EA009955B1 - Слияние цитокинов и опухоленацеливающих белков - Google Patents

Слияние цитокинов и опухоленацеливающих белков Download PDF

Info

Publication number
EA009955B1
EA009955B1 EA200401447A EA200401447A EA009955B1 EA 009955 B1 EA009955 B1 EA 009955B1 EA 200401447 A EA200401447 A EA 200401447A EA 200401447 A EA200401447 A EA 200401447A EA 009955 B1 EA009955 B1 EA 009955B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ligand
τνρ
tumor
ιρν
chemokine
Prior art date
Application number
EA200401447A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401447A1 (ru
Inventor
Анджело Корти
Флавио Курнис
Original Assignee
МОЛМЕД СпА
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by МОЛМЕД СпА filed Critical МОЛМЕД СпА
Publication of EA200401447A1 publication Critical patent/EA200401447A1/ru
Publication of EA009955B1 publication Critical patent/EA009955B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Конъюгат цитокина и опухоленацеливающего модуля (ТТМ), при условии, что, когда цитокин является TNF-α, TNF-β или IFN-γ, ТТМ является другим, чем лиганд CD13; когда цитокин является IL-12, ТТМ является другим, чем антитело к фибронектину; когда цитокин является TNF, ТТМ является другим, чем антитело к трансферриновому рецептору; и, когда цитокин является TNF, IFN-γ или IL-2, ТТМ является другим, чем антитело к TAG72 антигену.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции и ее использованию.
Предпосылки создания изобретения
Рост опухоли и масса представляют главные ограничивающие факторы для успешной иммунотерапии. Хирургическое лечение, химиотерапия и лучевое лечение используются обычно для уменьшения размеров опухолей с различным успехом, зависящим от локализации опухоли, ее диффузии и собственной устойчивости к лечению. Несмотря на измеримое улучшение в выживаемости пациентов, эти традиционные методы все еще имеют заметные недостатки. Уменьшение объема опухоли с помощью хирургии может быть эффективным при удалении первичной опухолевой массы, но является ограниченно пригодным при распространенных метастатических опухолях. С другой стороны, химиотерапия может быть связана с риском выбора резистентных вариантов, которые затем становятся неизлечимыми. Кроме того, химиотерапия обычно очень токсична для пациентов и имеет сильные иммунодепрессивные эффекты. По этим причинам необходимо развивать новые подходы к лечению рака, основанные на различных принципах, обладающие низкой токсичностью и высокой эффективностью в искоренении распространенных поражений.
Противоопухолевая активность некоторых цитокинов описана. Некоторые цитокины уже используются для лечения людей. Например, цитокины, такие как 1Ь-2 и ΙΕΝ-γ, показали хорошую противоопухолевую активность у пациентов с различными типами опухолей, такими как метастатическая карцинома почки, лейкоз ворсистых клеток, саркома Капоши, меланома, множественная миелома и похожие. Другие цитокины, подобные ΙΕΝβ, фактору некроза опухоли (ΤΝΕ)α, ΤΝΕβ, 1Ь-1, 4, 6, 12, 15 и колониестимулирующим факторам (С8Е§), показали определенную противоопухолевую активность на некоторых типах опухолей.
Вообще, терапевтическое использование цитокинов сильно ограничено их системной токсичностью. ΤΝΕ, например, был первоначально обнаружен по его способности вызывать геморрагический некроз некоторых опухолей и по его ίη νίίΓΟ цитотоксическому эффекту на различных опухолевых линиях, но впоследствии доказали, что он имеет сильную провоспалительную активность, которая может, при определенных условиях, нанести серьезный вред телу человека.
Поскольку системная токсичность является основной проблемой в использовании фармакологически активных количеств цитокинов у человека, оцениваются новые производные и терапевтические стратегии, направленные на уменьшение токсических эффектов этого класса биологических действующих веществ при сохранении их терапевтической эффективности.
Некоторые новые подходы направлены на:
a) создание слитых белков, которые могут доставлять ΤΝΕ в опухоль и повышать местную концентрацию. Например, были получены слитые белки, состоящие из ΤΝΕ и опухолево-специфичных антител;
b) разработка мутантов ΤΝΕ, которые сохраняют противоопухолевую активность и имеют пониженную системную токсичность. Таким образом, были получены мутанты, способные селективно распознавать только один рецептор;
c) использование анти-ΤΝΕ антител, способных понижать некоторые токсические эффекты ΤΝΕ без изменения его противоопухолевой активности. Такие антитела уже описаны в литературе;
ά) использование производных ΤΝΕ с повышенным периодом полураспада (например, ΤΝΕ, конъюгированный с полиэтиленгликолем).
В ЕР 251494 раскрыта система для ведения диагностического или терапевтического агента, которая содержит антитело, конъюгированное с авидином или стрептавидином, агент, способствующий комплексообразованию конъюгированного антитела, и вещество, состоящее из диагностического или терапевтического агента, конъюгированного с биотином, которые вводили последовательно и в достаточной мере медленно для того, чтобы сделать возможной локализацию терапевтического или диагностического агента через биотин-стрептавидиновое взаимодействие на клетке-мишени, распознаваемой антителом. Описанные терапевтические или диагностические агенты содержат хелаты металлов, в частности хелаты радионуклидов, и низкомолекулярные противоопухолевые агенты, такие как цисплатин, доксорубицин, и т.д.
В ЕР 496074 раскрыт способ, который предлагает последовательное введение биотинилированного антитела, авидина или стрептавидина и биотинилированного диагностического или терапевтического агента. Хотя, в общем, указывается цитотоксичность агентов, подобных рицину, заявка, главным образом, относится к радиолабильным соединениям.
В \УО 95/15979 раскрыт способ локализации высокотоксичных агентов на клеточных мишенях, основанный на введении первого конъюгата, содержащего специфическую молекулу-мишень, конъюгированную с лигандом или антилигандом, с последующим введением второго конъюгата, состоящего из токсичного агента, связанного с антилигандом или лигандом.
В \УО 99/13329 раскрыт способ направления молекулы к опухолевым ангиогенным сосудам, основанный на конъюгации указанной молекулы с лигандами ΝΟΚ рецепторов. В качестве возможных кандидатов рассматривался ряд молекул, но подробно описан только доксорубицин. Не раскрыто использование лигандов ΝΟΚ рецепторов в качестве носителей цитокинов для вызова иммунного ответа.
- 1 009955
В \νϋ 01/61017 изобретатель описывает, как неожиданно он нашел, что терапевтический показатель определенных цитокинов может быть значительно улучшен и их иммунотерапевтические свойства могут быть усилены путем связывания с лигандом рецептора Ν-аминопептидазы (СЭ 13). СЭ 13 является трансмембранным гликопротеином в 150 кДа, который хорошо сохраняется в различных видах. Его экспрессировали на нормальных клетках, а также в миелоидные опухолевые линии, в ангиогенный эндотелий и некоторый эпителий. ί.Ό13 рецептор обычно идентифицируется как ΝΟΚ рецептор, так как его пептидные лиганды разделяют аминокислоты звена ΝΟΒ.
На1ш С. е! а1. (2002) №Шгс Вю1ес1шо1оду 20: 264-269 описывают слитый белок, состоящий из 1Ь-12, слитый с фрагментом человеческого антитела, специфичного к ΕΌ-Β домену фибронектина. Сагпето11а с1 а1. (2002) В1ооб 99 (5): 1659-65 описывают слитый белок из 1Ь-2 и антитела к ΕΌ-Β.
СоШ А. е! а1. (1998) Сапсег Векеатсй 58: 3866-3872 раскрывают непрямой подход или преварительно нацеливающий подход к хомингу ΤΝΕ к опухолям, включающий предварительное нацеливание опухоли с биотинилированными антителами и авидином или стрептавидином с последующей замедленной доставкой биотинилированного ΤΝΕ.
НоодепЬоот е! а1. (1991) Мо1. 1ттипо1. 28: 1027-1037 описывают слитый белок, сконструированный путем слияния части тяжелой цепи гена антитрансферринового рецептора тАЬ с ΤΝΕ-α геном. Уапд е! а1. (1995) Нит. АпйЬоб. НуЬгоботак 6: 129-136 описывают слияние Ν-конца ΤΝΕ с С-концом шарнирной области тАЬ против опухолеассоциированного ΤΛΟ72 антигена, экспрессируемого колоректальной аденокарциномой, аденокарциномами желудка и яичника. Уапд е! а1. (1995) Мо1. 1ттипо1. 32: 873-881 описывают получение моновалентного Εν-ΤΝΕ слитого белка с ΤΛС72 антигеном. Насколько нам известно, не сообщалось никаких данных об активности этих конъюгатов ш νί\Ό.
Х1апд е! а1. (1993) Сапсег Вю1йет. 8: 327-337 описывают рекомбинантную бифункциональную молекулу одноцепочечного Εν, направленную к ΤА672 и ΙΕΝ-γ; и Х1апд е! а1. (1994) 1ттип. Се11 Вю1. 72: 275285 описывают рекомбинантную бифункциональную молекулу одноцепочечного Εν, направленную к ΤА672 и Ш-2.
Однако остается потребность в дальнейшем и в улучшенных фармацевтических композициях и в способах лечения и диагностики рака.
Мы нашли, что концепция нацеленной доставки цитокинов является широко применимой и неожиданно увеличивает терапевтический индекс химиотерапевтических лекарственных средств. Вследствие сложности мультивалентных взаимодействий, необходимых для работы этих конъюгатов (нацеливающий рецептор, ΤΝΕ рецепторы), не очевидно, что сосудистые рецепторы, отличные от СЭ13. могут работать.
Изложение изобретения
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предлагается конъюгат цитокина и опухоленацеливающего модуля (ТТМ), при условии, что, когда цитокин является ΤΝΕ-α, ΤΝΕ-β или ΙΕΝ-γ, ТТМ является другим, чем ί.Ό13 лиганд; когда цитокин является 1Ь-2 или 1Ь-12, ТТМ является другим, чем антитело к фибронектину; когда цитокин является ΤΝΕ, ТТМ является другим, чем антитело к трансферриновому рецептору; когда цитокин является ΤΝΕ, ΙΕΝ-γ или 1Ь-2, ТТМ является другим, чем антитело к ΤΛС72 антигену; когда цитокин является ΙΕΝ, ТТМ является другим, чем лиганд ανβ3 интегрина; когда цитокин является ΤΝΕ, ТТМ является другим, чем фибронектин.
В другом варианте осуществления конъюгат является небиотинилированным ΤΝΕ.
Предпочтительно цитокин является воспалительным цитокином.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения цитокин является химиотерапевтическим цитокином.
Предпочтительно цитокин является ΤΝΕα, ΤΝΕβ, ΙΕΝα, ΙΕΝβ, ΙΕΝγ, 1Ь-1, 2, 4, 6, 12, 15, ЕМАР II, сосудистым эндотелиальным фактором роста (УЕОЕ), ΡΌΟΕ, ΡΌ-ЕСОЕ или хемокином.
В одном варианте осуществления изобретения цитокин представляет собой ΤΝΕα, ΤΝΕβ или ΙΕΝγ.
Соединение-мишень может быть экспрессированно либо на поверхности эндотелиальных клеток опухолевых сосудов, либо во внеклеточном матриксе в тесном контакте или по соседству с эндотелиальными клетками.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ является опухолево-сосудистым нацеливающим модулем (ΤνΤΜ).
В другом варианте осуществления изобретения ΤνΤΜ является связывающим партнером опухолевого сосудистого рецептора, маркера или другого внеклеточного компонента.
В другом варианте осуществления изобретения ТТМ является связывающим партнером опухолевого рецептора, маркера или другого внеклеточного компонента.
В другом варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой антитело или лиганд или их фрагменты.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит ΝΟΒ или ΒΟΌ звено, или представляет собой НШ-!а!, аннексин V, остеопонтин, фибронектин, коллаген типа Ι или Ιν, гиалуронат, эфрин, или является связывающим партнером к онкофетальному фибронектину, или представляет собой их фрагменты. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ является другим, чем НШ-1а!.
- 2 009955
В предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит Ν0Β звено.
Предпочтительно ТТМ представляет собой ί.’ΝΟΚί.’ν8Οί.ΆΟΚί.’. Ν6ΚΑΗΆ, ΟΝΟΒΟ.
циклоСV^N^ΚМЕС. линейный или циклический ΟΝΟΚΠ.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит ΚΟΌ звено.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ нацелен на УЕСЕВ. 1САМ 1. 2 или 3. РЕСАМ1. С.П31. С.П13. VСΑМ-1. селектин. Ас1ВП. Ас4ВПВ. Ас4В1. Ас4В1В. С.П44. аминопептидазу А. аминопептидазу N (СП13). ανβ3 интегрин. ανβ5 интегрин. ЕСЕ-1. 2. 3. или 4. 1Б-1В. ЕРНЕ. ММР. N02. тенасцин. онкофетальный фибронектин. ΡΌ-ЕССЕВ. ΤΝΕΒ. ΡΌ6ΕΒ или Р8МА. В другом варианте осуществления изобретения ТТМ не нацелен на УЕСЕВ.
Предпочтительно конъюгат представлен в форме слитого белка.
В другом варианте осуществления изобретения конъюгат представлен в форме нуклеиновой кислоты. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается вектор экспрессии. содержащий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается клетка-хозяин. трансформированная вектором экспрессии по настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается способ получения конъюгата. включающий культивирование заявленной клетки-хозяина при условиях. обеспечивающих экспрессию конъюгата.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция. содержащая конъюгат по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. разбавитель или наполнитель.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит другой противоопухолевый агент или диагностическое опухолевизуализирующее вещество.
Предпочтительно другим противоопухолевым агентом является доксорубицин или мелфалан.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предлагается использование конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения медикамента для лечения или диагностики рака.
Предлагая другой путь. настоящее изобретение предлагает способ лечения или диагностики рака. включающий введение пациенту. нуждающемуся в таком лечении или диагностике. эффективного количества конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Комбинации предпочтительных нацеливающих модулей и цитокинов. которые могут использоваться в настоящем изобретении. приведены в нижеследующей табл. А.
Таблица А
Цитокин Нацеливающий модуль
ΙΡΝ-α КСЮ- содержащий пептид
ΙΡΝ-β КСЮ- содержащий пептид
1Ъ-2 КСЮ- содержащий пептид
1Ь-12 КСЮ- содержащий пептид
ЕМАРII КСЮ- содержащий пептид
УЕОР КСЮ- содержащий пептид
1Ь-1 КСЮ- содержащий пептид
ΙΕ-6 КСЮ- содержащий пептид
1Ы2 КСЮ- содержащий пептид
РГХЗР КСЮ- содержащий пептид
РО-ЕСОР КСЮ- содержащий пептид
СХС хемокин КСЮ- содержащий пептид
СС хемокин КСЮ- содержащий пептид
С хемокин КСЮ- содержащий пептид
1Ь-15 КСЮ- содержащий пептид
ΤΝΡ-α ΝΟΚ- содержащий пептид
ΤΝΡ-β ΝΟΚ- содержащий пептид ί
ΙΡΝ-α ΝΟΚ- содержащий пептид
ΙΡΝ-β Ν6Κ- содержащий пептид
ΙΡΝ-γ ΝΟΚ- содержащий пептид
1Ь-2 ΝΟΚ- содержащий пептид
ΙΕ-12 ΝΟΚ- содержащий пептид
- 3 009955
ΕΜΑΡ 11 ΝΟΚ- содержащий пептид
УЕОР ΝΟΚ- содержащий пептид
1Ь-1 ΝΟΚ- содержащий пептид
1Ь-6 ΝΟΚ- содержащий пептид
1Ь-12 ΝΟΚ- содержащий пептид
ΡϋΟΡ ΝΟΚ- содержащий пептид
Ρϋ-ЕССР ΝΟΚ- содержащий пептид
СХС хемокин ΝΟΚ- содержащий пептид
СС хемокин ΝΟΚ- содержащий пептид
С хемокин ΝΟΚ- содержащий пептид
1Ь-15 ΝΟΚ- содержащий пептид
ΤΝΡ-α Лиганд УЕОРК
ΤΝΡ-β Лиганд УЕОРК
ΙΡΝ-α Лиганд νΕΟΡΚ
ΙΕΝ-β Лиганд νΕΟΡΚ
ΙΡΝ-γ Лиганд УЕОРК
Ш-2 Лиганд νΕΟΡΚ
1Б-12 Лиганд νΕΟΡΚ
ΕΜΑΡ II Лиганд νΕΟΡΚ
νΕΟΡ Лиганд νΕΟΡΚ
1Ь-1 Лиганд νΕΟΡΚ
1Ь-6 Лиганд νΕΟΡΚ
1Ь-12 Лиганд νΕΟΡΚ
ΡϋΟΡ Лиганд νΕΟΡΚ
Р0-ЕС6Г Лиганд УЕОЕК
СХС хемокин Лиганд νΕΟΡΚ
СС хемокин Лиганд νΕΟΡΚ
С хемокин Лиганд νΕΟΡΚ
1Ь-15 Лиганд УЕОРК
ΤΝΡ-α Ат к νΕΟΡΚ
ΤΝΓ-β Ат к УЕОРК
ΙΡΝ-α Ат к νΕΟΡΚ
ΙΡΝ-β АткνΕΟΡΚ
ΙΓΝ-γ Ат к νΕΟΡΚ
Ιί-2 Ат к νΕΟΡΚ
1Б-12 Ат к νΕΟΡΚ
ΕΜΑΡ II Ат к νΕΟΡΚ
νΕΟΡ Ат к УЕОРК
1Ь-1 Ат к УЕОРК
1Ь-6 АткνΕΟΡΚ
1Ь-12 Ат к νΕΟΡΚ
РЭОР Ат к νΕΟΡΚ
ΡΏ-ЕСОР Ат к νΕΟΡΚ
СХС хемокин Ат к УЕОРК
СС хемокин Ат к УЕОРК
С хемокин Ат к νΕΟΡΚ
1Ь-15 Ат к νΕΟΡΚ
ΤΝΡ-α Ηΐν-ί3ί
- 4 009955
ΤΝΡ-β Н1У-1а1
ΙΡΝ-α Ηΐν-ίαΐ
ΙΡΝ-β Ηΐν-ΐαί
ΙΡΝ-γ Ηΐν-ί3ΐ
11,-2 Н1У-1а1
1Б-12 Н1У-1а1
ΕΜΑΡΙΙ Ηΐν-ΐειΐ
УЕ6Р Ηΐν-ίαί
1Ь-1 ΗΙΥ-ίαΙ
11,-6 Ηΐν-ίϋΙ
11,-12 Ηΐν-ΟΙ
ΡϋΟΡ Ηΐν-ΐ3ί
РЭ-ЕСОР Ηΐν-ί3ί
СХС хемокин Ηΐν-Ι3ί
СС хемокин Ηΐν-ΐ3ΐ
С хемокин ШУ-таГ
11,-15 Ηΐν-ίβΙ
ΤΝΡ-α Лигзнд 1САМ 1,2 или 3
ΤΝΡ-β Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΙΡΝ-α Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΙΡΝ-β Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΙΡΝ-γ Лиганд 1САМ 1,2 или 3
ΙΕ-2 Лиганд 1САМ 1,2 или 3
11,-12 Лиганд 1САМ 1,2 или 3
- 5 009955
Ρϋ-ЕССР Ат к 1САМ 1,2 или 3
СХС хемокин Ат к 1САМ 1,2 или 3
СС хемокин Ат к 1САМ 1,2 или 3
С хемокин Ат к 1САМ 1,2 или 3
1Б-15 Ат к 1САМ 1,2 или 3
ΤΝΡ-α Лиганд РЕСАМ-1/СО31
ΤΝΡ-β Лиганд РЕСАМ-1/СО31
ΙΕΝ-α Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΙΡΝ-β Лиганд РЕСАМ-1/СО31
ΙΡΝ-γ Лиганд РЕСАМ-1 /СОЗ 1
Ιί-2 Лиганд РЕСАМ-1/СО31
1Б-12 Лиганд РЕСАМ-1/СО31
ΕΜΑΡII Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
УЕСР Лиганд РЕСАМ-1 /СОЗ 1
1Ы Лиганд РЕСАМ-1/СО31
1Ь-6 Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Ш-12 Лиганд РЕСАМ-1/СО31
ΡϋΟΡ Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
Ρϋ-ЕСОР Лиганд РЕСАМ-1/СО31
СХС хемокин Лиганд РЕСАМ-1/СО31
СС хемокин Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
С хемокин Лиганд РЕСАМ-1/СОЗ 1
ΙΕ-15 Лиганд РЕСАМ-1/СО31
ΤΝΡ-α Ат к РЕСАМ-1/СО31
ΤΝΡ-β Ат к РЕСАМ-1/СО31
ΙΡΝ-α Ат к РЕСАМ-1/СО31
ΙΡΝ-β Ат к РЕСАМ-1/СО31
ΙΡΝ-γ Ат к РЕСАМ-1/СО31
Ш-2 Ат к РЕСАМ-1/СО31
1Ь-12 АткРЕСАМ-1/СО31
ΕΜΑΡ II АткРЕСАМ-1/СО31
УЕСР АткРЕСАМ-1/СО31
Ш-1 АткРЕСАМ-1/СО31
Ш-6 Ат к РЕСАМ-1/СО31
ΙΕ-12 АткРЕСАМ-1/СО31
роср Ат к РЕСАМ-1/СОЗ 1
РО-ЕССР Ат к РЕСАМ-1/СО31
СХС хемокин Ат к РЕСАМ-1/СО31
СС хемокин АткРЕСАМ-1/СО31
С хемокин Ат к РЕСАМ-1/СО31
ΙΕ-15 АткРЕСАМ-1/СО31
ΤΝΡ-α Лиганд УСАМ-1
ΤΝΡ-β Лиганд УСАМ-!
ΙΡΝ-α Лиганд УСАМ-1
ΙΡΝ-β Лиганд УСАМ-1
ΙΡΝ-γ Лиганд УСАМ-1
Ш-2 Лиганд УСАМ-1
ΙΕ-12 Лиганд УСАМ-1
- 6 009955
ЕМАР 11 Лиганд УСАМ-1
УЕОР Лиганд УСАМ-1
1Ь-1 Лиганд УСАМ-1
1Ь-6 Лиганд УСАМ-1
1Ы2 Лиганд УСАМ-1
ΡΏΟΡ Лиганд УСАМ-1
Ρϋ-ЕСОР Лиганд УСАМ-1
СХС хемокин Лиганд УСАМ-1
СС хемокин Лиганд УСАМ-1
С хемокин Лиганд УСАМ-1
1Ь-15 Лиганд УСАМ-1
ΤΝΡ-α Ат к УСАМ-1
ΤΝΡ-β Ат кУСАМ-1
ΙΡΝ-α Ат кУСАМ-1
ΙΡΝ-β Ат к УСАМ-1
ΙΡΝ-γ Ат к УСАМ-1
1Ь-2 Ат к УСАМ-1
1Ь-12 Ат кУСАМ-1
ЕМАР II Ат к УСАМ-1
УЕОР Ат к УСАМ-1
1Ь-1 Ат к УСАМ-1
1Ь-6 Ат к УСАМ-1
1Ь-12 Ат к УСАМ-1
ΡΏΟΡ Ат к УСАМ-1
Ρϋ-ЕСОЕ Ат кУСАМ-1
СХС хемокин Ат кУСАМ-1
СС хемокин Ат к УСАМ-1
С хемокин Ат к УСАМ-1
1Ь-15 Ат к УСАМ-1
ΤΝΡ-α Лиганд селектина
ΤΝΡ-β Лиганд селектина
ΙΡΝ-α Лиганд селектина
ΙΡΝ-β Лиганд селектина
ΙΡΝ-γ Лиганд селектина
1Ь-2 Лиганд селектина
1Ь-12 Лиганд селектина
ЕМАР II Лиганд селектина
УЕОР Лиганд селектина :
1Ы Лиганд селектина
ΙΕ-6 Лиганд селектина
1Ь-12 Лиганд селектина
ΡΌΟΡ Лиганд селектина
Ρϋ-ЕСОР Лиганд селектина
СХС хемокин Лиганд селектина
СС хемокин Лиганд селектина
С хемокин Лиганд селектина
1Ы5 Лиганд селектина
ΤΝΡ-α Ат к селектину
- 7 009955
ΊΝΡ-β Ат к селектину
ΙΡΝ-α Ат к селектину
ΙΡΝ-β Ат к селектину
ΙΡΝ-γ Ат к селектину
1Ь-2 Ат к селектину
1Ь-12 Ат к селектину
ΕΜΑΡ II Ат к селектину
УЕОР Ат к селектину
ΙΕ-1 Ат к селектину
ΙΕ-6 Ат к селектину
ΙΕ-12 Ат к селектину
ΡϋΟΡ Ат к селектину
Ρϋ-ЕССР Ат к селектину
СХС хемокин Ат к селектину
СС хемокин Ат к селектину
С хемокин Ат к селектину
1Ь-15 Ат к селектину
ΤΝΡ-α Лиганд ΑοΐΚΙΙ, АсЖПВ, Ас1К1 или АсЖ1В
ΤΝΡ-β Лиганд АсхКП, АсШПВ, АсхК1 или Ас1К1В
ΙΡΝ-α Лиганд ΑοίΚΙΙ, АсХЯПВ, Ас1К1 или АС1К1В
ΙΡΝ-β Лиганд Ас(КП, ΑοίΚΙΙΒ, Ас1К1 или Ас(К1В
ΙΕΝ-γ Лиганд АсЖИ, Ас(НПВ, ΑοίΚΙ или Ас1К1В
1Ь-2 Лиганд АсХКЛ, АсхКЛВ, Ас1к1 или ΑοΐΚΙΒ
1Ь-12 Лиганд АсхКП, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑείΚΙΒ
ΕΜΑΡ II Лиганд АсЖП, ΑοίΚΙΙΒ, ΑοίΚΙ или ΑϋΐΚΙΒ
νεαρ Лиганд АсХКЛ, Ас(Ш1В, АсГК.1 или Ас1К1В
1Ь-1 Лиганд Ас1К11, АсхКЛВ, АсгК1 или АсЙУВ
1Ь-6 Лиганд АсЙЕП, ΑϋΚΠΒ, ΑσΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
1Б-12 Лиганд АсЙШ, АсхКПВ, ΑοίΚΙ или Ас1К1В
РОСЕ Лиганд АсХКП, ΑοίΚΙΙΒ, Ас1к1 или АсШВ
Ρϋ-ЕССР Лиганд ΑοΐΚΙΙ, Ас(КЛВ, АстК.1 или Ас(К1В
СХС хемокин Лиганд АсПШ, АсХКЛВ, АсхК.1 или Ас<К1В
СС хемокин Лиганд АсХКИ, АсхКПВ, Ас1Ю или АсХК1В
С хемокин Лиганд ΑσίΚΙΙ, АсИШВ, ΑοίΚΊ или АсХК1В
- 8 009955
1Ы5 Лиганд ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΤΝΡ-α Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΤΝΡ-β Ат к АсЖП, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΙΡΝ-α Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΙΡΝ-β Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΙΡΝ-γ Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
1Ь-2 Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
1Ы2 Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΕΜΑΡ II Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
УЕОР Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
1Ы Ат к ΑοίΚΠ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
1Ь-6 Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΙΕ-12 Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΡΏΟΡ Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
Ρϋ-ЕСОР Ат к АссКП, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
СХС хемокин Ат к АС1К.П, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
СС хемокин Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
С хемокин Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
1Ь-15 Ат к ΑοΐΚΙΙ, ΑοΐΚΙΙΒ, ΑοΐΚΙ или ΑοΐΚΙΒ
ΤΝΡ-α Аннексии V
ΤΝΡ-β Аннексии V
ΙΡΝ-α Аннексин V
ΙΡΝ-β Аннексии V
ΙΡΝ-γ Аннексин V
1Ь-2 Аннексин V
1Ы2 Аннексин V
ΕΜΑΡ II Аннексин V
УЕСР Аннексин V
1Ь-1 Аннексин V
1Ь-6 Аннексин V
1Ь-12 Аннексии V
ΡΌΟΡ Аннексин V
Ρϋ-ЕССР Аннексин V
СХС хемокин Аннексин V
СС хемокин Аннексин V
С хемокин Аннексин V
1Ь-15 Аннексин V
ΤΝΡ-α Лиганд СЭ44
ΤΝΡ-β Лиганд СО44
ΙΡΝ-α Лиганд СО44
ΙΡΝ-β Лиганд СЭ44
ΙΡΝ-γ Лиганд СО44
1Ь-2 Лиганд СЭ44
1Б-12 Лиганд СО44
ΕΜΑΡ II Лиганд СО44
УЕСР Лиганд ΟΌ44
1Ь-1 Лиганд СО44
- 9 009955
1Ь-6 Лиганд СО44
Ш-12 Лиганд ΟΏ44
ΡΏΟΡ Лиганд СЭ44
Ρϋ-ЕССР Лиганд СР44
СХС хемокин Лиганд СЭ44
СС хемокин Лиганд СЭ44
С хемокин Лиганд СБ44
Ш-15 Лиганд СЭ44
ΤΝΡ-α Ат к СО44
ΤΝΡ-β Ат к СЭ44
ΙΡΝ-α Ат к СО44
ΙΡΝ-β Ат к СО44
ΙΡΝ-γ Ат к СЭ44
Ш-2 Ат к СО44
Ш-12 Ат к СЭ44
ΕΜΑΡ II Ат к СО44
УЕСР Ат к СЭ44
Ш-1 Ат к СО44
Ш-6 Ат к СО44
Ш-12 АткСО44
ΡϋΟΡ Ат к СО44
ΡΩ-ЕСОР Ат к СЭ44
СХС хемокин Ат к СО44
СС хемокин Ат к С 1)44
С хемокин Ат к СО44
ΙΕ-15 Ат к ΟΌ44
ΤΝΡ-α Остеопонтин
ΤΝΡ-β Остеопонтин
ΙΡΝ-α Остеопонтин
ΙΡΝ-β Остеопонтин
ΙΡΝ-γ Остеопонтин
Ш-2 Остеопонтин
ΙΕ-12 Остеопонтин
ΕΜΑΡ II Остеопонтин
νΕΟΡ Остеопонтин
Ш-1 Остеопонтин
Ш-6 Остеопонтин
Ш-12 Остеопонтин
ΡϋΟΡ Остеопонтин
Ρϋ-ЕССР Остеопонтин I
СХС хемокин Остеопонтин
СС хемокин Остеопонтин
С хемокин Остеопонтин
Ш-15 Остеопонтин
ΤΝΡ-α Фибронектин |
ΤΝΡ-β Фибронектин ;
ΙΡΝ-α Фибронектин (
ΙΡΝ-β Фибронектин
- 10 009955
ΙΕΝ-γ Фибронектин
1Ь2 Фибронектин
Ш-12 Фибронектин
ЕМАР II Фибронектин
νΕΘΓ Фибронектин
Ш-1 Фибронектин
Ш-6 Фибронектин
Ш-12 Фибронектин
РООГ Фибронектин
Ρϋ-ЕССГ Фибронектин
СХС хемокин Фибронектин
СС хемокин Фибронектин
С хемокин Фибронектин
Ш-15 Фибронектин
ΤΝΡ-α Коллаген типа I или IV
ΤΝΡ-β Коллаген типа I или IV
ΙΡΝ-α Коллаген типа I или IV
ΙΡΝ-β Коллаген типа I или IV
ΙΡΝ-γ Коллаген типа I или IV
ГЬ-2 Коллаген типа I или IV
ΙΕ-12 Коллаген типа I или IV
ЕМАР II Коллаген типа I или IV
ΫΕΟΡ Коллаген типа I или IV
Ш-1 Коллаген типа 1 или IV
Ш-6 Коллаген типа I или IV
Ш-12 Коллаген типа I или IV
РОСЕ Коллаген типа I или IV
РЭ-ЕСОР Коллаген типа I или IV
СХС хемокин Коллаген типа I или IV
СС хемокин Коллаген типа I или IV
С хемокин Коллаген типа I или IV
ΙΕ-15 Коллаген типа I или IV
ΤΝΡ-α Гиалуронат
ΤΝΡ-β Гиалуронат
ΙΡΝ-α Гиалуронат
ΙΡΝ-β Гиалуронат
ΙΡΝ-γ Гиалуронат
Ш-2 Гиалуронат
Ш-12 Гиалуронат
ЕМАР II Гиалуронат
УЕ6Р Гиалуронат
Ш-1 Гиалуронат
Ш-6 Гиалуронат
Ш-12 Гиалуронат
ΡϋΟΡ Гиалуронат
РО-ЕССГ Гиалуронат
СХС хемокин Гиалуронат
СС хемокин Гиалуронат
- 11 009955
С хемокин Гиалуронат
1Ь-15 Гиалуронат
ΤΝΡ-α Лиганд РОЕ-1,2, 3 или 4
ΤΝΡ-β Лиганд ЕОЕ-1,2, 3 или 4
ΙΡΝ-α Лиганд ГОЕ-1,2, 3 или 4
ΙΡΝ-β Лиганд ЕСР-1,2, 3 или 4
ΙΡΝ-γ Лиганд ЕОЕ-1,2, 3 или 4
1Ь-2 Лиганд ГОГ-1,2, 3 или 4
1Ь-12 Лиганд ГОЕ-1,2, 3 или 4
ΕΜΑΡ II Лиганд ЕОЕ-1,2, 3 или 4
УЕбР Лиганд РОР-1,2,3 или 4
1Ь-1 Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
1Ь-6 Лиганд РСР-1,2, 3 или 4
1Ь-12 Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
ρυσρ Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
РО-ЕСОР Лиганд ГОР-1, 2, 3 или 4
СХС хемокин Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
СС хемокин Лиганд РОР-1,2, 3 или 4
С хемокин Лиганд РОР-1, 2, 3 или 4
1Ь-15 Лиганд РОГ-1, 2, 3 или 4
ΤΝΡ-α Ат к РОР-1, 2, 3 или 4
ΤΝΡ-β Ат к РСР-1,2, 3 или 4
ΙΡΝ-α Ат к РОР-1,2,3 или 4
ΙΡΝ-β Ат к РОР-1, 2, 3 или 4
ΙΓΝ-γ Ат к РОЕ-1,2, 3 или 4
1Ь2 Ат к ГОЕ-1,2,3 или 4
1Ы2 Ат к РОР-1, 2, 3 или 4
ΕΜΑΡ И Ат к РОР-1,2, 3 или 4
νΕΟΡ Ат к РОР-1,2, 3 или 4
1Ь1 Ат к ГОЕ-1,2, 3 или 4
ΙΕ-6 Ат к ГОР-1,2,3 или 4
1Ь-12 Ат к ЕОЕ-1,2,3 или 4
РБОР Ат к РОР-1,2, 3 или 4
РО-ЕСОР Ат к РОЕ-1, 2, 3 или 4
СХС хемокин Ат к РОР-1,2, 3 или 4
СС хемокин Ат к ГСГ-1,2, 3 или 4
С хемокин Ат к ГОР-1,2,3 или 4
1Ь-15 Ат к РОР-1,2,3 или 4
ΤΝΡ-α Лиганд 1Ь-1К
ΤΝΡ-β Лиганд Ιί-ΙΚ
ΙΡΝ-α Лиганд 1Ь-1К
ΙΡΝ-β Лиганд 1Ь-1К
ΙΡΝ-γ Лиганд ΙΡ-1Κ
1Ь-2 Лиганд 1Ь-1К.
1Ь-12 Лиганд ΙΕ-1Κ.
ΕΜΑΡ II Лиганд 1Ь-1К
νΕΟΡ Лиганд 1Ъ-1К
1Ь-1 Лиганд 1Ь-1К
- 12 009955
1Ь-6 Лиганд 1Ь-1К
1Ь-12 Лиганд 1Ь-1К
ΡϋΟΕ Лиганд 1Ь-1К
Ρϋ-ЕССР Лиганд 1Ь-1Я
СХС хемокин Лиганд Ιί-ΙΚ
СС хемокин Лиганд 1ИК
С хемокин Лиганд 1Ь-1К
1Ь-15 Лиганд 1Ь-1К
ΤΝΡ-α ΑτκΙΕ-ΙΒ.
ΤΝΡ-β Ат к 1Ь-1К
ΙΡΝ-α Атк1Ь-1К
ΙΡΝ-β Атк 1Ь-1К
ΙΡΝ-γ Ат к 1Ь-1К
1Ь-2 Ат к ΙΕ-1К
1Ь-12 Атк1Ь-1К
ΕΜΑΡ Π Атк1Ь-1К
УЕСР Атк1Ь-1К
1Ь-1 Ат к 1ИК.
1Ь-6 Атк 1Ь-1К
ΙΕ-12 ΑτκΙί-ΙΚ
ΡϋΟΡ Ат к 1Б-1К.
Ρϋ-ЕССР Атк1Ь-1К
СХС хемокин Атк1Ь-1К
СС хемокин Атк1Ь-1К
С хемокин Ат к 1Ь-1К.
ΙΕ-15 Атк1Ь-1К
ΤΝΡ-α Лиганд СЭ31
ΤΝΡ-β Лиганд СОЗ1
ΙΡΝ-α Лиганд СОЗ 1
ΙΡΝ-β Лиганд СОЗ 1
ΙΡΝ-γ Лиганд СО31
ΙΕ-2 Лиганд СОЗ 1
1Б-12 Лиганд СОЗ 1
ΕΜΑΡ II Лиганд СОЗ 1
УЕОР Лиганд СОЗ 1
1Ь-1 Лиганд СОЗ 1
1Ь-6 Лиганд СОЗ1
1Ь-12 Лиганд СОЗ 1
ΡϋΟΡ Лиганд СОЗ 1
РО-ЕСОР Лиганд СОЗ 1
СХС хемокин Лиганд СОЗ 1
СС хемокин Лиганд СОЗ 1
С хемокин Лиганд СОЗ 1
1Ь-15 Лиганд СОЗ 1
ΤΝΡ-α Ат к СОЗ 1
ΤΝΡ-β Ат к СОЗ 1
ΙΡΝ-α Ат к СОЗ 1
ΙΡΝ-β Ат к СОЗ 1
- 13 009955
ΙΡΝ-γ АткСО31
1Ь-2 АткСОЗ!
1Ь-12 Ат к СОЗ 1
ЕМАР II Ат к СОЗ 1
УЕОР Ат к СОЗ 1
ΙΕ-1 Ат к СОЗ 1
т-6 Ат к СОЗ 1
1Б-12 Ат к СОЗ 1
ΡϋΟΡ Атк СОЗ 1
Ρϋ-ЕССР Ат к СОЗ 1
СХС хемокин Атк СОЗ 1
СС хемокин Атк СОЗ 1
С хемокин Ат к СОЗ 1
т-15 Ат к СОЗ 1
ΤΝΡ-α Лиганд ЕРНК
ΤΝΡ-β Лиганд ЕРНК
ΙΡΝ-α Лиганд ЕРНК
ΙΡΝ-β Лиганд ЕРНК
ΙΡΝ-γ Лиганд ЕРНК
1Б-2 Лиганд ЕРНК
т-12 Лиганд ЕРНК
ЕМАР II Лиганд ЕРНК
УЕОР Лиганд ЕРНК
Ш-1 Лиганд ЕРНК
т-6 Лиганд ЕРНК
т-12 Лиганд ЕРНК
роор Лиганд ЕРНК
РО-ЕСОР Лиганд ЕРНК
СХС хемокин Лиганд ЕРНК
СС хемокин Лиганд ЕРНК
С хемокин Лиганд ЕРНК
т-15 Лиганд ЕРНК
ΤΝΡ-α Ат к ЕРНК
ΤΝΡ-β Ат к ЕРНК
ΙΡΝ-α Ат к ЕРНК
ΙΡΝ-β Ат к ЕРНК
ΙΡΝ-γ Ат к ЕРНК
т-2 Ат к ЕРНК
ΙΕ-12 Ат к ЕРНК
ЕМАР II Ат к ЕРНК
УЕОР Ат к ЕРНК
ΙΕ-1 Ат к ЕРНК
т-6 Ат к ЕРНК
ΙΕ-12 Ат к ЕРНК
роср Ат к ЕРНК
РО-ЕСОР Ат к ЕРНК
СХС хемокин Ат к ЕРНК
СС хемокин Ат к ЕРНК
- 14 009955
С хемокин Ат к ЕРНЕ
Ιί-15 Ат к ЕРНЕ.
ΤΝΡ-α Эфрин
ΤΝΕ-β Эфрин
ΙΡΝ-α Эфрин
ΙΡΝ-β Эфрин
ΙΡΝ-γ Эфрин
1Ь-2 Эфрин
1Ь-12 Эфрин
ЕМАР II Эфрин
УЕОР Эфрин
ΙΕ-1 Эфрин
1Ь-6 Эфрин
1Ь-12 Эфрин
РЭОР Эфрин
Ρϋ-ЕСОЕ Эфрин
СХС хемокин Эфрин
СС хемокин Эфрин
С хемокин Эфрин
ΙΣ-15 Эфрин
ΤΝΡ-α Лиганд ММР
ΤΝΡ-β Лиганд ММР
ΙΡΝ-α Лиганд ММР
ΙΡΝ-β Лиганд ММР
ΙΡΝ-γ Лиганд ММР
1Ь-2 Лиганд ММР
1Ь-12 Лиганд ММР
ЕМАР II Лиганд ММР
УЕОР Лиганд ММР
1Ы Лиганд ММР
1Ь-6 Лиганд ММР
1Ь-12 Лиганд ММР
ΡϋΟΡ Лиганд ММР
Ρϋ-ЕСОР Лиганд ММР
СХС хемокин Лиганд ММР
СС хемокин Лиганд ММР
С хемокин Лиганд ММР
1Ь-15 Лиганд ММР
ΤΝΡ-α Ат к ММР
ΤΝΡ-β Ат к ММР
ΙΡΝ-α Ат к ММР
ΙΡΝ-β Ат к ММР
ΙΡΝ-γ Ат к ММР
1Ь-2 Ат к ММР
1Ь-12 Ат к ММР
ЕМАР II Ат к ММР
УЕОР Ат к ММР
1Ы Ат к ММР
- 15 009955
Ш-6 Ат к ММР
Ш-12 Ат к ММР
ΡϋΟΡ Ат к ММР
Ρϋ-ЕСОР Ат к ММР
СХС хемокин Ат к ММР
СС хемокин Ат к ММР
С хемокин Ат к ММР
Ш-15 Ат к ММР
ΤΝΡ-α Лиганд N02
ΤΝΡ-β Лиганд N02
ΙΡΝ-α Лиганд N02
ΙΡΝ-β Лиганд N02
ΙΡΝ-γ Лиганд N02
Ш-2 Лиганд N02
Ш-12 Лиганд N02
ΕΜΑΡ II Лиганд N02
УЕОР Лиганд N02
Ш-1 Лиганд N02
Ш-6 Лиганд N02
Ш-12 Лиганд N02
ΡϋΟΡ Лиганд N02
РО-ЕСОР Лиганд N02
СХС хемокин Лиганд N02
СС хемокин Лиганд N02
С хемокин Лиганд N02
Ш-15 Лиганд N02
ΤΝΡ-α Ат к N02
ΤΝΡ-β Ат к N02
ΙΡΝ-α Ат к N02
ΙΡΝ-β Ат к N02
ΙΡΝ-γ Ат к N02
Ш-2 Ат к N02
Ш-12 Ат к N02
ΕΜΑΡ II Ат к N02
УЕОР Ат к N02
Ш-1 Ат к N02
Ш-6 Ат к N02
Ш-12 Ат к N02
ΡϋΟΡ Ат к N02
Ρϋ-ЕСОР Ат к N02
СХС хемокин Ат к N02
СС хемокин Ат к N02
С хемокин Ат к N02
Ш-15 Ат к N02
ΤΝΡ-α Лиганд тенасцина
ΤΝΡ-β Лиганд тенасцина
ΙΡΝ-α Лиганд тенасцина
ΙΡΝ-β Лиганд тенасцина
- 16 009955
ΙΕΝ-γ Лиганд тенасцина
Ш-2 Лиганд тенасцина
Ш-12 Лиганд тенасцина
ЕМАР II Лиганд тенасцина
УЕОЕ Лиганд тенасцина
Ш-1 Лиганд тенасцина
Ш-6 Лиганд тенасцина
Ш-12 Лиганд тенасцина
РОСЕ Лиганд тенасцина
Ρϋ-ЕССЕ Лиганд тенасцина
СХС хемокин Лиганд тенасцина
СС хемокин Лиганд тенасцина
С хемокин Лиганд тенасцина
Ш-15 Лиганд тенасцина
ΤΝΕ-α Ат к тенасцину
ΤΝΓ-β Ат к тенасцину
ΙΕΝ-α Ат к тенасцину
ΙΡΝ-β Ат к тенасцину
ΙΓΝ-γ Ат к тенасцину
Ш-2 Ат к тенасцину
Ш-12 Ат к тенасцину
ЕМАР II Ат к тенасцину
УЕОЕ Ат к тенасцину
Ш-1 Ат к тенасцину
Ш-6 Ат к тенасцину
Ш-12 Ат к тенасцину
РОСЕ Ат к тенасцину
ΡΌ-ЕСОЕ Ат к тенасцину
СХС хемокин Ат к тенасцину
СС хемокин Ат к тенасцину
С хемокин Ат к тенасцину
Ш-15 Ат к тенасцину
ΤΝΓ-α Лиганд РО-ЕСОГК
ΤΝΕ-β Лиганд Ρϋ-ЕСОГК
ΙΓΝ-α Лиганд Ρϋ-ЕССГК.
ΙΓΝ-β Лиганд Ρϋ-ЕСОГК
ΙΕΝ-γ Лиганд Ρϋ-ЕСОЕК
Ш-2 Лиганд Ρϋ-ЕССГК.
Ш-12 Лиганд Ρϋ-ЕСОГК
ЕМАР II Лиганд РП-ЕСОЕК
УЕОЕ Лиганд ΡΏ-ЕСОРК
Ш-1 Лиганд Ρϋ-ЕСОГК
Ш-6 Лиганд РЭ-ЕСОЕК
Ш-12 Лиганд Ρϋ-ЕСОЕК
ΡϋΟΕ Лиганд Ρϋ-ЕСОГК
Ρϋ-ЕСОГ Лиганд РП-ЕСОЕК
СХС хемокин Лиганд Ρϋ-ЕСОЕК
СС хемокин Лиганд РО-ЕСОЕК
- 17 009955
С хемокин Лиганд РО-ЕССГК
Ш-15 Лиганд Ρϋ-ЕССРК
ΤΝΡ-α Ат к Ρϋ-ЕССРК
ΤΝΡ-β Ат к РО-ЕССГК
ΙΡΝ-α АткРО-ЕССРК
ΙΡΝ-β Ат к Ρϋ-ЕССРК
ΙΡΝ-γ Ат к Ρϋ-ЕССРК
Ш-2 Ат к Ρϋ-ЕССРК
Ш-12 Ат к Ρϋ-ЕССРК
ΕΜΑΡ II Ат к Ρϋ-ЕССРК
УЕСР Ат к Ρϋ-ЕССРК
Ш-1 АткРО-ЕССРК
Ш-6 Ат к РЬ-ЕССРК
Ш-12 Ат к РО-ЕССРК
ΡϋΟΡ АткРО-ЕССРК
Ρϋ-ЕССР Ат к Ρϋ-ЕССРК
СХС хемокин АткРО-ЕССРК
СС хемокин АткРО-ЕССРК
С хемокин Ат к РО-ЕССРК
Ш-15 АткРО-ЕССРК
ΤΝΡ-α Лиганд ΤΝΡΚ
ΤΝΡ-β Лиганд ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-α Лиганд ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-β Лиганд ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-γ Лиганд ΤΝΡΚ
Ш-2 Лиганд ΤΝΡΚ
Ш-12 Лиганд ΤΝΡΚ
ΕΜΑΡ II Лиганд ΤΝΡΚ
УЕСР Лиганд ΤΝΡΚ
Ш-1 Лиганд ΤΝΡΚ
Ш-6 Лиганд ΤΝΡΚ
Ш-12 Лиганд ΤΝΡΚ
РОСЕ Лиганд ΤΝΡΚ
Ρϋ-ЕССР Лиганд ΤΝΡΚ
СХС хемокин Лиганд ΤΝΡΚ
СС хемокин Лиганд ΤΝΡΚ
С хемокин Лиганд ΤΝΡΚ
Ш-15 Лиганд ΤΝΡΚ
ΤΝΡ-α Ат к ΤΝΡΚ
ΤΝΡ-β Ат к ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-α Ат к ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-β Ат к ΤΝΡΚ
ΙΡΝ-γ Ат к ΤΝΡΚ
Ш-2 Ат к ΤΝΡΚ
Ш-12 Ат к ΤΝΡΚ
ΕΜΑΡ II Ат к ΤΝΡΚ
УЕСР Ат к ΤΝΡΚ
Ш-1 Ат к ΤΝΡΚ
- 18 009955
т-6 Ατ к ΤΝΡΚ
1Ы2 Ατ к ΤΝΡΚ
ΡϋΟΡ Ατ к ΤΝΡΚ
Ρϋ-ЕСОР Ατ к ΤΝΡΚ
СХС хемокин ΑτκΤΝΡΚ
СС хемокин Ατ к ΤΝΡΚ
С хемокин Ατ к ΤΝΡΚ
т-15 Ατ к ΤΝΡΚ
ΤΝΡ-α Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΤΝΡ-β Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-α Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-β Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-γ Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Ь-2 Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Ь-12 Лиганд ΡϋΟΡΚ
ЕМАР II Лиганд ΡϋΟΡΚ
УЕОР Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Ь-1 Лиганд ΡϋΟΡΚ
1Ь-6 Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΊΕ-12 Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΡϋΟΡ Лиганд ΡϋΟΡΚ
Ρϋ-ЕСОР Лиганд ΡϋΟΡΚ
СХС хемокин Лиганд ΡϋΟΡΚ
СС хемокин Лиганд ΡϋΟΡΚ
С хемокин Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΙΕ-15 Лиганд ΡϋΟΡΚ
ΤΝΡ-α Ατ к ΡϋΟΡΚ
ΤΝΡ-β Ατ к ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-α Ατ к ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-β Ατ к ΡϋΟΡΚ
ΙΡΝ-γ ΑτкΡϋΟΡΚ
1Б-2 Ατ к ΡϋΟΡΚ
т-12 Ατ к ΡϋΟΡΚ
ЕМАР II Ατ к ΡϋΟΡΚ
УЕОР Ατ к ΡϋΟΡΚ
т-ι Ατ к ΡϋΟΡΚ
т-6 Ατ к ΡϋΟΡΚ
т-12 Ατ к ΡϋΟΡΚ
ΡϋΟΡ Ατ к ΡϋΟΡΚ
Ρϋ-ЕСОР ΑτкΡϋΟΡΚ
СХС хемокин Ατ к ΡϋΟΡΚ
СС хемокин Ατ к ΡϋΟΡΚ
С хемокин ΑτкΡϋΟΡΚ
т-15 Ατ к ΡϋΟΡΚ
ΤΝΡ-α Лиганд Ρ8ΜΑ
ΤΝΡ-β Лиганд Ρ8ΜΑ
ΙΡΝ-α Лиганд Ρ8ΜΑ
ΙΡΝ-β Лиганд Р8МА
- 19 009955
ΙΡΝ-γ Лиганд Р8МА
Ш-2 Лиганд Р8МА
Ш-12 Лиганд Р8МА
ΕΜΑΡ II Лиганд Р8МА
УЕОР Лиганд Р8МА
Ш-1 Лиганд Р8МА
Ш-6 Лиганд Р8МА
Ш-12 Лиганд Р8МА
ΡϋΟΡ Лиганд Р8МА
РП-ЕСОР Лиганд Р8МА
СХС хемокин Лиганд Р8МА
СС хемокин Лиганд Р8МА
С хемокин Лиганд Р8МА
Ш-15 Лиганд Р8МА
ΤΝΡ-α Ат к Р8МА
ΤΝΡ-β Ат к Р8МА
ΙΡΝ-α Ат к Р8МА
ΙΡΝ-β Ат к Р8МА
ΙΡΝ-γ Ат к Р8МА
Ш-2 Ат к Р8МА
Ш-12 Ат к Р8МА
ΕΜΑΡ II Ат к Р8МА
УЕОР Ат к Р8МА
Ш-1 Ат к Р8МА
Ш-6 Ат к Р8МА
Ш-12 Ат к Р8МА
ΡϋΟΡ Ат к Р8МА
Ρϋ-ЕСОР Ат к Р8МА
СХС хемокин АткРЗМА
СС хемокин Ат к Р8МА
С хемокин Ат к Р8МА
Ш-15 Ат к Р8МА
ΤΝΡ-α Витронектин
ΤΝΡ-β Витронектин
ΙΡΝ-α Витронектин
ΙΡΝ-β Витронектин
ΙΡΝ-γ Витронектин
Ш-2 Витронектин
Ш-12 Витронектин
ΕΜΑΡ II Витронектин
УЕОР Витронектин
Ш-1 Витронектин
Ш-6 Витронектин
Ш-12 Витронектин
ΡϋΟΡ Витронектин
Рй-ЕСОР Витронектин
СХС хемокин Витронектин
СС хемокин Витронектин
- 20 009955
С хемокин Витронектин
1Ь-15 Витронектин
ΤΝΡ-α Ламинин
ΤΝΡ-β Ламинин
ΙΡΝ-α Ламинин
ΙΡΝ-β Ламинин
ΙΡΝ-γ Ламинин
1Ь-2 Ламинин
1Ь-12 Ламинин
ЕМАР II Ламинин
УЕСР Ламинин
1Ь-1 Ламинин
1Ь-6 Ламинин
1Ь-12 Ламинин
ΡϋΟΡ Ламинин
Ρϋ-ЕССР Ламинин
СХС хемокин Ламинин
СС хемокин Ламинин
С хемокин Ламинин
1Ь-15 Ламинин
ΤΝΡ-α Лиганд онкофетального фибронектина
ΤΝΡ-β Лиганд онкофетального фибронектина
ΙΡΝ-α Лиганд онкофетального фибронектина
ΙΡΝ-β Лиганд онкофетального фибронектина
ΙΡΝ-γ Лиганд онкофетального фибронектина
[Ь-2 Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-12 Лиганд онкофетального фибронектина
ЕМАР II Лиганд онкофетального фибронектина
УЕОР Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-1 Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-6 Лиганд онкофетального фибронектина
1Ь-12 Лиганд онкофетального фибронектина
ΡΌΟΡ Лиганд онкофетального фибронектина
РЭ-ЕСОР Лиганд онкофетального фибронектина
СХС хемокин Лиганд онкофетального фибронектина
СС хемокин Лиганд онкофетального фибронектина
С хемокин Лиганд онкофетального фибронектина
ГЫ 5 Лиганд онкофетального фибронектина
ΤΝΡ-α Ат к онкофетальному фибронектину
ΤΝΡ-β Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΡΝ-α Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΡΝ-β Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΓΝ-γ Ат к онкофетальному фибронектину
1Ь-2 Ат к онкофетальному фибронектину
1Ы2 Ат к онкофетальному фибронектину
ЕМАР II Ат к онкофетальному фибронектину
УЕОР Ат к онкофетальному фибронектину
1Ы Ат к онкофетальному фибронектину
- 21 009955
1Ь-6 Ат к онкофетальному фибронектин}’
1Ь-12 Ат к онкофетальному фибронектину
ΡϋΟΡ Ат к онкофетальному фибронектин}'
Ρϋ-ЕССР Ат к онкофетальному фибронектину
СХС хемокин Ат к онкофетальному фибронектин}'
СС хемокин Ат к онкофетальному фибронектину
С хемокин Ат к онкофетальному фибронектину
ΙΕ-15 Ат к онкофетальному фибронектину
Следует отметить, что в вышеуказанной таблице термин Ат означает антитело и что антитела и лиганды включают их фрагменты.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат содержит ΤΝΡα или ΤΝΡβ и ЫСВ-содержащий пептид или ΤΝΡα или ΤΝΡβ и ВСО-содержащий пептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат представлен в форме слитого белка.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество продукта конъюгации ΤΝΡ и первого ТТМ или полинуклеотида, кодирующего таким же образом, и эффективное количество ΙΡΝ-γ и второго ТТМ или полинуклеотида, кодирующего таким же образом, где указанный первый ТТМ и указанный второй ТТМ конкурируют за различные рецепторы.
Некоторые ключевые преимущества изобретения
Для того, чтобы достигнуть раковых клеток в твердых опухолях, химиотерапевтические лекарственые средства должны проникнуть в кровеносные сосуды опухоли, пересечь сосудистую стенку и окончательно мигрировать через интерстициому. Гетерогенная опухолевая перфузия, сосудистая проницаемость, и клеточная плотность, и увеличенное интерстициональное давление могут представлять существенные барьеры, что может ограничить проникновение лекарственного средства в неопластичные клетки, отдаленные от опухолевых сосудов, и, следовательно, эффективность химиотерапии (1). Стратегии, направленные на улучшение пенетрации лекарственного средства в опухоль, представляют, таким образом, большой экспериментальный и клинический интерес.
Растущий объем данных показывает, что фактор некроза опухоли α (ΤΝΡ) и воспалительный цитокин, наделенный потенциальной противоопухолевой активностью, могут использоваться для этой цели. Например, добавление ΤΝΡ к регионарной изолированной перфузии конечности мелфаланом или доксорубицином привело к более высоким показателям отклика у пациентов с завершающей стадией саркомы мягких тканей или меланомы, чем полученным с единственным химиотерапевтическим лекарственным средством (2-6). Вызываемое ΤΝΡ изменение эндотелиальной барьерной функции, снижение опухолевого интерстициального давления, увеличение пенетрации химиотерапевтического лекарственного средства и повреждения опухолевых сосудов подтверждают важность механизмов синергии между ΤΝΡ и химиотерапией (3, 4, 7-10). К сожалению, системное введение ΤΝΡ сопровождается чрезмерной токсичностью, максимально допустимая доза (8-10 мкг/кг) в 10-50 раз ниже, чем предполагаемая эффективная доза (11, 12). По этой причине отказались от системного введения ΤΝΡ и клиническое применение этого цитокина ограничено местно-регионарным лечением. Тем не менее, некоторые особенности активности ΤΝΡ, в частности селективность для опухолеассоциированных сосудов и синергия с химиотерапевтическими лекарственными средствами, продолжают поддерживать надежды относительно возможности более широкого терапевтического применения (13).
Сосудистые эффекты ΤΝΡ обеспечивают рациональное развитие стратегии сосудистого нацеливания, направленной на увеличение локальной эффективности и на возможность системного введения терапевтических доз. Недавно мы показали, что нацеленная доставка ΤΝΡ в опухолевые сосуды может быть достигнута путем связывания этого белка с СЫСВС пептидом, лигандом аминопептидазы Ν (СЭ13), который определяет опухолевую неоваскулярность (14). В настоящей работе мы исследовали, действительно ли сосудистое нацеливание с другими конъюгатами может увеличить пенетрацию химиотерапевтических лекарственных средств в опухоль и улучшить их эффективность. Кроме того, мы проверили, действительно ли сосудистое нацеливание с конъюгатами может ослабить лекарственно-пенетрационные барьеры и увеличить количество химиотерапевтического средства, которое достигает раковых клеток.
Чтобы сократить опухолевые клетки до числа, которое может быть полностью разрушено противоопухолевыми эффекторными Т-клетками, мы должны предусмотреть такой способ уменьшения массы опухоли, который, в отличие от химиотерапии, не является иммунодепресантным.
В этом отношении, мы верим, что опухолесосудистое нацеливание для уничтожения опухолевых клеток является одним из наиболее перспективных терапевтических подходов к лечению рака. Опухолеиндуцированный сосудистый эндотелий составлен из нетрансформированных клеток, которые поэтому
- 22 009955 не подвергаются мутациям, вызываемым терапией. Таким образом, повторные обработки этого сосудистого эндотелия опухоли-мишени, в принципе, могут быть проведены без опасения выбора резистентных вариантов. Второе, разрушением относительно небольшого числа опухолевых сосудов может быть, возможно, уничтожено огромное количество опухолевых клеток, которые зависят от кровоснабжения при разрастании.
Биологическая терапия, которая повреждает функции опухолеассоциированных сосудов и разрушает формирование новых сосудов без вызывания иммунодепрессии, была бы, следовательно, очень привлекательным подходом к уменьшению массы опухоли перед иммунотерапией или другими терапевтическими воздействиями.
Среди различных цитокинов и биологических модуляторов, которые могут поражать опухолевые сосуды так же, как и имунная система, ΤΝΡ-α, один или в комбинации с интерфероном гамма и химиотерапией, несомненно, является одним из наиболее эффективных. Массированный геморрагический некроз и уменьшение опухоли, которые этот цитокин может вызывать в течение 24 ч в опухолях животных, являются общепризнанными со времени его открытия. В настоящее время установлено, что ΤΝΡ может разрушать опухолевую макро- и микроваскуляторность метастатических меланом конечностей у пациентов, когда вводится местно в высокой дозе в комбинации с интерфероном гамма и мелфаланом путем изолированной перфузии конечности. ΤΝΡ может вызвать каскад событий, ведущих к повреждению эндотелиальных клеток, агрегации тромбоцитов, внутрисосудистому осаждению фибрина, и коагуляции, и кульминационной остановке опухолевого кровообращения. Удивительно, но нормальные сосуды около опухоли остаются неповрежденными, подтверждая, что ΤΝΡ может каким-то образом различать сосудистую систему нормальных тканей и опухолевых. Следовательно, является заманчивой возможность использовать ΤΝΡ, чтобы вызвать уменьшение опухоли перед другим терапевтическим вмешательством.
Другим потенциальным преимуществом уменьшения опухоли с помощью ΤΝΡ перед традиционными химиотерапевтическими агентами является то, что он не является иммунодепрессантом, а, наоборот, он является важным активатором иммунного ответа. Действительно, ΤΝΡ может активировать антиген предъявляемой клетки, который, в свою очередь, является важным ключевым медиатором иммунного ответа, так же, как и различные другие механизмы, которые вносят вклад в эффективный иммунный ответ.
К сожалению, клиническое использование ΤΝΡ в качестве противоракового лекарственного средства ограничивалось до сих пор местным применением из-за ограничивающей дозу системной токсичности и низкого терапевтического индекса.
Растворимый биоактивный ΤΝΡ является гомотримерным белком, который медленно диссоциирует на неактивные мономерные субъединицы при пикомолярных уровнях (1). Биологические активности вызываются тримерным ΤΝΡ при взаимодействии и последующей гомотипической кластеризации двух различных рецепторов клеточной поверхности (2) в 55-60 кДа и 75-80 кДа, соответственно (ρ55ΤΝΡΚ и ρ75ΤΝΡΚ). ρ55ΤΝΡΚ считается посредником большинства ΤΝΡ эффектов (3, 4, 5, 6, 7), тогда как ρ75ΤΝΡΚ благодаря его высокой аффинности (К,,=0.1/ 10-9М против 0,5/10-9М для ρ55ΤΝΡΚ) играет важную роль в увеличении локальной концентрации ΤΝΡ и в прохождении лиганда к ρ55ΤΝΡΚ (8, 9). Помимо этих поддерживающих или модулирующих эффектов прямой сигнализации ρ55ΤΝΡΚ может также внести вклад в различные клеточные реакции, подобные пролиферации тимоцитов, фибробластов и природных клеток-киллеров, секреции СМ-С8Р (2, 10, 11), и в определяющие локально ограниченные реакции, вызываемые эндогенной мембранно-связанной формой ΤΝΡ (12).
Клинические испытания, выполненные для демонстрации противоопухолевой активности ΤΝΡ, показали, что введение больших терапевтически эффективных доз ΤΝΡ сопровождается недопустимо высокими уровнями системной токсичности, дозаограничивающей токсичностью обычно является гипотония. Поэтому попытки системного введения ΤΝΡ опухолевому пациенту были, по существу, прекращены. Тем не менее, замечательная противоопухолевая активность ΤΝΡ на некоторых животных моделях продолжала питать надежды относительно возможности терапевтического применения ΤΝΡ у людей. Это подразумевало, однако, необходимость найти способы понижения токсичности ΤΝΡ при системном введении или доставки ΤΝΡ с относительной или абсолютной селективностью к действительной терапевтической мишени-опухоли.
Максимальная переносимая доза при болюсном введении ΤΝΡ (внутривенно) у человека составляет 218-410 мкг/м2 (28), примерно в 10 раз ниже, чем эффективная доза у животных (29). Основываясь на данных, полученных на мышиных моделях, мы посчитали, что необходима по меньшей мере в 10 раз большая доза для достижения противоопухолевого эффекта у людей.
Одним из подходов, который выполнялся для того, чтобы использовать противоопухолевую активность ΤΝΡ и в то же время избежать его системной токсичности, было регионарное или местное введение. Таким образом, местное введение ΤΝΡ показало многообещающие уровни ответа при саркоме Капоши, плазмоцитомах, аденокарциномах яичника и различных метастатических опухолях в печени (30, 31). Что касается регионарного введения, поразительные результаты были получены, когда высокие дозы ΤΝΡ использовались в комбинации с мелфаланом в изолированной перфузии конечности для лечения
- 23 009955 меланомы и саркомы конечности. Этот метод позволил достичь 90-100% полного ответа с опухолями, подвергающимися геморрагическому некрозу (32), это наблюдение согласуется с наблюдениями, полученными при доклинических изучениях некоторых экспериментальных животных опухолевых моделей.
Хотя эти результаты являются обнадеживающими, применимость этих подходов остается ограниченной по двум главным причинам. Первое, в большинстве случаев, где местно-регионарная терапия может быть предусмотрена, вероятно, что использование принятых способов вмешательства (например, хирургия, лучевая терапия), возможно, также и в будущем будет превалировать. Второе, по определению, злокачественность имеет тенденцию к распространению, и это означает, что в положении, где местно-регионарная терапия ограничена, необходимость новых терапевтических подходов для медиков является наиболее острой. В первом клиническом изучении на гипертермической изолированной перфузии конечности высокие скорости ответа были получены с единичной дозой 4 мг ΤΝΕ в комбинации с мелфаланом и интерфероном-γ (32). Другие работы показали, что интерфероном-γ можно пренебречь и что даже меньшие дозы ΤΝΒ могут быть успешными для вызова терапевтического ответа (33, 34). Так как даже это лечение не свободно от риска токсичности (35), сосудистое нацеливание производных ΤΝΤ может представлять альтернативный подход к снижению токсических эффектов.
Подробное описание изобретения
Теперь будут описаны различные предпочтительные особенности и варианты осуществления изобретения в виде нелимитирующих примеров.
Хотя, в основном, используемые здесь методики хорошо известны из уровня техники, можно сделать ссылку, в частности, на 8ашЬтоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошид, А ЬаЬотаЮгу Мапиа1 (1989) аиб Аи8иЬе1 с1 а1., 81юг1 РгоЮсой ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1999) 411' Еб, 1о1ш №Пеу & 8ои§, 1ис. (а также полная версия Ситгеи! РгоЮсой ίη Мо1еси1аг Вю1оду).
Конъюгат
Настоящее изобретение относится к конъюгату, который представляет собой молекулу, содержащую по меньшей мере один нацеливающий модуль/полипептид, связанный, по крайней мере, с цитокином, образованный через генетическое слияние или химическое сдваивание. Под термином связанный мы подразумеваем, что первая и вторая последовательности ассоциированы так, что вторая последовательность способна транспортироваться первой последовательностью к клетке-мишени. Таким образом, конъюгаты включают слитые белки, в которых транспортный белок связан с цитокином через их полипептидные скелеты посредством генетической экспрессии молекулы ДНК, кодирующей эти белки, непосредственно синтезированные белки и спаренные белки, в которых первоначально образуемая последовательность ассоциирована структурирующим агентом. Этот термин также включает ассоциаты, такие как агрегаты, цитокина с нацеливающим белком. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения вторая последовательность может содержать полинуклеотидную последовательность. Этот вариант осуществления может рассматриваться как комплекс белок/нуклеиновая кислота.
Вторая последовательность может быть того же вида, что и первая последовательность, но в конъюгате по настоящему изобретению, в некоторой степени, различны с природной ситуацией, или последовательности могут быть разного вида.
Конъюгаты по настоящему изобретению способны направляться к клетке так, что может иметь место эффекторная функция, соответствующая полипептидной последовательности, спаренной с транспортной последовательностью.
Пептид может быть спарен прямо с цитокином или опосредованно через спейсер, которым может быть единичная аминокислота, аминокислотная последовательность или органический остаток, такой как 6-аминокаприл-№гидроксисукцинимид.
Пептидный лиганд предпочтительно связан с Ν-концом цитокина, минимизируя, таким образом, любое вмешательство в связывание модифицированного цитокина с его рецептором. И, наоборот, пептид может быть связан с аминокислотными остатками, которые являются амидо- или карбоксильносвязанными акцепторами, которые могут быть на молекуле от природы или искусственно вставленными с помощью методов генной инженерии. Модифицированный цитокин преимущественно получают с использованием кДНК, содержащей 5'-прилегающую последовательность, кодирующую пептид.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагается продукт конъюгации между ΤΝΕ и ί,'ΝΟΒί.' последовательностью, в котором аминный конец ΤΝΕ связан с ί,'ΝΟΒί.' пептидом через спейсер С (глицин).
Цитокины
Пенетрация лекарственного средства в неопластичные клетки является основной для эффективности твердоопухолевой химиотерапии. Для того, чтобы достать раковые клетки в твердых опухолях, химиотерапевтические лекарственые средства должны проникнуть в кровеносные сосуды опухоли, пересечь сосудистую стенку и окончательно мигрировать через интерстициому. Гетерогенная опухолевая перфузия, сосудистая проницаемость, и клеточная плотность, и увеличенное интерстициональное давление могут представлять существенные барьеры, что может ограничить проникновение лекарственного средства в неопластичные клетки, отдаленные от опухолевых сосудов, и, следовательно, эффективность химиотерапии. Цитокины, которые влияют на подавление этих факторов, и используются в настоящем
- 24 009955 изобретении. Нелимитирующий список цитокинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включает ΤΝΡα, ΤΝΡβ, ΙΡΝα, ΙΡΝβ, ΙΡΝγ, 1Ь-1, 2, 4, 6, 12, 15, ЕМАР II, сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕСР). ΡΌ6Ρ, ΡΌ-ЕСбР или хемокин.
ΤΝΡ
ΤΝΡ действует как воспалительный цитокин и влияет на изменение эндотелиальной барьерной функции, снижение опухолевого интерстициального давления, и увеличение пенетрации химиотерапевтического лекарственного средства, и повреждение опухолевых сосудов.
Первое предположение, что существует некротизирующая опухоль молекула, было сделано, когда было обнаружено, что у раковых пациентов иногда наблюдалась спонтанная регрессия опухолей после бактериальных инфекций. Последующие исследования в 1960-х подтвердили, что хозяин-ассоциированные (или эндогенные) медиаторы, вырабатываемые в ответ на бактериальные продукты, были, вероятно, ответственны за наблюдаемые эффекты. В 1975г. было показано, что бактериально-индуцируемый циркулирующий фактор имел сильную противоопухолевую активность против опухолей, имплантированных в кожу мыши. Этот фактор, названный фактором некроза опухоли (ΤΝΡ), был впоследствии выделен, клонирован и оказался прототипом семейства молекул, вовлеченных в иммунную регуляцию и воспаление. Рецепторы для ΤΝΡ и других членов суперсемейства ΤΝΡ также составляют суперсемейство родственных белков.
Родственные ΤΝΡ лиганды обычно разделяют ряд общих свойств. Эти свойства не включают высокую степень гомологии общей аминокислотной последовательности. За исключением фактора роста нервов (ΝΟΡ) и ΤΝΡ-бета, все лиганды синтезированы в виде трансмембранных белков II типа (внеклеточный С-конец), которые содержат короткий цитоплазматический сегмент (10-80 аминокислотных остатков) и относительно длинную внеклеточную область (140-215 аминокислотных остатков). ΝΟΡ, который структурно не родственный ΤΝΡ, включен в это суперсемейство только потому, что его способность связывать ΤΝΡΚ8Ρ ниже аффинности Ν6Ρ рецептора (ΕΝ6ΡΚ). Ν6Ρ имеет классическую сигнальную последовательность пептида и является секретированным. ΤΝΡ-β, наоборот, хотя также полностью секретирован, имеет первичную структуру, намного более родственную трансмембранным белкам типа II. ΤΝΡ-β можно рассматривать как белок типа II с нефункциональным, или неэффективным, трансмембранным сегментом. В общем, ΤΝΡ8Ρ члены образуют тримерные структуры, а их мономеры составлены из бета-цепей, которые ориентируют их в двухпластинчатую структуру. Как следствие тримерной структуры этих молекул, предположили, что лиганды и рецепторы ΤΝ8Ρ и ΤΝΡΚ8Ρ суперсемейств подвергаются кластеризации во время сигнальной трансдукции.
ΤΝΡ-α
Человеческий ΤΝΡ-α представляет собой негликозилированный полипептид из 233 аминокислотных остатков, который существует либо как трансмембранный, либо как растворимый белок. Когда выражен в виде мембранного связанного белка в 26 кДа, ΤΝΡ-α состоит из цитоплазматического домена, включающего 29 аминокислотных остатков, трансмембранного сегмента, включающего 28 аминокислотных остатков, и внеклеточного участка, включающего 176 аминокислотных остатков. Растворимый белок создается путем протеолитического расщепления с помощью ΤΝΡ-альфа конвертирующего фермента (ТАСЕ) в 85 кДа, который генерирует молекулу в 17 кДа, включающую 157 аминокислотных остатков, которая обычно циркулирует в виде гомотримера.
ΤΝΡ-β/ΕΤ-α
ΤΝΡ-β, по-другому известный как лимфотоксин-α (ΕΤ-α), является молекулой, клонирование которой было осуществлено одновременно с клонированием ΤΝΡ-α. Хотя ΤΝΡ-β циркулирует в виде гликозилированного полипептида в 25 кДа, состоящего из 171 аминокислотного остатка, была найдена большая форма длиной 194 аминокислотных остатка. Человеческие ΤΝΡ-β кДНК коды для открытого считывания составлены из 205 аминокислотных остатков (202 у мыши), и, очевидно, некоторая протеолитическая переработка осуществляется во время секреции. Как и ΤΝΡ-α, циркулирующий ΤΝΡ-β существует в виде нековалентно связанного тримера, и известно, что он связывает те же рецепторы, что и ΤΝΡ-α.
В одном варианте осуществления изобретения ΤΝΡ представляет собой мутантную форму ΤΝΡ, способную селективно связываться с одним из ΤΝΡ рецепторов (Еоейсйет Н. е! а1. (1993) 1. ΒίοΙ. Сйеш. 268: 26350-7; Уап Ойабе X. е! а1. (1993) ХаИие 361: 266-9).
Были осуществлены различные подходы, направленные на снижение системной токсичности ΤΝΡ при сохранении его противоопухолевой активности. Хотя конечной целью является та же, что и в предыдущей части, т.е. увеличение терапевтического индекса, основное направление значительно отличается. В предыдущем случае значительное повышение отдельной биологической активности, цитотоксичности, первоначально задумывалось представить как ίη νίίτο коррелят противоопухолевой активности ΤΝΡ, в настоящем используется селективная модификация биологического профиля ΤΝΡ, ведущая к сохранению некоторых активностей и потере других.
Работа по этому последнему направлению обещала преимущества, главным образом, возможность конструировать мутанты ΤΝΡ, связанные только с одним из двух ΤΝΡΚ. Попытки работы в этом направлении были инициированы наблюдением, что человеческий ΤΝΡ связывает только один (ρ55ΤΝΡΚ) из
- 25 009955 двух мышиных ΤΝΕΚ, взаимодействие с мышиным ρ75ΤΝΕΚ является видоспецифичным (2). Исследования ίη νίνο показали, что системная токсичность человеческого ΤΝΕ была приблизительно в 50 раз ниже, чем токсичность мышиного ΤΝΕ, при введении нормальным мышам, в то время как противоопухолевая активность была эквивалентной (44). Эти наблюдения полагали, что мутанты ΤΝΕ, которые сохраняют связывание с ρ75ΤΝΕΚ, должны иметь более благоприятный терапевтический индекс, чем природный ΤΝΕ. Действительно, такие рецептор-селективные мутанты ΤΝΕ были впоследствии получены с помощью методов сайт-специфического мутагенеза (4, 45). Исследования, проведенные с ρ55ΤΝΕΚспецифичным мутантом, показали, что он был так же эффективен, как природный ΤΝΕ, в отношении противоопухолевой активности ίη νίνο, несмотря на то, что активности на нейтрофилах и эндотелиальных клетках, двух типах клеток, верно, играющих важную роль в ΤΝΕ-индуцированной системной токсичности, были сильно снижены (6).
Хотя эти результаты были сильно обнадеживающими ввиду возможного терапевтического использования этих мутантов в противоопухолевой терапии, надежды, которые выросли, были значительно ослаблены наблюдением, что у приматов также ρ55ΤΝΕΚ играет важную роль в системной токсичности (46) и что выгода на основе сниженной токсичности терялась, когда мутанты вводились в комбинации с агентом, который повышал восприимчивость к ΤΝΕ, аналогу 1Ь-1, ЬР8 или, что наиболее важно в этом положении, в присутствии самой опухоли, которая делает организм восприимчивым к ΤΝΕ способом, похожим на описанный для экзогенно введенных веществ в ссылке (47).
Принимая во внимание вышесказанное, мы решили, что связывание этих и других мутантов ΤΝΕ с ανβ3 лигандом приведет в результате к улучшению их терапевтического индекса.
Многие другие воспалительные цитокины также обладают способностью увеличивать проницаемость эндотелиальных сосудов, и следует принимать во внимание, что изобретение может применять такие цитокины, вместе с агентами, которые увеличивают экспрессию таких цитокинов. Воспалительные цитокины, также известные как провоспалительные цитокины, представляют собой ряд полипептидов или гликопротеинов с молекулярными массами между 5 и 70 кДа. Они обладают стимулирующим эффектом на воспалительную реакцию. Наиболее важными воспалительными цитокинами являются ΤΝΕ, 1Ь-1, 1Ь-6 и Ш-8.
Таблица некоторых цитокинов, классифицированных как воспалительные цитокины, показана ниже. Воспалительные цитокины
Группа Индивидуальные цитокины
Эндогенные цитокины Ιί-Ι, ΤΝΡ-α, 1Ь-6
Повышающая регуляция 1Ь-1, ΤΝΡ-α, 1Ь-6, ΙΓΝ-α, ]ΝΕ-β,
хемокины
Стимуляция продукта ревматических 1Ь-1,Ш-6,Ш-11, ΤΝΡ-α, ΙΝΓ-γ, ΤΌΕ-β,
проб ЫЕ, О8М, СЫТГ
Хемоаттрактантные цитокины
СХС хемокины Ш-8, РЕ-4, РВР, ΝΑΡ-2, β-ΤΟ
СС хемокины ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, МСР-1, МСР-2, МСР-
3, ΕΛΝΤΕ8
С хемокины Лимфотактин
Стимуляция воспалительных цитокинов Ш-12
ΤΟΕ-β: трансформирующий фактор роста, ΜΕ: ингибиторный фактор лейкемии; О8М: онкостатин М; ί,’ΝΤΕ: цилиарный нейротрофический фактор; ΡΕ-4: тромбоцитарный фактор 4; РВР: тромбоцитарный основной белок; ΝΑΡ-2: активирующий нейтрофилы белок 2; β-ΤΟ: β-тромбоглобулин; ΜΙΡ: воспалительный белок макрофага; МСР: хемоаттрактантный белок моноцита.
Повышающая регуляция воспалительной реакции также выполняется 1Ь-11, ΙΕΝ-α, ΙΕΝ-β и особенно членами суперсемейства хемокинов. ΤΟΕ-β в некоторых ситуациях имеет ряд воспалительных активностей, включающих хемоаттрактантные эффекты на нейтрофилы, Т-лимфоциты и инактивированные моноциты.
- 26 009955
Ш-2
Из-за центральной роли системы 1Б-2/1Б-2В в опосредовании иммунного и воспалительного ответов очевидно. что контролирование и манипулирование этими системами имеют важные диагностические и терапевтические последствия. 1Ь-2 показал себя как возможное противоопухолевое лекарственное средство в силу его способности стимулировать пролиферацию и активность опухолеатакующих ЬАК и Т1Б (опухолеинфильтрующие лимфоциты) клеток. Однако проблемы токсичности 1Ь-2 по-прежнему беспокоят и заслуживают исследования. Настоящее изобретение направлено на решение этой проблемы.
Ш-15
Интерлейкин 15 (Ш-15) - это новый цитокин. имеющий многие биологические свойства. общие с ГБ-2. но не имеющий аминокислотной последовательности. гомологичной 1Ь-2. ГС-15 был первоначально идентифицирован в среде. кондиционированной с обезьяньей почечной эпителиальной клеточной линией (СVI/ЕВNΑ). исходя из его митогенной активности на мышиную Т-клеточную линию. СТЬЬ-2. ГС-15 также был независимо открыт как цитокин. продуцируемый человеческими зрелыми Т-клетками линии клеток лейкемии (НиТ-102). который стимулировал пролиферацию Т-клеток и был обозначен Ш-Т. В силу его активности как стимулятора Т-клеток. ΝΚ клеток. ГАК клеток и ТШ8. Ш-2 в настоящее время проходит клинические испытания для определения его потенциального использования в лечении рака и вирусных инфекций. Из-за его похожих биологических активностей ГС-15 должен иметь похожий терапевтический потенциал.
Хемокины
Хемокины являются суперсемейством очень маленьких секретированных белков. которые принимают участие в движении лейкоцита. рекрутинге и рециркуляции. Они также играют решающую роль во многих патофизиологических процессах. таких как аллергическая реакция. инфекционные и аутоиммунные заболевания. ангиогенез. воспаление. рост опухоли и кроветворное развитие. Приблизительно 80% этих белков имеют от 66 до 78 аминокислот в их природной форме. Остальные больше и содержат дополнительные аминокислоты. расположенные против ядра белка или в виде части удлиненного С-концевого сегмента. Все хемокины сигнализируют через 7 трансмембранных доменов С-протеин спаренных рецепторов. Известно по меньшей мере 17 хемокиновых рецепторов. и многие из этих рецепторов проявляют нерегулярные связывающие свойства. в результате чего самые различные хемокины могут сигнализировать через одинаковый рецептор.
Хемокины делят на подсемейства. исходя из консервативных звеньев аминокислотной последовательности. Члены наибольшего семейства имеют по меньшей мере 4 консервативных цистеиновых остатка. которые образуют 2 внутримолекулярные дисульфидные связи. Подсемейства определяют по положению первых двух цистеиновых остатков.
Альфа-подсемейство. также называемое СХС хемокины. имеет 1 аминокислоту. разделяющую первых два цистеиновых остатка. Эта группа может быть затем подразделена. исходя из присутствия или отсутствия д1и-1еи-агд (ЕСЕ) аминокислотного звена. предшествующего первому цистеиновому остатку. В настоящее время имеется 5 СХС-специфичных рецепторов. и они обозначены СХСВ1-СХСВ5. ЕБШ хемокины связывают СХСЕ2 и. в основном. действуют как нейтрофильные хемоаттрактанты и активаторы. ЕСЕ хемокины связывают СХСЕ3-5 и действуют. в первую очередь. на лимфоциты. Во время написания этой работы в научной литературе были описаны 14 различных человеческих генов. кодирующих СХС хемокины. с некоторым дополнительным разнообразием. вносимым путем альтернативного сплайсинга.
В бета-подсемействе. также называемом СС хемокины. первых два цистеина являются смежными друг с другом без промежуточной аминокислоты. В настоящее время известны 24 индивидуальных члена человеческого бета-подсемейства. Рецепторы для этой группы обозначены ССК1-ССК11. Клетки-мишени для различных членов СС семейства включают большинство типов лейкоцитов.
Известны два белка с гомологией хемокина. которые выпадают из альфа- и бета-подсемейств. Лимфотактин является единственным членом гамма-класса (С хемокин). который потерял первый и третий цистеины. Лимфотактиновый рецептор обозначен ХСВ1. Фракталкин. единственный известный член дельта-класса (СХ3С хемокин). имеет три промежуточные аминокислоты между первыми двумя цистеиновыми остатками. Эта молекула уникальна среди хемокинов. так как является трансмембранным белком с Ν-концевым хемокиновым доменом. слитым с длинным муциноподобным звеном. Фракталкиновый рецептор известен как СХ3СЕ1.
УЕСЕ
Настоящее изобретение также применимо к сосудистому эндотелиальному фактору роста (УЕСЕ). Ангиогенез - это процесс развития новых кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой системы. Он играет существенную роль в эмбриональном развитии. нормальном росте тканей. заживлении ран. репродуктивном цикле у женщин (т.е. овуляция. менструация и плацентарное развитие). а также главную роль во многих заболеваниях. Особый интерес сосредоточен на раке. так как опухоли не могут расти сверх нескольких миллиметров без развития нового кровоснабжения. Ангиогенез также необходим для распространения и роста опухолевых метастазов.
Одним из наиболее важных факторов роста и жизнеспособности эндотелия является УЕСЕ. УЕСЕ стимулирует ангиогенез и пролиферацию эндотелиальных клеток. и он играет важную роль в регуляции
- 27 009955 васкулогенеза. УБОР представляет собой гепаринсвязанный гликопротеин, который секретируется в виде гомодимера в 45 кДа. Большинство видов клеток, но обычно не сами эндотелиальные клетки, секретируют УЕОР. Так как первоначально открытый УЕОР, УЕОР-А, увеличивает сосудистую проницаемость, он был известен как фактор сосудистой проницаемости. Кроме того, УЕОР вызывает расширение сосудов, в некоторой степени через стимуляцию нитроксидсинтазы в эндотелиальных клетках. УЕОР может также стимулировать клеточную миграцию и ингибировать апоптоз. Имеется несколько сплайсвариантов УЕОР-А. Главные из них включают 121, 165, 189 и 206 аминокислот, и каждый содержит специфичный экзон присоединения.
ЕМАР II
Эндотелиальный моноцитактивирующий полипептид-11 (ЕМАР-ΙΙ) является цитокином, который является антиангиогенным фактором в сосудистом развитии опухоли, и сильно ингибирует рост опухоли. Рекомбинантный человеческий ЕМАР-ΙΙ представляет собой белок в 18,3 кДа, содержащий 166 аминокислотных остатков. Также было найдено, что ЕМАР-ΙΙ увеличивает проницаемость эндотелиальных сосудов.
РИОР
Было сделано предположение, что антогонисты тромбоцитарного фактора роста (РИОР) должны увеличивать лекарственное накопление и терапевтические эффекты широкого ряда противоопухолевых агентов в обычных твердых опухолях. РИОР является цитокином в 30 кДа, и выделяется тромбоцитами на ране, и стимулирует близлежащие клетки к росту и заживлению раны.
РИ-ЕСОР
Как предполагает его название, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (РИ-ЕСОР) был первоначально выделен на основании его способности вызывать митоз в эндотелиальных клетках. Его родственным белком является глиостатин.
Нацеливающий модуль
Мы нашли, что терапевтический индекс цитокинов может быть увеличен путем хоминга нацеливающего цитокина к опухолевым сосудам. Кроме того, так как известно, что опухолевые клетки могут формировать часть выстилки опухолевой сосудистой системы, настоящее изобретение охватывает нацеливание как прямо на опухолевые клетки, так и на опухолевую сосудистую систему. Любые подходящие нацеливающие модули на опухоли или опухолевую сосудистую систему (особенно эндотелиальные клетки) могут быть использованы в конъюгате по настоящему изобретению. Многие такие нацеливающие модули известны, эти фрагменты и любые другие, которые впоследствии станут доступны, охватываются объемом настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения нацеливающй фрагмент представляет собой связывающий партнер, такой как лиганд, рецептора, экспрессируемого опухолевой клеткой, или связывающий партнер, такой как антитело, к маркеру или компоненту внеклеточного матрикса, ассоциированного с опухолевыми клетками. Наиболее предпочтительным нацеливающим модулем является связывающий партнер, такой как лиганд, рецептора, экспрессируемого опухолево-ассоциированными сосудами, или связывающий партнер, такой как антитело, к эндотелиальному маркеру или компоненту внеклеточного матрикса, ассоциированного с ангиогенными сосудами. Термин связывающий партнер используется здесь в самом широком его смысле и включает как природные, так и синтетические связывающие домены, включая лиганды и антитела или их связывающие фрагменты. Таким образом, указанный связывающий партнер может быть антителом или его фрагментом, таким как РаЬ, Ру, одноцепочечный Ру, пептид или пептидомиметик, а именно пептидоподобная молекула, способная связываться с рецептором, маркером внеклеточного компонента клетки.
Далее представлены нелимитирующие примеры подходящих нацеливающих доменов и рецепторов/маркеров, на которые может быть нацелен конъюгат.
СИ13
Неожиданно было найдено, что терапевтический индекс определенных цитокинов может быть заметно улучшен и их иммунотерапевтические свойства могут быть повышены путем спаривания с лигандом рецептора аминопептидазы-Ν (СИ13). СИ13 является трансмембранным гликопротеином в 150 кДа, высококонсервативным в различных биотипах. Он экспрессируется как на нормальных клетках, так и в миелоидных опухолевых линиях, в ангиогенный эндотелий и некоторый эпителий. СИ13 рецетор обычно идентифицируют как '^ОВ рецептор, в котором его пептидные лиганды разделяет аминокислотное '^ОВ звено. Предпочтительно лиганд представляет собой прямой или циклический пептид, содержащий звено NОΚ, такой как СNОΚСУ8ОСАОΚС, NОΚАΗА, ОNОΚО, циклоСУРУОВМЕС или циклоСNОΚС или более предпочтительно пептид СNОΚС. Более подробное описание можно найти в нашей заявке \¥О 01/61017, которая включена здесь в виде ссылки.
ΤΝΕ рецептор
Как и члены ΤΝΕ суперсемейства, члены суперсемейства ΤΝΕ рецептора (ΤΝΕΒδΕ) также разделяют ряд общих свойств. В частности, молекулы в ΤΝΓΚίΤ - все типа Ι (Ν-концевые внеклеточные) гликопротеины, содержащие 1-6 лигандсвязывающих, цистеинобогащенных звеньев из 40 аминокислотных остатков во внеклеточном домене. Кроме того, функциональные члены ΤΝΕΒΞΕ обычно являются тримерными или мультимерными комплексами, которые стабилизируются внутрицистеиновыми дисуль
- 28 009955 фидными связями. В отличие от большинства членов ΤΝΕ8Ε, члены ΤΝΕΚ8Ε существуют и в мембранно-связанной, и в растворимой формах. И, наконец, хотя гомология аминокислотной последовательности в цитоплазматических доменах членов суперсемейства не превышает 25%, ряд рецепторов способен трансдуцировать апоптотические сигналы в различные клетки, предполагая общие функции.
СЭ40
СЭ40 представляет собой трансмембранный гликопротеин в 50 кДа, содержащий 277 аминокислотных остатков, очень часто ассоциируемый с В-клеточной пролиферацией и дифференциацией. Экспрессированный на различных типах клеток СЭ40 кДНК кодирует 20 аминокислотных сигнальных последовательностей, 173 аминокислотные внеклеточные области, 22 аминокислотных трансмембранных сегмента и 62 аминокислотных цитоплазматических домена. Имеется 4 цистеинобогащенных звена во внеклеточной области, которые сопровождаются околомембранной последовательностью, богатой серинами и треонинами. Известные клетки для экспрессии СЭ40 включают эндотелиальные клетки.
ΤΝΕΚΙ/ρ55/00120η
ΤΝΕΚΙ представляет собой трансмембранный гликопротеин в 55 кДа, содержащий 455 аминокислотных остатков, который, вероятно, экспрессируется практически всеми содержащими ядро клетками млекопитающих. Молекула имеет 190 аминокислотных внеклеточных областей, 25 аминокислотных трансмембранных сегментов и 220 аминокислотных цитоплазматических доменов. Оба, и ΤΝΕ-α, и ΤΝΕβ, связываются с ΤΝΕΚΙ. Среди ряда клеток, экспрессирующих ΤΝΕΚΙ, имеются эндотелиальные клетки.
ΤΝΕΚΙΙ/ρ75/ί.Ό120ό
Человеческий ΤΝΕΚΙΙ представляет собой трансмембранный гликопротеин в 75 кДа, содержащий 461 аминокислотный остаток, первоначально выделенный из библиотеки человеческих легочных фибробластов. Этот рецептор состоит из 240 аминокислотной внеклеточной области, 27 аминокислотных трансмембранных сегментов и 173 аминокислотных цитоплазматических доменов. Были идентифицированы растворимые формы ΤΝΕΚΙΙ, являющиеся, вероятно, результатом протеолитического расщепления с помощью металлопротеиназы, названной ΤΚΚΕ (энзим, высвобождающий ΤΝΕ-рецептор). Процесс выпадения происходит независимо от растворимости ΤΝΕΚΙΙ. Среди множества клеток, экспрессирующих ΤΝΕΚΙΙ, имеются эндотелиальные клетки.
СЭ134Б/ОХ40Б
ОХ40, рецептор для ОХ40Б, является маркером активации Т-клеток с ограниченной экспрессией, который, по-видимому, промотирует выживание (и возможно пролонгирует иммунный ответ) СЭ4' Тклеток на сайтах воспаления. ОХ40Б также проявляет ограниченную экспрессию. Недавно сообщалось, что только активированные СЭ4+, СЭ8' Т-клетки, В-клетки и сосудистые эндотелиальные клетки экспрессируют этот фактор. Человеческий лиганд представляет собой гликозилированный полипептид в 32 кДа, содержащий 183 аминокислотных остатка, который состоит из 21 аминокислотного цитоплазматического домена, 23 аминокислотных трансмембранных сегментов и 139 аминокислотных внеклеточных областей. Семейство νΕΟΕ рецептора
Имеется 3 рецептора в семействе νΕΟΕ рецептора. Они имеют общие свойства мультиплетных неподобных внеклеточных доменов и активность тирозинкиназы. Домены энзимов νΕΟΕ рецептора 1 (νΕΟΕ К1, также известный как Ε1!-1), νΕΟΕ К2 (также известный как ΚΌΚ или Е1к-1) и νΕΟΕ К3 (также известный как Ε1!-4) делятся инсерционной последовательностью. Эндотелиальные клетки также экспрессируют дополнительные νΕΟΕ рецепторы, нейрофиллин-1 и нейрофиллин-2. νΕΟΕ-А связывается с νΕΟΕ К1 и νΕΟΕ К2 и нейрофиллином-1 и нейрофиллином-2. Ρ1ΟΕ и νΕΟΕ-В связывают νΕΟΕ К1 и нейрофиллин-1. νΕΟΕ-С и -Ό связывают νΕΟΕ К3 и νΕΟΕ К2. Также было найдено, что Ш\;-1а1 и производные от него пептиды нацеливают νΕΟΕΚ.
ΡΌΟΕ рецепторы
ΡΌΟΕ рецепторы экспрессировали в стромальный компартмент в большинство обычных твердых опухолей. Ингибирование стромально экспрессированных ΡΌΟΕ рецепторов на модели рака ободочной кишки у крыс понижало давление опухолевой интерстециальной жидкости и увеличивало опухолевый транскапиллярный транспорт.
Ρ§ΜА
Простатаспецифичный мембранный антиген ^БМА) также является превосходным опухолевым эндотелиальным маркером и может генерировать Ρ§ΜА антитела.
Молекулы клеточной адгезии (САМ§)
Молекулы клеточной адгезии (САМ§) представляют собой белки клеточной поверности, вовлеченные в связывание клеток, обычно лейкоцитов, друг с другом, эндотелиальными клетками или внеклеточным матриксом. Специфические сигналы, продуцируемые в ответ на ранение и инфекцию, контролируют экспрессию и активацию определенных из этих молекул адгезии. Взаимодействия и ответы, затем инициированные путем связывания этих САМ§ с их рецепторами/лигандами, играют важные роли в опосредовании воспалительных и иммунных реакций, которые составляют одну линию защиты тела против этих поражений. Большинство охарактеризованных до сих пор САМ§ распадаются на три основных семейства белков: суперсемейство иммуноглобулина (И), семейство интегрина и семейство селектина.
- 29 009955
Член семейства селектина молекул клеточной поверхности Ь-селектин состоит из ИН2-концевого лектинового типа С-домена, ЕСЕ-подобного домена, 2 комплементных контрольных доменов, 15 аминокислотных спейсеров, трансмембранной последовательности и короткого цитоплазматического домена.
Были идентифицированы 3 лиганда для Ь-селектина на эндотелиальных клетках, все содержащие О-гликозилированный муцин или муцинподобные домены. Первый лиганд, С1уСАМ-1, экспрессируется почти исключительно в высокоэндотелиальные венулы периферийных и брыжеечных лимфатических узлов. Вторым лигандом Ь-селектина, первоначально названным §др90, как теперь показано, является СЭ34. Этот сиаломуцинподобный гликопротеин, часто используемый как поверхностный маркер для очистки плюрипотентных стволовых клеток, проявляет сосудистую экспрессию в широком диапазоне нелимфоидных тканей, а также на капиллярах периферийных лимфоузлов. Третьим лигандом для Ьселектина является МабСАМ 1, муцинподобный гликопротеин, найденный на высокоэндотелиальных венулах лимфатических узлов слизистой оболочки.
Р-Селектин, член семейства селектина молекул клеточной поверхности, состоит из ИН2-концевого лектинового типа С-домена, ЕСЕ-подобного домена, 9 комплементных контрольных доменов, трансмембранного домена и короткого цитоплазматического домена.
Тетрасахаридсиалил Ье\\'Ьх (§Ьех) был идентифицирован как лиганд для Р- и Е-селектина, но Р-, Еи Ь-селектины могут все связывать &Ьех и §Ьеа при определенных условиях. Также сообщалось, что Р-селектин селективно связывается с гликопротеином в 160 кДа, присутствующим на мышиных миелоидных клетках, и с гликопротеином на миелоидных клетках, кровяных нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах, названным гликопротеиновым лигандом Р-селектина (Р8СЬ-1), этот лиганд может также связывать Е-селектин. Р-Селектинопосредованный роллинг лейкоцитов может быть полностью ингибирован моноклональным антителом, специфичным для Р8ЬС-1, предполагается, что, хотя Р-селектин может связываться с различными гликопротеинами в условиях ίη νίΐτο, похоже, что физиологически важное связывание сильно ограничено. Ряд доказательств подтверждает, что Р-селектин вовлекается в адгезию миелоидных клеток, а также В- и субпопуляции Т-клеток с активированным эндотелием.
1д суперсемейство САМ§
1д суперсемейство САМ§ представляет собой кальцийнезависимые трансмембранные гликопротеины. Члены 1д суперсемейства включают молекулы внутриклеточной адгезии (1САМ§), молекулу сосудисто-клеточной адгезии (УСАМ-1), молекулу тромбоцит-эндотелиально-клеточной адгезии (РЕСАМ-1) и молекулу нейроклеточной адгезии (ИСАМ). Каждый член 1д суперсемейства САМ имеет внеклеточный домен, который содержит несколько 1д-подобных внутрицепочечно дисульфидно-связанных цепей с консервативными цистеиновыми остатками, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, который взаимодействует с цитоскелетом. Обычно они связывают интегрины или другие члены 1д суперсемейства САМ§. Нейронные САМ§ могут вовлекаться в нейронный паттернинг. Эндотелиальные САМ§ играют важную роль в иммунном ответе и воспалении.
Более подробно, молекула сосудисто-клеточной адгезии (УСАМ-1, СЭ106. или ГИСАМ-НО), молекула тромбоцит-эндотелиально-клеточной адгезии (РЕСАМ-1/СЭ31) и молекулы внутриклеточной адгезии 1, 2 и 3 (1САМ-1, 2 и 3) являются 5 функционально родственными САМ/1д8Е молекулами, которые существенно вовлечены в лейкоцитсвязывающая ткань/эндотелиальная клетка взаимодействия. Экспрессированные, главным образом, на эндотелиальных клетках, эти молекулы, в основном, регулируют миграцию лейкоцитов через стенки кровеносных сосудов, и предоставляют точки крепления для развития эндотелия во время ангиогенеза, и все являются пригодными для нацеливания в настоящем изобретении.
Человеческий СЭ31 является трансмембранным гликопротеином типа I (внеклеточный Ν-конец) в 130 кДа, который принадлежит к молекулам клеточной адгезии (САМ) или С2-подобной подгруппе 1д8Е1. Зрелая молекула имеет 711 аминокислотных остатков в длину и содержит внеклеточную область из 574 аминокислотных остатков, трансмембранный сегмент из 19 аминокислотных остатков и цитоплазматический хвост из 118 аминокислотных остатков. Во внеклеточной области имеется 9 потенциальных Ν-взаимносвязанных сайтов гликозилирования, и, с прогнозируемой молекулярной массой от 80 кДа, многие из этих сайтов оказались занятыми. Наиболее замечательной чертой этой внеклеточной области является наличие шести 1д-гомологических единиц, которые похожи на С2 домены 1д8Е. Хотя они отличаются, присутствие этих модулей является общей чертой всех 1д8Е адгезионных молекул (1САМ-1, 2, 3 и УСАМ-1).
Интегрины
Интегрины являются нековалентно связанными гетеродимерами из α и β субъединиц. На настоящее время идентифицированы 16 α субъединиц и 8 β субъединиц. Их можно объединять различными путями с образованием разных типов интегриновых рецепторов. Лигандами для различных интегринов являются адгезивные внеклеточные матриксные (ЕСМ) белки, такие как фибронектин, витронектин, коллагены и ламинин. Многие интегрины распознают аминокислотную последовательность ВСЭ (аргинин-глицинаспарагиновая кислота), которая присутствует в фибронектине или других адгезивных белках, с которыми они связываются. Петиды и белковые фрагменты, содержащие РСЭ последовательность, могут использоваться для того, чтобы модулировать активность ΚΌΌ-распознающих интегринов. Таким образом,
- 30 009955 настоящее изобретение может применять в качестве нацеливающего модуля пептиды, распознаваемые интегринами. Эти пептиды условно известны как КСЭ-содержащие пептиды. Эти пептиды могут включать пептиды, звенья которых были идентифицированы как связывающиеся с интегринами. Эти звенья включают аминокислотные последовательности: ΌΟΚ, ΝΟΚ и СРСЭС. Пептидные звенья могут быть линейными или циклическими. Такие звенья описаны более детально в следующих патентах, которые здесь включены путем ссылки в отношении описания РСЭ пептидов: патент США 5536814, в котором описаны СКСЭСЬ, СКСЭСА и САСКСЭСЬСА; патент США 4578079, относящийся к синтетическим пептидам формулы Х-КСЭ-Т/С-Υ, где X и Υ являются аминокислотами. В патенте США 5547936 описан пептид, содержащий последовательность Х-ВСЭ-ХХ. где X - аминокислота. В патенте США 4988621 описан ряд ВСЭ-содержащих пептидов. В патенте США 4879237 описан общий пептид формулы ΒΟΌ-Υ, где Υ - аминокислота, и пептид С-РСЭ-АР. В патенте США 5169930 описан пептид ΒΟΌ8ΡΚ, который связывается с αν β1 интегрином. Патенты США 5498694 и 5700908 относятся к цитоплазматическому домену субъединицы β3 интегрина, который, строго говоря, не является РСЭ-содержащим пептидом, хотя он содержит последовательность РСЭ. В νΟ 97/08203 описаны циклические пептиды, которые являются структурными миметиками или РСЭ-связанными сайтами. В патенте США 5612311 описаны 15 ВСЭ-содержащих пептидов, которые являются циклизируемым эфиром через С-С связывание или через другие группы, такие как аналоги пенициламина или меркаптопропионовой кислоты. В патенте США 5672585 описана общая формула обобщающих ВСЭ-содержащих пептидов. Предпочтительной группой пептидов являются те, где остаток аспарагиновой кислоты РСЭ превращен в Ометокситирозиновое производное. В патенте США 5120829 описаны РСЭ сайт связывания, промотирующий прилипание клеток, и гидрофобный домен прилипания. Ό-форма описана в патенте США 5587456. В патенте США 5648330 описан циклический ВСЭ-содержащий пептид, который имеет высокое сродство к СР ПЬ/Ша.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нацеливающий модуль является лигандом αν β3 или αν β5 интегрина.
Ранее сообщалось о применении ανβ3 лигандов для транспортировки цитотоксических химиотерапевтических лекарственных средств к опухолям (νΡΙ 99-215158/199918). Однако в этой заявке идея заключалась в доставке к опухолевым сосудам токсичных соединений, таких как химиотерапевтические лекарственные средства, или токсины, или антиангиогенные соединения.
И, по контрасту, ΤΝΡ является активатором эндотелиальных и имунных клеточных функций, лучшим, чем ингибитор или токсическое соединение.
Например, ΤΝΡ, верно, является проангиогенной молекулой, а не антиангиогенной молекулой. Кроме того, несмотря на то, что ΤΝΡ был открыт благодаря его цитотоксичности против некоторых линий опухолевых клеток, хорошо известно, что ΤΝΡ редко может убивать клетки в культуре, если защитные механизмы не блокированы (например, ингибиторами транскрипции/трансляции).
Поэтому казалось, что противоопухолевая активность ΤΝΡ основана на его активирующих эффектах на разных клетках и мало или не направляет цитотоксические эффекты на опухолевые клетки или эндотелиальные клетки. В этом контексте ΤΝΡ выглядел бы как модификатор биологического ответа, а не как классическое цитотоксическое соединение.
Таким образом, терапевтические свойства ΤΝΡ, доставленного ανβ3, являются неочевидными только на основании раскрытия в патенте νΡΙ 99-215158/199918.
Молекулы, содержащие АСОСЯСПСРСС звено, предполагались для нацеливания активированных мышиных, а также человеческих сосудов (72). Таким образом, можно ожидать, что человеческий РСЭΤΝΡ обладает лучшими противоопухолевыми свойствами, чем человеческий ΤΝΡ у пациентов, как мы наблюдали с мышиными аналогами у мышей.
Максимально допустимая доза при болюсном введении ΤΝΡ (внутривенно) у человека составляет 218-410 мкг/м2 (28), примерно в 10 раз ниже, чем эффективная доза у животных (29). Основываясь на данных, полученных на мышиных моделях, мы посчитали, что необходима в 10-50 раз большая доза для достижения противоопухолевого эффекта у людей (35). В первом клиническом изучении на гипертермической изолированной перфузии конечности высокие скорости ответа были получены с единственной дозой 4 мг ΤΝΡ в комбинации с мелфаланом и интерфероном-γ (32). Другие работы показали, что интерфероном-γ можно пренебречь и что даже меньшие дозы ΤΝΡ могут быть успешными для вызова терапевтического ответа (33, 34). Так как даже это лечение не свободно от риска токсичности (35), использование ЯСЭ-ΤΝΡ может представлять альтернативный подход к снижению токсических эффектов, по меньшей мере, в этом положении.
Кроме того, ЯСЭ-ΤΝΡ кДНК могла бы быть использована для целей генной терапии вместо гена ΤΝΡ (76), тогда как биотинилированный РСЭ-ΤΝΡ мог бы применяться, в принципе, в комбинированном опухолевом предварительном нацеливании с биотинилированным антителом и авидином (71) для дальнейшего увеличения его терапевтического индекса.
Активин
Клетки, известные для экспрессии Ае1КП, включают эндотелиальные клетки. ΛοίΡΙΙΒ экспрессия
- 31 009955 очень похожа на экспрессию Лс®И и также была найдена в эндотелиальных клетках. Клетки, известные для экспрессии Ас1К1, включают сосудистые эндотелиальные клетки. Лс1й1В также был идентифицирован в эндотелиальных клетках.
Ангиогенин
Ангиогенин (ΑΝΟ) является негликозилированным полипептидом с молекулярной массой 14 кДа, названным так за его способность вызывать рост новых кровеносных сосудов.
Аннексин V
Аннексин V является членом семейства кальциевых и фосфолипидных связанных белков с сосудистой антикоагулянтной активностью. Существуют различные синонимы аннексина V: плацентарный протеин 4 (РР4), плацентарный антикоагулянтный протеин I (РАР I), калфобиндин I (СРВ-1), кальцийзависимый фосфолипидсвязывающий протеин 33 (СаВР33), сосудистый антикоагулянтный протеин альфа (УАСа), анхорин СП, липокортин-ν, эндонексин II и ингибитор тромбопластина. Ряд сайтов связывания для аннексина V был описан как 6-24х106/клетка в опухолевых клетках и 8,8х106/клетка для эндотелиальных клеток.
СО44
Другой молекулой, возможно вовлеченной в адгезию лейкоцитов (белых клеток), является СИ44, молекула, повсеместно экспрессированная как на кроветворных, так и некроветворных клетках. СО44 замечательна ее способностью генерировать альтернативно сплайсированные формы, многие из которых различаются по их активности. Их выдающаяся пластичность привела к предположению, что СО44 через ее изменяющуюся природу играет роль в некоторых способах, которые используют опухолевые клетки для успешного развития в течение роста и метастазирования. СИ44 представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I (внеклеточный Ν-конец) в 80-250 кДа. Клетки, известные для экспрессии СИ44Н, включают сосудистые эндотелиальные клетки.
Имеется множество лигандов для СИ44, включая остеопонтин, фибронектин, коллаген типов I и IV и гиалуронат. Сообщается, что связывание с фибронектином ограничивается вариантами СИ44, экспрессирующими хрондроитин сульфат, с сайтом прилипания хрондроитина сульфата, локализованным в экзонах ν8-ν11. Предполагается, что гиалуронатное связывание возможно практически со всеми СИ44 изоформами. Предполагается, что один из основных сайтов связывания сосредоточен в экзоне 2 и включает остатки лизина и аргинина. Обнаружены также другие, чем простая экспрессия известного гиалуронатсвязывающего звена, факторы, необходимые для связывания гиалуроната. Успешному связыванию гиалуроната способствует объединение экспрессируемых экзонов, особенности цитоплазматического хвоста, гликозилированные структуры и состояние активности клеток. Таким образом, на основе его гиалуронатсвязывающей функции, большая доля потенциальной пластичности существует внутри каждой СИ44-экспрессирующей клетки.
Фактор роста фибробластов (ТОТ)
Название фактор роста фибробластов (ТОТ) является ограничивающим описанием для этого семейства цитокинов. Функция ТОТ не ограничивается ростом клеток. Хотя некоторые ТОТ§, действительно, вызывают пролиферацию фибробластов, первоначальная молекула ТОТ (ТОТ-2 или основная ТОТ), как теперь известно, также вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток, хондроцитов, гладких мышечных клеток, меланоцитов, а также других клеток. Он может также промотировать дифференциацию адипоцитов, вызывать продуцирование Ш-6 макрофагами и фибробластами, стимулировать миграцию астроцита и пролонгировать нейронное выживание. На настоящее время суперсемейство ТОТ состоит из 23 членов, все из которых содержат консервативную центральную область из 120 аминокислотных остатков, которая содержит 6 идентичных вставленных аминокислот.
ТОТ-1.
Человеческий ТОТ-1 (также известный как ТОТ кислотный, ТОТа, ЕСОТ и НВОТ-1) представляет собой негликозилированный полипептид в 17-18 кДа, который экспрессируется разными клетками всех трех зародышевых слоев. Связывающей молекулой может быть любой ТОТ рецептор. Клетки, известные для экспрессии ТОТ-1, включают эндотелиальные клетки.
ТОТ-2.
Человеческий ТОТ-2, также известный как ТОТ основной, НВОТ-2 и ЕИОТ, представляет собой негликозилированный полипептид в 18 кДа, который проявляет и внутриклеточную и внеклеточную активность. После секреции ТОТ-2 секвестируется на любой клеточной поверхности Н8 или матриксных гликозаминогликанах. Хотя ТОТ-2 секретируется как мономер, клеточная поверхность Н8, кажется, димеризует мономерный ТОТ-2 в нековалентную бок-в-бок конфигурацию, которая вспоследствии способствует димеризации и активации ТОТ рецепторов. Клетки, известные для экспрессии ТОТ-2, включают эндотелиальные клетки.
ТОТ-3.
Человеческий ТОТ-3 представляет собой продукт ίηΐ-2 гена (т.е. извлеченный из области интеграции 2, области на хромосоме 7 мыши, которая содержит ген (Ш1-2/ТОТ-3), случайно активированный последующей ретровирусной инсерцией). Молекула синтезирована как гликопротеин с молекулярной массой 28-32 кДа, состоящий из 222 аминокислот, который содержит ряд пептидных звеньев. Сообщалось,
- 32 009955 что клетки для экспрессии ЕСЕ-3 ограничены развивающимися клетками и опухолями. Опухоли для экспрессии ЕСЕ-3 включают клеточные линии карциномы молочной железы и рака ободочной кишки.
ЕСЕ-4.
Человеческий ЕСЕ-4 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 22 кДа, состоящий из 176 аминокислот, который является продуктом развивающе-регуляторного гена. Молекула была синтезирована как предшественник из 206 аминокислот, который содержит большую неопределенную 30 аминокислотную сигнальную последовательность плюс два гепаринсвязанных звена (при аминокислотах 51-55 и 140-143). Гепаринсвязанные участки непосредственно связаны с активностью ЕСЕ-4; гепарин/гепаран регулирует способность ЕСЕ-4 к активации ЕСЕК1 и ЕСЕК2. Клетки, известные для экспрессии ЕСЕ-4, включают опухолевые клетки и эмбриональные клетки. Его идентификация в раке желудка человека дала толчок к одному альтернативному обозначению (/Й81-1/Й81), в то время как его выделение из саркомы Капоши заложило основу для другого названия (К-ЕСЕ).
1Ь-1К
1Ь-1 проявляет свое влияние путем связывания специфических рецепторов. Были идентифицированы два отдельных белка, связывающих 1Ь-1 рецептор, плюс один несвязывающий сигнализирующий акцессорный белок.
Каждый имеет три внеклеточных иммуноглобулиноподобных (1д-подобных) домена, квалифицирующих их в качестве членов семейства рецепторов цитокинов типа IV. Два связывающих рецептор белка определены как 1Ь-1 рецептор типа I (1Ь-1 К!) и 1Ь-1 рецептор типа II (1Ь-1 КН), соответсвенно. Человеческий 1Ь-1 Ш представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 80 кДа, состоящий из 522 аминокислот, который был выделен из эндотелиальных клеток.
КТК
Было найдено, что новое семейство тирозинкиназных рецепторов (КТК), Ерй рецепторы и лиганды эфринов вовлечены в сосудистую сборку, ангиогенез, опухолегенез и метастазирование. Было также найдено, что Ерй рецепторы класса А и их лиганды повышаются в опухоли и ассоциированной сосудистой системе.
ММР
Матриксные металлопротеиназы (ММР§) вовлечены в рост опухоли, ангиогенез, инвазию и метастазирование. Они также были предложены для использования в качестве опухолевых маркеров.
ЫС2
ЫС2 представляет собой большой полностью мембранный хондроитинсульфат протеогликан, который был впервые идентифицирован как молекула клеточной поверхности, экспрессируемая незрелыми невральными клетками. Впоследствии было найдено, что ЫС2 экспрессируется широким рядом незрелых клеток, а также разными типами опухолей с высокой злокачественностью. ЫС2 был предложен в качестве молекулы-мишени в опухолевой сосудистой системе. В частности, коллагеназа-1 (С1) является преобладающей матриксной металлопротеиназой, присутствующей во вновь образованных микрососудах, и служит как маркер неоваскуляризации.
Онкофетальный фибронектин
Также было найдено, что экспрессия онкофетального фрагмента фибронектина (Еи-ί) увеличивается во время ангиогенеза, и он был предложен в качестве маркера опухолевого ангиогенеза. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ является антителом или его фрагментом к онкофетальному ΕΌВ домену фибронектина. Получение такого антитела и его конъюгация с ГЕ-12 описаны Найи е1 а1. (2002) №1Ц.1гс Вю1есйио1оду 20: 264-269.
Тенасцин
Тенасцин является матриксным гликопротеином, встречающимся в злокачественных опухолях, включая рак мозга и рак молочной железы и меланому. Его экспрессия является злокачественной, но не вполне дифференцированные опухоли и ассоциация с кровеносными сосудами опухолей делают его не только важной мишенью для понимания биологии злокачественных опухолей и ангиогенеза, но и терапевтической раковой мишенью, а также маркером.
Нацеливающий модуль является предпочтительно полипептидом, который способен к связыванию с опухолевой клеткой или молекулой опухолевой сосудистой поверхности. Как и указанные выше, другие такие поверхностные молекулы, которые известны или становятся доступными, также могут быть нацелены в первую очередь.
Будет высоко оценен тот, кто сможет использовать обычное белковое связывание в способе идентификации молекул, которые связываются с поверхностными молекулами. Будет также высоко оценен тот, кто сможет использовать структурно-основанную лекарственную конструкцию для определения последовательностей, которые связывают поверхностные молекулы.
Высокопроизводительный скрининг, как описанный выше для синтетических соединений, также может быть использован для идентификации нацеливающих молекул.
Настоящее изобретение также предполагает использование конкурентоспособных методов скрининга лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные к связыванию мишени, специфически конкурируют с тестовыми соединениями для связывания мишени.
- 33 009955
Связывающий партнер (ВР)
Нацеливающий модуль, главным образом, имеет форму связывающего партнера (ВР) с поверхностной молекулой, содержащего или состоящего из одного или более связывающих доменов.
Лиганд
Нацеливающий модуль по настоящему изобретению может иметь форму лиганда. Лиганды могут быть природными или синтетическими. Термин лиганд также относится к химически модифицированным лигандам. Один или более связывающих доменов ВР могут состоять, например, из природного лиганда для рецептора, причем природный лиганд может быть молекулой адгезии, или лигандом рецептора фактора роста (например, эпидермального фактора роста), или фрагментом природного лиганда, который сохраняет связывающую способность к рецептору.
Синтетические лиганды включают конструктивные лиганды. Используемый здесь термин конструктивные лиганды относится к агентам, которые, вероятно, связываются с рецептором на основе сравнения их трехмерной формы и трехмерной формы рецептора.
Антитела
Альтернативно, связывающие домены могут быть получены из последовательностей тяжелых и легких цепей из вариабельной области иммуноглобулина (1д). Такая вариабельная область может быть получена из природного человеческого антитела или антитела другого вида, например антитела грызунов. Альтернативно, вариабельная область может быть получена из конструированного антитела, такого как гуманизированное антитело, или из библиотеки демонстрации фагов из иммунизированных или неиммунизированных животных или библиотеки демонстрации мутагенных фагов. В качестве второй альтернативы, вариабельная область может быть получена из одноцепочечного вариабельного фрагмента (δϋΡν). ВР может содержать другие последовательности для достижения мультимеризации или действовать как спейсер между связывающими доменами или образуется в результате инсерции рестрикционных сайтов в генах, кодирующих Вр, включая последовательности 1д петли или новые спейсеры и конструированные линкерные последовательности.
ВР может содержать дополнительно одну или более вариабельных областей иммуноглобулина, всю или часть константной области тяжелой цепи 1д и также может содержать природный целый 1д, конструктированный 1д, конструктированную 1д-подобную молекулу, одноцепочечный 1д или одноцепочечную 1д-подобную молекулу. Альтернативно или в дополнение, ВР может содержать один или более доменов из другого белка, такого как токсин.
Используемый здесь термин антитело относится к белку, содержащему один или более полипетидов, в основном, кодируемых генами иммуноглобулина или фрагментами генов иммуноглобулина. Антитела могут существовать как в виде интактного иммуноглобулина, так и в виде ряда фрагментов, включая полноохарактеризованные фрагменты, получаемые перевариванием с различными пептидазами. В то время как различные фрагменты антител определены на основе переваривания интактных антител, был бы высоко оценен тот специалист, который смог бы синтезировать фрагменты антител бе ηονο или химически, или используя технологию рекомбинантных ДНК. Таким образом, используемый здесь термин антитело также включает фрагменты антител, или полученные модификацией целого антитела, или синтезированные бе ηονο с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Фрагменты антител, охватываемые термином антитела, включают, но не ограничиваются ими, ЕаЬ. ЕаЬ'. В(аЬ')2, 5сЕу. Ρν, 6δΡν б^аЬοбу и Ρ6 фрагменты.
Изобретение также включает моноклональные или поликлональные антитела к поверхностным белкам. Таким образом, настоящее изобретение далее включает способ получения моноклональных или поликлональных антител к полипептидам по изобретению.
Если желательны поликлональные антитела, выбранное млекопитающее (например, мышь, кролик, коза, лошадь и т.д.) иммунизируют иммуногенным полипептидом, несущим эпитоп(ы). Сыворотку от иммунизированного животного собирают и обрабатывают по известным методикам. Если сыворотка, содержащая поликлональные антитела к эпитопу, содержит антитела к другим антигенам, то поликлональные антитела могут быть очищены иммуноаффинной хроматографией. Методики продуцирования и выделения поликлональной антисыворотки известны из уровня техники. Для того, чтобы такие антитела могли быть получены, изобретение также включает полипептиды по изобретению или их фрагменты, гаптенизированные другим полипептидом для использования в качестве иммуногена у животного или человека.
Моноклональные антитела, направленные против связывания эпитопов клеточной поверхности в полипептидах, могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методология для изготовления моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Иммортализованная антителопродуцирующая линия клеток может быть создана слиянием клеток, а также другими методиками, такими как прямая трансформация В-лимфоцитов с онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштейна-Барр. Панели моноклональных антител, полученных против эпитопов, могут быть исследованы на различные свойства, например изотопное и эпитопное сродство.
Альтернативный метод включает скрининг библиотек демонстрации фагов, где, например, фаг экспрессирует 5сΡν фрагменты на поверхности их оболочек с большим рядом комплементарно детермини
- 34 009955 рующих областей (СИЯк). Это метод хорошо известен из уровня техники.
Для целей этого изобретения термин антитело, если не указано противоположное, включает фрагменты целых антител, которые сохраняют их связывающую активность для антигена-мишени. Как указывалось выше, такие фрагменты включают Ρν, Г(аЬ') и Г(аЬ')2 фрагменты, а также одноцепочечные антитела (ксГу). Кроме того, антитела и их фрагменты могут быть гуманизированными антителами, например, как описано в ЕР-А-239400.
Скрининг
Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу скрининга агента, способного к связыванию с опухолью или молекулой опухолевой сосудистой клеточной поверхности, способу, включающему контактирование молекулы клеточной поверхности с агентом и детерминирование, если указанный агент связывает указанную молекулу клеточной поверхности.
Используемый здесь термин агент включает, но не ограничивается им, соединение, такое как тестовое соединение, которое может быть доступно или получено любым подходящим путем, природным или нет. Агент может быть сконструирован или доступен из библиотеки соединений, которая может содержать пептиды, а также другие соединения, такие как малые органические молекулы и особенно новые соединения свинца. Для примера, агент может быть природным веществом, биологической макромолекулой или экстрактом, полученным из биологических материалов, таких как бактерии, грибки или животные (предпочтительно млекопитающих) клетки или ткани, органической или неорганической молекулой, синтетическим тестовым соединением, полусинтетическим тестовым соединением, структурным или функциональным миметиком, пептидом, пептидомиметиком, производным тестового соединения, пептидом, отщепленным из целого белка, или пептидом, синтезированным искусственно (так, как в примере, или используя пептидный синтезатор) или рекомбинантными методиками или их комбинацией, рекомбинантным тестовым соединением, природным или неприродным тестовым соединением, слитым белком или его эквивалентом или мутантами, производными или их комбинациями.
Агент может быть аминокислотной последовательностью или их химическим производным. Вещество может быть даже органическим соединением или другим химикатом. Агент может быть нуклеотидной последовательностью, которая может быть смысловой последовательностью или антисмысловой последовательностью.
Белок
Термин белок включает одноцепочечные полипептидные молекулы, а также мультиплетные полипептидные комплексы, где индивидуальные составные полипептиды связаны ковалентным или нековалентным способом. Термин полипептид включает пептиды из 2 или более кислот в длину, обычно имеющие более 5, 10 или 20 аминокислот.
Гомологи полипептидов
Следует понимать, что последовательности полипептидов для использования в настоящем изобретении не ограничиваются индивидуальными последовательностями или их фрагментами, но также включают гомологичные последовательности, полученные любым путем, например родственные вирусно/бактериальные белки, клеточные гомологи или синтетические пептиды, а также варианты и их производные. Последовательности полипептидов по настоящему изобретению также включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по настоящему изобретению.
Варианты полипептидов, производные и фрагменты
Термины вариант или производное в отношении аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению включают любое замещение, вариацию, модификацию, перемещение, делецию или добавление одной (или более) аминокислот из или в последовательность, при условии, что результирующая аминокислотная последовательность предпочтительно имеет нацеливающую активность, предпочтительно имея по меньшей мере 25-50% активностиполипептидов, представленных в перечне последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере, по существу, такую же активность.
Таким образом, последовательности могут быть модифицированы для использования в настоящем изобретении. Обычно модификации делают, чтобы сохранить активность последовательности. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотное замещение может быть выполнено, например, 1, 2 или 3 и до 10, 20 или 30 замещений, при условии, что модифицированная последовательность сохраняет по меньшей мере около 25-50% активности или, по существу, имеет такую же активность. Однако в альтернативном варианте осуществления изобретения модификации аминокислотных последовательностей полипептидов по изобретению могут быть выполнены с целью снизить биологическую активность полипетида. Например, могут быть полезными усеченные полипептиды, которые сохраняют способность связывания с молекулой-мишенью, но теряют функциональные эффекторные домены.
В основном, предпочтительно менее чем 20, 10, 5% аминокислотных остатков вариантов или производных изменяются по сравнению с соответствующей областью, отображенной в перечне последовательности.
Аминокислотное замещение может включать использование не встречающихся в природе аналогов, например, чтобы увеличить период полураспада в плазме крови терапевтически введенного полипептида
- 35 009955 (см. ниже подробностим получения производных пептидов для использования в терапии).
Консервативное замещение может быть выполнено, например, в соответствии с нижеприведенной таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке второй колонки и предпочтительно в одной линии третьей колонки могут быть замещены друг другом.
Алифатическая Неполярная САР
II. V
Полярная-незаряженная С8ТМ
N0
Полярная-заряженная НЕ
кк
Ароматическая НЕ№У
Полипептиды по изобретению также включают фрагменты вышеуказанных полипептидов и их варианты, включая фрагменты последовательностей. Предпочтительные фрагменты включают те, которые включают эпитоп. Подходящие фрагменты будут по меньшей мере около 5, например 10, 12, 15 или 20 аминокислот в длину. Они могут быть также менее чем 200, 100 или 50 аминокислот в длину. Полипептидные фрагменты белков и аллельные и видовые варианты их могут содержать 1 или более (например, 2, 3, 5 или 10) замещений, делеций или инсерций, включая консервативные замещения. При выполнении замещений, делеций и/или инсерций, например, посредством рекомбинантной технологии предпочтительно изменяется менее чем 20, 10 или 5% аминокислотных остатков, отображенных в перечне последовательности.
Белки по изобретению обычно изготавливают рекомбинантными способами, например, как описано ниже. Однако они могут быть также изготовлены синтетическими способами с использованием методик, хорошо известных специалистам, таких как твердофазный синтез. Различные методики химического синтеза пептидов рассматривались Вог§1а аиб Р1е1б8, 2000, Τ^ЬΤес11. 18: 243-251 и описаны подробно в содержащихся там ссылках.
Получение
Способы получения ΕΌ13 Б-ΙΡΝ конъюгатов были описаны в №О 01/61017. Например, интерферон гамма может быть слит с СЫСКС пептидом методом генной инженерии или путем химического синтеза. Данная димерная структура интерферона гамма, конъюгаты, несущие два СЫСКС звена при Ν-конце или С-конце, предпочтительна для обеспечения мультивалентных высоко авидностных взаимодействий.
Используя похожие методы, можно получить СИСЭС-ΙΡΝ-γ конъюгаты для использования в комбинации с СЫСКС-ΤΝΡ.
Специалист в данной области техники может легко получить конъюгаты ανβ3Ε-ΤΝΡ с антителом или фрагментами антитела, которые нацеливают опухолевые клетки или опухолеассоциированные сосуды, для дальнейшего увеличения хоминга к опухоли этих производных ΤΝΡ. Например, ανβ3Ε-ΤΝΡ можно спарить с антителами против опухолеспецифических антигенов или против других опухолевых ангиогенных маркеров, например матриксные металлопротеазы (57) или сосудистый эндотелиальный фактор роста (58), или направленных против компонентов внеклеточного матрикса, такими как антитела антитенасцина или антифибронектиновый ΕΌΒ домен.
Конъюгат ανβ3Ε-ΤΝΡ может быть получен многими путями. Например, ανβ3Ε является антителом или его фрагментом, предпочтительно человеческого происхождения или несущим гуманизированный клеточный каркас. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ανβ3Ε является пептидом. Например, недавно с использованием фагопептидных библиотек был открыт пептид, который связан с ανβ3. Этот пептид характеризуется наличием последовательности СИСЭС. Пептиды или антитела могут быть спарены с ΤΝΡ с использованием хорошо известных технологий рекомбинантных ДНК или с помощью химической конъюгации. Эти молекулы могут быть также получены непрямой конъюгацией, например они могут быть обе биотинилированы и спарены с использованием четырехвалентного авидина в качестве нековалентного кросс-линкера.
Терапевтические пептиды
Пептиды по настоящему изобретению могут быть введены терапевтически пациенту. Предпочти
- 36 009955 тельно использовать пептиды, которые не состоят исключительно из встречающихся в природе аминокислот, но которые модифицированы, например, с пониженной иммуногенностью, с повышенным циркуляторным полупериодом в теле пациента, с улучшенной биопереносимостью и/или повышенной эффективностью и/или специфичностью.
Был использован ряд подходов для модификации пептидов для терапевтического применения. Один из подходов заключается в связывании пептидов или белков с различными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ΡΕΟ) и полипропиленгликоль (ΡΡΟ) - см., например, патенты США №№ 5091176, 5214131 и 5264209.
Замена встречающихся в природе аминокислот различными некодированными или модифицированными аминокислотами, такими как Ό-аминокислоты и Ν-метиламинокислоты, также может быть использована для модификации пептидов.
Другой подход заключается в использовании бифункциональных кросс-линкеров, таких как Ν-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (см. патент США 5580853).
Было бы желательно использовать производные пептидов по изобретению, которые являются конформационно ограниченными. Конформационное ограничение связано со стабильностью и предпочтительной конформацией трехмерной формы, принимаемой пептидом. Конформационные ограничения включают локальные ограничения, включающие ограничивание конформационной подвижности единичного остатка в пептиде; региональные ограничения, включающие ограничивание конформационной подвижности группы остатков, которые могут образовывать некоторую вторичную структурную единицу; и общие ограничения, включающие полную структуру пептида.
Активная конформация пептида может быть стабилизирована посредством ковалентной модификации, такой как циклизация, или внедрением гамма-лактамных или другого типа мостиков. Например, боковые цепи могут быть циклизованы в скелет, чтобы создать Ь-гамма-лактамное звено на каждой стороне сайта взаимодействия. См., в основном, НгиЬу с1 а1., Λρρ1χ;·ιΙίοη5 о£ ЗуШйейс ΡορΙίάοδ. ίη ЗумИзеНс ΡορΙίάοδ: Α Икег'к Сшйе: 259-345 (\У.Н. Ε^еетаη & Со. 1992). Циклизация также может быть достигнута, например, образованием цистеиновых мостиков, связыванием амино- и карбоксиконцевых групп соответствующих концов аминокислот или связыванием аминогрупп остатка Ьу8 или соответствующего гомолога с карбоксигруппой Ακρ, С1и или соответствующего гомолога. Связывание альфа-аминогрупп полипептида с эпсилон-аминогруппами остатка лизина с использованием иодацетангидрида также может быть осуществлено. См. \Уоой αηά ^е(хе1, 1992, Ιηΐ'1 ί. Ρеρΐ^άе Рго1ет Ке§. 39: 533-39.
Другой подход, описанный в И8 5891418, включает введение скелета с комплексообразующим ионом металла в структуру пептида. Обычно предпочтительный металлопептидный скелет основан на необходимом количестве частных координирующих групп, требуемых координационной сферой данного комплексообразующего иона металла. В основном, большинство ионов металлов, которые могут использоваться, имеют координационное число от 4 до 6. Природа координирующих групп в пептидной цепочке включает атомы азота аминной, амидной, имидазольной или гуанидиновой функциональных групп, атомы серы тиолов или дисульфидов и атомы кислорода гидроксильной, фенольной, карбонильной или карбоксильной функциональных групп. Кроме того, пептидная цепочка или индивидуальные аминокислоты могут быть химически изменены включением координирующих групп, таких как, например, оксим, гидразино, сульфидрил, фосфат, циано, пиридино, пиперидино или морфолино. Структура пептида может быть и линейной, и циклической, однако, линейная структура обычно предпочтительна. Примером малого линейного пептида является С1у-С1у-С1у-С1у, который имеет 4 азота (Ν4 комплексобразующая система) в скелете, за счет чего может образовывать комплекс с ионом металла с координационным числом 4.
Другой методикой улучшения свойств терапевтических пептидов является использование непептидных пептид омиметиков. Широкий ряд используемых методик может быть применен для установления точной структуры пептида. Эти методики включают определение последовательности аминокислот, рентгеноструктурную кристаллографию, масс-спектроскопию, спектроскопию ядерно-магнитного резонанса, компьютерное молекулярное моделирование, составление генетической карты пептида и их комбинации. Структурный анализ пептидов обычно приводит к большому объему данных, которые включают аминокислотную последовательность пептида, а также трехмерное расположение его атомов. На основании этой информации могут быть изображены непептидные пептидомиметики, которые имеют требуемую для терапевтической активности химическую функциональность, но являются более стабильными, например менее подвержены биологической деградации. Пример такого подхода приведен в И8 5811512.
Методики химического синтеза терапевтических пептидов по изобретению описаны в вышеприведенных ссылках, а также в обзоре Вогща αηά Ε^е1ά8, 2000, ИЫесй. 18: 243-251 и подробно описаны в содержащихся там ссылках.
Бифункциональные производные
Следующий вариант осуществления изобретения относится к бифункциональным производным, в которых цитокины, модифицированные с ТТМ, конъюгированы с антителами или их фрагментами, против опухолевых антигенов или других опухолевых ангиогенных маркеров, например αν интегрины, металлопротеазы или фактор сосудистого роста, или антителами или их фрагментами, направленными про
- 37 009955 тив компонентов внеклеточного матрикса, такими как антитела антитенасцина или антифибронектина ΕΌΒ домен. Недавно сообщалось о получении продукта слияния между ΤΝΡ и шарнирной областью тАЬ против опухолеассоциированного ΤΑΟ72 антигена, экспрессируемого желудочной и яичниковой аденокарциномой.
Следующий вариант осуществления изобретения относится к опухолевому предварительному нацеливанию с системой биотин/авидин. Согласно этому подходу на опухолевом антигенном сайте в несколько различный стадий получают трехкомпонентный комплекс, который сформирован: 1) биотинилированным тАЬ, 2) авидином (или стрептавидином) и 3) бивалентным цитокином, модифицированным с ТТМ и биотином. Ряд сообщений утверждают, что предварительное нацеливание по сравнению с традиционным нацеливанием с иммуноконъюгатами может, действительно, увеличить отношение активных молекул, нацеленных на мишень, к свободным активным молекулам, понижая таким образом токсичность лечения. Этот метод показал благоприятные результаты с биотинилированным ΤΝΡ, который был способен стимулировать цитотоксичность ίη νίίτο и уменьшать рост опухолевых клетов в условиях, в которых обычный ΤΝΡ был неактивен. Метод предварительного нацеливания также может быть осуществлен по двухфазной процедуре путем использования биспецифичного антитела, которое одновременно связывается с опухолевым антигеном и модифицированным цитокином. Использование биспецифичного антитела, направленного против карциноэмбрионального антигена и ΤΝΡ, недавно было описано как способ для ΤΝΡ опухолевого предварительного нацеливания.
Опухолевое предварительное нацеливание является другим подходом, который стал недавно развиваться. Предварительное нацеливание может быть выполнено с рядом разных классов соединений в соотвествии с двухшаговым или трехшаговым подходом (59). Специфический пример, основанный на авидин-биотиновой системе, предложенной для иммуносцинтиграфии опухолей, может быть полезным для иллюстрации принципа. В этом случае биотинилированный тАЬ, специфичный к опухолеассоциированному антигену, вводится первым (нацеливающая молекула, первый шаг). На следующий день вводится авидин или стрептавидин (преследующая молекула, второй шаг), четырехвалентные макромолекулы, которые образуют комплекс с биотинилированным тАЬ и способствуют быстрому удалению избытка циркулирующих молекул. Еще днем позже вводится меченный радионуклидом биотин (эффекторная молекула, третий шаг). Это время, когда и нацеливающая, и преследующая макромолекулы эффективно удалены из циркуляции. Это делает возможными быструю диффузию и локализацию эффектора в опухоли, а также быстрое выведение избытка циркулирующих свободных молекул. Это явно отличается от непосредственно меченных тАЬ, которые циркулируют значительно более длинный период времени, увеличивая таким образом фон в иммуносцинтиграфии и токсические побочные явления в радиоиммунотерапии. Несколько сообщений показывают, что подход предварительного нацеливания, действительно, может сильно улучшить отношение мишень/кровь по сравнению с традиционным нацеливанием с иммуноконъюгатами и уменьшить токсичность лечения (60, 61, 62, 63).
Применение стратегии предварительного нацеливания в опухолевой терапии с биотинилированным ΤΝΡ вызывало особый интерес из-за явно высшей аффинности биотин-авидин взаимодействия (10-15) по сравнению с аффинностью ΤΝΡ-ΤΝΡΚ взаимодействий. Это предполагало допустить эффективное преимущественное связывание биотинилированного ΤΝΡ с предварительно нацеленными клетками над клетками, экспрессирующими ΤΝΡ, и продлить его персистенцию на опухолевом сайте. На основании этого подхода недавно было описано использование трехшаговой тАЬ/авидин системы для нацеливания биотинилированного ΤΝΡ (Мого, 1997). Клетки мышиной КМА лимфомы, которые были трансфектированы с Τΐιν 1.1 аллелью, созданы Оакрагл е! а1. (71). Аналогичный подход может быть использован для дальнейшего увеличения терапевтического индекса биотинилированного ανβ3Ε-ΤΝΡ.
Стратегия ανβ3Ε-ΤΝΡ предварительного нацеливания вовсе не обязательно ограничивается трехшаговым подходом. Например, двухшаговый подход, описанный в литературе, основан на использовании биспецифичного антитела, с одной стороны, специфичного для опухолевого антигена и, с другой, для ΤΝΡ. В частности, недавно было описано использование биспецифичного антитела, направленного против онкофетального антигена, и ΤΝΡ, чтобы нацелить ΤΝΡ на опухоли (64).
Согласно следующему варианту осуществления изобретение включает цитокин, конъюгированный с ТТМ и антителом или его фрагментом (прямо или опосредованно через мостик биотин-авидин), на различных ΤΝΡ субъединицах, где антитело или его фрагменты направлены против антигена, экспрессированного на опухолевых клетках или других компонентах опухолевой стромы, например тенацин или фибронектин ΕΌΒ домене. Результаты - в дальнейшем улучшении опухолевых хоминговых свойств модифицированного цитокина и в слабом высвобождении последнего в опухолевую микросреду через тример-мономер-тример переходы. Модифицированные субъединицы, например, ΤΝΡ конъюгатов могут диссоциировать из нацеливающих комплексов и реассоциировать с образованием немодифицированных тримерных ΤΝΡ молекул, которые затем диффундируют в опухолевую микросреду. Было показано, что высвобождение биоактивного ΤΝΡ осуществляется через 24-48 ч после нацеливания.
Получение цитокинов в форме липосом может улучшить их биологическую активность. Действительно, наблюдали, что ацилирование аминогрупп ΤΝΡ приводит к увеличению его гидрофобности без
- 38 009955 потери биологической активности ίη νίίτο. Кроме того. сообщалось. что ΊΝΈ1. связанный с липидами. имеет неповрежденные цитотоксичность ίη νίίτο. иммуномодулирующие свойства и пониженную токсичность ίη νίνο.
Инкапсулирование ют33Ь-Т№ в липосомы может быть еще одним путем улучшения. в качественном отношении. его биологического профиля. Осуществимость этого подхода была подсказана наблюдением. что ацилирование некоторых аминогрупп Т№ ведет к увеличению его гидрофобности без потери его биологической активности ίη νίίτο. Эти данные были использованы. чтобы без труда интегрировать Т№ в липосомы. Сообщалось. что такой липидно-связанный Т№ сохраняет неизмененными ίη νίίτο цитотоксичность на опухолевых клетках и иммуномодулирующие свойства и в то же время имеет меньшие токсические эффекты ίη νίνο (48. 49).
Получение производных ют33Ь-Т№ с полиэтиленгликолем (пэгулирование) может рассматриваться как предпочтительный выбор для удлинения его периода полураспада.
Во многих случаях измеренный период полураспада Т№ ίη νίνο может быть более кажущимся. чем реальным. Таким образом. наблюдали. что этот параметр сильно зависит от введенной дозы. и заметили диспропорциональное удлинение периода полураспада при увеличении доз Т№ (50). Одним объяснением этого феномена является то. что при низких дозах Т№ эффективно связывается растворимым циркулирующим ТКТЕ (51). Содержание такого растворимого ТНЕВ быстро возрастает в сыворотке пациента. леченного системно Т№ (52). и является результатом протеолитического расщепления поверхностносвязанных рецепторов. Т№. связанный с циркулирующим ТНЕВ. может избежать обнаружения в большинстве анализов. обычно используемых для измерения уровней Т№. Измерения для определения несвязанного циркулирующего Т№ начинают при уровне выше порогового. при котором все растворимые ТУК. и базальные. и Т№-индуцируемые. становятся насыщенными. отражая таким образом. более точно. действительный ίη νίνο период полураспада Т№.
Очевидно. что пэгулирование Т№ не предполагает избавления от этих мешающих эффектов ТНЕВ. и. таким образом. любой подход. направленный на удлинение периода полураспада Т№. и. в целом. при уменьшении доз вводимого Т№. должен учитывать тот факт. что. для того. чтобы быть активным. уровень Т№ должен превышать связывающую способность растворимого циркулирующего ТНЕВ. Тем не менее. одной из возможностей справиться с этой проблемой является мутагенез СО13Ь-Т№. чтобы ослабить его способность взаимодействовать с природными Т№ рецепторами. делая. таким образом. возможным введение более высоких доз.
Комбинированный подход
Один из легчайших подходов. который позволяет достичь наиболее благоприятного терапевтического индекса для системного введения 'ТЫЕ. заключается в объединении Т№ с другими агентами. Была надежда достичь терапевтических методов. позволяющих вводить низшие дозы Т№. которые при одновременном сохранении противоопухолевой активности имели меньшие системные токсические эффекты. Этот подход был сильно спекулятивным. потому что нельзя было исключить возможность. что такие методы привели бы к синергетическому эффекту также в отношении токсичности и. вследствие этого. к терапевтическому индексу. идентичному тому. который наблюдали с одним Т№. Действительно. во всех случаях. в которых такая комбинация терапевтических методов была изучена на людях. эта последняя ситуация. как было доказано. оказалась верной.
Один из этих подходов. который был изучен наиболее подробно. заключался в объединенном использовании Т№ и ШЫ-у (36. 37). особенно из-за синергизма действия на эндотелиальные клетки этих цитокинов. Второй подход заключается в объединении с химиотерапией.
Методы объединения Т№ и некоторых соединений. описанных как синергисты Т№. были изучены на некоторых экспериментальных опухолевых моделях. К сожалению. это лечение сопровождалось повышенной системной токсичностью.
Нацеленная доставка 'ТИЕ к опухолевым сосудам является подходом. который недавно был предложен для увеличения терапевтического индекса Т№. νθ 01/61017 описывает производное ТОТ с улучшенным терапевтическим индексом. полученное связыванием Т№ с лигандом аминопептидазы Ν (СЭ13). мембранной протеазой. экспрессированной в опухолевых сосудах. Этот цитокин взаимодействует очень сложным образом с СЭ13 и ΤNΕ-рецепторами. селективно активируя при низких дозах опухолевые эндотелиальные клетки. Получив синергетический эффект Т№ и ί^Ν-γ на эндотелиальных клетках. было бы целесообразно нацелить на эндотелиальные клетки оба цитокина. конъюгированных с СЭ13 лигандами. Однако можно было ожидать. что эти модифицированные цитокины конкурируют за один и тот же рецептор (СЭ13) на эндотелиальных клетках. приводя к потере нацеливания и активности. νθ 01/61017 показывает. как получить конъюгаты этого цитокина с СЭ13 лигандами. например ΝΟΒТ№ и ΝΟΒ-ΒΝ-γ. Эксперименты. выполненные в нашей лаборатории. основанные на введении Т№ и IΕN-γ. обоих конъюгированных с СЭ13 лигандом (ΓΝΟΒΓ). показали. что. действительно. когда эти модифицированные цитокины вводились животным моделям. их терапевтическая активность была ниже. чем когда они вводились одни. вероятно потому. что они конкурируют за один и тот же нацеливающий рецептор.
- 39 009955
Мы нашли, что эти цитокины могут быть нацелены к сосудам без перекрестного вмешательства в связывание, например, путем нацеливания ΤΝΡ к опухолевому сосудистому рецептору, отличному от СИ13. и ΙΕΝ-γ к СИ13 (например, спариванием его с СУОВС пептидом) или наоборот.
В этом предпочтительном варианте осуществления изобретения ΤΝΕ спарен с лигандами ανβ3, такими как пептиды, содержащие СВОИС звено. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается объединенное использование ανβ3Ε-ΙΕΝпроизводного и СИ 13 лиганд-ΤΝΕ. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается объединенное использование ανβ3Ε-ΤΝΕ производного и СИ13 лиганд-ΙΕΝ-γ. Полинуклеотиды
Полинуклеотиды для использования в изобретениии содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные конъюгаты по изобретению. Специалисту должно быть понятно, что ряд различных полинуклеотидов может кодировать один и тот же полипептид как результат дегенерации генетического кода. Кроме того, следует понимать, что специалист может, используя общепринятые методики, выполнить нуклеотидные замещения, которые не влияют на последовательность полипептида, кодируемого полинуклеотидами по изобретению, чтобы отразить использование кодона любого индивидуального организма-хозяина, в котором полипептиды по изобретению экспрессируются.
Полинуклеотиды по изобретению могут содержать ДНК или РНК. Они могут быть однонитевыми или двунитевыми. Они могут быть также полинуклеотидами, которые включают внутри них синтетические или модифицированные нуклеотиды. Из уровня техники известен ряд различных типов модификации олигонуклеотидов. Они включают метилфосфонилирование и фосфоротиолирование скелета, добавление акридиновой и полилизиновой цепей при 3 и/или 5 концах молекулы. Для целей настоящего изобретения понятно, что полинуклеотиды, описанные здесь, могут быть модифицированы любым методом, доступным из уровня техники. Такие модификации могут быть выполнены для того, чтобы усилить активность ίη νίνο или продолжительность жизни полинуклеотидов по изобретению.
Нуклеотидные векторы
Полинуклеотиды по изобретению могут быть инкорпорированы в рекомбинантный способный к репликации вектор. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке-хозяине. Таким образом, в следующем варианте осуществления изобретения предложен метод получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида по изобретению в способный к репликации вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяин и выращивания клеткихозяина при условиях, которые вызывают репликацию вектора. Вектор может быть получен обратно из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, такие как Е. οοΐί, дрожжи, линии клеток млекопитающих и другие эукариотические линии клеток, например клетки насекомых 8Г9.
Предпочтительно полинуклеотид по изобретению в векторе является операбельно связанным с контрольной последовательностью, обеспечивающей экспрессию кодирующей последовательности клеткойхозяином, т.е. вектор является вектором экспрессии. Термин операбельно связанный означает, что описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным им способом. Регуляторная последовательность, операбельно связанная с кодирующей последовательностью, перекрестно связана таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условии совместимости с контрольной последовательностью.
Контрольные последовательности могут быть модифицированы добавлением последующих транскрипционных регуляторных элементов, чтобы сделать уровень транскрипции, направляемый контрольными последовательностями, более чувствительным к транскрипционным модуляторам.
Векторы по изобретению могут быть трансформированы или трансфектированы в подходящую клетку-хозяин, как описанные ниже, предусматривающие экспрессию белка по изобретению. Этот процесс может включать культивирование клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, как описанный выше, при условиях, предусматривающих экспрессию вектором кодирующей последовательности кодирующего белка, и необязательно, выделение экспрессированного белка.
Векторами могут быть, например, плазмида или вирусный вектор, полученный с источником репликации, необязательно промотором экспрессии указанного полинуклеотида и необязательно регулятором промотора. Векторы могут содержать один или более селективных маркерных генов, например устойчивый к ампициллину ген в случае бактериальной плазмиды или устойчивый к неомицину ген для вектора млекопитающих. Векторы могут быть использованы, например, для трансфекции или трасформации клетки-хозяина.
Контрольные последовательности, операбельно связанные с последовательностью кодирующего белка по изобретению, включают промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Эти контрольные последовательности могут быть подобраны по совместимости с клеткой-хозяином, в которой вектор экспрессии будет использоваться. Термин «промотор» хорошо известен из уровня техники и охватывает области нуклеиновых кислот, распределенных по размеру и сложности от минимальных промоторов до промоторов, включающих высшие элементы и энхансеры.
Промоторы обычно выбирают из промоторов, которые являются функциональными в клетках мле
- 40 009955 копитающих, хотя могут быть использованы прокариотические промоторы и промоторы, функциональные в других эукариотических клетках. Промотор обычно извлекают из последовательности промотора вирусных или эукариотических генов. Например, возможен промотор, извлеченный из генома клетки, в которой осуществлена экспрессия. Что касается эукариотических промоторов, они могут быть промоторами, которые функционируют повсеместно (такие, как промоторы а-актина, Ь-актина, тубулина) или, альтернативно, тканеспецифично (такие, как промоторы генов пируваткиназы). Могут быть также использованы тканеспецифичные промоторы, специфичные к различным клеткам. Они могут быть также промоторами, которые реагируют на специфичные стимулы, например промоторами, которые связывают рецепторы стероидных гормонов. Могут также использоваться вирусные промоторы, например длинноконцевой повторный промотор вируса лейкемии мыши Молони (ММЬУ ЬТК.), ЬТК. промотор вируса саркомы Рауса (К8У) или ΙΕ промотор цитомегаловируса человека (СМУ).
Также может быть благоприятным, если промоторы будут индуцибельными, для того чтобы уровни экспрессии гетерологичных генов можно было регулировать на протяжении времени жизни клетки. Индуцибельный означает, что уровни экспрессии, полученные, используя промотор, могут регулироваться.
Кроме того, любой из этих промоторов может быть модифицирован добавлением других регуляторных последовательностей, например энхансерной последовательности. Могут также использоваться химерные промоторы, содержащие элементы последовательности из двух или более различных промоторов, описанных выше.
Клетки-хозяева
Векторы и полинуклеотиды по изобретению могут быть внедрены в клетку-хозяин для целей репликации векторов/полинуклеотидов и/или экспрессии белков по изобретению, кодированных полинуклеотидами по изобретению. Хотя белки по изобретению могут быть продуцированы с использованием прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев, предпочтительно использовать эукариотические клетки, например дрожжи, клетки насекомых или млекопитающих, в частности клетки млекопитающих.
Векторы/полинуклеотиды по изобретению могут быть внедрены в подходящую клетку-хозяин с использованием различных методик, известных из уровня техники, таких как трансфекция, трансформация и электропорация. Известны различные методики из уровня техники, где векторы/полинуклеотиды по изобретению вводятся животным, например инфицирование рекомбинантными вирусными векторами, такими как ретровирусы, вирусы герпеса и аденовирусы, прямая инъекция нуклеиновых кислот и биолитическая трансформация.
Экспрессия белка и очистка
Клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды по изобретению, могут быть использованы для экспрессии белков по изобретению. Клетки-хозяева могут культивироваться в соответствующих условиях, которые позволяют экспрессию белков по изобретению. Экспрессия белков по изобретению может быть конститутивной при условии, чтобы они непрерывно продуцировались, или индуцибельной, требующей стимуляции для инициирования экспрессии. В случае индуцибельной экспрессии продуцирование белка может быть инициировано, когда требуется, например, добавлением вещества индуктора в культуральную среду, например дексаметазона или ΙΡΤΟ.
Белки по изобретению можно экстрагировать из клеток-хозяев различными методиками, известными из уровня техники, включая энзиматический, химический и/или осмотический лизис и физическое разрушение.
Введение
Белки по изобретению предпочтительно могут быть объединены с различными компонентами для получения композиций по изобретению. Предпочтительно композиции объединяются с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем с получением фармацевтической композиции (которые могут использоваться для людей или животных). Подходящие носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, например фосфатно-буферный солевой раствор. Подробное описание наполнителей можно найти в Т11С НаибЬоок οί Рйагтассибса1 ΕχοίρίοηΚ 2иб Еби, Еб§ \Уабс & \Ус11сг. Атепсаи Рйагтасеибса1 А^оаабоп. Композиция по изобретению может быть введена прямой инъекцией. Композиция может быть выполнена в форме для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного, орального или трансдермального введения.
Обычно конъюгат может быть введен в дозе от 1 до 10 мг.
Композиция может быть выполнена в такой форме, что введение ежедневно, еженедельно или ежемесячно будет достигаться желаемой ежедневной дозировкой. Должно быть по достоиству оценено то, что композиция может быть легко выполнена в форме, вводимой менее часто, например каждые 2, 4, 6, 8, 10 или 12 ч.
Полинуклеотиды/векторы, кодирующие компоненты полипептидов, могут быть введены непосредственно в виде голой конструкции нуклеиновой кислоты, предпочтительно содержащей фланкирующие последовательности, гомологичные геному клетки-хозяина.
Поглощение голой конструкции нуклеиновой кислоты клетками млекопитающих повышают различными известными методиками трансфекции, например методиками, вкючающими использование трансфекционных агентов. Пример этих агентов включает катионные агенты (например, кальцийфосфат
- 41 009955 и ΌΕΑΕ-декстран) и липофектанты (например, липофектам™ и трансфектам). Обычно конструкции нуклеиновых кислот смешивают с трансфекционным агентом с получением композиции.
Предпочтительно полинуклеотид или вектор по изобретению объединяют с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем с получением фармацевтической композиции. Подходящие носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, например фосфатно-буферный солевой раствор. Композиция может быть выполнена в форме для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного или трансдермального введения.
Пути введения и описанные режимы дозировки приведены только как рекомендации, поскольку специалист-практик будет способен легко определить оптимальный путь введения и режимы дозирования для любого конкретного пациента и условий.
Вирусные векторы
В предпочтительном варианте осуществления конъюгат вводится с использованием вирусного вектора, более предпочтительно ретровирусного вектора.
Ретровирусы
Ретровирусный вектор может быть полученным или извлекаемым из любого подходящего ретровируса. Был идентифицирован большой ряд различных ретровирусов. Примеры включают вирус лейкемии мышей (МЬУ), вирус иммунодефицита человека (Ηΐν), вирус иммунодефицита обезьяны, Т-клеточный вирус лейкемии человека (ΗΤΕν), вирус инфекционной анемии лошадей (ΕΙΑν), вирус опухоли молочной железы мыши (ΜΜΤν), вирус саркомы Рауса (Я8У), вирус саркомы Фуджинами (Ри8У), вирус лейкемии мышей Молони (Мо-МЬУ), РВЯ вирус остеосаркомы мышей (РВЯ М8У), вирус саркомы мышей Молони (Мо-М8У), вирус лейкемии мышей Абельсона (А-МБА), вирус-29 миелоциматоза птиц (МС29) и вирус эритробластоза птиц (ΑΕν). Подробный список ретровирусов можно найти в Сойш с1 а1., 1997, гей^иикек, Со1б 8ρπη§ НагЬоиг ЬаЬогаФгу Ргекк Ебк: !М. Сойш, 8.М. Нидйек, Η.Ε. Уштои^, ρρ. 758-763.
Подробности геномной структуры некоторых ретровирусов можно найти в уровне техники. Например, подробности о Ηΐν и Мо-МЬУ можно найти в ЫСВ1 СеиЬаик (Сеиоте Ассеккюп Ыок. АР033819 и АР033811, соответственно).
Ретровирусы можно широко разделить на две категории, а именно простые и комплексные. Ретровирусы можно далее разделить на 7 групп. 5 из этих групп представляют ретровирусы с онкогенным потенциалом. Оставшиеся 2 группы являются лентивирусами и спумавирусами. Обзор этих ретровирусов представлен в Сойш е1 а1., 1997 (там же).
Группа лентивирусов может быть далее подразделена на главные и неглавные. Примеры главных лентивирусов включают вирус иммунодефицита человека (Ηΐν), возбудитель синдрома ауто-иммунодефицита человека (АГО8) и вирус иммунодефицита обезьяны (δΐν). Группа неглавных лентивирусов включает медленный вирус уйпа/таеб! вирус (Уму), а также родственный козлиный артрит-энцефалитный вирус (САйУ), вирус инфекционной анемии лошадей (ΕΙΑν) и совсем недавно описанные вирус иммунодефицита кошек (Ρΐν) и вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (Βΐν).
Это изобретение также относится к использованию векторов для доставки конъюгата в форме нуклеотидной последовательности в кроветворную стволовую клетку (Η8ί.').
Перенос гена включает доставку в клетки-мишени, такие как ΗδίΑ кассеты экспрессии, слагаемой из одной или более нуклеотидных последовательностей и последовательностей, контролирующих их экспрессию. Это может быть осуществлено ех νί\Ό по методике, по которой кассету переносят в клетки в лаборатории и модифицированные клетки затем вводят реципиенту. Альтернативно, перенос гена может быть осуществлен ίη νί\Ό по методике, по которой кассету экспрессии переносят непосредственно в клетки внутри индивидуума. По обеим методикам, процесс переноса обычно поддерживается вектором, который помогает доставить кассету к соответствующему внутриклеточному сайту.
Костный мозг был традиционным источником Η8ί.'5 для трансдукции, самые последние исследования предполагают, что периферийные стволовые клетки крови или хордовые клетки крови могут быть равно хорошими или лучшими клетками-мишенями (Са§8е1 е1 а1., 1993, Εχρ. ^тайк 21: 585-591; Вгедш е1 а1., 1992, В1ооб 80: 1418-1422; Ьи е1 а1., 1993, 1. Εχρ. Меб. 178: 2089-2096).
Другие противораковые агенты
Конъюгат по настоящему изобретению может быть использован в комбинации с одним или более другими активными агентами, такими как одно или более цитотоксических лекарственных средств. Таким образом, в одном из вариантов настоящего изобретения способ содержит введение другого активного фармацевтического ингредиента, такого как цитотоксическое лекарственное средство, либо в объединенной дозировочной форме с конъюгатом, либо в раздельной дозировочной форме. Такая раздельная дозировочная форма цитотоксического лекарственного средства может включать твердую оральную, оральный раствор, сироп, эликсир, инъекционную, трансдермальную, трансмукосальную (через слизистую оболочку) и другие дозируемые формы. Конъюгат и другой активный фармацевтический ингредиент могут быть объединены в одной дозируемой форме или поставлены в раздельных дозируемых формах, которые используются вместе или последовательно.
Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут использоваться в настоящем изобретениии, включают алкилированные лекарственные средства, такие как циклофосфамид, ифосфамид,
- 42 009955 хлорамбуцил, мелфалан, бусульфан, ломустин, кармустин, хлормесхин (мустин), эстрамустин, треосульфан, тиотеф, митобронитол; цитотоксические антибиотики, такие как доксорубицин, эпирубицин, акларубицин, идарубицин, даунорубицин, митоксантрон (митозантрон), блеомицин, дактиномицин и митомицин; атниметаболиты, такие как метотрексат, капецитабин, цитарабин, флударабин, кладрибинин, гемцитабин, фторурацил, ралтитрексед, меркаптопурин, тегафур и тиогуанин; алкалоиды утса, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин, и этопозид; другие неопластические лекарственные средства, такие как амсакрин, альтретамин, крисантаспас, дакарбазин и темозоломид, гидроксикарбамид (гидроксимочевина), пентостатин, соединения платины, включающие карбоплатин, цисплатин и оксалиплатин, порфимер натрия, прокарбазин, разоксан, таксаны, включающие доцетаксель и паклитаксель, ингибиторы топоизомеразы Ι, включающие иринотекан и топотекан, трастузумаб и третиноин.
В предпочтительном варианте осуществления другим цитотоксическим лекарственным средством является доксорубицин или мелфалан.
Конъюгат по настоящему изобретению может также применяться в диагностических целях с использованием проницаемости опухолевых клеток и сосудов для соединений. Например, конъюгат может быть использован для повышения поглощения опухолью радиолабильных антител или гормонов (опухолевизуализирующие соединения) в радиоиммуносцинтиграфии или радиотерапии опухоли.
Чертежи и примеры
Настоящее изобретение далее будет описано путем ссылок на следующие неограничивающие примеры и чертежи, где фигура иллюстрирует определение терапевтической и токсической активности ΤΝΡ и ΒΟΌ-ΤΝΡ в комбинации с ΝΟΒ-ΙΡΝ на модели аденокарциномы молочной железы мыши Т/8А. Более подробно показано, что противоопухолевая активность ΚΟΩ-ιηΤΝΕ в комбинации с ΝΟΚ-ηΙΡΝ-γ сильнее, чем активность ιηΤΝΕ введенного в комбинации с ΝΟΚ-ηΙΡΝ-γ, или чем активность одного ΝΟΒιηΙΕΝ-γ. Эти результаты показывают, что нацеленная доставка ΤΝΡ и ΙΡΝ-γ к разным рецепторам опухолевой сосудистой системы может привести к синергетическому эффекту.
Примеры
Пример 1. Получение ΤΝΡ и ΚΟΌ-ΤΝΡ.
Мышиные рекомбинантный ΤΝΡ и ЛСОСРСОСЕСС -ΤΝΡ (ΒΟΌ-ΤΝΡ) были получены экспрессией цитоплазматической кДНК в Е. тоН. кДНК, кодирующая мышиный Μόϊ-ΤΝΕμ^ (66), была получена обратной транскриптазо-полимеразной цепной реакцией (ВТ-РСВ) на мРНК, выделенной из липополисахаридстимулированных мышиных К.Л\У-264.7 моноцит-макрофаговых клеток, с использованием 5'СТССАТССТСАСАСАССААТСАСТССаС-3' и 5'-Т6ССТСАСАТАТ6СТСА6АТСАТСТТСТС-3' в качестве 3'- и 5'-праймеров.
Амплифицированный фрагмент был обработан с Ыбе I и Ват ΗΙ (Ыете Епд1апб Вю1аЬк, ВеуеНеу, МА) и клонирован в рЕТ-11Ь (Νονα^η, Μαόικοη, ^Ι), предварительно обработанным с теми же энзимами (ρΤΝΡ).
кДНК, кодирующая АС^СВС^СΡСС-ΤNΕ1-156, была амплифицирована РСВ на ρΤΝΡ с использованием 5'-ТССАСАТСАТАТСССТТСССАСТССССТССТСАСТССТТСТССССТСТСАСАТСАТСТТСТС-3' в качестве 5'-праймера и вышеуказанного 3'-праймера.
Амплифицированный фрагмент был обработан и клонирован в рЕТ-11Ь, как описано выше, и использован для трансформации клеток Е. то11 ВЬ21(ОЕ3) (Νονα^η). Экспрессия ΤΝΡ и ΒΟΌ-ΤΝΡ была выполнена с изопропил-О-тиогалактозидом согласно инструкции производителей рЕТ11Ь. Растворимые ΤΝΡ и ΒΟΌ-ΤΝΡ были выделены из 2 л культур путем разрушения ультразвуком бактерий в 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте, 20 мМ ТП8-НС1, рН 8,0, с последующим центрифугированием (15000х г, 20 мин, 4°С). Оба экстракта смешивали с сульфатом аммония (25% насыщения), оставляли на 1 ч при 4°С и затем центрифугировали, как указано выше. Содержание сульфата аммония в супернатантах затем доводили до 65% насыщения, оставляли при 4°С на 24 ч и затем центрифугировали. Каждый осадок растворяли в 200 мл 1М сульфата аммония, 50 мМ ТГ18-НС1, рН 8,0, и очищали с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий на Р^^^ер^тке 6 Ρακί Ρ1ο^ (ΡΕα™α«α-υρ)οΗη) (градиентное элюирование, буфер А: 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0, содержащий 1М сульфат аммония; буфер В: 20% глицерин, 5% метанол, 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0). Фракции, содержащие ΤΝΡ иммунореактивные материалы (метод вестерн-блоттинга), были объединены, диализованы в 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте, 20 мМ Тп8-НС1, рН 8,0, и затем очищены ионообменной хроматографией на ОЕЛЕ-БерНаго^е Ρακί Ρ1ο\ν (РИатата-ир-ЩЬи) (градиентное элюирование, буфер А: 20 мМ ТГ18-НС1, рН 8,0; буфер В: 1М хлорид натрия, 20 мМ Тпк-НСЕ рН 8,0). Фракции, содержащие ΤΝΡ иммунореактивные материалы, были объединены и очищены гель-хроматографией на 8ерЬасгу1-8-300 НВ (РИатата-ир-ЩИн), предварительно уравновешены и элюированы 150 мМ хлоридом натрия, 50 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 7,3 (РВ8). Фракции, содержащие 40000-50000 Мг продуктов, объединяли, делили на аликвоты и хранили замороженными при -20°С. Все растворы, используемые на хроматографичеких стадиях, готовили с использованием стерильной и свободной от токсинов воды (8а1£, Ве^аито, Иа1у).
Молекулярная масса очищенного ΤΝΡ и ^60-4^ была измерена с помощью электроаэрозольной масс-спектрометрии, как описано (65). Содержание белка измеряли с помощью коммерческого набора
- 43 009955 реактивов для количественного анализа белка (Легсе, КоскЕогб, ГЬ).
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЭГ) и вестерн-блоттинг анализ выполняли с использованием 12,5 или 15% полиакриламидного геля по стандартным методикам.
Не редуцирующий ДСН-ПЭГ ΤΝΕ показал единственную полосу при 17-18 кДа, как предполагалось для мономерного ΤΝΕ. А не редуцирующий ДСН-ПЭГ и вестерн-блоттинг анализ ΚΟΌ-ΤΝΕ показали различные иммунореактивные формы в 18, 36 и 50 кДа, вероятно, соответствующие мономерам, димерам и тримерам. При редуцирующих условиях большинство полос в 50 и 36 кДа были превращены в 18 кДа формы, что указывает на присутствие ΚΟΌ-ΤΝΕ молекул с межцепочечными дисульфидными мостиками. Полоса 18 кДа составляла почти 1/2 от общего материала. Эти электрофоретические диаграммы предполагают, что ΚΟΌ-ΤΝΕ был смесью тримеров, составленных 3 мономерными субъединицами с правильными внутрицепочечными дисульфидами (10-20%), и оставшаяся большая часть составлена тримерами с 1 или более межцепочечных дисульфидов.
Молекулярная масса мономеров ΤΝΕ и ΚΟΌ-ΤΝΕ была 17386,1±2,0 Да и 18392,8 Да, соответственно, по результатам электроаэрозольной масс-спектрометрии. Эти значения очень хорошо соответствуют массам, предполагаемым для МеЕ-ЮТ^б (17386,7 Да) и для АС^СΚΟ^СΕСΟ-ΤNΕ1-156 (18392,9 Да).
Пример 2. Цитотоксическая активность ΤΝΕ и ΚΟΌ-ΤΝΕ ш νίΙΐΌ.
Биологическую активность ΤΝΕ и ΚΟΌ-ΤΝΕ устанавливали с помощью стандартного цитолитического анализа, основанного на Ь-М фибробластах мыши (АТСС ССЬ1.2), как описано (67). Цитолитическая активность ΤΝΕ и ΚΟΌ-ΤΝΕ на КМА-Τ клетках была тестирована в присутствии 30 нг/мл актиномицина Ό (68). Каждый образец анализировали в 2 экземплярах при 3 различных разбавлениях. Результаты выражали как значение ±8Ό 2-3 независимых анализов.
Цитотоксическая активность ш νίΐΓΌ ΤΝΕ и ΚΟΌ-ΤΝΕ была (1,2±0,14)χ108 ед./мг и (1,7±1)±108 ед./мг, соответственно, установленная стандартным цитолитическим анализом с Ь-М клетками. Эти результаты показывают, что АС^СΚΟ^СΕСΟ звенья в ΚΟΌ-ΤΝΕ молекуле не мешают сворачиванию, олигомеризации и связыванию с ΤΝΕ рецепторами.
В предыдущем исследовании мы показали, что КМА-Τ клетки могут быть разрушены ΤΝΕ в присутствии 30 нг/мл актиномицина Ό, тогда как в отсутствие ингибиторов транскрипции эти клетки являлись устойчивыми к ΤΝΕ даже после нескольких дней инкубации (68). Цитоксическая активность ш νίίΐΌ ΚΟΌ-ΤΝΕ на КМА-Τ клетках в присутствии актиномицина Ό была (1,6+1,3)±108 ед./мг, измеренная с ипользованием ΤΝΕ ((1,2±0,14)±108 ед./мг) в качестве стандарта.
Пример 3. Определение терапевтической и токсической активности ΤΝΕ и ΚΟΌ-ΤΝΕ.
Вирусиндуцированную КМА лимфому С57ВЬ/6 происхождения (69) поддерживали ш νίΙΐΌ в ΚΡΜI 1640, 5% эмбриональной бычей сыворотки (ЕВ8), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В, 2 мМ глутамина и 50 мкМ 2-меркаптометанола. КМА-Τ получали из линии клеток КМА трансфекцией конструкцией, кодирующей Τ1κ 1.1 аллель, и культивировали, как описано [Мого, 1997 #28]. Клетки Τ/ЗА аденокарциномы молочной железы мыши культивировали, как описано.
Исследования ш νί\Ό на животных моделях были одобрены Этическим комитетом Сан-Рафаэлевского научного института и выполнены в соответствии с установленными нормами. С57ВЬ/6 мышам (Сйат1е8 ККет ЬаЬога!опе8, Са1со, Пару) (16-18 г) были введены 5χ104 живых клеток КМА-Τ или Τ8А, соответственно, подкожно в левый бочок. Через 10-12 дней после имплантации опухоли мышей обрабатывали внутрибрюшинно (ί.ρ.) 250 мкл растворов ΤΝΕ или ΒΟΩ-ΤΝΕ, разбавленных свободным от эндотоксинов 0,9% хлоридом натрия. Предварительные эксперименты показали, что противоопухолевая активность не изменялась при добавлении к растворам ΤΝΕ или ΒΟΩ-ΤΝΕ в качестве носителя человеческого сывороточного альбумина. Каждый эксперимент выполнялся с 5 мышами на группу. Рост опухоли контролировался ежедневно путем измерения кронциркулем. Площадь опухоли оценивали путем вычисления Γιχτ2π, тогда как объем опухоли оценивали путем вычисления Τιχτ2χτ3χ4/3π, где г1 и г2 означают продольный и поперечный радиусы и г3 - толщина опухолей, выдающихся из поверхности нормальной кожи. Животных умерщвляли прежде, чем опухоль достигала 1,0-1,5 см в диаметре. Размеры опухоли показывали как значения ±8Ε (5-10 животных на группу) и сравнивали с !-тестом.
Противоопухолевую активность и токсичность ΒΟΩ-ΤΝΕ сравнивали с противоопухолевой активностью и токсичностью ΤΝΕ, используя модели КМА-Τ лимфомы и Τ/ЗА на С57ВЬ6 мышах.
Мышиный ΤΝΕ, введенный животным, несущим введенные +с. КМА-Τ опухоли, вызывал через 24 ч уменьшение массы опухоли и геморрагический некроз в центральной части опухоли, следующий за существенной остановкой роста опухоли в течение нескольких дней (71). Единичная обработка ΤΝΕ не вызывает полной регрессии этой опухоли даже при дозах, близких к ЬП50, поскольку живые клетки, остающиеся вокруг некротической области, вновь начинают расти через несколько дней после обработки. На первом этапе экспериментов исследовали влияние разных доз (ί.ρ.) ΤΝΕ или ΒΟΩ-ΤΝΕ на выживаемость животных. Чтобы избежать непомерных страданий, животных умерщвляли, когда опухоль достигала в диаметре более 1-1,3 см. Летальность от ΤΝΕ и ΒΟΩ-ΤΝΕ через 3 после обработки была различной (ЬП50, 6 и 12 мкг, соответственно), поскольку их противоопухолевая активность была заметно различной.
- 44 009955
Например, 1 мкг КСЭ-ΤΝΕ приостанавливает рост опухоли более эффективно, чем 2 мкг ΤΝΕ. Интересно, что некоторые животные были излечены 16 мкг КСЭ-ΤΝΕ. тогда как ни одно животное из всех не было излечено с помощью ΤΝΕ. Излеченных отсортированных животных затем заражали канцерогенными дозами клеток или КМА-Т или КМА дикого типа, предположив, что единичная обработка КСЭ-ΤΝΕ была способна вызвать защитный иммунитет.
Таким образом, рассчитанное отношение эффективность/токсичность КСЭ-ΤΝΕ при этих условиях было в 4 раза больше, чем для ΤΝΤ. Учитывая, что форма с правильными дисульфидными мостиками при получении КСЭ-ΤΝΕ составляет около 10-20%, можно рассчитать, что терапевтический индекс ΗΟΩ-ΤΝΕ на 20-40% выше, чем терапевтический индекс ΤΝΕ.
Кроме того, КСЭ-ΤΝΕ может вызывать защитные иммунные реакции более эффективно, чем ΤΝΕ.
Так как КМА-Τ клетки не экспрессируют альфа ν интегрин (ЕАС8 с анти-альфа ν антителом), в то время как эндотелиальные клетки могут экспрессировать этот интегрин, то результаты предполагают, что механизм действия основан на нацеливании клеток, других, чем опухолевые клетки, например эндотелиальные клетки.
Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены здесь путем ссылки. Различные модификации и вариации описанных методов и систем изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отклонения от объема и духа изобретения. Хотя изобретение было описано в связи со специфическими предпочтительными вариантами осуществления, должно быть понятно, что изобретение, как оно изложено в формуле изобретения, будет неверно ограничивать такими специфическими вариантами осуществления. Несомненно, различные модификации описанных методов для осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в молекулярной биологии и родственных областях, подразумеваются в объеме следующей формулы изобретения.
Ссылки
1. Сой1 А., е! а1. В1осйеш1са1 1оигиа1. 1992; 284: 905-10.
2. Τайад1^а Ь.А., е! а1. Ргосеебшдз о£ 1Не №10опа1 Асабету о£ 8с1епсе5 о£ 1Не ИиДеб 81а1ез о£ Атенса. 1991; 88: 9292-6.
3. ЕзретП< Τ., е! а1. 1оигпа1 о£ Ехрейтеи!а1 Мебюте. 1990; 171: 415-26.
4. Ьое!зсйег Н., е! а1. 1оита1 о£ В1о1од1са1 Сйет1з!гу. 1993; 268: 26350-7.
5. Vаи Оз!абе X., е! а1. Еигореаи 1оита1 о£ ВюсйетИйу. 1994; 220: 771-779.
6. ВагЬага ТА., е! а1. ЕМВО боитаТ 1994; 13: 843-50.
7. Еиде1таии Н., е! а1. I. Вю1. СНет. 1990; 265: 14497.
8. В1дба б., е! а1. боита1 о£ Ехрейтеи!а1 Мебкте. 1994; 180: 445-60.
9. Τа^ίад1^а Ь.А., е! а1. боита1 о£ В1о1од1са1 Сйет1зйу. 1993; 268: 18542-8.
10. VанбеиаЬее1е Р., е! а1. боита1 о£ Е.хрептеп1а1 Мебюте. 1992; 176: 1015-24.
11. Иаите В., е! а1. боита1 о£ [ттипо^ду. 1991; 146: 3045-8.
12. Сге11 М., е! а1. Се11. 1995; 83: 793-802.
13. СагзххеП Е.А., е! а1. Ргос. Ыа!1. Асай 8сг И8А. 1975; 72: 3666-70.
14. Не1зои Ь., е! а1. ХаИие. 1975; 258: 731-732.
15. ^асеу К.Т аиб Сегат1 А. Аиииа1 Кет1е\\· о£ Се11 Вю1оду. 1993; 9: 317-43.
16. ЕШой М.6., е! а1. боита1 о£ Iттииорйа^тасо1оду. 1995; 17: 141-5.
17. Ра11аб1ио М.А., 1г., е! а1. боита1 о£ Iттиио1оду. 1987; 138: 4023-32.
18. С1аизз М., е! а1. боита1 о£ Вю1одюа1 Сйет1з!гу. 1990; 265: 7078-83.
19. №\\то111 Р.Р. аиб 8!ет И.М. боита1 о£ Ехрейтеи!а1 Мебюте. 1986; 163: 740-5.
20. С1аизз М., е! а1. боита1 о£ Ехрейтеи1а1 Мебкте. 1990; 172: 1535-45.
21. Мст!озй 6.К., е! а1. Саисег КезеагсН. 1990; 50: 2463-9.
22. Меи1бегз р., е! а1. К1биеу ЛЛтайоиаЕ 1992; 42: 327-34.
23. νаи бе ^1е1 Р.А., е! а1. IттииорЬа^тасо1оду. 1992; 23: 49-56.
24. №\\то111 Р., е! а1. боита1 о£ Ехрептеи!а1 Мебкте. 1988; 168: 637-47.
25. 81гуНп Наизеи А., е! а1. Еигореаи боигиа1 о£ Iттиио1оду. 1993; 23: 2358-64.
26. Та\1ог А. ЕА8ЕВ боита1. 1993; 7: 290-8.
27. 8Ырр М.А. аиб Ьоок Ά.Τ. В1ооб. 1993; 82: 1052-70.
28. Егакег ΌΗ., А1ехаибег Н.К. аиб Разз НТ. Вю1ощс Легару \\Λι ΤΝΤ: зуз!етк абтЛ1зйайои аиб 1зо1а!юи-рейизюи ш Вю1ощс Легару о£ саисег: рпис1р1ез аиб ргасбсе. V. Эе νίΐη, 8. Не11таи аиб 8. КозеиЬегд, еб. ТВ. Ырртсо!! Сотраиу: РЫ1абе1рЛа. 1995. 329-345.
29. Е1егз ^. Вю1ощс Легару \νίΐ1ι ΤΝΤ: ргесНшса1 з!иб1ез ш Вю1ощс Легару о£ саисег: рпис1р1ез аиб ргасбсе. V. Эе νίΐη, 8. Не11таи аиб 8. КозеиЬегд, еб. ТВ. ЫрртсоИ Сотраиу: РЫ1абе1рЛа. 1995. 295-327.
30. 81бйи К.8. аиб Во11ои А.Р. Рйагтасо1од1са1 ΤΛπψν. 1993; 57: 79-128.
31. Н1еЬег и. аиб Не1т М.Е. Оисо1оду. 1994; 51: 142-53.
32. Ыеиагб Ό., е! а1. \Уог1б боигиа1 о£ 8игдегу. 1992; 16: 234-40.
33. НШ 8., е! а1. ВпбзН боигиа1 о£ 8игдегу. 1993; 80: 995-7.
34. Еддегтои! А.М., е! а1. АинаИ о£ 8игдегу. 1996; 224: 756-65.
35. 8сЬгайогб! Коорз Н., е! а1. КабюЛегару аиб Оисо1оду. 1998; 48: 1-4.
- 45 009955
36. ^ййаткоп Β.Ό., е! а1. Ргосеейтдк о£ 1йе Ναΐίοηαΐ Асайету о£ 8с1епсек о£ 1йе Ипйей 8!а!ек о£ Атенса. 1983; 80: 5397-401.
37. Тгапкеп Ь., е! а1. Еигореап 1оигпа1 о£ Сапсег & С1шка1 Опсо1оду. 1986; 22:419-26.
38. КиГТ М.К. апй ОйГогй О.Е. Титог №сгокк Тас!ог. т Ьутрйоктек. Е. Р1ск, ей. Асайетк Ргекк: \'е\\ Уогк. 1981. 235-272.
39. Веуаей К., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1993; 53: 2623-30.
40. Веуаей К., е! а1. Ргосеейтдк о£ 1йе №1йопа1 Асайету о£ 8скпсек о£ 1йе Ипйей 81а1ек о£ Атепса. 1989; 86: 9494-8.
41. Ва1кМ11 Т.К., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1986; 46: 3990-3.
42. 8сйй1ег РН., е! а1. Сапсег. 1992; 69: 562-71.
43. Шпек А.Ь., е! а1. Сапсег СйетоШегару & Рйагтасо1оду. 1992; 30: 73-6.
44. Вгоискаей Р., е! а1. Ьутрйокте & Су!окте Кекеагсй. 1992; 11: 193-6.
45. Vаη Ок!айе X., е! а1. №1иге. 1993; 361: 266-9.
46. Vаη 2ее К.Р, е! а1. 1оита1 о£ Е.хрептеп1а1 Мейкте. 1994; 179: 1185-91.
47. Ваййо1еупк 1., е! а1. Месйоп & Iттиηйу. 1987; 55: 2230-3.
48. ИеЬк К.Р, е! а1. 1оита1 о£ [ттипокду. 1989; 143: 1192-7.
49. ИеЬк К.Р, е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1990; 50: 375-80.
50. К1тига К., е! а1. Сапсег СйетоШегару & Рйагтасо1оду. 1987; 20: 223-9.
51. Айегка Ό., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1991; 51: 5602-7.
52. Ьапк М., е! а1. Су!окте. 1990; 2: 402-6.
53. НоодепЬоот Н.К., е! а1. Мо1еси1аг Iттиηο1οду. 1991; 28: 1027-37.
54. Уапд 1., е! а1. Нитап АпйЬойкк & НуЬпйотак. 1995; 6: 129-36.
55. Уапд 1., е! а1. Мо1еси1аг Iттиηο1οду. 1995; 32: 873-81.
56. Ракдиайш К., е! а1. №11иге Вю!есйпо1оду. 1997; 15: 542-6.
57. Койипеп Е., е! а1. №11иге Вк!есйпо1оду. 1999; 17: 768-774.
58. Вгеккеп К.А., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1998; 58: 1952-1959.
59. Соой\\й1 И.А. 1оита1 о£ Шскаг Мейкте. 1995; 36: 876-9.
60. РадапеШ О., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1991; 51: 5960-6.
61. Мойогай О., е! а1. Вгй1кй 1оита1 о£ Орй!а1то1оду. 1994; 78: 19-23.
62. Со1отЬо Р., е! а1. 1оита1 о£ Епйосппо1одка1 йкекИдаЦоп. 1993; 16: 841-3.
63. РадапеШ О., Мадпап Р., 8ксагй1 А. апй Рахю Т. Сйшса1 аррйсайоп о£ !йе ау1йш-Ью!т кук!ет £ог !итог !агдейпд. ш Сапсег !йегару \\йй гайк1аЬе1ей апйЬойкк. Ό. Оо1йепЬегд, ей. СКС Ргекк: Воса Ка!оп. 1995. 239-253.
64. КоЬей В., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1996; 56: 4758-4765.
65. Сой1 А., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1998; 58: 3866-3872.
66. Реппка Ό., е! а1. Ргосеейтдк о£ !йе №11юпа1 Асайету о£ 8скпсек о£ !йе Ипйей 81а1ек о£ Атегка. 1985; 82: 6060-4.
67. Сой1 А., е! а1. 1оита1 о£ Iттиηο1οд^са1 Ме!йойк. 1994; 177: 191-198.
68. Мого М., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1997; 57: 1922-8.
69. Ищпддгеп Н.О. апй Кагге К. 1оита1 о£ Ехрептеп!а1 Мейкте. 1985; 162: 1745-59.
70. Сейк С., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1983; 43: 3507-10.
71. Оакрат А., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1999; 59: 2917-23.
72. Агар ^., е! а1. 8скпсе. 1998; 279: 377-80.
73. Та1тайде РЕ., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1987; 47: 2563-70.
74. РПхептакг К., е! а1. 1оита1 о£ Iттиηο1οду. 1987; 138: 975-80.
75. Акйег А.Ь., е! а1. 1оита1 о£ Iттиηο1οду. 1991; 146: 3227-34.
76. М|/идис1и Н., е! а1. Сапсег Кекеагсй. 1998; 58: 5725-30.
77. Оакрат А., е! а1. 1оита1 о£ Вю1одка1 Сйетк!гу. 1997; 272: 20835-43.

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат с антиопухолевой активностью, включающий ГЕ-12 и по меньшей мере 1 опухоленацеливающий модуль, содержащий NОК звено.
  2. 2. Конъюгат по п.1, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой опухолевососудистый нацеливающий модуль.
  3. 3. Конъюгат по п.1 или 2, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой СNОКСV8ОСΑОКС, NОКΑНΑ, ОNОКО, циклоСV^NОЯМЕС, линейный или циклический СNОКС.
  4. 4. Конъюгат по одному из пп.1-3, в котором опухоленацеливающий модуль связан с Ш-П через спейсер.
  5. 5. Конъюгат по одному из пп.1-4, представленный в форме слитого белка.
  6. 6. Конъюгат по одному из пп.1-5, представленный в форме нуклеиновой кислоты.
  7. 7. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6.
    - 46 009955
  8. 8. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.7.
  9. 9. Способ получения конъюгата, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8 при условиях, обеспечивающих экспрессию конъюгата.
  10. 10. Фармацевтическая композиция, обладающая антиопухолевой активностью, содержащая конъюгат по одному из пп.1-6 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
  11. 11. Фармацевтическая композиция по п.10, дополнительно содержащая другой противоопухолевый агент или диагностическое опухолевизуализирующее вещество.
  12. 12. Фармацевтическая композиция по п.11, содержащая в качестве другого противоопухолевого агента доксорубицин или мелфалан.
  13. 13. Применение конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12 для получения медикамента для лечения или диагностики рака.
  14. 14. Способ лечения или диагностики рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или диагностике, эффективного количества конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12.
EA200401447A 2002-04-30 2003-04-30 Слияние цитокинов и опухоленацеливающих белков EA009955B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0209893.7A GB0209893D0 (en) 2002-04-30 2002-04-30 Conjugate
PCT/IB2003/002515 WO2003092737A1 (en) 2002-04-30 2003-04-30 Fusions of cytokines and tumor targeting proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401447A1 EA200401447A1 (ru) 2005-08-25
EA009955B1 true EA009955B1 (ru) 2008-04-28

Family

ID=9935814

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800386A EA200800386A1 (ru) 2002-04-30 2003-04-30 Конъюгат цитокина и опухоленацеливающего модуля, фармацевтическая композиция на его основе, способ получения данного конъюгата и его применение
EA200401447A EA009955B1 (ru) 2002-04-30 2003-04-30 Слияние цитокинов и опухоленацеливающих белков

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800386A EA200800386A1 (ru) 2002-04-30 2003-04-30 Конъюгат цитокина и опухоленацеливающего модуля, фармацевтическая композиция на его основе, способ получения данного конъюгата и его применение

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20050074426A1 (ru)
EP (1) EP1499362A1 (ru)
JP (1) JP2005525115A (ru)
KR (1) KR20050003400A (ru)
CN (2) CN101433722A (ru)
AU (1) AU2003236969A1 (ru)
CA (1) CA2484425A1 (ru)
EA (2) EA200800386A1 (ru)
GB (1) GB0209893D0 (ru)
IL (1) IL164897A0 (ru)
NO (1) NO20045236L (ru)
WO (1) WO2003092737A1 (ru)
ZA (1) ZA200408768B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2502518C2 (ru) * 2008-05-13 2013-12-27 Молмед С.П.А. Конъюгаты для лечения мезотелиомы

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8263739B2 (en) 2000-06-02 2012-09-11 Bracco Suisse Sa Compounds for targeting endothelial cells, compositions containing the same and methods for their use
US7109167B2 (en) 2000-06-02 2006-09-19 Bracco International B.V. Compounds for targeting endothelial cells, compositions containing the same and methods for their use
CA2594927A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-13 Buck Institute Hunter-killer peptides and methods of use
AU2005317684B2 (en) 2004-12-23 2012-02-16 Molmed Spa Conjugation product
WO2006102395A2 (en) * 2005-03-22 2006-09-28 Medstar Health Inc Delivery systems and methods for diagnosing and treating cardiovascular diseases
CN102539734B (zh) * 2005-05-12 2016-02-03 清华大学 核仁素辅助的癌症诊断与治疗方法
PL1899364T3 (pl) 2005-05-17 2020-08-24 University Of Connecticut Kompozycje i sposoby immunomodulacji w organizmie
GB0708864D0 (en) * 2007-05-08 2007-06-13 Molmed Spa Cytokine Conjugate
CA2691075C (en) 2007-06-15 2017-04-11 Daniela Gast Treatment of tumors using specific anti-l1 antibody
NZ582330A (en) 2007-06-27 2012-05-25 Marinepolymer Tech Inc COMPLEXES OF IL-15 AND IL-15Ra (RECEPTOR ALPHA) AND USES THEREOF
GB0803076D0 (en) * 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
AU2008201871A1 (en) * 2008-04-16 2009-11-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Inhibition of angiogenesis and tumor metastasis
EP2448599A1 (en) * 2009-06-30 2012-05-09 Philogen S.p.A. Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer
US9526251B2 (en) 2010-02-25 2016-12-27 Marrone Bio Innovations, Inc. Use of Burkholderia formulations, compositions and compounds to modulate crop yield and/or corn rootworm infestation
US8822193B2 (en) 2010-02-25 2014-09-02 Marrone Bio Innovations, Inc. Isolated bacterial strain of the genus Burkholderia and pesticidal metabolites therefrom
CN102260352B (zh) * 2010-05-28 2013-11-20 山东先声麦得津生物制药有限公司 靶向性白细胞介素融合蛋白及其制备方法与应用
WO2013158962A1 (en) * 2012-04-19 2013-10-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Imaging-aided gene therapy using mesenchymal stem cells as target-delivery vehicle
US9119401B2 (en) 2012-10-19 2015-09-01 Marrone Bio Innovations, Inc. Plant glutamine synthetase inhibitors and methods for their identification
CN104177500B (zh) * 2013-05-24 2018-05-25 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途
US9914759B2 (en) * 2013-07-19 2018-03-13 Vib Vzw Targeted modified TNF family members
WO2016050702A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Binding molecules, especially antibodies, binding to l1cam (cd171)
GB201419184D0 (en) 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
CN104403004B (zh) 2014-11-24 2017-10-13 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途
CN112574316A (zh) * 2015-07-02 2021-03-30 博际生物医药科技(杭州)有限公司 用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白
CN108135881B (zh) 2015-08-11 2020-11-13 同宜医药（苏州）有限公司 多配体药物偶联体及其用途
CN105218682B (zh) * 2015-10-26 2019-05-07 杨晶 经il-12/cd62l融合蛋白改造的肿瘤治疗剂及其制法和用途
US10066023B2 (en) * 2015-10-30 2018-09-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for tumor transduction
CN105585637B (zh) * 2015-12-23 2020-04-03 杨晶 基于il-12稳定膜表达的肿瘤治疗剂及其制法和用途
CN105622759A (zh) * 2016-01-04 2016-06-01 深圳精准医疗科技有限公司 IL-12/CD107a融合蛋白增强CTL抗肿瘤效果的治疗剂及其制法和用途
GB201602359D0 (en) * 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EA201991204A1 (ru) 2016-12-22 2019-12-30 Университа Дельи Студи Манья Греча Катандзаро Моноклональное антитело против уникального сиалогликозилированного опухолеассоциированного эпитопа cd43
JP7246617B2 (ja) * 2017-02-01 2023-03-28 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド 免疫活性の増加における使用のためのＴＧＦβおよびＡＣＴＲＩＩアンタゴニスト
CN109467607B (zh) * 2017-12-28 2020-10-30 北京泽勤生物医药有限公司 一种靶向肿瘤的酸性敏感融合肽及其应用
CN108314741B (zh) * 2018-03-22 2021-08-03 中国人民解放军第四军医大学 一种肿瘤血管靶向抗癌肽nkl-dota及其制备方法
JP7460609B2 (ja) * 2018-05-14 2024-04-02 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なインターロイキン－２ポリペプチド及びその使用方法
WO2020006539A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 Platelet Biogenesis, Inc. Compositions for drug delivery and methods of use thereof
CN108864251B (zh) * 2018-06-30 2022-06-14 大连理工大学 一类氨肽酶n激活的药物前体化合物及其制备方法和应用
CN117683140A (zh) * 2022-09-09 2024-03-12 北京昌平实验室 肿瘤靶向的以白介素2为活性成分的融合蛋白型药物前体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990010385A1 (en) * 1989-03-15 1990-09-20 Tykocinski Mark L Cd8-based pharmaceuticals
WO2001061017A2 (en) * 2000-02-15 2001-08-23 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
WO2001062298A2 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4578079A (en) * 1982-08-04 1986-03-25 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
DE3423234A1 (de) * 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
US4650674A (en) * 1984-07-05 1987-03-17 Genentech, Inc. Synergistic cytotoxic composition
US4988621A (en) * 1985-05-24 1991-01-29 La Jolla Cancer Research Foundation Peptides in cell detachment and aggregation
US4879237A (en) * 1985-05-24 1989-11-07 La Jolla Cancer Research Foundation Use of peptides in control of cell attachment and detachment
US5547936A (en) * 1985-06-17 1996-08-20 La Jolla Cancer Research Foundation Inhibition of cell migration with synthetic peptides
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
DE3716513A1 (de) * 1987-05-16 1988-11-24 Basf Ag Proteine mit tnf-wirkung
US5214131A (en) * 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
US5091176A (en) * 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
US5120829A (en) * 1989-03-20 1992-06-09 La Jolla Cancer Research Foundation Hydrophobic attachment site for adhesion peptides
US5498694A (en) * 1989-05-25 1996-03-12 La Jolla Cancer Research Foundation Peptides of the cytoplasmic domain of integrin
US5169930A (en) * 1990-01-05 1992-12-08 La Jolla Cancer Research Foundation Fibronectin receptor
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5648330A (en) * 1990-04-06 1997-07-15 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating vascular graft occlusion
US5612311A (en) * 1990-04-06 1997-03-18 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5672585A (en) * 1990-04-06 1997-09-30 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5811512A (en) * 1991-08-22 1998-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-peptide peptidomimetics and related cyclic hexapeptides
US5258517A (en) * 1992-08-06 1993-11-02 Sepracor, Inc. Method of preparing optically pure precursors of paroxetine
US5536814A (en) * 1993-09-27 1996-07-16 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5580853A (en) * 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5888814A (en) * 1994-06-06 1999-03-30 Chiron Corporation Recombinant host cells encoding TNF proteins
US5811388A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Cibus Pharmaceutical, Inc. Delivery of drugs to the lower GI tract
US5891418A (en) * 1995-06-07 1999-04-06 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical constructs and applications
US6576239B1 (en) * 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6180084B1 (en) * 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
CN1239675A (zh) * 1998-06-23 1999-12-29 金斗植 抗肿瘤试剂
US7309694B2 (en) * 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
US7109303B2 (en) * 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
WO2001090326A2 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 Pharmacia & Upjohn Company Novel matrix metalloproteinases
JP2004501664A (ja) * 2000-06-30 2004-01-22 ボード・オブ・リージェンツ，ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム 標的化薬剤送達のための腫瘍組織を浸潤する細胞特異的な内部移行ペプチドの単離
US20030077818A1 (en) * 2001-03-08 2003-04-24 Dickerson Erin B. Compositions and methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium
US20040110933A1 (en) * 2002-09-13 2004-06-10 Dyax Corporation CD44-binding ligands

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990010385A1 (en) * 1989-03-15 1990-09-20 Tykocinski Mark L Cd8-based pharmaceuticals
WO2001061017A2 (en) * 2000-02-15 2001-08-23 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
WO2001062298A2 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAP W. ET AL.: "Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, US, vol. 279, no. 5349, 16 January 1998 (1998-01-16), pages 377-380, XP002235060, ISSN: 0036-8075, cited in the application, page 377, column 1, paragraph 1-column 3, paragraph 2 page 380, column 1, paragraph 2-column 2, paragraph 1 *
CARNEMOLLA BARBARA ET AL.: "Enhancement of the antitumor properties of interleukin-2 by its targeted delivery to the tumor blood vessel extracellular matrix", BLOOD, vol. 99, no. 5, 1 March 2002 (2002-03-01), pages 1659-1665, XP002256864, ISSN: 0006-4971, page 1660, column 1, paragraph 2 page 1664, column 1, paragraph 2 column 2, paragraph 2 *
CURNIS FLAVIO ET AL.: "Enhancement of tumor necrosis factor alpha antitumor immunotherapeutic properties by targeted delivery to aminopeptidase N (CD13)", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, vol. 18, no. 11, November 2000 (2000-11), pages 1185-1190, XP002180671, ISSN: 1087-0156, abstract *
HALIN C. ET AL.: "Enhancement of the antitumor activity of interleukin-12 by targeted delivery to neovasculature", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 20, no. 3, March 2002 (2002-03), pages 264-269, XP002256784, ISSN: 1087-0156, cited in the application, page 264, column 1, paragraph 1-column 2, paragraph 1 *
HALIN CORNELIA ET AL.: "Antibody-based targeting of angiogenesis", NEWS IN PHYSIOLOGICAL SCIENCES, vol. 16, no. August, August 2001 (2001-08), pages 191-194, XP002256865, ISSN: 0886-1714, page 192, column 1, paragraph 1-page 193, column 2, paragraph 2, page 194, column 1, paragraph 2 *
PASQUALINI R. ET AL.: "ALPHAV INTEGRINS AS RECEPTORS FOR TUMOR TARGETING BY CIRCULATING LIGANDS", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, vol. 15, no. 6, 1997, pages 542-546, XP001026410, ISSN: 1087-0156, cited in the application, page 543, column 1, paragraph 1, page 545, column 2, last paragraph-page 546, column 1, paragraph 1 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2502518C2 (ru) * 2008-05-13 2013-12-27 Молмед С.П.А. Конъюгаты для лечения мезотелиомы

Also Published As

Publication number Publication date
EA200800386A1 (ru) 2008-10-30
NO20045236L (no) 2005-01-31
JP2005525115A (ja) 2005-08-25
US20050074426A1 (en) 2005-04-07
CN100457189C (zh) 2009-02-04
KR20050003400A (ko) 2005-01-10
EA200401447A1 (ru) 2005-08-25
CN1665543A (zh) 2005-09-07
AU2003236969A1 (en) 2003-11-17
WO2003092737A1 (en) 2003-11-13
ZA200408768B (en) 2007-03-28
EP1499362A1 (en) 2005-01-26
IL164897A0 (en) 2005-12-18
CN101433722A (zh) 2009-05-20
GB0209893D0 (en) 2002-06-05
CA2484425A1 (en) 2003-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009955B1 (ru) Слияние цитокинов и опухоленацеливающих белков
US9782496B2 (en) Immunoconjugates for the treatment of tumours
ES2565543T3 (es) Construcciones de fusión a Fc de unión a fosfatidilserina y su uso terapéutico
US7795386B2 (en) Peptides comprising an isoDGR motif
US7622105B2 (en) Modified cytokines for use in cancer therapy
Murer et al. Targeted delivery of TNF potentiates the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity of an anti-melanoma immunoglobulin
WO2008152508A2 (en) Cytokine conjugate
US20030077818A1 (en) Compositions and methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU