличение пенетрации химиотерапевтического лекарственного средства и повреждение опухолевых сосудов.
Первое предположение, что существует некротизирующая опухоль молекула, было сделано, когда
- 41 007396 было обнаружено, что у раковых пациентов иногда наблюдалась спонтанная регрессия опухолей после бактериальных инфекций. Последующие исследования в 1960-х подтвердили, что хозяинассоциированные (или эндогенные) медиаторы, вырабатываемые в ответ на бактериальные продукты, были, вероятно, ответственны за наблюдаемые эффекты. В 1975 г. было показано, что бактериальноиндуцируемый циркулирующий фактор имел сильную противоопухолевую активность против опухолей, имплантированных в кожу мыши. Этот фактор, названный фактором некроза опухоли (ΤΝΡ), был впоследствии выделен, клонирован и оказался прототипом семейства молекул, вовлеченных в иммунную регуляцию и воспаление. Рецепторы для ΤΝΡ и других членов суперсемейства ΤΝΡ также составляют суперсемейство родственных белков.
Соответствующие ΤΝΡ лиганды обычно разделяют ряд общих свойств. Эти свойства не включают высокую степень гомологии общей аминокислотной последовательности. За исключением фактора роста нервов (ΝΟΡ) и ΤΝΡ-β, все лиганды синтезированы в виде трансмембранных белков II типа (внеклеточный С-конец), которые содержат короткий цитоплазматический сегмент (10-80 аминокислотных остатков) и относительно длинную внеклеточную область (140-215 аминокислотных остатков). ΝΟΡ, который структурно неродственный ΤΝΡ, включен в это суперсемейство только потому, что его способность связывать ΤΝΡΚ.8Ρ ниже аффинности ΝΟΡ рецептора (ΕΝΟΡΒ). ΝΟΡ имеет классическую сигнальную последовательность пептида и является секретированным. ΤΝΡ-β, наоборот, хотя также полностью секретирован, имеет первичную структуру намного более родственную трансмембранным белкам типа II. ΤΝΡ-β можно рассматривать как белок типа II с нефункциональным, или неэффективным, трансмембранным сегментом. В общем ΤΝΡ8Ρ члены образуют тримерные структуры, а их мономеры составлены из β-цепей, которые ориентируют их в двухпластинчатую структуру. Как следствие тримерной структуры этих молекул, предположили, что лиганды и рецепторы ΤΝ8Ρ и ΤΝΡΚ.8Ρ суперсемейств подвергаются кластеризации во время сигнальной трансдукции.
ΤΝΡ-α. Человеческий ΤΝΡ-α представляет собой негликозилированный полипептид из 233 аминокислотных остатков, который существует либо как трансмембранный, либо как растворимый белок. Когда выражен в виде мембранного связанного белка в 26 кДа, ΤΝΡ-α состоит из цитоплазматического домена, включающего 29 аминокислотных остатков, трансмембранного сегмента, включающего 28 аминокислотных остатков, и внеклеточного участка, включающего 176 аминокислотных остатков. Растворимый белок создается путем протеолитического расщепления с помощью ΤΝΡ-α конвертирующего фермента (ТАСЕ) в 85 кДа, который генерирует молекулу в 17 кДа, включающую 157 аминокислотных остатков, которая обычно циркулирует в виде гомотримера.
ΤΝΡ-β/ΕΤ-α. ΤΝΡ-β, по-другому известный как лимфотоксин-α (ΕΤ-α), является молекулой, клонирование которой было осуществлено одновременно с клонированием ΤΝΡ-α. Хотя ΤΝΡ-β циркулирует в виде гликозилированного полипептида в 25 кДа, состоящего из 171 аминокислотного остатка, была найдена большая форма длиной 194 аминокислотных остатка. Человеческие ΤΝΡ-β к ДНК коды для открытого считывания составлены из 205 аминокислотных остатков (202 у мыши), и очевидно, некоторая протеолитическая переработка осуществляется во время секреции. Как и ΤΝΡ-α, циркулирующий ΤΝΡβ существует в виде нековалентно связанного тримера, и известно, что он связывает те же рецепторы, что и ΤΝΡ-α.
В одном варианте осуществления изобретения ΤΝΡ представляет собой мутантную форму ΤΝΡ, способную селективно связываться с одним из ΤΝΡ рецепторов (БосБсНсг Н. е! а1. (1993) 1 ΒίοΙ СНсш 268:26350-7; Уап О§1аке X. е! а1. (1993) Ыа1иге 361:266-9).
Многие другие воспалительные цитокины также обладают способностью увеличивать проницаемость эндотелиальных сосудов, и следует принимать во внимание, что изобретение может применять такие цитокины, вместе с агентами, которые увеличивают экспрессию таких цитокинов. Воспалительные цитокины, также известные как провоспалительные цитокины, представляют собой ряд полипептидов или гликопротеинов с молекулярными массами между 5 и 70 кДа. Они обладают стимулирующим эффектом на воспалительную реакцию. Наиболее важными воспалительными цитокинами являются ΤΝΡ, Ш-1, Ш-6 и Ш-8.
Таблица некоторых цитокинов, классифицированных как воспалительные цитокины, показана ниже:
- 42 007396
Воспалительные цитокины
Группа Индивидуальные цитокины
Эндогенные цитокины Ш-1, ΤΝΡ-α, Ш-6
Повышающая регуляция Ш-1, ΤΝΡ-α, Ш-6, ΙΡΝ-α, ΙΝΡ-β, хемокины
Стимуляция продукта ревматических проб Ш-1, Ш-6, Ш-11, ΤΝΡ-α, ΙΝΡ-γ, ΤΟΡ-β, ЫР, ΟδΜ, ΕΝΤΡ
Хемоаттрактантные цитокины
СХС хемокины Ш-8, РР-4, РВР, ΝΑΡ-2, β-ΤΟ
СС хемокины ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-Ιβ, МСР-1, МСР-2, МСР- 3, ΚΑΝΤΕ8
С хемокины Лимфотактин
Стимуляция воспалительных цитокинов Ш-12
ΤΘΡ-β: трансформирующий фактор роста, ЫР: ингибиторный фактор лейкемии; Θ8Μ: онкостатин М; ΘΝΤΡ: цилиарный нейротрофический фактор; РР-4: тромбоцитарный фактор 4; РВР: тромбоцитарный основной белок; ΝΑΡ-2: активирующий нейтрофилы белок 2; β-ΤΘ: β-тромбоглобулин; ΜΙΡ: воспалительный белок макрофага; МСР: хемоаттрактантный белок моноцита.
Повышающая регуляция воспалительной реакции также выполняется 1Ь-11, ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, и особенно членами суперсемейства хемокинов. ΤΘΡ-β в некоторых ситуациях имеет ряд воспалительных активностей, включающих хемоаттрактантные эффекты на нейтрофилы, Т лимфоциты и инактивированные моноциты.
Ш-2.
Из-за центральной роли системы ΙΡ-2/ΙΡ-2Β в опосредовании иммунного и воспалительного ответов, очевидно, что контролирование и манипулирование этими системами имеет важные диагностические и терапевтические последствия. ΙΡ-2 показал себя как возможное противоопухолевое лекарственное средство в силу его способности стимулировать пролиферацию и активность опухоле-атакующих РАК и !Ш (опухоле-инфильтрующие лимфоциты) клеток. Однако проблемы токсичности ΙΡ-2 по-прежнему беспокоят и заслуживают исследования. Настоящее изобретение направлено на решение этой проблемы.
Ш-15.
Интерлейкин 15 (Ш-15) - это новый цитокин, имеющий многие биологические свойства общие с ΙΡ2, но не имеющий аминокислотной последовательности гомологичной Ш-2. Ш-15 был первоначально идентифицирован в среде, кондиционированной с обезьяньей почечной эпителиальной клеточной линией (ΘνΙ/ΕΒΝΑ), исходя из его митогенной активности на мышиную Т-клеточную линию, ΘΤΡΡ-2. Ш-15 также был независимо открыт как цитокин, продуцируемый человеческими зрелыми Т-клетками линии клеток лейкемии (НиТ-102), который стимулировал пролиферацию Т-клеток и был обозначен Ш-Τ. В силу его активности как стимулятора Т-клеток, ΝΚ клеток, РАК клеток, и ΤΙΡδ, ΙΡ-2 в настоящее время проходит клинические испытания для определения его потенциального использования в лечении рака и вирусных инфекций. Из-за его похожих биологических активностей Ш-15 должен иметь похожий терапевтический потенциал.
Хемокины.
Хемокины являются суперсемейством очень маленьких секретированных белков, которые принимают участие в движении лейкоцита, рекрутинге и рециркуляции. Они также играют решающую роль во многих патофизиологических процессах, таких как аллергическая реакция, инфекционные и аутоиммунные заболевания, ангиогенез, воспаление, рост опухоли и кроветворное развитие. Приблизительно 80% этих белков имеют от 66 до 78 аминокислот в их природной форме. Остальные больше и содержат дополнительные аминокислоты, расположенные против ядра белка или в виде части удлиненного Сконцевого сегмента. Все хемокины сигнализируют через семь трансмембранных доменов Θ-протеин спаренных рецепторов. Известно по меньшей мере семнадцать хемокиновых рецепторов, и многие из этих рецепторов проявляют нерегулярные связывающие свойства, в результате чего самые различные хемокины могут сигнализировать через одинаковый рецептор.
Хемокины делят на подсемейства, исходя из консервативных звеньев аминокислотной последовательности. Члены наибольшего семейства имеют по меньшей мере четыре консервативных цистеиновых остатков, которые образуют две внутримолекулярные дисульфидные связи. Подсемейства определяют по
- 43 007396 положению первых двух цистеиновых остатков.
α-Подсемейство, также называемое СХС хемокины, имеет одну аминокислоту, разделяющую первые два цистеиновых остатка. Эта группа может быть затем подразделена, исходя из присутствия или отсутствия д1и-1еи-агд (ЕЬК) аминокислотного звена, предшествующего первому цистеиновому остатку. В настоящее время имеется пять СХС-специфичных рецепторов и они обозначены СХСР1-СХСР5. ЕЬВ+ хемокины связывают СХСК.2 и в основном действуют как нейтрофильные хемоаттрактанты и активаторы. ЕВК. хемокины связывают СХСК.3-5 и действуют в первую очередь на лимфоциты. Во время написания этой работы в научной литературе были описаны 14 различных человеческих генов, кодирующих СХС хемокины, с некоторым дополнительным разнообразием, вносимым путем альтернативного сплайсинга.
В β-подсемействе, также называемом СС хемокины, первых два цистеина являются смежными друг с другом без промежуточной аминокислоты. В настоящее время известны 24 индивидуальных члена человеческого β-подсемейства. Рецепторы для этой группы обозначены ССР1-ССР11. Клетки-мишени для различных членов СС семейства включают большинство типов лейкоцитов.
Известны два белка, которые выпадают из α- и β-подсемейств. Лимфотактин является единственным членом γ-класса (С хемокин), который потерял первый и третий цистеины. Лимфотактиновый рецептор обозначен ХСК.1. Фракталкин, единственный известный член δ-класса (СХ3С хемокин), имеет три промежуточных аминокислоты между первыми двумя цистеиновыми остатками. Эта молекула уникальна среди хемокинов, так как является трансмембранным белком с Ν-концевым хемокиновым доменом, слитым с длинным муциноподобным звеном. Фракталкиновый рецептор известен как СХ3СР1.
УЕСЕ.
Настоящее изобретение также применимо к сосудистому эндотелиальному фактору роста (УЕСЕ). Ангиогенез - это процесс развития новых кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой системы. Он играет существенную роль в эмбриональном развитии, нормальном росте тканей, заживлении ран, репродуктивном цикле у женщин (т.е. овуляция, менструация и плацентарное развитие), а также главную роль во многих заболеваниях. Особый интерес сосредоточен на раке, так как опухоли не могут расти сверх нескольких миллиметров без развития нового кровоснабжения. Ангиогенез также необходим для распространения и роста опухолевых метастазов.
Одним из наиболее важных факторов роста и жизнеспособности эндотелия является УЕСЕ. УЕСЕ стимулирует ангиогенез и пролиферацию эндотелиальных клеток и он играет важную роль в регуляции васкулогенеза. УЕСЕ представляет собой гепаринсвязанный гликопротеин, который секретируется в виде гомодимера в 45 кДа. Большинство видов клеток, но обычно не сами эндотелиальные клетки, секретируют УЕСЕ. Так как первоначально открытый УЕСЕ, УЕСЕ-А, увеличивает сосудистую проницаемость, он был известен как фактор сосудистой проницаемости. Кроме того, УЕСЕ вызывает расширение сосудов в некоторой степени через стимуляцию нитроксидсинтазы в эндотелиальных клетках. УЕСЕ может также стимулировать клеточную миграцию и ингибировать апоптоз. Имеется несколько сплайсвариантов УЕСЕ-А. Главные из них включают 121, 165, 189 и 206 аминокислот, и каждый содержит специфичный экзон присоединения.
ЕМАР II.
Эндотелиальный моноцит, активирующий полипептид-11 (ЕМАР-ΙΙ), является цитокином, который является антиангиогенным фактором в сосудистом развитии опухоли, и сильно ингибирует рост опухоли. Рекомбинантный человеческий ЕМАР-ΙΙ представляет собой белок в 18,3 кДа, содержащий 166 аминокислотных остатка. Также было найдено, что ЕМАР-ΙΙ увеличивает проницаемость эндотелиальных сосудов.
РБСЕ.
Было сделано предположение, что антогонисты тромбоцитарного фактора роста (РБСЕ) должны увеличивать лекарственное накопление и терапевтические эффекты широкого ряда противоопухолевых агентов в обычных твердых опухолях. РБСЕ является цитокином в 30 кДа и выделяется тромбоцитами на ране и стимулирует близлежащие клетки к росту и заживлению раны.
РБ-ЕССЕ.
Как предполагает его название, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (РБ-ЕССЕ) был первоначально выделен на основании его способности вызывать митоз в эндотелиальных клетках. Его родственным белком является глиостатин.
Нацеливающий модуль.
Мы нашли, что терапевтический индекс цитокинов может быть увеличен путем хоминга нацеливающего цитокина к опухолевым сосудам. Кроме того, так как известно, что опухолевые клетки могут формировать часть выстилки опухолевой сосудистой системы, настоящее изобретение охватывает нацеливание как прямо на опухолевые клетки, так и на опухолевую сосудистую систему. Любые подходящие нацеливающие модули на опухоли или опухолевую сосудистую систему (особенно эндотелиальные клетки) могут быть использованы в конъюгате по настоящему изобретению. Многие такие нацеливающие модули известны, эти фрагменты и любые другие, которые впоследствии станут доступны, охваты
- 44 007396 ваются объемом настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения нацеливающий фрагмент представляет собой связывающий партнер, такой как лиганд, рецептора, экспрессируемого опухолевой клеткой, или связывающий партнер, такой как антитело, к маркеру или компоненту внеклеточного матрикса, ассоциированного с опухолевыми клетками. Наиболее предпочтительным нацеливающим модулем является связывающий партнер, такой как лиганд, рецептора, экспрессируемого опухолево-ассоциированными сосудами, или связывающий партнер, такой как антитело, к эндотелиальному маркеру или компоненту внеклеточного матрикса, ассоциированного с ангиогенными сосудами. Термин связывающий партнер используется здесь в самом широком его смысле и включает как природные, так и синтетические связывающие домены, включая лиганды и антитела или их связывающие фрагменты. Таким образом, указанный связывающий партнер может быть антителом или его фрагментом, таким как РаЬ, Ρν, одноцепочечный Ρν, пептид или пептидо-миметик, а именно, пептидоподобная молекула, способная связываться с рецептором, маркером внеклеточного компонента клетки.
Далее представлены нелимитирующие примеры подходящих нацеливающих доменов и рецепторов/маркеров, на которые может быть нацелен конъюгат:
ΟΌ13.
Неожиданно было найдено, что терапевтический индекс определенных цитокинов может быть заметно улучшен и их иммунотерапевтические свойства могут быть повышены путем спаривания с лигандом рецептора аминопептидазы-Ν (СЭ13). СЭ13 является трансмембранным гликопротеином в 150 кДа, высококонсервативным в различных биотипах. Он экспрессируется как на нормальных клетках, так и в миелоидных опухолевых линиях, в ангиогенный эндотелий и некоторый эпителий. СЭ13 рецетор обычно идентифицируют как ΝΟΚ рецептор, в котором его пептидные лиганды разделяет аминокислотное ΝΟΚ звено. Предпочтительно лиганд представляет собой прямой или циклический пептид, содержащий звено ΝΟΚ, такой как СНОКСУБОСАОКС, ΝΟΚΑΗΑ, ΟΝΟΚΟ, циклоСV^NСΚΜΕС. или циклоС^СРС. или более предпочтительно пептид ΤΝΟΚΤ. Более подробное описание можно найти в нашей заявке АО 01/61017, которая включена здесь в виде ссылки.
ΤΝΡ рецептор.
Как и члены ΤΝΡ суперсемейства, члены суперсемейства ΤΝΡ рецептора (ΤΝΡΚ8Ρ) также разделяют ряд общих свойств. В частности, молекулы в ΤΝΡΚ8Ρ все типа I (Ν-концевые внеклеточные) гликопротеины, содержащие одно-шесть лигандсвязывающих, цистеинобогащенных звеньев из 40 аминокислотных остатков во внеклеточном домене. Кроме того, функциональные члены ΤΝΡΚ8Ρ обычно являются тримерными или мультимерными комплексами, которые стабилизируются внутрицистеиновыми дисульфидными связями. В отличие от большинства членов ΤΝΡ8Ρ, члены ΤΝΡΚ8Ρ существуют и в мембранносвязанной и в растворимой формах. И, наконец, хотя гомология аминокислотной последовательности в цитоплазматических доменах членов суперсемейства не превышает 25%, ряд рецепторов способен трансдуцировать апоптотические сигналы в различные клетки, предполагая общие функции.
СЭ40: СЭ40 представляет собой трансмембранный гликопротеин в 50 кДа, содержащий 277 аминокислотных остатков, очень часто ассоциируемый с В-клеточной пролиферацией и дифференциацией. Экспрессированный на различных типах клеток СЭ40 кДНК кодирует 20 аминокислотную сигнальную последовательность, 173 аминокислотную внеклеточную область, 22 аминокислотный трансмембранный сегмент и 62 аминокислотный цитоплазматический домен. Имеется четыре цистеинобогащенных звена во внеклеточной области, которые сопровождаются околомембранной последовательностью богатой серинами и треонинами. Известные клетки для экспрессии СЭ40 включают эндотелиальные клетки.
ΤΝΡΚΙ/ρ55/ΤΟ120;·ι: ΤΝΡΚΙ представляет собой трансмембранный гликопротеин в 55 кДа, содержащий 455 аминокислотных остатков, который вероятно экспрессируется практически всеми содержащими ядро клетками млекопитающих. Молекула имеет 190 аминокислотную внеклеточную область, 25 аминокислотный трансмембранный сегмент и 220 аминокислотный цитоплазматический домен. Оба и ΤΝΡ-α, и ΤΝΡ-β связываются с ΤΝΡΚΙ. Среди ряда клеток, экспрессирующих ΤΝΡΚΙ, имеются эндотелиальные клетки.
ΤΝΡΚΙΙ/ρ75ΑΌ120Κ человеческий ΤΝΡΚΙΙ представляет собой трансмембранный гликопротеин в 75 кДа, содержащий 461 аминокислотный остаток, первоначально выделенный из библиотеки человеческих легочных фибробластов. Этот рецептор состоит из 240 аминокислотной внеклеточной области, 27 аминокислотного трансмембранного сегмента и 173 аминокислотного цитоплазматического домена. Были идентифицированы растворимые формы ΤΝΡΚΙΙ, являющиеся вероятно результатом протеолитического расщепления с помощью металлопротеиназы, названной ΤΗΚΕ (энзим, высвобождающий ΤΝΡрецептор). Процесс выпадения происходит независимо от растворимости ΤΝΡΚΙΙ.
Среди множества клеток, экспрессирующих ΤΝΡΚΙΙ, имеются эндотелиальные клетки.
СП134Ь/ОХ40Ь: ОХ40, рецептор для ОХ40Ь, является маркером активации Т-клеток с ограниченной экспрессией, который по-видимому промотирует выживание (и возможно пролонгирует иммунный ответ) СЭ4' Т-клеток на сайтах воспаления. ОХ40Ь также проявляет ограниченную экспрессию. Недавно сообщалось, что только активированные СЭ4+, СЭ8+ Т-клетки, В-клетки и сосудистые эндотелиальные клетки экспрессируют этот фактор. Человеческий лиганд представляет собой гликозилированный полипептид в 32 кДа, содержащий 183 аминокислотных остатка, который состоит из 21 аминокислотного ци
- 45 007396 топлазматического домена, 23 аминокислотного трансмембранного сегмента и 139 аминокислотной внеклеточной области.
Семейство νΕΟΕ рецептора.
Имеется три рецептора в семействе νΕΟΕ рецептора. Они имеют общие свойства мультиплетных ΙβΟ-подобных внеклеточных доменов и активность тирозинкиназы. Домены энзимов νΕΟΕ рецептора 1 (νΕΟΕ Κ1, также известный как Ε1ΐ-1), νΕΟΕ Κ2 (также известный как ΚΌΚ или Е1к-1), и νΕΟΕ Κ3 (также известный как Ε1Ϊ-4) делятся инсерционной последовательностью. Эндотелиальные клетки также экспрессируют дополнительные νΕΟΕ рецепторы, нейрофиллин-1 и нейрофиллин-2. νΕΟΕ-Λ связывается с νΕΟΕ Κ1 и νΕΟΕ Κ2 и нейрофиллином-1 и нейрофиллином-2. Ρ1ΟΕ и νΕΟΕ-В связывают νΕΟΕ Κ1 и нейрофиллин-1. νΕΟΕ-С и -Ό связывают νΕΟΕ Κ3 и νΕΟΕ Κ2. Также было найдено, что ΗΙν-ΙαΙ и производные от него пептиды нацеливают νΕΟΕΚ.
ΡΌΟΕ рецепторы.
ΡΌΟΕ рецепторы экспрессировали в стромальный компартмент в большинство обычных твердых опухолей. Ингибирование стромально экспрессированных ΡΌΟΕ рецепторов на модели рака ободочной кишки у крыс понижало давление опухолевой интерстециальной жидкости и увеличивало опухолевый транскапиллярный транспорт.
Ρ8ΜΛ.
Простата-специфичный мембранный антиген (Ρ8ΜΛ) также является превосходным опухолевым эндотелиальным маркером и может генерировать Ρ8ΜΛ антитела.
Молекулы клеточной адгезии (ί,'ΛΜδ).
Молекулы клеточной адгезии (ί,'ΛΜδ) представляют собой белки клеточной поверности, вовлеченные в связывание клеток, обычно лейкоцитов, друг с другом, эндотелиальными клетками или внеклеточным матриксом. Специфические сигналы, продуцируемые в ответ на ранение и инфекцию, контролируют экспрессию и активацию определенных из этих молекул адгезии. Взаимодействия и ответы, затем инициированные путем связывания этих ί,'ΛΜδ с их рецепторами/лигандами, играют важные роли в опосредовании воспалительных и иммунных реакций, которые составляют одну линию защиты тела против этих поражений. Большинство охарактеризованных до сих пор ί,'ΛΜδ распадаются на три основных семейства белков: суперсемейство иммуноглобулина (Ιβ), семейство интегрина и семейство селектина.
Член семейства селектина молекул клеточной поверхности Ь-селектин состоит из ИН2-концевого лектинового типа С-домена, ΕΟΕ-подобного домена, двух комплементных контрольных доменов, 15 аминокислотного спейсера, трансмембранной последовательности и короткого цитоплазматического домена.
Были идентифицированы три лиганда для Ь-селектина на эндотелиальных клетках, все содержащие О-гликозилированный муцин или муцинподобные домены. Первый лиганд, Ο1уСΛΜ-1, экспрессируется почти исключительно в высокоэндотелиальные венулы периферийных и брыжеечных лимфатических узлов. Вторым лигандом Ь-селектина, первоначально названный 8§ρ90, как теперь показано, является СИ34. Этот сиаломуцинподобный гликопротеин, часто используемый как поверхностный маркер для очистки плюрипотентных стволовых клеток, проявляет сосудистую экспрессию в широком диапазоне нелимфоидных тканей, а также на капиллярах периферийных лимфоузлов. Третьим лигандом для Ьселектина является Μαάί,'ΛΜ 1, муцинподобный гликопротеин, найденный на высокоэндотелиальных венулах лимфатических узлов слизистой оболочки.
Р-селектин, член семейства селектина молекул клеточной поверхности, состоит из ИН2-концевого лектинового типа С-домена, ΕΟΕ-подобного домена, девяти комплементных контрольных доменов, трансмембранного домена и короткого цитоплазматического домена.
Тетрасахаридсиалил Ье\\'Ьх (§Ьех) был идентифицирован как лиганд для Р- и Е-селектина, но Р-, Еи Ь-селектины могут все связывать &Ьех и &Ьеа при определенных условиях. Также сообщалось, что Рселектин селективно связывается с гликопротеином в 160 кДа, присутствующим на мышиных миелоидных клетках, и с гликопротеином на миелоидных клетках, кровяных нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах, названным гликопротеиновым лигандом Р-селектина (Ρ8ΟΌ-1), этот лиганд может также связывать Е-селектин. Р-селектин-опосредованный роллинг лейкоцитов может быть полностью ингибирован моноклональным антителом специфичным для Ρ8ΌΟ-1, предполагается, что хотя Р-селектин может связываться с различными гликопротеинами в условиях ίη νίΐτο, похоже, что физиологически важное связывание сильно ограничено. Ряд доказательств подтверждает, что Р-селектин вовлекается в адгезию миелоидных клеток, а также В- и субпопуляции Т-клеток, с активированным эндотелием.
Ιβ суперсемейство СΛΜ8.
Ιβ суперсемейство СΛΜ8 представляет собой кальций-независимые трансмембранные гликопротеины. Члены Ιβ суперсемейства включают молекулы внутриклеточной адгезии (^ΛΜδ), молекулу сосудисто-клеточной адгезии (VСΛΜ-1), молекулу тромбоцит-эндотелиально-клеточной адгезии (РЕСАМ1), и молекулу нейро-клеточной адгезии (NСΛΜ). Каждый член Ιβ суперсемейства САМ имеет внеклеточный домен, который содержит несколько Ιβ-подобных внутрицепочечно дисульфидно-связанных цепей с консервативными цистеиновыми остатками, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, который взаимодействует с цитоскелетом. Обычно они связывают интегрины или другие члены Ιβ су
- 46 007396 персемейства САМ§. Нейронные САМ§ могут вовлекаться в нейронный паттернинг. Эндотелиальные СЛМ§ играют важную роль в иммунном ответе и воспалении.
Более подробно, молекула сосудисто-клеточной адгезии (УСАМ-1, СЭ106, или ГЫСЛМ-110), молекула тромбоцит-эндотелиально-клеточной адгезии (РЕСАМ-1/СЭ31) и молекулы внутриклеточной адгезии 1, 2 & 3 (1САМ-1, 2 & 3) являются пятью функционально родственными САМ/1д8Е молекулами, которые существенно вовлечены в лейкоцит-связывающая ткань/эндотелиальная клетка взаимодействия. Экспрессированные, главным образом, на эндотелиальных клетках, эти молекулы в основном регулируют миграцию лейкоцитов через стенки кровеносных сосудов и предоставляют точки крепления для развития эндотелия во время ангиогенеза и все являются пригодными для нацеливания в настоящем изобретении.
Человеческий СЭ31 является трансмембранным гликопротеином типа I (внеклеточный Ν-конец) в 130 кДа, который принадлежит к молекуле клеточной адгезии (САМ) или С2-подобной подгруппе 1д8Е1. Зрелая молекула имеет 711 аминокислотных остатков в длину и содержит внеклеточную область из 574 аминокислотных остатков, трансмембранный сегмент из 19 аминокислотных остатков и цитоплазматический хвост из 118 аминокислотных остатков. Во внеклеточной области имеется девять потенциальных Ν-взаимносвязанных сайтов гликозилирования, и, с прогнозируемой молекулярной массой от 80 кДа, многие из этих сайтов оказались занятыми. Наиболее замечательной чертой этой внеклеточной области является наличие шести 1д-гомологических единиц, которые похожи на С2 домены 1д8Е. Хотя они отличаются, присутствие этих модулей является общей чертой всех 1д8Е адгезионных молекул (1САМ-1, 2, 3 & УСАМ-1).
Интегрины.
Интегрины являются нековалентно связанными гетеродимерами из α и β субъединиц. На настоящее время идентифицированы 16 α субъединиц и 8 β субъединиц. Их можно объединять различными путями с образованием разных типов интегриновых рецепторов. Лигандами для различных интегринов являются адгезивные внеклеточные матриксные (ЕСМ) белки, такие как фибронектин, витронектин, коллагены и ламинин. Многие интегрины распознают аминокислотную последовательность КСЭ (аргинин-глицинаспарагиновая кислота), которая присутствует в фибронектине или других адгезивных белках, с которыми они связываются. Петиды и белковые фрагменты, содержащие КСЭ последовательность, могут использоваться для того, чтобы модулировать активность КСЭ-распознающих интегринов. Таким образом, настоящее изобретение может применять в качестве нацеливающего модуля пептиды, распознаваемые интегринами. Эти пептиды условно известны как КСЭ-содержащие пептиды. Эти пептиды могут включать пептиды, звенья которых были идентифицированы как связывающиеся с интегринами. Эти звенья включают аминокислотные последовательности: ЭСР. ΝΟΒ и СКСЭС. Пептидные звенья могут быть линейными или циклическими. Такие звенья описаны более детально в следующих патентах, которые здесь включены путем ссылки в отношении описания КСЭ пептидов: патент США 5,536,814, в котором описаны СКСПСЬ, СКСЭСА и СЛСРСЭСБСЛ. Патент США 4578079, относящийся к синтетическим пептидам формулы Х-КСО-Т/С-У, где X и Υ являются аминокислотами. В патенте США 5547936 описан пептид, содержащий последовательность Х-КСЭ-ХХ, где X - аминокислота. В патенте США 4988621 описан ряд КСЭ-содержащих пептидов. В патенте США 4879237 описан общий пептид формулы ΚΠΌ-Υ, где Υ - аминокислота, и пептид С-КСЭ-АР. В патенте США 5169930 описан пептид ΚΠΌδΡΚ, который связывается с αν β1 интегрином. Патенты США 5498694 и 5700908 относятся к цитоплазматическому домену субъединицы β3 интегрина, который, строго говоря, не является КСЭсодержащим пептидом; хотя он содержит последовательность КСЭ. В АО 97/08203 описаны циклические пептиды, которые являются структурными миметиками или КСЭ-связанными сайтами. В патенте США 5612311 описаны 15 КСЭ-содержащих пептидов, которые являются циклизируемым эфиром через С-С связывание или через другие группы, такие как аналоги пенициламина или меркаптопропионовой кислоты. В патенте США 5672585 описана общая формула обобщающих КСЭ-содержащих пептидов. Предпочтительной группой пептидов являются те, где остаток аспарагиновой кислоты КСЭ превращен в О-метокситирозиновое производное. В патенте США 5120829 описаны КСЭ сайт связывания, промотирующий прилипание клеток, и гидрофобный домен прилипания. Ό форма описана в патенте США 5587456. В патенте США 5648330 описан циклический КСЭ-содержащий пептид, который имеет высокое сродство к СР БЬ/Ша.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нацеливающий модуль является лигандом αν β3 или αν β5 интегрина.
Активин.
Клетки, известные для экспрессии Ас®П, включают эндотелиальные клетки. АсЖПВ экспрессия очень похожа на экспрессию Ас1КП, и также была найдена в эндотелиальных клетках. Клетки, известные для экспрессии АсЖ1, включают сосудистые эндотелиальные клетки. Ас1К1В также был идентифицирован в эндотелиальных клетках.
Ангиогенин.
Ангиогенин ^ΝΠ) является негликозилированным полипептидом с молекулярной массой 14 кДа,
- 47 007396 названный так за его способность вызывать рост новых кровеносных сосудов.
Аннексии V.
Аннексин V является членом семейства кальциевых и фосфолипидных связанных белков с сосудистой антикоагулянтной активностью. Существуют различные синонимы аннексина V: плацентарный протеин 4 (РР4), плацентарный антикоагулянтный протеин I (РАР I), калфобиндин I (СРВ-1), кальций зависимый фосфолипид связывающий протеин 33 (СаВР33), сосудистый антикоагулянтный протеин альфа (УЛСа), анхорин СП, липокортин V, эндонексин II и ингибитор тромбопластина. Ряд сайтов связывания для аннексина V был описан как 6-24 х 106/клетка в опухолевых клетках и 8,8 х 106/клетка для эндотелиальных клеток.
СО44.
Другой молекулой, возможно вовлеченной в адгезию лейкоцитов (белых клеток), является СО44, молекула повсеместно экспрессированная как на кроветворных, так и некроветворных клетках. СО44 замечательна ее способностью генерировать альтернативно сплайсированные формы, многие из которых различаются по их активности. Их выдающаяся пластичность привела к предположению, что СО44 через его изменяющуюся природу играет роль в некоторых способах, которые используют опухолевые клетки для успешного развития в течение роста и метастазирования. СО44 представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I (внеклеточный Ν-конец) в 80-250 кДа. Клетки, известные для экспрессии СО44Н, включают сосудистые эндотелиальные клетки.
Имеется множество лигандов для СО44, включая остеопонтин, фибронектин, коллаген типов I и IV и гиалуронат. Сообщается, что связывание с фибронектином ограничивается вариантами СО44, экспрессирующими хрондроитин сульфат, с сайтом прилипания хрондроитина сульфата, локализованным в экзонах ν8-ν11. Предполагается, что гиалуронатное связывание возможно практически со всеми СЭ44 изоформами. Предполагается, что один из основных сайтов связывания сосредоточен в экзоне 2 и включает остатки лизина и аргинина. Обнаружены также другие, чем простая экспрессия известного гиалуронатсвязывающего звена, факторы, необходимые для связывания гиалуроната. Успешному связыванию гиалуроната способствует объединение экспрессируемых экзонов, особенности цитоплазматического хвоста, гликозилированные структуры и состояние активности клеток. Таким образом, на основе его гиалуронат-связывающей функции, большая доля потенциальной пластичности существует внутри каждой СО44-экспрессирующей клетки.
Фактор роста фибробластов (РСР).
Название фактор роста фибробластов (РСР) является ограничивающим описанием для этого семейства цитокинов. Функция РСР не ограничивается ростом клеток. Хотя некоторые РСР§ действительно вызывают пролиферацию фибробластов, первоначальная молекула РСР (РСР-2 или основная РСР), как теперь известно, также вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток, хондроцитов, гладких мышечных клеток, меланоцитов, а также других клеток. Он может также промотировать дифференциацию адипоцитов, вызывать продуцирование ГЬ-б макрофагами и фибробластами, стимулировать миграцию астроцита и пролонгировать нейронное выживание. На настоящее время суперсемейство РСР состоит из 23 членов, все из которых содержат консервативную центральную область (ядро) из 120 аминокислотных остатков, которая содержит шесть идентичных вставленных аминокислот.
РСР-1: человеческий РСР-1 (также известный как РСР кислотный, РСРа, ЕССР и НВСР-1) представляет собой негликозилированный полипептид в 17-18 кДа, который экспрессируется разными клетками всех трех зародышевых слоев. Связывающей молекулой может быть любой РСР рецептор. Клетки, известные для экспрессии РСР-1, включают эндотелиальные клетки.
РСР-2: человеческий РСР-2, также известный как РСР основной, НВСР-2 и ЕОСР, представляет собой негликозилированный полипептид в 18 кДа, который проявляет и внутриклеточную, и внеклеточную активность. После секреции РСР-2 секвестируется на любой клеточной поверхности Н8 или матриксных гликозаминогликанах. Хотя РСР-2 секретируется как мономер, клеточная поверхность Н8 кажется димеризует мономерный РСР-2 в нековалентную бок-в-бок конфигурацию, которая вспоследствии способствует димеризации и активации РСР рецепторов. Клетки, известные для экспрессии РСР-2, включают эндотелиальные клетки.
РСР-3: человеческий РСР-3 представляет собой продукт ίηΐ-2 гена [т.е. извлеченный из области интеграции 2, области на хромосоме 7 мыши, которая содержит ген (ш!-2/РСР-3) случайно активированный последующей ретровирусной инсерцией]. Молекула синтезирована как гликопротеин с молекулярной массой 28-32 кДа, состоящий из 222 аминокислот, который содержит ряд пептидных звеньев. Сообщалось, что клетки для экспрессии РСР-3 ограничены развивающимися клетками и опухолями. Опухоли для экспрессии РСР-3 включают клеточные линии карциномы молочной железы и рака ободочной кишки.
РСР-4: человеческий РСР-4 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 22 кДа, состоящий из 176 аминокислот, который является продуктом развивающе-регуляторного гена. Молекула была синтезирована как предшественник из 206 аминокислот, который содержит большую неопределенную 30 аминокислотную сигнальную последовательность плюс два гепаринсвязанных звена (при аминокислотах 51-55 и 140-143). Гепаринсвязанные участки непосредственно связаны с активностью РСР-4;
- 48 007396 гепарин/гепаран регулирует способность ЕСЕ-4 к активации ЕСЕК1 и ЕСЕК2. Клетки, известные для экспрессии ЕСЕ-4, включают опухолевые клетки и эмбриональные клетки. Его идентификация в раке желудка человека дала толчок к одному альтернативному обозначению (/Й81-1/Й81), в то время как его выделение из саркомы Капоши заложило основу для другого названия (К-ЕСЕ).
1Ь-1К.
1Ь-1 проявляет свое влияние путем связывания специфических рецепторов. Были идентифицированы два отдельных белка, связывающих 1Ь-1 рецептор, плюс один несвязывающий сигнализирующий акцессорный белок. Каждый имеет три внеклеточных иммуноглобулиноподобных (Ц-подобных) домена, квалифицирующих их в качестве членов семейства рецепторов цитокинов типа IV. Два связывающих рецептор белка определены как 1Ь-1 рецептор типа I (1Ь-1 К!) и 1Ь-1 рецептор типа II (1Ь-1 КН) соответственно. Человеческий ГС-1 К1 представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 80 кДа, состоящий из 522 аминокислот, который был выделен из эндотелиальных клеток.
КТК.
Было найдено, что новое семейство тирозинкиназных рецепторов (КТК), Ερίι рецепторы и лиганды эфринов вовлечены в сосудистую сборку, ангиогенез, опухолегенез и метастазирование. Было также найдено, что Ερίι рецепторы класса А и их лиганды повышаются в опухоли и ассоциированной сосудистой системе.
ММР.
Матриксные металлопротеиназы (ММР§) вовлечены в рост опухоли, ангиогенез, инвазию и метастазирование. Они также были предложены для использования в качестве опухолевых маркеров.
ЫС2.
ЫС2 представляет собой большой полностью мембранный хондроитинсульфат протеогликан, который был впервые идентифицирован как молекула клеточной поверхности, экспрессируемая незрелыми невральными клетками. Впоследствии было найдено, что ЫС2 экспрессируется широким рядом незрелых клеток, а также разными типами опухолей с высокой злокачественностью. ЫС2 был предложен в качестве молекулы-мишени в опухолевой сосудистой системе. В частности, коллагеназа-1 (С1) является преобладающей матриксной металлопротеиназой, присутствующей во вновь образованных микрососудах, и служит как маркер неоваскуляризации.
Онкофетальный фибронектин.
Также было найдено, что экспрессия онкофетального фрагмента фибронектина (Еп-Г) увеличивается во время ангиогенеза и он был предложен в качестве маркера опухолевого ангиогенеза. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ является антителом или его фрагментом к онкофетальному ΕΌ-В домену фибронектина. Получение такого антитела и его конъюгация с ^-12 описаны На1ш с1 а1. (2002) Ыа!иге В1о!есйио1оду 20:264-269.
Тенасцин.
Тенасцин является матриксным гликопротеином, встречающимся в злокачественных опухолях, включая рак мозга и рак молочной железы и меланому. Его экспрессия является злокачественной, но не вполне дифференцированные опухоли и ассоциация с кровеносными сосудами опухолей делает его не только важной мишенью для понимания биологии злокачественных опухолей и ангиогенеза, но и терапевтической раковой мишенью, а также маркером.
Нацеливающий модуль является предпочтительно полипептидом, который способен к связыванию с опухолевой клеткой или молекулой опухолевой сосудистой поверхности. Как и указанные выше, другие такие поверхностные молекулы, которые известны или становятся доступными, также могут быть нацелены в первую очередь.
Будет высоко оценен тот, кто сможет использовать обычное белковое связывание в способе идентификации молекул, которые связываются с поверхностными молекулами. Будет также высоко оценен тот, кто сможет использовать структурно-основанную лекарственную конструкцию для определения последовательностей, которые связывают поверхностные молекулы.
Высокопроизводительный скрининг, как описанный выше для синтетических соединений, также может быть использован для идентифицирующих нацеливающих молекул.
Настоящее изобретение также предполагает использование конкурентоспособных методов скрининга лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные к связыванию мишени, специфически конкурируют с тестовыми соединениями для связывания мишени.
Связывающий партнер (ВР).
Нацеливающий модуль главным образом имеет форму связывающего партнера (ВР) с поверхностной молекулой, содержащего или состоящего из одного или более связывающих доменов.
Лиганд.
Нацеливающий модуль по настоящему изобретению может иметь форму лиганда. Лиганды могут быть природными или синтетическими. Термин лиганд также относится к химически модифицированным лигандам. Один или более связывающих доменов ВР могут состоять, например, из природного лиганда для рецептора, причем природный лиганд может быть молекулой адгезии или лигандом рецептора фактора роста (например, эпидермального фактора роста), или фрагментом природного лиганда, который
- 49 007396 сохраняет связывающую способность к рецептору.
Синтетические лиганды включают конструктивные лиганды. Используемый здесь термин конструктивные лиганды относится к агентам, которые вероятно связываются с рецептором на основе сравнения их трехмерной формы и трехмерной формы рецептора.
Антитела.
Альтернативно, связывающие домены могут быть получены из последовательностей тяжелых и легких цепей из вариабельной области иммуноглобулина (1д). Такая вариабельная область может быть получена из природного человеческого антитела или антитела другого вида, например антитела грызунов. Альтернативно, вариабельная область может быть получена из конструированного антитела, такого как гуманизированное антитело, или из библиотеки демонстрации фагов из иммунизированных или неиммунизированных животных или библиотеки демонстрации мутагенных фагов. В качестве второй альтернативы, вариабельная область может быть получена из одноцепочечного вариабельного фрагмента (кеРу). ВР может содержать другие последовательности для достижения мультимеризации или действовать как спейсер между связывающими доменами, или образуется в результате инсерции рестрикционных сайтов в генах, кодирующих Вр, включая последовательности 1д петли или новые спейсеры и конструированные линкерные последовательности.
ВР может содержать дополнительно одну или более вариабельных областей иммуноглобулина, всю или часть константной области тяжелой цепи 1д и также может содержать природный целый 1д, конструктированный 1д, конструктированную 1д-подобную молекулу, одноцепочечный 1д или одноцепочечную 1д-подобную молекулу. Альтернативно, или в дополнение, ВР может содержать один или более доменов из другого белка, такого как токсин.
Используемый здесь термин антитело относится к белку, содержащему один или более полипетидов, в основном кодируемых генами иммуноглобулина или фрагментами генов иммуноглобулина. Антитела могут существовать как в виде интактного иммуноглобулина, так и в виде ряда фрагментов, включая полно-охарактеризованные фрагменты, получаемые перевариванием с различными пептидазами. В то время как различные фрагменты антител определены на основе переваривания интактных антител, был бы высоко оценен тот специалист, который смог бы синтезировать фрагменты антител бе ηονο или химически, или используя технологию рекомбинантных ДНК. Таким образом, используемый здесь термин антитело также включает фрагменты антител, или полученные модификацией целого антитела или синтезированные бе ηονο с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Фрагменты антител, охватываемые термином антитела включают, но не ограничиваются ими, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, 5θΡν. Ρν, 6&Ρν 6ίαόο6ν. и Рб фрагменты.
Изобретение также включает моноклональные или поликлональные антитела к поверхностным белкам. Таким образом, настоящее изобретение далее включает способ получения моноклональных или поликлональных антител к полипептидам по изобретению.
Если желательны поликлональные антитела, выбранное млекопитающее (например, мышь, кролик, коза, лошадь и т.д.) иммунизируют иммуногенным полипептидом, несущим эпитоп(ы). Сыворотку от иммунизированного животного собирают и обрабатывают по известным методикам. Если сыворотка, содержащая поликлональные антитела к эпитопу, содержит антитела к другим антигенам, то поликлональные антитела могут быть очищены иммуноаффинной хроматографией. Методики продуцирования и выделения поликлональной антисыворотки известны из уровня техники. Для того чтобы такие антитела могли быть получены, изобретение также включает полипептиды по изобретению или их фрагменты, гаптенизированные другим полипептидом для использования в качестве иммуногена у животного или человека.
Моноклональные антитела, направленные против связывания эпитопов клеточной поверхности в полипептидах, могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методология для изготовления моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Иммортализованная антитело-продуцирующая линия клеток может быть создана слиянием клеток, а также другими методиками, такими как прямая трансформация В-лимфоцитов с онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштейна-Барр. Панели моноклональных антител, полученных против эпитопов, могут быть исследованы на различные свойства, например, изотопное и эпитопное сродство.
Альтернативный метод включает скрининг библиотек демонстрации фагов, где, например, фаг экспрессирует 5сРу фрагменты на поверхности их оболочек с большим рядом комплементарно детерминирующих областей (СЭКя). Это метод хорошо известен из уровня техники.
Для целей этого изобретения термин антитело, если не указано противоположное, включает фрагменты целых антител, которые сохраняют их связывающую активность для антигена-мишени. Как указывалось выше, такие фрагменты включают Ρν, Р(аЬ') и Р(аЬ')2 фрагменты, а также одноцепочечные антитела ЦсРу). Кроме того, антитела и их фрагменты могут быть гуманизированными антителами, например, как описано в ЕР-А-239400.
Скрининг.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу скринига агента, способного к связыванию с опухолью или молекулой опухолевой сосудистой клеточной поверхности, способу, вклю
- 50 007396 чающему контактирование молекулы клеточной поверхности с агентом и детерминирование, если указанный агент связывает указанную молекулу клеточной поверхности.
Используемый здесь термин агент включает, но не ограничивается им, соединение, такое как тестовое соединение, которое может быть доступно или получено любым подходящим путем, природным или нет. Агент может быть сконструирован или доступен из библиотеки соединений, которая может содержать пептиды, а также другие соединения, такие как малые органические молекулы и особенно новые соединения свинца. Для примера, агент может быть природным веществом, биологической макромолекулой или экстрактом, полученным из биологических материалов, таких как бактерии, грибки или животные (предпочтительно млекопитающих) клетки или ткани, органической или неорганической молекулой, синтетическим тестовым соединением, полусинтетическим тестовым соединением, структурным или функциональным миметиком, пептидом, пептидомиметиком, производным тестового соединения, пептидом, отщепленным из целого белка, или пептидом, синтезированным искусственно (так как в примере, или используя пептидный синтезатор) или рекомбинантными методиками или их комбинацией, рекомбинантным тестовым соединением, природным или неприродным тестовым соединением, слитым белком или его эквивалентом или мутантами, производными или их комбинациями.
Агент может быть аминокислотной последовательностью или их химическим производным. Вещество может быть даже органическим соединением или другим химикатом. Агент может быть нуклеотидной последовательностью, которая может быть смысловой последовательностью или антисмысловой последовательностью.
Белок.
Термин белок включает одноцепочечные полипептидные молекулы, а также мультиплетные полипептидные комплексы, где индивидуальные составные полипептиды связаны ковалентным или нековалентным способом. Термин полипептид включает пептиды из двух или более кислот в длину, обычно имеющие более 5, 10 или 20 аминокислот.
Гомологи полипептидов.
Следует понимать, что последовательности полипептидов для использования в настоящем изобретении не ограничиваются индивидуальными последовательностями или их фрагментами, но также включают гомологичные последовательности, полученные любым путем, например, родственные вирусно/бактериальные белки, клеточные гомологи или синтетические пептиды, а также варианты и их производные. Последовательности полипептидов по настоящему изобретению также включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по настоящему изобретению.
Варианты полипептидов, производные и фрагменты.
Термин вариант или производное в отношении аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению включает любое замещение, вариацию, модификацию, перемещение, делецию или добавление одной (или более) аминокислот из или в последовательность, при условии, что результирующая аминокислотная последовательность предпочтительно имеет нацеливающую активность, предпочтительно имея, по меньшей мере, 25-50% активности полипептидов, представленных в перечне последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере, по существу такую же активность.
Таким образом, последовательности могут быть модифицированы для использования в настоящем изобретении. Обычно модификации делают, чтобы сохранить активность последовательности. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения, аминокислотное замещение может быть выполнено, например, 1, 2 или 3 и до 10, 20 или 30 замещений, при условии, что модифицированная последовательность сохраняет, по меньшей мере, около 25-50% активности, или по существу имеет такую же активность. Однако в альтернативном варианте осуществления изобретения модификации аминокислотных последовательностей полипептидов по изобретению могут быть выполнены с целью снизить биологическую активность полипетида. Например, могут быть полезными усеченные полипептиды, которые сохраняют способность связывания с молекулой-мишенью, но теряют функциональные эффекторные домены.
В основном, предпочтительно менее чем 20%, 10%, 5% аминокислотных остатков вариантов или производных изменяются по сравнению с соответствующей областью, отображенной в перечне последовательности.
Аминокислотное замещение может включать использование не встречающихся в природе аналогов, например, чтобы увеличить период полураспада в плазме крови терапевтически введенного полипептида (см. ниже подробности получения производных пептидов для использования в терапии).
Консервативное замещение может быть выполнено, например, в соответствии с нижеприведенной таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке второй колонки и предпочтительно в одной линии третьей колонки могут быть замещены друг другом:
- 51 007396
ΙΙ Алифатическая Неполярная ОАР I
1ЬУ
Полярная-незаряженная С8ТМ
N0
Полярная-заряженная ΏΕ
КК
I Ароматическая ΗΡΨΥ
Полипептиды по изобретению также включают фрагменты вышеуказанных полипептидов и их варианты, включая фрагменты последовательностей. Предпочтительные фрагменты включают те, которые включают эпитоп. Подходящие фрагменты будут по меньшей мере около 5, например, 10, 12, 15 или 20 аминокислот в длину. Они могут быть также менее чем 200, 100 или 50 аминокислот в длину. Полипептидные фрагменты белков и аллельные и видовые варианты их могут содержать одно или более (например, 2, 3, 5 или 10) замещений, делеций или инсерций, включая консервативные замещения. При выполнении замещений, делеции и/или инсерций, например, посредством рекомбинантной технологии, предпочтительно изменяется менее чем 20, 10 или 5% аминокислотных остатков, отображенных в перечне последовательности.
Белки по изобретению обычно изготавливают рекомбинантными способами, например, как описано ниже. Однако они могут быть также изготовлены синтетическими способами с использованием методик хорошо известных специалистам, таких как твердофазный синтез. Различные методики химического синтеза пептидов рассматривались Вог§1а апб Б1е1бз, 2000, ПЬТеей 18: 243-251, и описаны подробно в содержащихся там ссылках.
Терапевтические пептиды.
Пептиды по настоящему изобретению могут быть введены терапевтически пациенту. Предпочтительно использовать пептиды, которые не состоят исключительно из встречающихся в природе аминокислот, но которые модифицированы, например, с пониженной иммуногенностью, с повышенным циркуляторным полупериодом в теле пациента, с улучшенной биопереносимостью и/или повышенной эффективностью и/или специфичностью.
Был использован ряд подходов для модификации пептидов для терапевтического применения. Один из подходов заключается в связывании пептидов или белков с различными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ΡΕΘ) и полипропиленгликоль (ΡΡΘ) - см., например, патенты США № 5091176, 5214131 и 5264209.
Замена встречающихся в природе аминокислот различными некодированными или модифицированными аминокислотами, такими как ϋ-аминокислоты и Ν-метиламинокислоты, также может быть использована для модификации пептидов.
Другой подход заключается в использовании бифункциональных кросс-линкеров, таких как Νсукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо] гексаноат и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо] гексаноат (см. патент США 5580853).
Было бы желательно использовать производные пептидов по изобретению, которые являются конформационно ограниченными. Конформационное ограничение связано со стабильностью и предпочтительной конформацией трехмерной формы, принимаемой пептидом. Конформационные ограничения включают локальные ограничения, включающие ограничивание конформационной подвижности единичного остатка в пептиде; региональные ограничения, включающие ограничивание конформационной подвижности группы остатков, которые могут образовывать некоторую вторичную структурную единицу; и общие ограничения, включающие полную структуру пептида.
Активная конформация пептида может быть стабилизирована посредством ковалентной модификации, такой как циклизация, или внедрением гамма-лактамных или другого типа мостиков. Например, боковые цепи могут быть циклизованы в скелет, чтобы создать Б-гамма-лактамное звено на каждой стороне сайта взаимодействия. См., в основном, НгиЬу е! а1., АррНеаНопз оГ ЗупФейе Рерйбез, ίη ЗупФейе РерНбез: А Изег'з Сшбе: 259-345 (А.Н. Бгеешап & Со. 1992). Циклизация также может быть достигнута, например, образованием цистеиновых мостиков, связыванием амино- и карбоксиконцевых групп соответствующих концов аминокислот, или связыванием аминогрупп остатка Буз или соответствующего гомолога с карбоксигруппой Азр, 61 и или соответствующего гомолога. Связывание α-аминогрупп полипептида с ε-аминогруппами остатка лизина с использованием иодацетангидрида также может быть осуществлено. См. Аооб апб Ше!/е1, 1992, Ιηΐ'1 I. Рерйбе Рго1еш Кез. 39: 533-39.
- 52 007396
Другой подход, описанный в И8 5891418, включает введение скелета с комплексообразующим ионом металла в структуру пептида. Обычно предпочтительный металло-пептидный скелет основан на необходимом количестве частных координирующих групп, требуемых координационной сферой данного комплексообразующего иона металла. В основном, большинство ионов металлов, которые могут использоваться, имеют координационное число от четырех до шести. Природа координирующих групп в пептидной цепочке включает атомы азота аминной, амидной, имидазольной или гуанидиновой функциональных групп, атомы серы тиолов или дисульфидов, и атомы кислорода гидроксильной, фенольной, карбонильной или карбоксильной функциональных групп. Кроме того, пептидная цепочка или индивидуальные аминокислоты могут быть химически изменены включением координирующих групп, таких как, например, оксим, гидразино, сульфидрил, фосфат, циано, пиридино, пиперидино или морфолино. Структура пептида может быть и линейной, и циклической, однако, линейная структура обычно предпочтительна. Примером малого линейного пептида является С1у-С1у-С1у-С1у. который имеет четыре азота (Ν4 комплексобразующая система) в скелете, за счет чего может образовывать комплекс с ионом металла с координационным числом четыре.
Другой методикой улучшения свойств терапевтических пептидов является использование непептидных пептидомиметиков. Широкий ряд используемых методик может быть применен для установления точной структуры пептида. Эти методики включают определение последовательности аминокислот, рентгеноструктурную кристаллографию, масс-спектроскопию, спектроскопию ядерно-магнитного резонанса, компьютерное молекулярное моделирование, составление генетической карты пептида, и их комбинации. Структурный анализ пептидов обычно приводит к большому объему данных, которые включают аминокислотную последовательность пептида, а также трехмерное расположение его атомов. На основании этой информации могут быть изображены непептидные пептидомиметики, которые имеют требуемую для терапевтической активности химическую функциональность, но являются более стабильными, например, менее подвержены биологической деградации. Пример такого подхода приведен в И8 5811512.
Методики химического синтеза терапевтических пептидов по изобретению описаны в вышеприведенных ссылках, а также в обзоре ВогДа апб Ие1б8, 2000, ПЬТсеН 18: 243-251 и подробно описаны в содержащихся там ссылках.
Бифункциональные производные.
Следующий вариант осуществления изобретения относится к бифункциональным производным, в которых цитокины, модифицированные с ТТМ, конъюгированы с антителами, или их фрагментами, против опухолевых антигенов или других опухолевых ангиогенных маркеров, например, αν интегрины, металлопротеазы или фактор сосудистого роста, или антителами или их фрагментами, направленными против компонентов внеклеточного матрикса, такими как антитела антитенасцина или антифибронектина ΕΌΒ домен. Недавно сообщалось о получении продукта слияния между ΤΝΕ и шарнирной областью тЛЬ против опухоле-ассоциированного ТАС72 антигена, экспрессируемого желудочной и яичниковой аденокарциномой.
Следующий вариант осуществления изобретения относится к опухолевому предварительному нацеливанию с системой биотин/авидин. Согласно этому подходу, на опухолевом антигенном сайте в несколько различный стадий получают трехкомпонентный комплекс, который сформирован 1) биотинилированным тАЬ, 2) авидином (или стрептавидином) и 3) бивалентным цитокином, модифицированным с ТТМ и биотином. Ряд сообщений утверждают, что предварительное нацеливание по сравнению с традиционным нацеливанием с иммуноконъюгатами, может действительно увеличить отношение активных молекул, нацеленных на мишень, к свободным активным молекулам, понижая таким образом токсичность лечения. Этот метод показал благоприятные результаты с биотинилированным ΤΝΕ, который был способен стимулировать цитотоксичность ίη νίίτο и уменьшать рост опухолевых клетов в условиях, в которых обычный ΤΝΕ был неактивен. Метод предварительного нацеливания также может быть осуществлен по двухфазной процедуре путем использования биспецифичного антитела, которое одновременно связывается с опухолевым антигеном и модифицированным цитокином. Использование биспецифичного антитела, направленного против карциноэмбрионального антигена и ΤΝΕ, недавно было описано, как способ для ΤΝΕ опухолевого предварительного нацеливания.
Согласно следующему варианту осуществления изобретение включает цитокин, конъюгированный с ТТМ и антителом, или его фрагментом (прямо или опосредованно через мостик биотин-авидин), на различных ΤΝΕ субъединицах, где антитело или его фрагменты направлены против антигена, экспрессированного на опухолевых клетках или других компонентах опухолевой стромы, например, тенацин или фибронектин ΕΌΒ домене. Результаты - в дальнейшем улучшении опухолевых хоминговых свойств модифицированного цитокина и в слабом высвобождении последнего в опухолевую микросреду через тример-мономер-тример переходы. Модифицированные субъединицы, например, ΤΝΕ конъюгатов могут диссоциировать из нацеливающих комплексов и реассоциировать с образованием немодифицированных тримерных ΤΝΕ молекул, которые затем диффундируют в опухолевую микросреду. Было показано, что высвобождение биоактивного ΤΝΕ осуществляется через 24-48 ч после нацеливания.
Получение цитокинов в форме липосом может улучшить их биологическую активность. Действи
- 53 007396 тельно наблюдали, что ацилирование аминогрупп ΤΝΕ приводит к увеличению его гидрофобности без потери биологической активности ίη νίίτο. Кроме того, сообщалось, что ΤΝΕ, связанный с липидами, имеет неповрежденные цитотоксичность ίη νίίτο, иммуномодулирующие свойства и пониженную токсичность ίη νίνο.
Полинуклеотиды.
Полинуклеотиды для использования в изобретениии содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные конъюгаты по изобретению. Специалисту должно быть понятно, что ряд различных полинуклеотидов может кодировать один и тот же полипептид, как результат дегенерации генетического кода. Кроме того, следует понимать, что специалист может, используя общепринятые методики, выполнить нуклеотидные замещения, которые не влияют на последовательность полипептида, кодируемого полинуклеотидами по изобретению, чтобы отразить использование кодона любого индивидуального организма-хозяина, в котором полипептиды по изобретению экспрессируются.
Полинуклеотиды по изобретению могут содержать ДНК или РНК. Они могут быть однонитевыми или двунитевыми. Они могут быть также полинуклеотидами, которые включают внутри их синтетические или модифицированные нуклеотиды. Из уровня техники известен ряд различных типов модификации олигонуклеотидов. Они включают метилфосфонилирование и фосфоротиолирование скелета, добавление акридиновой и полилизиновой цепей при 3' и/или 5' концах молекулы. Для целей настоящего изобретения понятно, что полинуклеотиды, описанные здесь, могут быть модифицированы любым методом доступным из уровня техники. Такие модификации могут быть выполнены для того, чтобы усилить активность ίη νίνο или продолжительность жизни полинуклеотидов по изобретению.
Нуклеотидные векторы.
Полинуклеотиды по изобретению могут быть инкорпорированы в рекомбинантный способный к репликации вектор. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке-хозяине. Таким образом, в следующем варианте осуществления изобретения предложен метод получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида по изобретению в способный к репликации вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяин и выращивания клеткихозяина при условиях, которые вызывают репликацию вектора. Вектор может быть получен обратно из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, такие как Е. οοΐί, дрожжи, линии клеток млекопитающих и другие эукариотические линии клеток, например, клетки насекомых 8Г9.
Предпочтительно полинуклеотид по изобретению в векторе является операбельно связанным с контрольной последовательностью, обеспечивающей экспрессию кодирующей последовательности клеткойхозяином, т.е. вектор является вектором экспрессии. Термин операбельно связанный означает, что описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным им способом. Регуляторная последовательность, операбельно связанная с кодирующей последовательностью, перекрестно связана таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условии совместимости с контрольной последовательностью.
Контрольные последовательности могут быть модифицированы добавлением последующих транскрипционных регуляторных элементов, чтобы сделать уровень транскрипции, направляемый контрольными последовательностями, более чувствительным к транскрипционным модуляторам.
Векторы по изобретению могут быть трансформированы или трансфектированы в подходящую клетку-хозяин, как описанные ниже, предусматривающие экспрессию белка по изобретению. Этот процесс может включать культивирование клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, как описанный выше, при условиях, предусматривающих экспрессию вектором кодирующей последовательности кодирующего белка, и необязательно, выделение экспрессированного белка.
Векторами могут быть, например, плазмида или вирусный вектор, полученный с источником репликации, необязательно промотором экспрессии указанного полинуклеотида и необязательно регулятором промотора. Векторы могут содержать один или более селективных маркерных генов, например, устойчивый к ампициллину ген в случае бактериальной плазмиды или устойчивый к неомицину ген для вектора млекопитающих. Векторы могут быть использованы, например, для трансфекции или трасформации клетки-хозяина.
Контрольные последовательности, операбельно связанные с последовательностью кодирующего белка по изобретению, включают промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Эти контрольные последовательности могут быть подобраны по совместимости с клеткой-хозяином, в которой вектор экспрессии будет использоваться. Термин «промотор» хорошо известен из уровня техники и охватывает области нуклеиновых кислот, распределенных по размеру и сложности от минимальных промоторов до промоторов, включающих высшие элементы и энхансеры.
Промоторы обычно выбирают из промоторов, которые являются функциональными в клетках млекопитающих, хотя могут быть использованы прокариотические промоторы и промоторы функциональные в других эукариотических клетках. Промотор обычно извлекают из последовательности промотора вирусных или эукариотических генов. Например, возможен промотор, извлеченный из генома клетки, в которой осуществлена экспрессия. Что касается эукариотических промоторов, они могут быть промоторами, которые функционируют повсеместно (такие как промоторы а-актина, Ь-актина, тубулина) или,
- 54 007396 альтернативно, тканеспецифично (такие как промоторы генов пируваткиназы). Могут быть также использованы тканеспецифичные промоторы, специфичные к различным клеткам. Они могут быть также промоторами, которые реагируют на специфичные стимулы, например, промоторами, которые связывают рецепторы стероидных гормонов. Могут также использоваться вирусные промоторы, например, длинноконцевой повторный промотор вируса лейкемии мыши Молони (ММЬУ ΕΤΚ), ΕΤΚ промотор вируса саркомы Рауса (КБУ) или ΙΕ промотор цитомегаловируса человека (СМУ).
Также может быть благоприятным, если промоторы будут индуцибельными, для того чтобы уровни экспрессии гетерологичных генов можно было регулировать на протяжении времени жизни клетки. Индуцибельный означает, что уровни экспрессии, полученные используя промотор, могут регулироваться.
Кроме того, любой из этих промоторов может быть модифицирован добавлением других регуляторных последовательностей, например, энхансерная последовательность. Могут также использоваться химерные промоторы, содержащие элементы последовательности из двух или более различных промоторов, описанных выше.
Клетки-хозяева.
Векторы и полинуклеотиды по изобретению могут быть внедрены в клетку-хозяин для целей репликации векторов/полинуклеотидов и/или экспрессии белков по изобретению, кодированных полинуклеотидами по изобретению. Хотя белки по изобретению могут быть продуцированы с использованием прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев, предпочтительно использовать эукариотические клетки, например, дрожжи, клетки насекомых или млекопитающих, в частности клетки млекопитающих.
Векторы/полинуклеотиды по изобретению могут быть внедрены в подходящую клетку-хозяин с использованием различных методик, известных из уровня техники, таких как трансфекция, трансформация и электропорация. Известны различные методики из уровня техники, где векторы/полинуклеотиды по изобретению вводятся животным, например инфицирование рекомбинантными вирусными векторами, такими как ретровирусы, вирусы герпеса и аденовирусы, прямая инъекция нуклеиновых кислот и биотрансформация.
Экспрессия белка и очистка.
Клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды по изобретению, могут быть использованы для экспрессии белков по изобретению. Клетки-хозяева могут культивироваться в соответствующих условиях, которые позволяют экспрессию белков по изобретению. Экспрессия белков по изобретению может быть конститутивной при условии, чтобы они непрерывно продуцировались, или индуцибельной, требующей стимуляции для инициирования экспрессии. В случае индуцибельной экспрессии продуцирование белка может быть инициировано, когда требуется, например, добавлением вещества индуктора в культуральную среду, например, дексаметазона или ΙΡΤ&
Белки по изобретению можно экстрагировать из клеток-хозяев различными методиками известными из уровня техники, включая энзиматический, химический и/или осмотический лизис и физическое разрушение.
Введение.
Белки по изобретению предпочтительно могут быть объединены с различными компонентами для получения композиций по изобретению. Предпочтительно композиции объединяются с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем с получением фармацевтической композиции (которые могут использоваться для людей или животных). Подходящие носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, например, фосфатно-буферный солевой раствор. Подробное описание наполнителей можно найти в ΤΙιο НаийЬоок οί Рйагтасеи11са1 Εχοίρίβηΐδ, 2ηά Εάη, Εάδ Аайе & Ае11ег, Атепсап Рйагтасеи1гса1 ΑδδοαηΙίοη. Композиция по изобретению может быть введена прямой инъекцией. Композиция может быть выполнена в форме для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного, орального или трансдермального введения. Обычно каждый белок может быть введен в дозе в интервале от 0,5 до 500 нг/кг, предпочтительно в интервале от 1 до 50 нг/кг, более предпочтительно в интервале от 5 до 15 нг/кг.
В альтернативном варианте настоящего изобретения приводится композиция, содержащая конъюгат, где конъюгат присутствует в таком количестве, что конъюгат или его метаболит доставляются в плазму крови субъекта, подвергаемого лечению, в количестве не более чем примерно 35000 нг/день, предпочтительно примерно 3500 нг/день, более предпочтительно примерно 1000 нг/день.
Вышеуказанные дозировки относятся к дозировкам для субъекта в 70 кг. Специалист в данной области легко способен модифицировать перечисленные дозировки для субъекта, имеющего массу более чем 70 кг.
Дозировка в день рассчитывается делением дозы, вводимой субъекту, на ожидаемый период дозирования в днях. Ожидаемый период дозирования обычно будет период до следующего введения, период, на протяжении которого доза имеет эффект, или период, на протяжении которого требуется, чтобы доза имела эффект.
Композиция может быть выполнена в такой форме, что введение ежедневно, еженедельно или ежемесячно будет достигаться желаемой ежедневной дозировкой. Должно быть по достоинству оценено то, что композиция может быть легко выполнена в форме, вводимой менее часто, например каждые 2, 4, 6,
- 55 007396
8, 10 или 12 ч.
Полинуклеотиды/векторы, кодирующие компоненты полипептидов, могут быть введены непосредственно в виде голой конструкции нуклеиновой кислоты, предпочтительно содержащей фланкирующие последовательности гомологичные геному клетки-хозяина.
Поглощение голой конструкции нуклеиновой кислоты клетками млекопитающих повышают различными известными методиками трансфекции, например, методиками, вкючающими использование трансфекционных агентов. Пример этих агентов включает катионные агенты (например, кальций фосфат и ΌΕΑΕ-декстран) и липофектанты (например, липофектам™ и трансфектамТМ). Обычно конструкции нуклеиновых кислот смешивают с трансфекционным агентом с получением композиции.
Предпочтительно полинуклеотид или вектор по изобретению объединяют с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем с получением фармацевтической композиции. Подходящие носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, например, фосфатно-буферный солевой раствор. Композиция может быть выполнена в форме для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного или трансдермального введения.
Пути введения и описанные режимы дозировки приведены только как рекомендации, поскольку специалист-практик будет способен легко определить оптимальный путь введения и режимы дозирования для любого конкретного пациента и условий.
Вирусные векторы.
В предпочтительном варианте осуществления конъюгат вводится с использованием вирусного вектора, более предпочтительно ретровирусного вектора.
Ретровирусы.
Ретровирусный вектор может быть полученным или извлекаемым из любого подходящего ретровируса. Был идентифицирован большой ряд различных ретровирусов. Примеры включают вирус лейкемии мышей (МЬУ), вирус иммунодефицита человека (ШУ), вирус иммунодефицита обезьяны, Т-клеточный вирус лейкемии человека (ИГРУ), вирус инфекционной анемии лошадей (ЕМУ), вирус опухоли молочной железы мыши (ΜΜΤν), вирус саркомы Рауса (КБУ), вирус саркомы Фуджинами (БиБУ), вирус лейкемии мышей Молони (Мо-МЬУ), ΡΒΚ вирус остеосаркомы мышей (ΡΒΚ МБУ), вирус саркомы мышей Молони (Мо-МБУ), вирус лейкемии мышей Абельсона (Α-МЬУ), вирус-29 миелоциматоза птиц (МС29) и вирус эритробластоза птиц (АЕУ). Подробный список ретровирусов можно найти в СоГПп е! а1., 1997, ге!гоу1ги8е8, Со1к Брппд НагЬоиг ЬаЬога!огу Ргекк Екк: 1М СоГйи, 8М Нидйек, НЕ Уагтик рр 758-763.
Подробности геномной структуры некоторых ретровирусов можно найти в уровне техники. Например, подробности о ШУ и Мо-МЬУ можно найти в NСΒI СепЬапк (Сепоте Ассеккюп Ыок. ΑΡ033819 и ΑΡ033811 соответственно).
Ретровирусы можно широко разделить на две категории, а именно, простые и комплексные. Ретровирусы можно далее разделить на семь групп. Пять из этих групп представляют ретровирусы с онкогенным потенциалом. Оставшиеся две группы являются лентивирусами и спумавирусами. Обзор этих ретровирусов представлен в СоГйи е! а1., 1997 (там же).
Группа лентивирусов может быть далее подразделена на главные и неглавные. Примеры главных лентивирусов включают вирус иммунодефицита человека (ШУ), возбудитель синдрома аутоиммунодефицита человека (АШБ) и вирус иммунодефицита обезьяны (8ГУ). Группа неглавных лентивирусов включает медленный вирус У1кпа/таек1 вирус (УМУ), а также родственный козлиный артритэнцефалитный вирус (САЕУ), вирус инфекционной анемии лошадей (ЕМУ) и совсем недавно описанные вирус иммунодефицита кошек (МУ) и вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (ΒIУ).
Это изобретение также относится к использованию векторов для доставки конъюгата в форме нуклеотидной последовательности в кроветворную стволовую клетку (Н8С).
Перенос гена включает доставку в клетки-мишени, такие как НБСк, кассеты экспрессии, слагаемой из одной или более нуклеотидных последовательностей и последовательностей, контролирующих их экспрессию. Это может быть осуществлено ех у1уо по методике, по которой кассету переносят в клетки в лаборатории и модифицированные клетки затем вводят реципиенту. Альтернативно, перенос гена может быть осуществлен ίη у1уо по методике, по которой кассету экспрессии переносят непосредственно в клетки внутри индивидуума. По обеим методикам, процесс переноса обычно поддерживается вектором, который помогает доставить кассету к соответствующему внутриклеточному сайту.
Костный мозг был традиционным источником НБСк для трансдукции, самые последние исследования предполагают, что периферийные стволовые клетки крови или хордовые клетки крови могут быть равно хорошими или лучшими клетками-мишенями (Сакке1 е! а1., 1993 Ехр Нета!о1 21: 585-591; Вгедш е! а1., 1992 В1оок 80: 1418-1422; Ьи е! а1., 1993 1 Ехр Мек 178: 2089-2096).
Другие противораковые агенты.
Конъюгат по настоящему изобретению может быть использован в комбинации с одним или более другими активными агентами, такими как одно или более цитотоксических лекарственных средств. Таким образом, в одном из вариантов настоящего изобретения способ содержит введение другого активного фармацевтического ингредиента, такого как цитотоксическое лекарственное средство либо в объединенной дозировочной форме с конъюгатом, либо в раздельной дозировочной форме. Такая раздельная
- 56 007396 дозировочная форма цитотоксического лекарственного средства может включать твердую оральную, оральный раствор, сироп, эликсир, инъекционную, трансдермальную, трансмукосальную (через слизистую оболочку) и другие дозируемые формы. Конъюгат и другой активный фармацевтический ингредиент могут быть объединены в одной дозируемой форме или поставлены в раздельных дозируемых формах, которые используются вместе или последовательно.
Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут использоваться в настоящем изобретениии, включают алкилированные лекарственные средства, такие как циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, мелфалан, бусульфан, ломустин, кармустин, хлорметхин (мустин), эстрамустин, треосульфан, тиотеф, митобронитол; цитотоксические антибиотики, такие как доксорубицин, эпирубицин, акларубицин, идарубицин, даунорубицин, митоксантрон (митозантрон), блеомицин, дактиномицин и митомицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, капецитабин, цитарабин, флударабин, кладрибинин, гемцитабин, фторурацил, ралтитрексед, меркаптопурин, тегафур и тиогуанин; алкалоиды утса, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин, и этопозид; другие неопластические лекарственные средства, такие как амсакрин, альтретамин, крисантаспас, дакарбазин и темозоломид, гидроксикарбамид (гидроксимочевина), пентостатин, соединения платины, включающие: карбоплатин, цисплатин и оксалиплатин, порфимер натрия, прокарбазин, разоксан, таксаны, включающие: доцетаксель и паклитаксель, ингибиторы топоизомеразы Ι, включающие: иринотекан и топотекан, трастузумаб и третиноин.
В предпочтительном варианте осуществления другим цитотоксическим лекарственным средством является доксорубицин, мелфалан или цисплатин.
Конъюгат по настоящему изобретению может также применяться в диагностических целях с использованием проницаемости опухолевых клеток и сосудов для соединений. Например, конъюгат может быть использован для повышения поглощения опухолью радиолабильных антител или гормонов (опухоле-визуализирующие соединения) в радиоиммуносцинтиграфии или радиотерапии опухоли.
Графические материалы и примеры
Настоящее изобретение далее будет описано путем ссылок на следующие неограничивающие примеры и чертежи, в которых фиг. 1 - влияние тΤNΕ и Ν6Ρ-111ΤΝΕ на рост опухоли и массу тела животных, несущих ΚΜΑ-Τ лимфомы. Животных, несущих ΚΜΑ-Τ (5 мышей/группа), обрабатывали ί.ρ. Ν6Ρ-111ΤΝΕ или тΤNΕ на 12 день после имплантации опухоли (А) или на 10, 11 и 12 день (В), в двух раздельных экспериментах (эксп. 1 и эксп. 2). Показаны объемы опухолей в эксп. 1(А) и эксп. 2(В) и вес тела животного в эксп. 1(С) 1-4 дни после обработки. Размерные стрелки в панели С указывают время обработки;
фиг. 2 - уровни циркуляции 8ΤΝΓ-Κ2 и их роль в регуляции активности Ν6Ρ-111ΤΝΕ и Ν6Κ-ΗΤΝΕ. Панель А: уровни 8ΤΝΕ-Κ1 и 8ΤΝΕ-Κ2 в сыворотке В16Е1 опухоленесущих мышей, 1 ч после обработки разными дозами Ν6Ρ-111ΤΝΕ или тΤNΕ. Животных (3 мыши/группа) обрабатывали на 6 день.
Панель В: влияние анти-хУНЕ-ВЗ тАЬ 661 на противоопухолевую активность Ν6Ρ-111ΤΝΕ. МАЬ 661 (100 мкг) вводили животным, несущим В16Е1 опухоли, на 5 и 8 день. Через час каждое животное обрабатывали Ν6Ρ-111ΤΝΕ в указанных дозах и через 2 ч - мелфаланом (90 мкг, 5 мышей/группа).
Панель С: влияние Ν6Ρ-11ΤΝΕ и 11ΤΝΕ на рост ΡΜΑ-Τ опухолей. Мышей обрабатывали разными дозами каждого цитокина на 11 день. Ν.8.: не существенный (ΐ-тест);
фиг. 3 - влияние мелфалана, одного (А) или в комбинации с Ν6Ρ-111ΤΝΕ (С) или тΤNЕ (Ό), на рост опухоли (Α-Ό) и массу тела (Е-Ε) мышей, несущих В16Е1 меланому. Животных обрабатывали (ί.ρ.) лекарственными средствами и дозами, указанными в каждой панели (5 животных/группа) на 4, 7 и 9 день после имплантации опухоли (указаны стрелками);
фиг. 4 - влияние различных доз доксорубицина, одного (белые прямоугольники) или в комбинации с Ν6Ρ-111ΤΝΕ (черные прямоугольники) на рост опухоли (А, В), массу тела (С, Ό) и выживание (Е) мышей, несущих В16Е1 меланомы. Лекарственные средства вводили животным (5 мышей/группа ί.ρ.) на 5 день после имплантации опухоли;
фиг. 5 - роль ΤΝΕ рецепторов в синергетической активности Ν6Ρ-111ΤΝΕ и мелфалана.
Панель А: влияние тΑЬ У1с.| (анти-ιηΤΝΕ нейтрализующее антитело) на противоопухолевую активность мелфалана в комбинации с Ν6Ρ-111ΤΝΕ в В16Е1 модели. Лекарственные средства вводили на 5 день. МаЬ У1с.| и Ν6Κ.-ΤΝΕ предварительно смешивали и инкубировали в течение 1 ч перед инъекцией животным.
Панель В: влияние мелфалана в комбинации с Ν6Ρ-11ΤΝΕ в указанных дозах;
фиг. 6 - влияние Ν6Β-111ΤΝΕ на пенетрацию доксорубицина в В16Е1 и Κ.ΜΑ-Τ опухоли.
Панель А: светлопольная (верхние панели) и флуоресцентная (нижние панели) микроскопия В16Е1 клеток, инкубированных ίη νίΐτο с 100 мкг/мл доксорубицина (30 мин, 37°С). Врезка: объединение изображений по методу светлого поля и флуоресцентного.
Панель В: стабильность В16Е1 флуоресцентного сигнала после ίη νίΐτο обработки доксорубицином. В16Е1 клетки инкубировали с различными дозами доксорубицина в культуральной среде (30 мин, 37°С), промывали 0,9% хлоридом натрия и фиксировали 4% формальдегидом. Затем клетки инкубировали от 0 до 24 ч в культуральной среде при 4°С, снова промывали и анализировали методом ΕΑС8.
Панель С, Ε: результаты ΕΑС8 анализов клеток, выделенных из В16Е1 (С) или Κ.ΜΑ-Τ (Р) через 2 ч
- 57 007396 после ίη νίΐΓΟ введения доксорубицина одного (320 мкг) или в комбинации с ΝΘΒ-ιιιΤΝΡ (0.1 нг). Пунктирные линии указывают интервал флуоресценции, рассматриваемый как положительный.
Панель Ό, С: значение ±8Е флуоресценции Β16Ρ1 (Ό) или ΗΜΑ-Τ (С) клеток, выделенных из опухолей.
Панель Е, Н: значение ± 8Е позитивных клеток, выделенных из Β16Ρ1 (Е) ΚΜΑ-Τ (Н) опухолей.
Статистические анализы с помощью двустороннего 1-теста, Р<0.05 (*);
фиг. 7 - схематическое представление гипотетического взаимодействия низкой (А), средней (В) и высокой (С) доз ΝΘΚ.-ΤΝΡ с растворимым и мембранным рецепторами в нормальных сосудах (СЭ 13негатив) и в опухоле-ассоциированных сосудах (СП13-позитив). Черные стрелки указывают сигнализацию ΤΝΡ рецептора или выпадение внеклеточного домена;
фиг. 8 - влияние ΚΘΌ-ΤΝΡ на рост опухоли (фиг. 8А) и массу тела (фиг. 8В) животного, несущего ΚΜΑ-Τ;
фиг. 9 - влияние единственной обработки (стрелка) ΙΡΝγ-ΝΘΚ на рост опухолей ΚΜΑ лимфомы у С57В6 мышей (фиг. 9А и фиг. 9С) и на массу животного (фиг. 9В);
фиг. 10 - влияние ΝΘΚ-ΤΝΡ и цисплатина на ΚΜΑ опухоли у С57/ВБ6 мышей.
Пример 1. Линии опухолевых клеток и реагенты.
Клетки Β16Ρ1 меланомы мыши и ΚΜΑ-Τ лимфомы культивировали, как описано ранее (14, 15). ΜΑΒ 6С1 (антогонист анти-р75 тΤNΡ рецептора крысы) был получен и охарактеризован, как описано ранее (16,17). МАЬ ν1ς (анти-ιηΤΝΡ крысы) был любезно предоставлен Όγ. Ό. Μαηποί (ИпКегкйу оГ КедепкЬшд, Германия). Мелфалан (Алкеран) был получен у С1ахо-ЭДе11соте (Лондон, Великобритания). Доксорубицин (Адрибластина) был закуплен у Р11агтас1а-ир)о11п (Милан, Италия).
Пример 2. Получение человеческого и мышиного ΤΝΡ и ΝΘΚ-ΤΝΡ.
Человеческий и мышиный ΤΝΡ и ΝΘΚ-ΤΝΡ (состоящий из ΤΝΡ, слитого с С-концом СЫСКСС) были получены рекомбинантной ДНК технологией и очищены из экстрактов клеток Е.соН. как описано (14). Все растворы, используемые на хроматографических стадиях, получали со стерильной и свободной от эндотоксинов водой (8а1Г, Бегдато, Йа1у). Концентрацию белка измеряли с помощью коммерческого набора реактивов для количественного анализа белка (Р1егсе, КоскГогб, ГЬ). Цитолитическая активность ίη νίΙΐΌ человеческого ΤΝΡ (ΗΤΝΡ), установленная стандартным цитолитическим анализом с Ь-Μ фибробластами мыши (18), была 5.4 х 107 единиц/мг, тогда как цитолитическая активность очищенного ΝΘΚ-ΗΤΝΡ была 1.4 х 108 единиц/мг. Цитолитическая активность мышиного ΤΝΡ (ιιιΤΝΡ) была 7.6 х 107 единиц/мг, тогда как цитолитическая активность ΝΘΚ-ιηΤΝΡ была 9.1 х 107 единиц/мг. Гидродинамические объемы ΝΘΚ-ΤΝΡ, ΝΘΚ-11ΤΝΡ и тΤNΡ были схожи с гидродинамическими объемами 11ΤΝΡ, гомотримерного белка (19), установлены с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке 8ирегбех 75 НК (Рйагтас1а, 8>ебеп). Электроаэрозольной масс-спектрометрией каждого продукта установлены следующие молекулярные массы: ΝΘΚ-ΗΤΝΡ, 17937.6 ± 1.9 Да (ожидаемый для ί,’ΝΘΕί,’Θ-ΙιΤΝΡΜмономеров, 17939.4 Да); ΗΤΝΡ, 17349 ± 1.3 (ожидаемый для ΗΤΝΡι-ι57, 17350.7); ЫСК-тЮТ, 17841.16 ± 2.5 (ожидаемый для СЫСКСС-тЮТ!^, 17844.2), ιηΤΝΡ, 17384.9 ± 2 (ожидаемый для Μе1-тΤNΡ1-156 , 17386.7). Содержание эндотоксина в каждом продукте, измеренное с использованием количественного хромогенного 11ти1ик амебоцитного лизатного (ΕΑΕ) теста (Β^οЭДЫйаке^), было: ΝΘΚ-ΗΤΝΡ, 0.079 единиц/мг; 11ΤΝΡ, 0.117 единиц/мг; ΝΘΚ-ΤΝΡ, 0.082 единиц/мг; тΤNΡ, 1.61 единиц/мг.
Пример 3. Исследования ίη νί\Ό.
Исследования на животных моделях были одобрены Этическим комитетом Сан-Рафаэлевского научного института и выполнены в соответствии с установленными нормами. 0'57606 мышам (Сйаг1ек Ккег ЬаЬога1ог1ек, Са1со, Йа1у), весящим 16-18 г, были сделаны подкожные инъекции в левый бок 5 х 104 живых клеток ΚΜΑ-Τ или Β16Ρ1; через 4-12 дней мышей обработали растворами ΤΝΡ или ΝΘΚ-ΤΝΡ (100 мкл) с последующим через 2 ч введением раствора мелфалана или доксорубицина (100 мкл). Если не указано иначе, все лекарственные средства вводили внутрибрюшинно (ί.ρ.). Все лекарственные средства были разбавлены 0,9% хлоридом натрия, содержащим 100 мкг/мл свободного от эндотоксина человеческого сывороточного альбумина (Ρа^та-Β^ад^η^, Бисса, Йа1у), за исключением доксорубицина, который был разбавлен одним 0,9% хлоридом натрия. Рост опухоли контролировался ежедневно путем измерения кронциркулем, как описывалось ранее (20). Животные были умерщвлены прежде, чем опухоль достигала 1,0-1,5 см в диаметре. Размеры опухоли показаны как значения ± 8Е (5 животных/группа).
Пример 4. Анализ растворимого ΤΝΡ рецептора.
Растворимый ρ55-ΤΝΡ рецептор (κΤΝΡ-Κ1) и растворимый ρ75-ΤΝΡ рецептор (κΤΝΡ-Κ2) в сыворотке животных были измерены с использованием набора фиапбкте Μ (К & Ό 8ук1етк, Μшηеаρο1^κ, ΜΝ 55413).
Пример 5. Выявление доксорубицина в опухолях.
ί.’57/ΒΓ·6 мышей, несущих Β16Ρ1 или ΚΜΑ-Τ опухоли (диаметр, 0.5-1 см), обработали с или без NΘΚ-т ΤΝΡ (0.1 нг, ί.ρ.), спустя 2 ч доксорубицином (320 мкг, ί.ρ.). Через 2 ч животные были умерщвлены, а опухоли были иссечены. Каждая опухоль была взвешена, дезагрегирована, ресуспендирована в холодном фосфатно-буферном солевом растворе (ΡΒ8) и профильтрована через фильтр 70 мкм. Клетки
- 58 007396 ресуспендировали с холодным РВ8 (50 мл), центрифугировали (1500 об./мин, 10 мин, 4°С), ресуспендировали в холодном РВ8 (2,5 мл/г опухолевой ткани) и смешивали со свежеприготовленным РВ8, содержащим 8% формальдегида (2,5 мл/г ткани). Клетки хранили в темноте при 4°С в течение ночи и затем анализировали методом ЕАС8. ЕАСЗсаи (Вес1оп-Э1ск1п8оп) калибровали с клетками, извлеченными из необработанных (нелеченных) опухолей. Каждый образец затем анализировали, используя ЕЬ-3 фильтр и Се11 ОпеЧ компьютерные программы.
Пример 6. Кривые доза-ответ ΝΟΚ-^ΤΝΡ и ιηΤΝΕ в моделях мышиной лимфомы и меланомы.
Противоопухолевая активность ΝΟΒ-ιηΤΝΕ и ιηΤΝΕ была впервые охарактеризована в отсутствии химиотерапевтических лекарственных средств. Чтобы сравнить кривые доза-ответ ΝΟΒ-ιηΤΝΕ и тТИЕ, мы выполнили несколько экспериментов, основанных на единичном или повторяющемся введении (ί.ρ.) различных доз ЫСВ-тТЫЕ и ιηΤΝΕ (от 0,01 до 10000 нг) мышам, несущим ВМА-Т лимфому или В16Е1 меланому. Мышиный ΤΝΒ задерживал рост опухоли при введении высоких доз (10000 нг) (фиг. 1 А); не вызывали эффектов дозы ниже чем 100 нг, ни при единичном (фиг. 1А), ни при повторном введении (фиг. 1В). ΝΟΒ-^ΤΝΡ был заметно более эффективным. В этом случае мы наблюдали противоопухолевые эффекты даже с дозами ниже, чем 0,01 нг (фиг. 1А, В). Однако кривая доза-ответ была более сложной. Например, влияние 10 нг было неожиданно ниже, чем влияние 0,01-0,1 нг и 1000-10000 нг. Колоколообразная кривая доза-ответ наблюдалась в нескольких других экспериментах, проведенных на ВМА-Τ модели, а также на модели В16Е1 меланомы (не показано). Эти результаты показывают, что 1) эффективность низких доз ΝΟΒ-^ΤΝΡ значительно выше, чем эффективность низких доз тΤNΡ, и 2) дозы ΝΌΒ^ΤΝΒ больше, чем 1-10 нг, активируют механизмы негативных ответных реакций, что ингибирует его потенциальную противоопухолевую активность.
Пример 7. Нанограммовые дозы Ν6Κ.-ΤΝΕ. но не пикограммовые, вызывают выпадение растворимого ΤΝΒ рецептора.
Были исследованы защитные механизмы, ответственные за колоколообразную кривую доза-ответ ΝΌΒ^ΤΝΒ. Так как экзогенное введение ΤΝΒ может вызвать выпадение растворимого ΤΝΒ рецептора (δΤΝΒ-Βδ) ίη νίνο (21), мы предположили, низшая эффективность 10 нг Ν6Κ-ΤΝΕ была связана с индукцией 8ΤΝΡ-Β1 и/или 8ΤΝΒ-Β2 и, следовательно, нейтрализацией его взаимодействия с мембранными рецепторами.
Чтобы проверить эту гипотезу, мы измерили уровни 8ΤΝΒ-Β1 и 8ΤΝΒ-Β2 в сыворотке мышей, несущих опухоль, собранной через 1 ч после введения различных доз тΤNΡ апб ΝΟΡ-ιηΤΝΕ. Как ожидалось, оба продукты вызывали выпадение 8ΤΝΒ-Β2, но не выпадение 8ΤΝΒ-Β1, при дозах больше чем 4 нг (фиг. 2А).
Чтобы оценить, регулирует ли выпадение 8ΤΝΒ-Β2 активность ΝΟΒ-ιηΤΝΕ мы ввели этот цитокин вместе с тАЬ 6С1, антогонистом ηκιη-8ΤΝΒ-Β2 антитела, который предотвращает связывание тΤNΡ с растворимым и мембранным мышиным ΤΝΕ-Κ.2 (16). Противоопухолевая активность 10 нг ΝΟΡ-ιηΤΝΕ была повышена с помощью тАЬ 6С1 (фиг. 2В), в соответствии с гипотезой, что 8ΤΝΒ-Β2 играет роль в ингибировании противоопухолевых эффектов ΝΌΒ^ΤΝΒ.
Для дальнейшего подтверждения этой гипотезы мы сравнили ίη νίνο кривую доза-ответ ΝΟΒ-^ΤΝΡ с кривой доза-ответ ΝΌΒ-ΗΤΝΒ, воспользовавшись тем обстоятельством, что человеческий цитокин не может связать мышиный 8ΤΝΕ-Κ.2 (22). Мы нашли, что кривая доза-ответ Ν6Ρ-11ΤΝΕ была не колоколообразной и что 10 нг Ν6Ρ-11ΤΝΕ также активны, как 1 нг (фиг. 2С). Также примечательно, что 1 нг было достаточно, чтобы вызвать максимальный противоопухолевый эффект. Можно предположить, что связывание рецептора на сосудах может быть достигнуто при очень низких уровнях Ν6Ρ-11ΤΝΕ в крови.
Взятые вместе, результаты этих экспериментов подтверждают, что ΝΟΡ-ιηΤΝΕ и тΤNΡ, в дозах более чем 4 нг, вызывают выпадение 8ΤΝΒ-Β2 в количествах, достаточных для ингибирования их противоопухолевой активности.
Пример 8. Пикограммовые дозы ΝΟΡ-ιηΤΝΕ являются достаточными, чтобы усилить терапевтическое действие мелфалана и доксорубицина.
Затем мы исследовали, действительно ли нацеленная доставка низких доз ΝΟΒ-^ΤΝΒ в опухолевые сосуды может увеличить противоопухолевую активность химиотерапевтических лекарственных средств. Эти эксперименты были выполнены на В16Е1 модели спонтанной меланомы мыши, характеризумой редкой иммуногенностью и низкой чувствительностью к мелфалану. Мелфалан (90 мкг) был неспособен повлиять на рост опухолей, когда инъецировался один (фиг. 3А). Аналогично, тΤNΡ (0.1 нг, один, ί.ρ.) был практически не активен, в то время как такая же доза ΝΟΒ-^ΤΝΡ умеренно задерживала рост опухоли (фиг. 3В, верхние панели). Комбинация мелфалана с 0,1 нг ΝΟΡ-ιηΤΝΕ вызывала более сильные противоопухолевые эффекты, чем единственные агенты, указывая на синергетический эффект (фиг. 3С). Примечательно, что комбинация мелфалана с 0,1 нг ΝΟΒ-^ΤΝΒ была более эффективной, чем комбинация с 5000 нг тΤNΡ (фиг. 3С-Э). Мы наблюдали этот синергизм даже, когда NСВ-тΤNЕ (0.1 нг) инъецировали ί.ν. (не показано).
Два похожих эксперимента мы провели с доксорубицином на В16Е1 модели. Животные были обработаны через пять дней после имплантации опухоли с или без ΝΟΒ-^ΤΝΒ и через 2 ч различными дозами доксорубицина (20-320 мкг, ί.ρ.). В обоих экспериментах действие доксорубицина плюс ΝΟΒ-^ΤΝΡ
- 59 007396 было сильнее, чем действие одного доксорубицина (фиг. 4А, В, Е), что указывает, что ХОК-тТХР заметно улучшает эффективность этого лекарственного средства.
Например, действие доксорубицина (40 мкг) плюс ХОК-тТХР (0,1 нг) было сильнее, чем действие 320 мкг одного доксорубицина (фиг. 4В), в то время как действие доксорубицина (20 мкг) плюс ХОКтТХР было ниже (фиг. 4А). Из этих результатов мы оценили, что активность доксорубицина повышается в 8-10 раз с помощью ХОК-тТХР.
В заключение, эти результаты означают, что пикограмовые дозы ХОК-ТХР достаточны для улучшения ответа опухолей и на мелфалан, и на доксорубицин.
Пример 9. Низкие дозы ХОК-тТХР не токсичны и не увеличивают токсичность мелфалана.
Чтобы оценить отношение эффективность/токсичность каждой обработки, мы ежедневно контролировали массу тела животных и выживание животных после обработки. В то время как терапевтические дозы тТХР (10000 нг) вызывали заметную потерю массы тела у животных, несущих КМА-Т (фиг. 1С, слева), терапевтические дозы ХОК-тТХР (0.01-1 нг) не вызывали потери массы тела (фиг. 1С, справа). Кроме того, ни ХОК-тТХР, ни тТХР (1 нг каждого) не увеличивал смертность при 200 мкг мелфалана у мышей, несущих КХА-Т опухоль (табл. 1).
Таблица 1 Влияние тТХР и ХОК-тТХР на токсичность мелфалана (высокая доза) у мышейа, несущих опухоль
Обработка Число живых мышей дня после обработки
Нет 5/5 (100%)
Мелфалан 7/10 (70%)
Мелфалан + ιηΤΝΕ 8/10 (80%)
Мелфалан + Ν6Κ-ηιΤΝΡ 8/10 (80%) а С57ВЧ6 мыши, несущие 11-дневные опухоли, были обработаны (ΐ.ρ.) 1 нг ХОК-тТХР или тТХР и через 2 ч 200 мкг мелфалана.
В В16Р1 модели терапевтические дозы ХОК-тТХР (0.1 нг) не вызывали потери массы тела даже в комбинации с мелфаланом (фиг. 3Е). Наоборот, мелфалан в комбинации с терапевтическими дозами тТХР (5 мкг) вызывал заметную потерю массы тела (фиг. 3Р). Кроме того, ХОК-тТХР (0.1 нг) не увеличивал потерю массы тела, вызванную высокими дозами доксарубицина (фиг. 4С-1)).
Эти результаты означают, что пикограмовые дозы ХОК-тТХР усиливают ответ опухолей на мелфалан и доксорубицин без заметного увеличения токсичности.
Пример 10. Активация ТХР-К1 необходима и достаточна для синергизма между ХОК-ТХР и химиотерапевтическими лекарственными средствами.
Были изучены механизмы синергизма между низкими дозами ХОК-тТХР и химиотерапией.
Чтобы оценить, действительно ли эти механизмы зависят от ТХР-Кк активации, мы исследовали влияние шАЬХк], нейтрализующего анти-тТХР антитело, на противоопухолевую активность ХОКтТХР (0.1 нг) в комбинации с мелфаланом (90 мкг). МАЬ ХЧ] ингибировал, по меньшей мере, частично, противоопухолевую активность этих лекарственных средств в В16Р1 модели (фиг. 5А). Это означает, что взаимодействие между ТХР-частью и ТХР-Кк является существенным для активности конъюгата.
Была изучена роль ТХР-К1 и ТХР-К2. С этой целью мы определяли действие мелфалана в комбинации с 0,01 нг или 0,1 нг ХОК-ЪТХР, специфического агониста ТХР-К1 (22). Действие мелфалана в В16Р1 модели усиливалось ХОК-НТХР (фиг. 5В), подтверждая, что активация ТХР-К1 является достаточной для синергизма.
Пример 11. Синергия между ХОК-ТХР и химиотерапией не зависит от цитотоксичности опухолевых клеток.
Чтобы оценить, зависит ли синергизм непосредственно от цитотоксичности против опухолевых клеток, мы измерили влияние каждого соединения, одного или в комбинации, на культивируемые В16Р1 клетки. Ни мелфалан, ни ХОК-тТХР, один или в комбинации, не убили этили клетки в течение 48 ч наблюдения т νίίτο (не показано). Аналогично, ХОК-тТХР не увеличивал цитотоксическую активность доксорубицина ιη νίίτο (не показано). Эти результаты означают, что синергизм, наблюдаемый т νίνο, не
- 60 007396 зависит непосредственно от цитотоксических эффектов против опухолевых клеток и указывает на косвенную роль компонента опухолевой стромы, например, эндотелиальной выстилки опухолевых сосудов.
Пример 12. ΝΟΒ-ΤΝΕ увеличивает пенетрацию доксорубицина в мышиные меланомы и лимфомы.
Мы исследовали, может ли ΝΟΒ-ηΤΝΕ увеличить пенетрацию химиотерапевтических лекарственных средств в опухоли. С этой целью мы измерили количество доксорубицина, которое проникло в В16Е1 и ВМА-Τ опухоли, воспользовавшись флуоресцентными свойствами этих лекарственных средств (23). Предварительные эксперименты показали, что ядра В16Е1 клеток становятся флуоресцентными после воздействия на эти клетки доксорубицина ш νίΙΐΌ (фиг. 6А). Как показали измерения методом ЕАСБ (фиг. 6В), флуоресцентный сигнал зависит от дозы и стабилен по меньшей мере 24 ч, когда клетки закреплены формальдегидом и хранятся при 4°С. Таким образом, интенсивность флуоресценции опухолевых клеток, выделенных из животных после обработки, показывает количество доксорубицина, которое содержится в пенетрированных опухолях. Мы наблюдали, что 0,1 нг ΝΟΒ-ηΤΝΕ, введенные за 2 ч до доксорубицина, увеличивали интенсивность флуоресценции и процент положительных клеток, выделенных из В16Е1 и ΒМА-Τ опухолей через 2 ч после обработки (2-5-раз, фиг. 6С-Н). Это означает, что ΝΟΒ-ηΤΝΕ увеличивает количество клеток, которые были достигнуты доксорубицином, а также внутриклеточное количество лекарственного средства.
Пример 13. Влияние ΒΟΩ-ΤΝΕ на опухоли.
С57/ВЬ6 мышей, несущих ΒМА-Τ опухоли (5 мышей/группа), обработали внутрибрюшинно мелфаланом одним или в комбинации с ΒΟΩ-ΤΝΕ или ΝΟΒ-ΤΝΕ. Влияние на объем опухоли показано на фиг. 8А, а влияние на массу животного показано на фиг. 8В. Эти результаты демонстрируют, что ΒΟΌΤΝΕ также активен в пикограммовом диапазоне.
Пример 14. Влияние ΙΕΝγ-ΝΟΒ на опухоли.
С57/ВЬ6 мышей, несущих НМЛ лимфому, обработали с или без ΙΕΝγ (3 нг) или ΙΕΝγ-ΝΟΒ (3 нг). Через 21 день животные были умерщвлены. Результаты объема опухоли и потери массы животного можно увидеть на фиг. 9А и 9В. Кроме того, С57/ВЬ6 мышей, несущих опухоли ВМА лимфомы, обработали с или без ΙΕΝγ (3 нг), ΙΕΝγ-ΝΟΒ (3 нг), ΙΕΝγ-ΝΟΒ (3 нг) плюс апи-СЭ13 Β3-63 тАЬ (25 мкг) или ΙΕΝγ-ΝΟΒ (3 нг) плюс тАВ 19Е12 (50 мкг). тАВ 19Е12 является посторонним Ι§Ο, используемым в качестве негативного контроля в эксперименте. Эти результаты демонстрируют, что ΙΕΝγ-ΝΟΒ. активен в пикограммовом интервале.
Пример 15. Пикограммовые дозы ΝΟΒ-ΤΝΕ достаточны для увеличения терапевтического эффекта цисплатина.
Мы исследовали, действительно ли нацеленная доставка низких доз ΝΟΒ-ΤΝΕ в опухолевые сосуды может увеличить противоопухолевую активность противоопухолевого лекарственного средства цисплатина. Эти эксперименты были выполнены на С.'57/ВЬ6/Х мышах, несущих ВМА-Τ опухоли с начальным возрастом 8 недель. Мышей обрабатывали с или без цисплатина или ΝΟΒ-ηΤΝΕ с обработкой на 10 день. Результаты показаны на фиг. 10. На этом чертеже, Су5 = Скр1а!шо Τеνа раствор 0.5 мг/мл; ΝΟΒ = ΝΟΒ-ηΤΝΕ. Растворитель НАБ 100 мг/мл в №1С1 0,9%. Эти результаты означают, что пикограммовые дозы ΝΟΒ-ΤΝΕ достаточны для увеличения терапевтического эффекта цисплатина.
Обобщение достижений
Изменение сосудистой проницаемости и интерстициального давления, повреждение эндотелиальных клеток и осаждение фибрина являются важными механизмами противоопухолевой активности ΤΝΕ, или одного или в комбинации с химиотерапевтическими лекарственными средствами. Далее, инфузия животному или пациенту ΤΝΕ может также вызвать механизмы негативных ответных реакций, которые нейтрализуют большинство из этих эффектов.
Например, ΤΝΕ даже при умеренной дозе может вызвать высвобождение растворимых р55 и р75 ΤΝΕ рецепторов, что может помешать его взаимодействию с мембранными рецепторами (21, 24). Хотя эти растворимые ингибиторы могут защищать тело от вредных воздействий этого цитокина, они могут также препятствовать его противоопухолевой активности и могут частично объяснить необходимость высоких доз ΤΝΕ для эффективной терапии. В этой работе мы постулировали, что хоминг (доставка) низких доз ΤΝΕ в опухолевые сосуды представляет новую стратегию, чтобы избежать токсических реакций, а также механизмов негативных ответных реакций, в тоже время сохраняя его синергизм с химиотерапией. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы исследовали противоопухолевую активность высоких и низких доз ΝΟΒ-ηΤΝΕ и ηΤΝΕ в интервале от пикограммовых до микрограммовых количеств на двух мышиных моделях, основанных на подкожных опухолях ΒМА-Τ лимфомы и В16Ε1 меланомы. Исследования были выполнены с использованием этих цитокинов одних или в комбинации с мелфаланом или доксорубицином. В то время как ηΤΝΕ был практически неактивен в этих моделях при дозах ниже, чем 100-1000 нг, мы нашли, что ΝΟΒ-ηΤΝΕ, даже один, может вызывать противоопухолевые эффекты в дозах таких низких как 0,01-0,1 нг. Так как значения ЬЭ50 ηΤΝΕ и ΝΟΒ-ηΤΝΕ похожи и соответствуют примерно 50000 нг у мышей, несущих ΒМА-Τ опухоль (14), эти результаты показывают, что отношение эффективность/токсичность для ΝΟΒ-ηΤΝΕ в 104-105 раз больше, чем для ηΤΝΕ.
Введение ультрамалых количеств ΝΟΒ-ηΤΝΕ (0,1 нг) опухоленесущим животным усилило проти
- 61 007396 воопухолевую активность мелфалана и доксорубицина без заметного увеличения токсичности, что оценивали по снижению массы опухоли, выживаемости животного и потере массы после обработки. Это означает, что ЫСК-тТЫЕ улучшает терапевтический индекс этих лекарственных средств. Примечательно, что были необходимы в 5 х 104 раз более высокие дозы тТЫЕ, чтобы увеличить эффект мелфалана до сравнимого уровня, вызывающего заметную потерю массы тела.
Тот факт, что и мелфалан, и доксорубицин при дозах практически неактивных в В16Е1 модели снижали рост опухоли, когда их объединяли с ЫСК-тТЫЕ, указывает, что эти лекарственные средства действуют синергестически. Изучения механизма действия показали, что синергизм зависит от взаимодействия ЫСК-тТЫЕ с ТЫЕ-К1 на стромальных клетках, наиболее правдоподобно эндотелиальных клетках, и гораздо меньше на опухолевых клетках. Кроме того, мы нашли, что сосудистое нацеливание с ЫСКтТЫЕ улучшает пенетрацию цитотоксичного лекарственного средства в опухоли. Примечательно, что ЫСК-тТЫЕ увеличивал и процент раковых клеток, которые были достигнуты доксорубицином за 2 ч, а также и внутриклеточное количество лекарственного средства, подтверждая, что ЫСК-ТЫЕ может изменять лекарственно-пенетрационные барьеры. Предыдущие изучения показали, что ТЫЕ может быстро увеличивать эндотелиальную проницаемость (25, 26) и может уменьшать давление интерстициальной жидкости (8), которые являются важными барьерами для пенетрации лекарственных средств в опухоли (1). Возможно, эти механизмы увеличивают конвективный транспорт лекарственных средств через стенки опухолевых сосудов и интерстициум, приводя в результате к повышенному поглощению лекарственного средства опухолевыми клетками. Выбор времени введения является весьма существенным для этих механизмов, поскольку ТЫЕ может также вызывать интраваскулярную коагуляцию (27), приводящую к окклюзии сосудов и снижению опухолевой перфузии. Согласно этой точке зрения, мы наблюдали, что действие мелфалана было выше, когда это лекарственное средство вводилось через 2 ч после ЫСК-ТЫЕ, чем через 6 ч (данные не показаны).
Гипотеза, что сосудистое нацеливание поможет избежать механизмов негативных ответных реакций, обычно ассоциируемых с ТЫЕ терапией, была подтверждена наблюдением, что пикограммовые дозы ЫСК-тТЫЕ не вызывают выпадения растворимого рецептора, в то время как и ЫСК-тТЫЕ, и тТЫЕ быстро вызывали высвобождение §ТЫЕ-К2 в циркуляцию при дозах более чем 4-10 нг. Эти уровни §ТЫЕК2 ингибировали почти полностью противоопухолевую активность 10 нг ЫСК-тТЫЕ, и этим можно объяснить парадоксальное наблюдение, что 10 нг менее активны, чем 0,1 нг. Вероятно, большая часть инъецируемых молекул быстро связывалась 8ТЫЕ-К2 и их активность блокировалась.
Были частично освещены молекулярные механизмы, лежащие в основе селективного взаимодействия низких доз ЫСК-тТЫЕ с опухолевыми кровеносными сосудами. Недавно мы показали, что различные СИ13 изоформы экспрессируются в опухоле-ассоциированных сосудах, в эпителиальных и миелоидных клетках, и что ИСК домен ЫСК-ТЫЕ селективно распознает СИ13 изоформ, ассоциированный с опухолевыми сосудами (28). Поэтому мы предположили, что низкие уровни ЫСК-тТЫЕ в крови могут быстро взаимодействовать с СИ13-позитивными эндотелиальными клетками вследствие высокоаддитивного мультивалентного связывания, включающего оба СИ 13 и ТЫЕ-Къ. и мало или нисколько с СИ13негативными эндотелиальными клетками нормальных сосудов из-за меньшей аддитивности. Схематическое представление этих концепций и гипотетических взаимодействий ЫСК-ТЫЕ с растворимыми и мембранными рецепторами показано на фиг. 7.
Мы также нашли, что КСИ-ТЫЕ и IЕNγ-NСК. являются активными в пикограммовом интервале.
Мы также показали, что ЫСК-ТЫЕ увеличивает действие цисплатина.
В заключение, мы нашли, что нацеленная доставка пикограммовых доз цитокинов в опухолевые сосуды усиливает противоопухолевую активность химиотерапевтических лекарственных средств у мышей без стимулирования выпадения растворимого рецептора. Определено, что СЫСКС звено является предполагаемой мишенью мышиных, а также человеческих опухоле-ассоциированных сосудов (29), наши результаты показывают, что комбинация низких доз нацеленных цитокинов с противораковыми лекарственными средствами может увеличить их терапевтический индекс у пациентов людей.
Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены здесь путем ссылки. Различные модификации и вариации описанных методов и систем изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники без отклонения от объема и духа изобретения. Хотя изобретение было описано в связи со специфическими предпочтительными вариантами осуществления, должно быть понятно, что изобретение, как оно изложено в формуле изобретения, будет неверно ограничивать такими специфическими вариантами осуществления. Несомненно, различные модификации описанных методов для осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в молекулярной биологии и родственных областях, подразумеваются в объеме следующей формулы изобретения.
Ссылки
1. 1аш, К.К. 1994. 8с1 Ат. 271:58-65.
2. Ыепагй, И., е! а1. 1992 I. С1т. Опсо1. 10:52-60.
3. Еддегтоп!, А.М., е! а1. 1996. I. С1ш. Опсо1. 14:2653-2665.
4. Ье_)еипе, Е.Е 1995. Еиг. I. Сапсег. 31 А: 1009-1016.
- 62 007396
5. Ргакег, 1).1.., е! а1. 1996. 1. С1т. Опсо1. 14:479-489.
6. ΚΟ88Ϊ, С.В., е! а1. 1999. Сапсег. 86:1742-1749.
7. νаη бег Vееη, А.Н., е! а1. 2000. Вг. 1. Сапсег. 82:973-980.
8. Кпк!епкеп, С.А., е! а1. 1996. Вг. 1. Сапсег. 74:533-536.
9. 8и7ик1, 8., е! а1. 1990. кН. 1. Сапсег. 46:1095-1100.
10. бе №й!, ЕН., е! а1. 2000. Вг. 1. Сапсег. 82:1000-1003.
11. Р1егк, ^. 1995. В1о1од1с !кегару тейк ΤΝΕ: ргескшса1 к!иб1ек. Ш Вю1одк !кегару о£ сапсег: ргшсЕ р1ез апб ргасксе. V. Бе У11а, 8. Не11тап, апб 8. ВокепЫегд, ебйогк. ЕВ. Б1рртсо!! Сотрапу, РЫ1абе1рЫа. 295-327.
12. Ргакег, Б.Б., А1ехапбег, Н.В. апб Ракк, Н.Е 1995. Вю1од1с !кегару тейк ΤΝΕ: кук!етк абт1шк!га!юп апб 1ко1а!юп-рег£икюп. к1 В1о1од1с !кегару о£ сапсег: рппс1р1ек апб ргасксе. V. Бе У11а, 8. Не11тап апб 8. ВокепЫегд, ебйогк. ЕВ. Б1рршсой Сотрапу, РЫ1абе1рЫа, 329-345.
13. Согк, А., апб Р. Магсисск 1998. 1. Бгид Тагд. 5:403-413.
14. Сигшк, Р., Ае! а1. 2000. ΝηΙ. В1о!ескпо1. 18:1185-1190.
15. Мого, М., е! а1. 1997. Сапсег Век. 57:1922-1928.
16. Согк, А., е! а1. 1999. Мгс! Iттиη. 67:5762-5767.
17. Ре1ад1, М., е! а1. 2000. Еиг. Су!окте №!. 11:580-588.
18. Согк, А., е! а1. 1994. 1. ]ттипо1. Ме!к. 177:191-198.
19. 8тйк, В.А., апб С. ВадНот. 1987. 1. Вю1. Скет. 262:6951-6954.
20. Сакрат, А., е! а1. 1999. Сапсег Век. 59:2917-2923.
21. Абегка, Ό., е! а1. 1998. 1. Скп. ^ек!. 101:650-659.
22. Табадка, Б.А., е! а1. 1991. Ргос. Асаб. 8ск И8А. 88:9292-9296.
23. Бик, С.К., апб Т.Р. Таппоск. 1989. 1. Νη11. Сапсег Шк!. 81:55-59.
24. 8е11а, А., е! а1. 1995. Сапсег Вю!кег. 10:225-235.
25. Вгей, 1., е! а1. 1989. 1. Ехр. Меб. 169:1977-1991.
26. Со1бЫ1ит, 8.Е., апб №.Б. 8ип. 1990. Ат. 1. РкукюБ 258:Б57-67.
27. С1аикк, М, е! а1. 1992. Моби1абоп о£ епбо!кека1 се11 кеток!а!1с ргорегкек Ыу ΤΝΡ: тк1дк!к т!о !ке го1е о£ епбо!ке1шт т !ке кок! гекропке !о шйатта!огу кбтик. Ш Титоиг песгокщ £ас!огк: !ке то1еси1ек апб (Ней етегдшд го1ек ш тебюте. В. Веибег, ебйог, Ватеп Ргекк, №те Уогк. 49-63.
28. Сигшк, Р., е! а1. 2002. Сапсег Век.:62:867-874.
29. Агар, №., е! а1. 1998. 8с1епсе. 279:377-380.

Claims (25)

1. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат цитокина и опухоле-нацеливающий модуль (ТТМ) и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель, отличающаяся тем, что цитокин присутствует в количестве, которое не вызывает механизмов негативных ответных реакций.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что цитокин присутствует в количестве, которое не вызывает выпадения растворимого цитокинового рецептора.
3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что конъюгат присутствует в количестве, обеспечивающем дозирование в интервале от 0,5 до 500 нг/кг.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что конъюгат присутствует в количестве, обеспечивающем дозирование в интервале от 1 до 50 нг/кг.
5. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что конъюгат присутствует в количестве, обеспечивающем дозирование в интервале от 5 до 15 нг/кг.
6. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что конъюгат присутствует в таком количестве, чтобы конъюгат или его метаболит поступал в плазму крови пациента, подвергнутого лечению, в количестве не более чем около 35000 нг/день для пациента с массой 70 кг.
7. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что цитокин является воспалительным цитокином.
8. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что цитокин является химиотерапевтическим цитокином.
9. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что цитокин является ΤΝΡα, ΤΝΡβ, [ΓΝα, ^Νβ, ^Νγ, ^-1, 2, 4, 6, 12, 15, ЕМАР II, сосудистым эндотелиальным фактором роста (УЕСР), РЦСР, РБ-ЕССР или хемокином.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, отличающаяся тем, что цитокин является ΤΝΕα, ΤΝ£β или ^Νγ.
11. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что ТТМ является опухолевым сосудистым нацеливающим модулем (ΤУΤМ).
12. Фармацевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что ΤУΤМ является связывающим партнером опухолевого сосудистого рецептора, маркера или другого внеклеточного компонента.
13. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что ТТМ является
- 63 007396 связывающим партнером опухолевого рецептора, маркера или другого внеклеточного компонента.
14. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что ТТМ является антителом, или лигандом, или его фрагментом.
15. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что ТТМ содержит ΝΟΚ или ΒΟΌ звено, или представляет Н1У-1а1, аннексин V, остеопонтин, фибронектин, коллаген типа I или IV, гиалуронат, эфрин, или является связывающим партнером онкофетального фибронектина; или его фрагмент.
16. Фармацевтическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что ТТМ содержит ΝΟΚ звено.
17. Фармацевтическая композиция по п.16, отличающаяся тем, что ТТМ является ΟΝΟΚΟνδΟΟΛΟΚϋ, ΝΟΚΑΗΑ, ΟΝΟΚΟ, циклоСУЬ^КМЕС, линейным или циклическим ΟΝΟΚϋ.
18. Фармацевтическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что ТТМ содержит ΝΟΚ звено.
19. Фармацевтическая композиция по п.14, отличающаяся тем, что ТТМ нацеливается к νΕΟΡΚ, 1САМ 1, 2 или 3, РЕСАМ-1, СБ31, СБ13, VСΑΜ-1, селектину, Αοΐ ΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ, ΑοΐΚΙΒ, СБ44, аминопептидазе А, аминопептидазе Ν (СБ13), ανβ3 интегрину, ανβ5 интегрину, ΡΟΡ-1, 2, 3, или 4, ΙΡ1Κ, ΕΡΗΚ, ММР, ΝΟ2, тенасцину, онкофетальному фибронектину, ΡΌ-ЕСОРВ, ΤΝΡΚ, ΡΌΟΡΚ или Ρ8ΜΑ.
20. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что конъюгат представлен в форме слитого белка.
21. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-19, отличающаяся тем, что конъюгат представлен в форме нуклеиновой кислоты.
22. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит другой противоопухолевый агент или диагностическое опухолевизуализирующее вещество.
23. Фармацевтическая композиция по п.22, отличающаяся тем, что другим противоопухолевым агентом является доксорубицин, мелфалан или цисплатин.
24. Применение конъюгата, как он определен в любом из предыдущих пунктов, или фармацевтической композиции по любому из предыдущих пунктов для получения медикамента для лечения или диагностики рака.
25. Способ лечения или диагностики рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или диагностике, конъюгата, как он определен в любом из пп.1-23, или фармацевтической композиции по любому из пп.1-23 в эффективном количестве, отличающийся тем, что указанное количество не вызывает механизма негативной ответной реакции.
EA200401446A 2002-04-30 2003-04-30 Иммуноконъюгаты для лечения опухолей EA007396B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0209896A GB0209896D0 (en) 2002-04-30 2002-04-30 Conjugate
PCT/IB2003/002187 WO2003093478A1 (en) 2002-04-30 2003-04-30 Immunoconjugates for the treatment of tumours

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401446A1 EA200401446A1 (ru) 2005-06-30
EA007396B1 true EA007396B1 (ru) 2006-10-27

Family

ID=9935816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401446A EA007396B1 (ru) 2002-04-30 2003-04-30 Иммуноконъюгаты для лечения опухолей

Country Status (19)

Country Link
US (3) US20050033026A1 (ru)
EP (1) EP1499730B1 (ru)
JP (1) JP4656937B2 (ru)
KR (1) KR20050007359A (ru)
CN (1) CN1665933B (ru)
AU (1) AU2003228057B2 (ru)
CA (1) CA2462879A1 (ru)
CY (1) CY1114730T1 (ru)
DK (1) DK1499730T3 (ru)
EA (1) EA007396B1 (ru)
ES (1) ES2441193T3 (ru)
GB (1) GB0209896D0 (ru)
HK (1) HK1072443A1 (ru)
IL (1) IL164896A (ru)
NO (1) NO332827B1 (ru)
PT (1) PT1499730E (ru)
SI (1) SI1499730T1 (ru)
WO (1) WO2003093478A1 (ru)
ZA (1) ZA200408767B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2649368C2 (ru) * 2007-10-30 2018-04-02 Филоджен С.П.А. Антиген, ассоциированный с ревматоидным артритом

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA011859B9 (ru) * 2004-01-05 2013-07-30 Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп. Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени
CN101124243A (zh) * 2004-12-23 2008-02-13 莫尔梅德股份有限公司 缀合产物
US7723472B2 (en) * 2005-02-28 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Extracellular matrix binding chimeric proteins and methods of use thereof
KR100835879B1 (ko) * 2006-10-10 2008-06-09 학교법인 한림대학교 아넥신 융합 단백질
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
GB0708864D0 (en) * 2007-05-08 2007-06-13 Molmed Spa Cytokine Conjugate
WO2009001219A2 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Philogen S.P.A Immunocytokines for cancer treatment in combination with chemotherapeutic agents
GB0803076D0 (en) * 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
DK2297304T3 (da) * 2008-05-07 2017-11-06 Bone Therapeutics Sa Humane knogledannende celler til behandling af tilstande og knoglesygdomme forbundet med immunodefekt eller immunsuppression
EA201791940A3 (ru) 2008-11-26 2018-04-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора iib активина и их использование
WO2010078916A1 (en) * 2008-12-19 2010-07-15 Philogen S.P.A. Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents
WO2011027980A2 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University Tumor cell-killing peptides
US20150359850A1 (en) 2009-11-25 2015-12-17 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an anti-activin-a compound to a subject
SG10201605027XA (en) 2011-12-19 2016-08-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
CA2873112A1 (en) * 2012-05-11 2013-11-14 Alexander Krantz Site-specific labeling and targeted delivery of proteins for the treatment of cancer
EP2903629B1 (en) 2012-10-03 2019-07-10 Philogen S.p.A. Antibody conjugate for use in treating inflammatory bowel disease
TWI602577B (zh) * 2015-08-27 2017-10-21 國立陽明大學 雙重標靶融合蛋白
CN105622759A (zh) * 2016-01-04 2016-06-01 深圳精准医疗科技有限公司 IL-12/CD107a融合蛋白增强CTL抗肿瘤效果的治疗剂及其制法和用途
WO2017194782A2 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Therapeutic targeting of non-cellular structures
WO2018067879A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
EP3886913A4 (en) * 2018-11-30 2023-01-11 Prism | Proteogenomics Research Institute for Systems Medicine IMPROVED TARGETED DELIVERY OF THERAPEUTICS
CN117683140A (zh) * 2022-09-09 2024-03-12 北京昌平实验室 肿瘤靶向的以白介素2为活性成分的融合蛋白型药物前体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0396387A2 (en) * 1989-05-05 1990-11-07 Research Development Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
WO1992008495A1 (en) * 1990-11-09 1992-05-29 Abbott Biotech, Inc. Cytokine immunoconjugates

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2005A (en) * 1841-03-16 Improvement in the manner of constructing molds for casting butt-hinges
US2006A (en) * 1841-03-16 Clamp for crimping leather
US4578079A (en) * 1982-08-04 1986-03-25 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
DE3423234A1 (de) 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
US4650674A (en) 1984-07-05 1987-03-17 Genentech, Inc. Synergistic cytotoxic composition
US4988621A (en) * 1985-05-24 1991-01-29 La Jolla Cancer Research Foundation Peptides in cell detachment and aggregation
US4879237A (en) * 1985-05-24 1989-11-07 La Jolla Cancer Research Foundation Use of peptides in control of cell attachment and detachment
US5547936A (en) * 1985-06-17 1996-08-20 La Jolla Cancer Research Foundation Inhibition of cell migration with synthetic peptides
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4863713A (en) 1986-06-23 1989-09-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents
DE3716513A1 (de) * 1987-05-16 1988-11-24 Basf Ag Proteine mit tnf-wirkung
US5214131A (en) * 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
US5091176A (en) * 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
AU5342290A (en) 1989-03-15 1990-10-09 David R. Kaplan Cd8-based pharmaceuticals
US5120829A (en) * 1989-03-20 1992-06-09 La Jolla Cancer Research Foundation Hydrophobic attachment site for adhesion peptides
US5498694A (en) * 1989-05-25 1996-03-12 La Jolla Cancer Research Foundation Peptides of the cytoplasmic domain of integrin
US5169930A (en) * 1990-01-05 1992-12-08 La Jolla Cancer Research Foundation Fibronectin receptor
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5672585A (en) * 1990-04-06 1997-09-30 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5612311A (en) * 1990-04-06 1997-03-18 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5648330A (en) * 1990-04-06 1997-07-15 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating vascular graft occlusion
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
IT1245748B (it) 1990-12-21 1994-10-14 Mini Ricerca Scient Tecnolog Preparazione includente anticorpi monoclonali biotinilati, avidina e biotina, per la diagnosi di affezioni tumorali e suo impiego
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5811512A (en) * 1991-08-22 1998-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-peptide peptidomimetics and related cyclic hexapeptides
US5258517A (en) 1992-08-06 1993-11-02 Sepracor, Inc. Method of preparing optically pure precursors of paroxetine
US5536814A (en) * 1993-09-27 1996-07-16 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
WO1995015979A1 (en) 1993-12-07 1995-06-15 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
JP2820016B2 (ja) 1993-12-28 1998-11-05 日本電気株式会社 電子回路
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5888814A (en) 1994-06-06 1999-03-30 Chiron Corporation Recombinant host cells encoding TNF proteins
AU3374795A (en) * 1994-08-29 1996-03-22 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
EP0833665A1 (en) 1995-05-16 1998-04-08 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment
US5811388A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Cibus Pharmaceutical, Inc. Delivery of drugs to the lower GI tract
US5891418A (en) * 1995-06-07 1999-04-06 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical constructs and applications
US5817750A (en) 1995-08-28 1998-10-06 La Jolla Cancer Research Foundation Structural mimics of RGD-binding sites
UY24367A1 (es) 1995-11-23 2000-10-31 Boehringer Ingelheim Int Vacunas contra tumores y procedimiento para su produccion
WO1998010795A2 (en) 1996-09-10 1998-03-19 The Burnham Institute Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same
US6576239B1 (en) 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6180084B1 (en) * 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
EP1015884B1 (en) 1997-09-10 2008-08-06 The Burnham Institute Methods of identifying molecules that home to angiogenic vasculature in tumors
WO2000009143A1 (en) * 1998-08-13 2000-02-24 G.D. Searle & Co. Multivalent avb3 and metastasis-associated receptor ligands
DK1156823T3 (da) * 1999-02-12 2009-01-19 Scripps Research Inst Fremgangsmåder til behandling af tumorer og metastaser ved anvendelse af en kombination af anti-angiogene terapier og immunoterapier
US7309694B2 (en) * 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
US7109303B2 (en) 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
AU2001239470A1 (en) * 2000-02-24 2001-09-03 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
EP1297112A2 (en) * 2000-05-22 2003-04-02 PHARMACIA &amp; UPJOHN COMPANY Novel matrix metalloproteinases
CA2414650A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Isolation of a cell-specific internalizing peptide that infiltrates tumor tissue for targeted drug delivery
EP1217070A1 (en) 2000-12-22 2002-06-26 CellGenix Technologie Transfer GmbH Selective cytotoxic fusion proteins
US20030077818A1 (en) * 2001-03-08 2003-04-24 Dickerson Erin B. Compositions and methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium
US20040110933A1 (en) * 2002-09-13 2004-06-10 Dyax Corporation CD44-binding ligands

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0396387A2 (en) * 1989-05-05 1990-11-07 Research Development Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
WO1992008495A1 (en) * 1990-11-09 1992-05-29 Abbott Biotech, Inc. Cytokine immunoconjugates
EP1149913A1 (en) * 1990-11-09 2001-10-31 GILLIES, Stephen D. Cytokine immunoconjugates

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PIETERZ G.A. ET AL.: "IN VITRO AND IN VIVO EVLUATION OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR-ALPHA (HTNFALPHA) CHEMICALLY CONJUGATED TO MONOCLONAL ANTIBODY", JOURNAL OF DRUG TARGETING, HARWOOD ACADEMIC PUBLISHERS GMBH, DE, vol. 5, no. 2, 1997, pages 109-120, XP009015282, ISSN: 1061-186X, page 112, left-hand column, line 31 - line 35 page 117, left-hand column, line 6 - line 12 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2649368C2 (ru) * 2007-10-30 2018-04-02 Филоджен С.П.А. Антиген, ассоциированный с ревматоидным артритом

Also Published As

Publication number Publication date
KR20050007359A (ko) 2005-01-17
IL164896A0 (en) 2005-12-18
DK1499730T3 (da) 2014-01-13
US20160074537A1 (en) 2016-03-17
NO20045237L (no) 2005-01-28
WO2003093478A9 (en) 2004-12-09
CA2462879A1 (en) 2003-11-13
ZA200408767B (en) 2006-12-27
US20100310506A1 (en) 2010-12-09
EA200401446A1 (ru) 2005-06-30
US20050033026A1 (en) 2005-02-10
US9119886B2 (en) 2015-09-01
EP1499730B1 (en) 2013-10-02
ES2441193T3 (es) 2014-02-03
NO332827B1 (no) 2013-01-21
US9782496B2 (en) 2017-10-10
AU2003228057A1 (en) 2003-11-17
HK1072443A1 (en) 2005-08-26
EP1499730A1 (en) 2005-01-26
WO2003093478A1 (en) 2003-11-13
JP2005526117A (ja) 2005-09-02
JP4656937B2 (ja) 2011-03-23
CN1665933B (zh) 2010-05-26
GB0209896D0 (en) 2002-06-05
AU2003228057B2 (en) 2008-08-28
CN1665933A (zh) 2005-09-07
SI1499730T1 (sl) 2014-02-28
CY1114730T1 (el) 2016-10-05
IL164896A (en) 2012-04-30
PT1499730E (pt) 2013-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007396B1 (ru) Иммуноконъюгаты для лечения опухолей
EA009955B1 (ru) Слияние цитокинов и опухоленацеливающих белков
AU2020200975B2 (en) New stable antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof
US7795386B2 (en) Peptides comprising an isoDGR motif
US20100069303A1 (en) Methods of treating bone disease using vascular endothelial growth factor fusion constructs
ES2575160T3 (es) Inhibidores de las interacciones que unen la subunidad alfa de la beta integrina-proteína G
US20100168038A1 (en) Use of compounds in combination with gamma-irradiation for the treatment of cancer
US20220008513A1 (en) Combined treatment of primary central nervous system lymphoma
US20220048973A1 (en) B1SP Fusion Protein Therapeutics, Methods, and Uses
WO2008152508A2 (en) Cytokine conjugate
US9561289B2 (en) Peptides for inhibiting tumor growth
Ngambenjawong Development and Optimization of Peptide-Based, Tumor-Associated Macrophage (TAM)-Targeting Therapeutics

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU