CN101433722A - 细胞因子与肿瘤靶向蛋白的融合物 - Google Patents

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Abstract

一种细胞因子与肿瘤靶向部分(TTM)的缀合物，前提条件是：当细胞因子是TNF－α、TNF－β或IFN－γ时，所述TTM不是CD13配体；当所述细胞因子是IL－12时，所述TTM不是抗纤连蛋白抗体；当所述细胞因子是TNF时，所述TTM不是抗转铁蛋白受体抗体；当所述细胞因子是TNF、IFN－γ或IL－2时，所述抗体不是抗TAG72抗原的抗体。

Description

细胞因子与肿瘤靶向蛋白的融合物
本申请为分案申请，原申请的申请日为2003年4月30日，申请号为03815203.7(PCT/IB03/02515)，发明名称为“细胞因子与肿瘤靶向蛋白的融合物”。
发明领域
本发明涉及一种药用组合物及其应用。
发明背景
肿瘤生长和肿瘤块是免疫疗法成功的主要限制因素。在常规上，外科手术疗法、化学疗法和放射疗法用于减小肿瘤的体积；根据肿瘤的定位、扩散和对治疗的内在抗性，这些疗法能够获得不同程度的成功。尽管这些疗法显著改善患者存活率，但仍然存在显著缺陷。通过外科手术减小肿瘤体积能够非常有效地除去原发性肿瘤块，但对于弥散性转移瘤的临床应用性有限。另一方面，化学疗法存在选择出抗性个体的风险，而这些抗性个体将是无法治疗的。此外，化学疗法通常对于患者有极大毒性，并且有强烈的免疫抑制效应。出于这些原因，有必要发展根据不同原则的用于治疗肿瘤的低毒性并且高效根除弥散性损害的有效方法。
已经描述一些细胞因子的抗肿瘤活性。一些细胞因子已经用于人体治疗。例如，细胞因子如IL-2和IFN-γ已经在不同类型肿瘤的患者体内显示有效抗肿瘤活性，所述肿瘤类型例如肾转移癌、毛细胞白血病、卡波西肉瘤、黑素瘤和多发性骨髓瘤等。已经显示其它细胞因子对一些肿瘤类型显示某种抗肿瘤活性，所述细胞因子如IFN-β、肿瘤坏死因子(TNF)α、TNFβ、IL-1、4、6、12、15和集落刺激因子(CFS)。
一般而言，细胞因子的治疗应用受到它们系统性毒性的强烈限制。例如，最初发现TNF能够诱导一些肿瘤的出血性坏死，并且TNF对不同肿瘤系有体外细胞毒性效应；但随后证明TNF有强烈的促炎活性，在TNF超量产生的情况下，会严重危害患者的身体。
由于系统性毒性是在人体应用药学有效量细胞因子的主要问题，因此，目前正在评估新型衍生物和治疗策略，目的是降低这类生物效应物的毒性效应，同时保持它们的治疗功效。
一些新型方法涉及：
a)发展能够传递TNF进入肿瘤并增加局部浓度的融合蛋白。例如，已经产生由TNF和肿瘤特异性抗体组成的融合蛋白；
b)发展维持抗肿瘤活性并且系统性毒性降低的TNF突变体。由此，已经制备能够选择性识别仅一种受体的突变体；
c)应用能够降低TNF某些毒性效应又不损失其抗肿瘤活性的抗TNF抗体。已经有文献描述这样的抗体；
d)应用半衰期更长的TNF衍生物(例如与聚乙二醇缀合的TNF)。
EP 251494公开一种用于给予诊断剂或治疗剂的系统。所述系统包括：与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的抗体，能够与所述缀合抗体复合的试剂，以及诊断剂或治疗剂与生物素缀合而组成的化合物。顺序给予上述化合物，并在给药之间有足够间隔，以便通过所述抗体识别的靶细胞表面生物素-抗生物素蛋白之间的相互作用，定位所述治疗剂或诊断剂。已经描述的治疗剂或诊断剂包括金属螯合物，尤其是放射性核素与低分子量抗肿瘤药物例如顺铂、多柔比星等的螯合物。
EP 496074公开一种方法，所述方法顺序给予一种生物素化抗体、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白以及一种生物素化诊断剂或治疗剂。虽然一般性提到细胞毒性剂如蓖麻毒蛋白，但主要公开与放射性标记化合物有关的应用。
WO 95/15979公开一种将高毒性剂定位到细胞靶表面的方法，所述方法主要步骤如下：首先给予第一种缀合物，所述化合物包含与一种配体或一种抗配体缀合的特异性靶分子；然后给予第二种缀合物，所述缀合物包含与一种抗配体或与所述配体结合的毒性剂。
WO 99/13329公开一种将分子靶向到肿瘤血管生成性血管的方法，所述方法的原理是将所述分子与NGR受体的配体缀合。已经提示许多分子作为可能的候选物，但仅仅专门论述多柔比星。未曾公开应用NGR受体的配体作为细胞因子载体，以诱导免疫反应。
在WO 01/61017中，本发明的发明人描述惊人的发现：通过将某些细胞因子与氨肽酶N受体(CD13)的配体偶联，能显著改善所述细胞因子的治疗指数，并且增强它们的治疗性质。CD13是一种150kDa跨膜糖蛋白，在各个物种之间高度保守。CD13在正常细胞中表达，也在骨髓肿瘤细胞系、血管生成性内皮和一些上皮中表达。CD13受体通常被定义为“NGR”受体，因为其肽配体都具有氨基酸“NGR”基序。
HalinC等(2002)Nature Biotechnology 20：264-269公开一种融合蛋白，所述融合蛋白包括与特异性针对纤连蛋白癌胚ED-B结构域的人抗体片段融合的IL-12。Carnemolla等(2002)Blood 99(5)：1659-65公开IL-2与抗ED-B抗体的融合蛋白。
CortiA等(1998)Cancer Research 58：3866-3872公开一种将TNF靶向肿瘤的间接方法或“预靶”方法，所述方法包括用生物素化抗体和抗生物素蛋白或链霉抗生物素预靶肿瘤细胞，一段时间后再给予生物素化TNF。
Hoogenboom等(1991)Mol.Immunol.28：1027-1037公开一种融合蛋白，所述融合蛋白如下构建：将抗运铁蛋白受体mAb的部分重链基因与TNF-α基因融合。Yang等(1995)Hum.Antibod.Hybrodomas 6：129-136公开将TNF的N末端与针对结肠癌、胃癌和卵巢腺癌表达的肿瘤相关TAG72抗原的mAb的绞链区C末端融合。Yang等(1995)Mol Immunol 32：873-881公开单价Fv-TNF与所述TAG72抗原的融合蛋白的生产。就我们所知，目前没有报道这些缀合物体内活性的数据。
Xiang等(1993)Cancer Biother 8：327-337公开针对TAG72的单链Fv和IFN-γ的重组双功能分子；Xiang等(1994)Immun Cell Biol 72：275-285公开了针对TAG72的单链Fv和IL-2的重组双功能分子。
然而，仍然需要其它的和改良的用于癌症治疗和诊断的药用组合物和方法。
目前，我们已经发现：靶向传递细胞因子的概念能够广泛应用，并且显著增加化疗药物的治疗指数。由于这些缀合物起作用(靶向受体、TNF受体)所需多价相互作用的复杂性，还不清楚除CD13以外的血管受体能否起作用。
发明简述
根据本发明的一个方面，提供一种细胞因子与一种肿瘤靶向部分(TTM)的缀合物，前提是当所述细胞因子是TNF-α、TNF-β或IFN-γ时，所述TTM不是CD13配体；当所述细胞因子是IL-2或IL-12时，所述TTM不是抗纤连蛋白抗体；当所述细胞因子是TNF时，所述TTM不是抗运铁蛋白受体的抗体；当所述细胞因子是TNF、IFN-γ或IL-2时，所述TTM不是抗TAG72抗原的抗体；当所述细胞因子是IFN时，所述TTM不是αvβ3整联蛋白配体；当所述细胞因子是TNF时，所述TTM不是纤连蛋白。
在另一实施方案中，所述缀合物不是生物素化TNF。
所述细胞因子最好是一种炎性细胞因子。
在一个优选实施方案中，所述细胞因子是一种化疗细胞因子。
所述细胞因子最好是TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、12、15、EMAP II、血管内皮生长因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趋化因子。
在一个实施方案中，所述细胞因子是TNFα、TNFβ或IFNγ。
所述靶化合物可以或者在肿瘤血管的内皮细胞表面表达，或者在与内皮细胞密切接触或者临近的基质中表达。
在一个实施方案中，所述TTM是肿瘤血管系统靶向部分(TVTM)。
在另一实施方案中，所述TVTM是一种肿瘤血管系统受体、标记或其它细胞外成分的结合配偶体。
在另一实施方案中，所述TTM是一种肿瘤受体、标记或其它细胞外成分的结合配偶体。
在另一实施方案中，所述TTM是一种抗体或配体或其片段。
在一个实施方案中，所述TTM包括NGR或RGD基序，或者所述TTM是HIV-tat、膜联蛋白V、骨桥蛋白、纤连蛋白、I型或IV型胶原蛋白、透明质酸、肝配蛋白，或者所述TTM是癌胚纤连蛋白的一种结合配偶体；或者所述TTM是上述物质的片段。在一个实施方案中，所述TTM不是HIV-tat。
在一个优选实施方案中，所述TTM包括NGR基序。
所述TTM优选是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环状CVLNGRMEC、线性或环状CNGRC。
在一个优选实施方案中，所述TTM包含RGD基序。
在一个实施方案中，所述TTM靶向VEGFR、ICAM1、2或3、PECAM-1、CD31、CD13、VCAM-1、选择蛋白、Act RII、ActRIIB、ActRI、ActRIB、CD44、氨肽酶A、氨肽酶N(CD13)、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、FGF-1、2、3或4、IL-1R、EPHR、MMP、NG2、腱生蛋白、癌胚纤连蛋白、PD-ECGFR、TNFR、PDGFR或PSMA。在另一实施方案中，所述TTM并不靶向VEGFR。
所述缀合物优选为融合蛋白的形式。
在另一实施方案中，所述缀合物为核酸形式。
根据本发明的另一方面，提供包含本发明核酸的表达载体。
根据本发明的另一方面，提供用本发明的表达载体转化的宿主细胞。
根据本发明的另一方面，提供制备缀合物的方法，所述方法包括在允许表达所述缀合物的条件下，培养本发明要求保护的宿主细胞。
根据本发明的再一方面，提供一种药用组合物，所述组合物包括本发明的缀合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个优选的实施方案中，所述组合物还包含另一种抗肿瘤药物或诊断性肿瘤成像化合物。
所述另一种抗肿瘤药物最好是多柔比星或美法仑。
根据本发明的再一方面，提供依照本发明的缀合物或药用组合物用于制备药物的应用，其中所述药物用于癌症治疗或诊断。
另一方面，本发明提供一种治疗或诊断癌症的方法，所述方法包括给予需要患者有效量依照本发明的缀合物或药用组合物。
下面表A显示可以在本发明中应用的优选靶向部分和细胞因子的组合。
表A
 
细胞因子 靶向部分
IFN-α 包含RGD的肽
IFN-β 包含RGD的肽
IL-2 包含RGD的肽
IL-12 包含RGD的肽
EMAP II 包含RGD的肽
VEGF 包含RGD的肽
IL-1 包含RGD的肽
IL-6 包含RGD的肽
IL-12 包含RGD的肽
PDGF 包含RGD的肽
PD-ECGF 包含RGD的肽
CXC趋化因子 包含RGD的肽
CC趋化因子 包含RGD的肽
 
C趋化因子 包含RGD的肽
IL-15 包含RGD的肽
TNF-α 包含NGR的肽
TNF-β 包含NGR的肽
IFN-α 包含NGR的肽
IFN-β 包含NGR的肽
IFN-γ 包含NGR的肽
IL-2 包含NGR的肽
IL-12 包含NGR的肽
EMAP II 包含NGR的肽
VEGF 包含NGR的肽
IL-1 包含NGR的肽
IL-6 包含NGR的肽
IL-12 包含NGR的肽
PDGF 包含NGR的肽
PD-ECGF 包含NGR的肽
CXC趋化因子 包含NGR的肽
CC趋化因子 包含NGR的肽
C趋化因子 包含NGR的肽
IL-15 包含NGR的肽
TNF-α VEGFR的配体
TNF-β VEGFR的配体
IFN-α VEGFR的配体
IFN-β VEGFR的配体
IFN-γ VEGFR的配体
IL-2 VEGFR的配体
IL-12 VEGFR的配体
 
EMAP II VEGFR的配体
VEGF VEGFR的配体
IL-1 VEGFR的配体
IL-6 VEGFR的配体
IL-12 VEGFR的配体
PDGF VEGFR的配体
PD-ECGF VEGFR的配体
CXC趋化因子 VEGFR的配体
CC趋化因子 VEGFR的配体
C趋化因子 VEGFR的配体
IL-15 VEGFR的配体
TNF-α 抗VEGFR抗体
TNF-β 抗VEGFR抗体
IFN-α 抗VEGFR抗体
IFN-β 抗VEGFR抗体
IFN-γ 抗VEGFR抗体
IL-2 抗VEGFR抗体
IL-12 抗VEGFR抗体
EMAP II 抗VEGFR抗体
VEGF 抗VEGFR抗体
IL-1 抗VEGFR抗体
IL-6 抗VEGFR抗体
IL-12 抗VEGFR抗体
PDGF 抗VEGFR抗体
PD-ECGF 抗VEGFR抗体
CXC趋化因子 抗VEGFR抗体
CC趋化因子 抗VEGFR抗体
 
C趋化因子 抗VEGFR抗体
IL-15 抗VEGFR抗体
TNF-α HIV-tat
TNF-β HIV-tat
IFN-α HIV-tat
IFN-β HIV-tat
IFN-γ HIV-tat
IL-2 HIV-tat
IL-12 HIV-tat
EMAP II HIV-tat
VEGF HIV-tat
IL-1 HIV-tat
IL-6 HIV-tat
IL-12 HIV-tat
PDGF HIV-tat
PD-ECGF HIV-tat
CXC趋化因子 HIV-tat
CC趋化因子 HIV-tat
C趋化因子 HIV-tat
IL-15 HIV-tat
TNF-α ICAM1、2或3的配体
TNF-β ICAM1、2或3的配体
IFN-α ICAM1、2或3的配体
IFN-β ICAM1、2或3的配体
IFN-γ ICAM1、2或3的配体
IL-2 ICAM1、2或3的配体
IL-12 ICAM1、2或3的配体
EMAP II ICAM1、2或3的配体
VEGF ICAM1、2或3的配体
 
IL-1 ICAM1、2或3的配体
IL-6 ICAM1、2或3的配体
IL-12 ICAM1、2或3的配体
PDGF ICAM1、2或3的配体
PD-ECGF ICAM1、2或3的配体
CXC趋化因子 ICAM1、2或3的配体
CC趋化因子 ICAM1、2或3的配体
C趋化因子 ICAM1、2或3的配体
IL-15 ICAM1、2或3的配体
TNF-α 抗ICAM1、2或3抗体
TNF-β 抗ICAM1、2或3抗体
IFN-α 抗ICAM1、2或3抗体
IFN-β 抗ICAM1、2或3抗体
IFN-γ 抗ICAM1、2或3抗体
IL-2 抗ICAM1、2或3抗体
IL-12 抗ICAM1、2或3抗体
EMAP II 抗ICAM1、2或3抗体
VEGF 抗ICAM1、2或3抗体
IL-1 抗ICAM1、2或3抗体
IL-6 抗ICAM1、2或3抗体
IL-12 抗ICAM1、2或3抗体
PDGF 抗ICAM1、2或3抗体
PD-ECGF 抗ICAM1、2或3抗体
CXC趋化因子 抗ICAM1、2或3抗体
CC趋化因子 抗ICAM1、2或3抗体
C趋化因子 抗ICAM1、2或3抗体
IL-15 抗ICAM1、2或3抗体
 
TNF-α PECAM-1/CD31的配体
TNF-β PECAM-1/CD31的配体
IFN-α PECAM-1/CD31的配体
IFN-β PECAM-1/CD31的配体
IFN-γ PECAM-1/CD31的配体
IL-2 PECAM-1/CD31的配体
IL-12 PECAM-1/CD31的配体
EMAP II PECAM-1/CD31的配体
VEGF PECAM-1/CD31的配体
IL-1 PECAM-1/CD31的配体
IL-6 PECAM-1/CD31的配体
IL-12 PECAM-1/CD31的配体
PDGF PECAM-1/CD31的配体
PD-ECGF PECAM-1/CD31的配体
CXC趋化因子 PECAM-1/CD31的配体
CC趋化因子 PECAM-1/CD31的配体
C趋化因子 PECAM-1/CD31的配体
IL-15 PECAM-1/CD31的配体
TNF-α 抗PECAM-1/CD31抗体
TNF-β 抗PECAM-1/CD31抗体
IFN-α 抗PECAM-1/CD31抗体
IFN-β 抗PECAM-1/CD31抗体
IFN-γ 抗PECAM-1/CD31抗体
IL-2 抗PECAM-1/CD31抗体
IL-12 抗PECAM-1/CD31抗体
EMAP II 抗PECAM-1/CD31抗体
VEGF 抗PECAM-1/CD31抗体
 
IL-1 抗PECAM-1/CD31抗体
IL-6 抗PECAM-1/CD31抗体
IL-12 抗PECAM-1/CD31抗体
PDGF 抗PECAM-1/CD31抗体
PD-ECGF 抗PECAM-1/CD31抗体
CXC趋化因子 抗PECAM-1/CD31抗体
CC趋化因子 抗PECAM-1/CD31抗体
C趋化因子 抗PECAM-1/CD31抗体
IL-15 抗PECAM-1/CD31抗体
TNF-α VCAM-1的配体
TNF-β VCAM-1的配体
IFN-α VCAM-1的配体
IFN-β VCAM-1的配体
IFN-γ VCAM-1的配体
IL-2 VCAM-1的配体
IL-12 VCAM-1的配体
EMAP II VCAM-1的配体
VEGF VCAM-1的配体
IL-1 VCAM-1的配体
IL-6 VCAM-1的配体
IL-12 VCAM-1的配体
PDGF VCAM-1的配体
PD-ECGF VCAM-1的配体
CXC趋化因子 VCAM-1的配体
CC趋化因子 VCAM-1的配体
C趋化因子 VCAM-1的配体
IL-15 VCAM-1的配体
 
TNF-α 抗VCAM-1抗体
TNF-β 抗VCAM-1抗体
IFN-α 抗VCAM-1抗体
IFN-β 抗VCAM-1抗体
IFN-γ 抗VCAM-1抗体
IL-2 抗VCAM-1抗体
IL-12 抗VCAM-1抗体
EMAP II 抗VCAM-1抗体
VEGF 抗VCAM-1抗体
IL-1 抗VCAM-1抗体
IL-6 抗VCAM-1抗体
IL-12 抗VCAM-1抗体
PDGF 抗VCAM-1抗体
PD-ECGF 抗VCAM-1抗体
CXC趋化因子 抗VCAM-1抗体
CC趋化因子 抗VCAM-1抗体
C趋化因子 抗VCAM-1抗体
IL-15 抗VCAM-1抗体
TNF-α 选择蛋白的配体
TNF-β 选择蛋白的配体
IFN-α 选择蛋白的配体
IFN-β 选择蛋白的配体
IFN-γ 选择蛋白的配体
IL-2 选择蛋白的配体
IL-12 选择蛋白的配体
EMAP II 选择蛋白的配体
VEGF 选择蛋白的配体
 
IL-1 选择蛋白的配体
IL-6 选择蛋白的配体
IL-12 选择蛋白的配体
PDGF 选择蛋白的配体
PD-ECGF 选择蛋白的配体
CXC趋化因子 选择蛋白的配体
CC趋化因子 选择蛋白的配体
C趋化因子 选择蛋白的配体
IL-15 选择蛋白的配体
TNF-α 抗选择蛋白抗体
TNF-β 抗选择蛋白抗体
IFN-α 抗选择蛋白抗体
IFN-β 抗选择蛋白抗体
IFN-γ 抗选择蛋白抗体
IL-2 抗选择蛋白抗体
IL-12 抗选择蛋白抗体
EMAP II 抗选择蛋白抗体
VEGF 抗选择蛋白抗体
IL-1 抗选择蛋白抗体
IL-6 抗选择蛋白抗体
IL-12 抗选择蛋白抗体
PDGF 抗选择蛋白抗体
PD-ECGF 抗选择蛋白抗体
CXC趋化因子 抗选择蛋白抗体
CC趋化因子 抗选择蛋白抗体
C趋化因子 抗选择蛋白抗体
IL-15 抗选择蛋白抗体
 
TNF-α ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
TNF-β ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IFN-α ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IFN-β ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IFN-γ ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IL-2 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IL-12 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
EMAP II ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
VEGF ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IL-1 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IL-6 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IL-12 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
PDGF ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
PD-ECGF ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
CXC趋化因子 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
CC趋化因子 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
C趋化因子 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
IL-15 ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB的配体
TNF-α 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
TNF-β 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IFN-α 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IFN-β 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IFN-γ 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IL-2 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IL-12 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
EMAP II 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
VEGF 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
 
IL-1 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IL-6 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IL-12 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
PDGF 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
PD-ECGF 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
CXC趋化因子 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
CC趋化因子 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
C趋化因子 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
IL-15 抗ActRII、ActRIIB、ActRI或ActRIB抗体
TNF-α 膜联蛋白V
TNF-β 膜联蛋白V
IFN-α 膜联蛋白V
IFN-β 膜联蛋白V
IFN-γ 膜联蛋白V
IL-2 膜联蛋白V
IL-12 膜联蛋白V
EMAP II 膜联蛋白V
VEGF 膜联蛋白V
IL-1 膜联蛋白V
IL-6 膜联蛋白V
IL-12 膜联蛋白V
PDGF 膜联蛋白V
PD-ECGF 膜联蛋白V
CXC趋化因子 膜联蛋白V
CC趋化因子 膜联蛋白V
C趋化因子 膜联蛋白V
IL-15 膜联蛋白V
 
TNF-α CD44的配体
TNF-β CD44的配体
IFN-α CD44的配体
IFN-β CD44的配体
IFN-γ CD44的配体
IL-2 CD44的配体
IL-12 CD44的配体
EMAP II CD44的配体
VEGF CD44的配体
IL-1 CD44的配体
IL-6 CD44的配体
IL-12 CD44的配体
PDGF CD44的配体
PD-ECGF CD44的配体
CXC趋化因子 CD44的配体
CC趋化因子 CD44的配体
C趋化因子 CD44的配体
IL-15 CD44的配体
TNF-α 抗CD44抗体
TNF-β 抗CD44抗体
IFN-α 抗CD44抗体
IFN-β 抗CD44抗体
IFN-γ 抗CD44抗体
IL-2 抗CD44抗体
IL-12 抗CD44抗体
EMAP II 抗CD44抗体
VEGF 抗CD44抗体
 
IL-1 抗CD44抗体
IL-6 抗CD44抗体
IL-12 抗CD44抗体
PDGF 抗CD44抗体
PD-ECGF 抗CD44抗体
CXC趋化因子 抗CD44抗体
CC趋化因子 抗CD44抗体
C趋化因子 抗CD44抗体
IL-15 抗CD44抗体
TNF-α 骨桥蛋白
TNF-β 骨桥蛋白
IFN-α 骨桥蛋白
IFN-β 骨桥蛋白
IFN-γ 骨桥蛋白
IL-2 骨桥蛋白
IL-12 骨桥蛋白
EMAP II 骨桥蛋白
VEGF 骨桥蛋白
IL-1 骨桥蛋白
IL-6 骨桥蛋白
IL-12 骨桥蛋白
PDGF 骨桥蛋白
PD-ECGF 骨桥蛋白
CXC趋化因子 骨桥蛋白
CC趋化因子 骨桥蛋白
C趋化因子 骨桥蛋白
IL-15 骨桥蛋白
 
TNF-α 纤连蛋白
TNF-β 纤连蛋白
IFN-α 纤连蛋白
IFN-β 纤连蛋白
IFN-γ 纤连蛋白
IL-2 纤连蛋白
IL-12 纤连蛋白
EMAP II 纤连蛋白
VEGF 纤连蛋白
IL-1 纤连蛋白
IL-6 纤连蛋白
IL-12 纤连蛋白
PDGF 纤连蛋白
PD-ECGF 纤连蛋白
CXC趋化因子 纤连蛋白
CC趋化因子 纤连蛋白
C趋化因子 纤连蛋白
IL-15 纤连蛋白
TNF-α I型或IV型胶原蛋白
TNF-β I型或IV型胶原蛋白
IFN-α I型或IV型胶原蛋白
IFN-β I型或IV型胶原蛋白
IFN-γ I型或IV型胶原蛋白
IL-2 I型或IV型胶原蛋白
IL-12 I型或IV型胶原蛋白
EMAP II I型或IV型胶原蛋白
VEGF I型或IV型胶原蛋白
 
IL-1 I型或IV型胶原蛋白
IL-6 I型或IV型胶原蛋白
IL-12 I型或IV型胶原蛋白
PDGF I型或IV型胶原蛋白
PD-ECGF I型或IV型胶原蛋白
CXC趋化因子 I型或IV型胶原蛋白
CC趋化因子 I型或IV型胶原蛋白
C趋化因子 I型或IV型胶原蛋白
IL-15 I型或IV型胶原蛋白
TNF-α 透明质酸
TNF-β 透明质酸
IFN-α 透明质酸
IFN-β 透明质酸
IFN-γ 透明质酸
IL-2 透明质酸
IL-12 透明质酸
EMAP II 透明质酸
VEGF 透明质酸
IL-1 透明质酸
IL-6 透明质酸
IL-12 透明质酸
PDGF 透明质酸
PD-ECGF 透明质酸
CXC趋化因子 透明质酸
CC趋化因子 透明质酸
C趋化因子 透明质酸
IL-15 透明质酸
 
TNF-α FGF-1、2、3或4的配体
TNF-β FGF-1、2、3或4的配体
IFN-α FGF-1、2、3或4的配体
IFN-β FGF-1、2、3或4的配体
IFN-γ FGF-1、2、3或4的配体
IL-2 FGF-1、2、3或4的配体
IL-12 FGF-1、2、3或4的配体
EMAP II FGF-1、2、3或4的配体
VEGF FGF-1、2、3或4的配体
IL-1 FGF-1、2、3或4的配体
IL-6 FGF-1、2、3或4的配体
IL-12 FGF-1、2、3或4的配体
PDGF FGF-1、2、3或4的配体
PD-ECGF FGF-1、2、3或4的配体
CXC趋化因子 FGF-1、2、3或4的配体
CC趋化因子 FGF-1、2、3或4的配体
C趋化因子 FGF-1、2、3或4的配体
IL-15 FGF-1、2、3或4的配体
TNF-α 抗FGF-1、2、3或4抗体
TNF-β 抗FGF-1、2、3或4抗体
IFN-α 抗FGF-1、2、3或4抗体
IFN-β 抗FGF-1、2、3或4抗体
IFN-γ 抗FGF-1、2、3或4抗体
IL-2 抗FGF-1、2、3或4抗体
IL-12 抗FGF-1、2、3或4抗体
EMAP II 抗FGF-1、2、3或4抗体
VEGF 抗FGF-1、2、3或4抗体
 
IL-1 抗FGF-1、2、3或4抗体
IL-6 抗FGF-1、2、3或4抗体
IL-12 抗FGF-1、2、3或4抗体
PDGF 抗FGF-1、2、3或4抗体
PD-ECGF 抗FGF-1、2、3或4抗体
CXC趋化因子 抗FGF-1、2、3或4抗体
CC趋化因子 抗FGF-1、2、3或4抗体
C趋化因子 抗FGF-1、2、3或4抗体
IL-15 抗FGF-1、2、3或4抗体
TNF-α IL-1R的配体
TNF-β IL-1R的配体
IFN-α IL-1R的配体
IFN-β IL-1R的配体
IFN-γ IL-1R的配体
IL-2 IL-1R的配体
IL-12 IL-1R的配体
EMAP II IL-1R的配体
VEGF IL-1R的配体
IL-1 IL-1R的配体
IL-6 IL-1R的配体
IL-12 IL-1R的配体
PDGF IL-1R的配体
PD-ECGF IL-1R的配体
CXC趋化因子 IL-1R的配体
CC趋化因子 IL-1R的配体
C趋化因子 IL-1R的配体
IL-15 IL-1R的配体
 
TNF-α 抗IL-1R抗体
TNF-β 抗IL-1R抗体
IFN-α 抗IL-1R抗体
IFN-β 抗IL-1R抗体
IFN-γ 抗IL-1R抗体
IL-2 抗IL-1R抗体
IL-12 抗IL-1R抗体
EMAP II 抗IL-1R抗体
VEGF 抗IL-1R抗体
IL-1 抗IL-1R抗体
IL-6 抗IL-1R抗体
IL-12 抗IL-1R抗体
PDGF 抗IL-1R抗体
PD-ECGF 抗IL-1R抗体
CXC趋化因子 抗IL-1R抗体
CC趋化因子 抗IL-1R抗体
C趋化因子 抗IL-1R抗体
IL-15 抗IL-1R抗体
TNF-α CD31的配体
TNF-β CD31的配体
IFN-α CD31的配体
IFN-β CD31的配体
IFN-γ CD31的配体
IL-2 CD31的配体
IL-12 CD31的配体
EMAP II CD31的配体
VEGF CD31的配体
 
IL-1 CD31的配体
IL-6 CD31的配体
IL-12 CD31的配体
PDGF CD31的配体
PD-ECGF CD31的配体
CXC趋化因子 CD31的配体
CC趋化因子 CD31的配体
C趋化因子 CD31的配体
IL-15 CD31的配体
TNF-α 抗CD31抗体
TNF-β 抗CD31抗体
IFN-α 抗CD31抗体
IFN-β 抗CD31抗体
IFN-γ 抗CD31抗体
IL-2 抗CD31抗体
IL-12 抗CD31抗体
EMAP II 抗CD31抗体
VEGF 抗CD31抗体
IL-1 抗CD31抗体
IL-6 抗CD31抗体
IL-12 抗CD31抗体
PDGF 抗CD31抗体
PD-ECGF 抗CD31抗体
CXC趋化因子 抗CD31抗体
CC趋化因子 抗CD31抗体
C趋化因子 抗CD31抗体
IL-15 抗CD31抗体
 
TNF-α EPHR的配体
TNF-β EPHR的配体
IFN-α EPHR的配体
IFN-β EPHR的配体
IFN-γ EPHR的配体
IL-2 EPHR的配体
IL-12 EPHR的配体
EMAP II EPHR的配体
VEGF EPHR的配体
IL-1 EPHR的配体
IL-6 EPHR的配体
IL-12 EPHR的配体
PDGF EPHR的配体
PD-ECGF EPHR的配体
CXC趋化因子 EPHR的配体
CC趋化因子 EPHR的配体
C趋化因子 EPHR的配体
IL-15 EPHR的配体
TNF-α 抗EPHR抗体
TNF-β 抗EPHR抗体
IFN-α 抗EPHR抗体
IFN-β 抗EPHR抗体
IFN-γ 抗EPHR抗体
IL-2 抗EPHR抗体
IL-12 抗EPHR抗体
EMAP II 抗EPHR抗体
VEGF 抗EPHR抗体
 
IL-1 抗EPHR抗体
IL-6 抗EPHR抗体
IL-12 抗EPHR抗体
PDGF 抗EPHR抗体
PD-ECGF 抗EPHR抗体
CXC趋化因子 抗EPHR抗体
CC趋化因子 抗EPHR抗体
C趋化因子 抗EPHRR抗体
IL-15 抗EPHR抗体
TNF-α 肝配蛋白
TNF-β 肝配蛋白
IFN-α 肝配蛋白
IFN-β 肝配蛋白
IFN-γ 肝配蛋白
IL-2 肝配蛋白
IL-12 肝配蛋白
EMAP II 肝配蛋白
VEGF 肝配蛋白
IL-1 肝配蛋白
IL-6 肝配蛋白
IL-12 肝配蛋白
PDGF 肝配蛋白
PD-ECGF 肝配蛋白
CXC趋化因子 肝配蛋白
CC趋化因子 肝配蛋白
C趋化因子 肝配蛋白
IL-15 肝配蛋白
 
TNF-α MMP的配体
TNF-β MMP的配体
IFN-α MMP的配体
IFN-β MMP的配体
IFN-γ MMP的配体
IL-2 MMP的配体
IL-12 MMP的配体
EMAP II MMP的配体
VEGF MMP的配体
IL-1 MMP的配体
IL-6 MMP的配体
IL-12 MMP的配体
PDGF MMP的配体
PD-ECGF MMP的配体
CXC趋化因子 MMP的配体
CC趋化因子 MMP的配体
C趋化因子 MMP的配体
IL-15 MMP的配体
TNF-α 抗MMP抗体
TNF-β 抗MMP抗体
IFN-α 抗MMP抗体
IFN-β 抗MMP抗体
IFN-γ 抗MMP抗体
IL-2 抗MMP抗体
IL-12 抗MMP抗体
EMAP II 抗MMP抗体
VEGF 抗MMP抗体
 
IL-1 抗MMP抗体
IL-6 抗MMP抗体
IL-12 抗MMP抗体
PDGF 抗MMP抗体
PD-ECGF 抗MMP抗体
CXC趋化因子 抗MMP抗体
CC趋化因子 抗MMP抗体
C趋化因子 抗MMP抗体
IL-15 抗MMP抗体
TNF-α NG2的配体
TNF-β NG2的配体
IFN-α NG2的配体
IFN-β NG2的配体
IFN-γ NG2的配体
IL-2 NG2的配体
IL-12 NG2的配体
EMAP II NG2的配体
VEGF NG2的配体
IL-1 NG2的配体
IL-6 NG2的配体
IL-12 NG2的配体
PDGF NG2的配体
PD-ECGF NG2的配体
CXC趋化因子 NG2的配体
CC趋化因子 NG2的配体
C趋化因子 NG2的配体
IL-15 NG2的配体
 
TNF-α 抗NG2抗体
TNF-β 抗NG2抗体
IFN-α 抗NG2抗体
IFN-β 抗NG2抗体
IFN-γ 抗NG2抗体
IL-2 抗NG2抗体
IL-12 抗NG2抗体
EMAP II 抗NG2抗体
VEGF 抗NG2抗体
IL-1 抗NG2抗体
IL-6 抗NG2抗体
IL-12 抗NG2抗体
PDGF 抗NG2抗体
PD-ECGF 抗NG2抗体
CXC趋化因子 抗NG2抗体
CC趋化因子 抗NG2抗体
C趋化因子 抗NG2抗体
IL-15 抗NG2抗体
TNF-α 腱生蛋白的配体
TNF-β 腱生蛋白的配体
IFN-α 腱生蛋白的配体
IFN-β 腱生蛋白的配体
IFN-γ 腱生蛋白的配体
IL-2 腱生蛋白的配体
IL-12 腱生蛋白的配体
EMAP II 腱生蛋白的配体
VEGF 腱生蛋白的配体
 
IL-1 腱生蛋白的配体
IL-6 腱生蛋白的配体
IL-12 腱生蛋白的配体
PDGF 腱生蛋白的配体
PD-ECGF 腱生蛋白的配体
CXC趋化因子 腱生蛋白的配体
CC趋化因子 腱生蛋白的配体
C趋化因子 腱生蛋白的配体
IL-15 腱生蛋白的配体
TNF-α 抗腱生蛋白抗体
TNF-β 抗腱生蛋白抗体
IFN-α 抗腱生蛋白抗体
IFN-β 抗腱生蛋白抗体
IFN-γ 抗腱生蛋白抗体
IL-2 抗腱生蛋白抗体
IL-12 抗腱生蛋白抗体
EMAP II 抗腱生蛋白抗体
VEGF 抗腱生蛋白抗体
IL-1 抗腱生蛋白抗体
IL-6 抗腱生蛋白抗体
IL-12 抗腱生蛋白抗体
PDGF 抗腱生蛋白抗体
PD-ECGF 抗腱生蛋白抗体
CXC趋化因子 抗腱生蛋白抗体
CC趋化因子 抗腱生蛋白抗体
C趋化因子 抗腱生蛋白抗体
IL-15 抗腱生蛋白抗体
 
TNF-α PD-ECGFR的配体
TNF-β PD-ECGFR的配体
IFN-α PD-ECGFR的配体
IFN-β PD-ECGFR的配体
IFN-γ PD-ECGFR的配体
IL-2 PD-ECGFR的配体
IL-12 PD-ECGFR的配体
EMAP II PD-ECGFR的配体
VEGF PD-ECGFR的配体
IL-1 PD-ECGFR的配体
IL-6 PD-ECGFR的配体
IL-12 PD-ECGFR的配体
PDGF PD-ECGFR的配体
PD-ECGF PD-ECGFR的配体
CXC趋化因子 PD-ECGFR的配体
CC趋化因子 PD-ECGFR的配体
C趋化因子 PD-ECGFR的配体
IL-15 PD-ECGFR的配体
TNF-α 抗PD-ECGFR抗体
TNF-β 抗PD-ECGFR抗体
IFN-α 抗PD-ECGFR抗体
IFN-β 抗PD-ECGFR抗体
IFN-γ 抗PD-ECGFR抗体
IL-2 抗PD-ECGFR抗体
IL-12 抗PD-ECGFR抗体
EMAP II 抗PD-ECGFR抗体
VEGF 抗PD-ECGFR抗体
 
IL-1 抗PD-ECGFR抗体
IL-6 抗PD-ECGFR抗体
IL-12 抗PD-ECGFR抗体
PDGF 抗PD-ECGFR抗体
PD-ECGF 抗PD-ECGFR抗体
CXC趋化因子 抗PD-ECGFR抗体
CC趋化因子 抗PD-ECGFR抗体
C趋化因子 抗PD-ECGFR抗体
IL-15 抗PD-ECGFR抗体
TNF-α TNFR的配体
TNF-β TNFR的配体
IFN-α TNFR的配体
IFN-β TNFR的配体
IFN-γ TNFR的配体
IL-2 TNFR的配体
IL-12 TNFR的配体
EMAP II TNFR的配体
VEGF TNFR的配体
IL-1 TNFR的配体
IL-6 TNFR的配体
IL-12 TNFR的配体
PDGF TNFR的配体
PD-ECGF TNFR的配体
CXC趋化因子 TNFR的配体
CC趋化因子 TNFR的配体
C趋化因子 TNFR的配体
IL-15 TNFR的配体
 
TNF-α 抗TNFR抗体
TNF-β 抗TNFR抗体
IFN-α 抗TNFR抗体
IFN-β 抗TNFR抗体
IFN-γ 抗TNFR抗体
IL-2 抗TNFR抗体
IL-12 抗TNFR抗体
EMAP II 抗TNFR抗体
VEGF 抗TNFR抗体
IL-1 抗TNFR抗体
IL-6 抗TNFR抗体
IL-12 抗TNFR抗体
PDGF 抗TNFR抗体
PD-ECGF 抗TNFR抗体
CXC趋化因子 抗TNFR抗体
CC趋化因子 抗TNFR抗体
C趋化因子 抗TNFR抗体
IL-15 抗TNFR抗体
TNF-α PDGFR的配体
TNF-β PDGFR的配体
IFN-α PDGFR的配体
IFN-β PDGFR的配体
IFN-γ PDGFR的配体
IL-2 PDGFR的配体
IL-12 PDGFR的配体
EMAP II PDGFR的配体
VEGF PDGFR的配体
 
IL-1 PDGFR的配体
IL-6 PDGFR的配体
IL-12 PDGFR的配体
PDGF PDGFR的配体
PD-ECGF PDGFR的配体
CXC趋化因子 PDGFR的配体
CC趋化因子 PDGFR的配体
C趋化因子 PDGFR的配体
IL-15 PDGFR的配体
TNF-α 抗PDGFR抗体
TNF-β 抗PDGFR抗体
IFN-α 抗PDGFR抗体
IFN-β 抗PDGFR抗体
IFN-γ 抗PDGFR抗体
IL-2 抗PDGFR抗体
IL-12 抗PDGFR抗体
EMAP II 抗PDGFR抗体
VEGF 抗PDGFR抗体
IL-1 抗PDGFR抗体
IL-6 抗PDGFR抗体
IL-12 抗PDGFR抗体
PDGF 抗PDGFR抗体
PD-ECGF 抗PDGFR抗体
CXC趋化因子 抗PDGFR抗体
CC趋化因子 抗PDGFR抗体
C趋化因子 抗PDGFR抗体
IL-15 抗PDGFR抗体
 
TNF-α PSMA的配体
TNF-β PSMA的配体
IFN-α PSMA的配体
IFN-β PSMA的配体
IFN-γ PSMA的配体
IL-2 PSMA的配体
IL-12 PSMA的配体
EMAP II PSMA的配体
VEGF PSMA的配体
IL-1 PSMA的配体
IL-6 PSMA的配体
IL-12 PSMA的配体
PDGF PSMA的配体
PD-ECGF PSMA的配体
CXC趋化因子 PSMA的配体
CC趋化因子 PSMA的配体
C趋化因子 PSMA的配体
IL-15 PSMA的配体
TNF-α 抗PSMA抗体
TNF-β 抗PSMA抗体
IFN-α 抗PSMA抗体
IFN-β 抗PSMA抗体
IFN-γ 抗PSMA抗体
IL-2 抗PSMA抗体
IL-12 抗PSMA抗体
EMAP II 抗PSMA抗体
VEGF 抗PSMA抗体
 
IL-1 抗PSMA抗体
IL-6 抗PSMA抗体
IL-12 抗PSMA抗体
PDGF 抗PSMA抗体
PD-ECGF 抗PSMA抗体
CXC趋化因子 抗PSMA抗体
CC趋化因子 抗PSMA抗体
C趋化因子 抗PSMA抗体
IL-15 抗PSMA抗体
TNF-α 玻连蛋白
TNF-β 玻连蛋白
IFN-α 玻连蛋白
IFN-β 玻连蛋白
IFN-γ 玻连蛋白
IL-2 玻连蛋白
IL-12 玻连蛋白
EMAP II 玻连蛋白
VEGF 玻连蛋白
IL-1 玻连蛋白
IL-6 玻连蛋白
IL-12 玻连蛋白
PDGF 玻连蛋白
PD-ECGF 玻连蛋白
CXC趋化因子 玻连蛋白
CC趋化因子 玻连蛋白
C趋化因子 玻连蛋白
IL-15 玻连蛋白
 
TNF-α 层粘连蛋白
TNF-β 层粘连蛋白
IFN-α 层粘连蛋白
IFN-β 层粘连蛋白
IFN-γ 层粘连蛋白
IL-2 层粘连蛋白
IL-12 层粘连蛋白
EMAP II 层粘连蛋白
VEGF 层粘连蛋白
IL-1 层粘连蛋白
IL-6 层粘连蛋白
IL-12 层粘连蛋白
PDGF 层粘连蛋白
PD-ECGF 层粘连蛋白
CXC趋化因子 层粘连蛋白
CC趋化因子 层粘连蛋白
C趋化因子 层粘连蛋白
IL-15 层粘连蛋白
TNF-α 癌胚纤连蛋白的配体
TNF-β 癌胚纤连蛋白的配体
IFN-α 癌胚纤连蛋白的配体
IFN-β 癌胚纤连蛋白的配体
IFN-γ 癌胚纤连蛋白的配体
IL-2 癌胚纤连蛋白的配体
IL-12 癌胚纤连蛋白的配体
EMAP II 癌胚纤连蛋白的配体
VEGF 癌胚纤连蛋白的配体
 
IL-1 癌胚纤连蛋白的配体
IL-6 癌胚纤连蛋白的配体
IL-12 癌胚纤连蛋白的配体
PDGF 癌胚纤连蛋白的配体
PD-ECGF 癌胚纤连蛋白的配体
CXC趋化因子 癌胚纤连蛋白的配体
CC趋化因子 癌胚纤连蛋白的配体
C趋化因子 癌胚纤连蛋白的配体
IL-15 癌胚纤连蛋白的配体
TNF-α 抗癌胚纤连蛋白抗体
TNF-β 抗癌胚纤连蛋白抗体
IFN-α 抗癌胚纤连蛋白抗体
IFN-β 抗癌胚纤连蛋白抗体
IFN-γ 抗癌胚纤连蛋白抗体
EMAP II 抗癌胚纤连蛋白抗体
VEGF 抗癌胚纤连蛋白抗体
IL-1 抗癌胚纤连蛋白抗体
IL-6 抗癌胚纤连蛋白抗体
PDGF 抗癌胚纤连蛋白抗体
PD-ECGF 抗癌胚纤连蛋白抗体
CXC趋化因子 抗癌胚纤连蛋白抗体
CC趋化因子 抗癌胚纤连蛋白抗体
C趋化因子 抗癌胚纤连蛋白抗体
IL-15 抗癌胚纤连蛋白抗体
可以知道，上表中术语“Ab”代表抗体，所述抗体和配体包括它们的片段。
在尤其优选的实施方案中，所述缀合物包含TNF-α或TNF-β以及包含NGR的肽，或者所述缀合物包含TNF-α或TNF-β以及包含RGD的肽。
在一个优选实施方案中，所述缀合物为融合蛋白形式。
本发明的另一方面提供一种药用组合物，所述组合物包含有效量TNF与第一种TTM的缀合产物或者编码同样物质的多核苷酸，并且包含有效量IFN-γ与第二种TTM或者编码同样物质的多核苷酸，其中所述第一种TTM和所述第二种TTM竞争不同受体。
本发明的一些关键好处
化疗药物要到达实体瘤中的癌症细胞，必须进入肿瘤血管，然后穿过血管壁，最后迁移穿过间质。异质性肿瘤灌注、血管渗透性和细胞密度以及间质压力增加是限制药物进入远离血管的瘤细胞并由此限制化疗有效性的关键障碍(1)。因此，目标在于改善药物穿透肿瘤的策略具有极大的实验价值和临床价值。
不断增加的证据显示：肿瘤坏死因子α(TNF)和具备强有力抗肿瘤活性的炎性细胞因子可以用于该目的。例如，与单独使用化疗药物相比，在美法仑或多柔比星区域孤立性肢体灌注中增加TNF在患有肢端软组织肉瘤或黑素瘤的患者体内产生更高的反应率(2-6)。TNF诱导的内皮屏障功能改变、肿瘤间质压力降低以及化疗药物穿透和肿瘤血管损伤增加被认为是TNF与化疗之间协同作用的重要机制(3，4，7-10)。不幸的是，系统性给予TNF伴随着禁止性毒性，其最大耐受剂量(8-10μg/kg)比估计的有效剂量低10-50倍(11，12)。出于这个原因，已经放弃系统性给予TNF，并且该细胞因子的临床应用仅限于局部区域性治疗。然而，TNF活性的一些特征，尤其是对肿瘤相关血管的选择性和与化疗药物的协同作用，仍然有更广泛治疗应用的可能性(13)。
TNF的血管效应为发展“血管靶”策略提供了基本原理，该策略目标在于增加局部有效性并使得能够系统性给予治疗剂量。我们最近已经证明，通过将TNF偶联到CNGRC肽，能够将该蛋白靶向传递到肿瘤血管，CNGRC肽是一种以肿瘤新生血管系统为靶的氨肽酶N(CD13)配体(14)。在当前工作中，我们已经研究用其它缀合物靶向血管能否增强化疗药物在肿瘤中的穿透并改善它们的功效。此外，我们考虑用所述缀合物靶向血管是否会降低药物穿透屏障并且能否增加到达癌症细胞的化疗药物的量。
为减少肿瘤细胞数量，使剩余的肿瘤细胞能够被抗肿瘤效应T细胞完全破坏，我们必须考虑一种减小肿瘤的方法，该方法与化疗不同，没有免疫抑制性。
在这一方面，我们相信：将肿瘤血管作为杀死肿瘤细胞的靶看起来是最有前途的癌症治疗方法之一。肿瘤诱导的血管内皮由非转化细胞组成，因此，所述细胞不发生治疗诱导的突变。因此，在原则上可以给予以肿瘤血管内皮为靶的重复治疗，而不存在选择出抗性变体的危险。第二，通过破坏相对少数量的肿瘤血管，有可能破坏相当大数量依赖血液支持存活的肿瘤细胞。
因此，破坏肿瘤相关血管、破坏新血管形成并且不引起免疫抑制的生物学疗法将是在免疫疗法或其它治疗干预之前减小肿瘤的一种非常有吸引力的方法。
在能够影响肿瘤血管以及免疫系统的各种细胞因子和生物学反应调节剂中，单独应用TNFα或者将TNFα与干扰素γ和化疗药物联合应用无疑是最有效的方法之一。自发现TNFα以来，已经很好地确认该细胞因子在24小时内诱导动物肿瘤大量出血性坏死和肿瘤萎缩。目前已经完全确认：当通过孤立性肢体灌注将高剂量TNF与干扰素γ和美法仑联合局部给药时，TNF也能够破坏患者体内肢端转移黑素瘤的肿瘤大血管和小血管。TNF能够引起一连串级联事件，导致内皮细胞破坏、血小板凝集、血管内血纤维蛋白沉积和凝结，并使最大程度地阻止肿瘤循环。引人注目的是，与肿瘤临近的正常血管不受影响，这指示TNF能够通过某种机制区分正常组织的血管系统以及肿瘤的血管系统。因此，一种有吸引力的可能性是在其它治疗干预之前，利用TNF来诱导减少肿瘤体积。
与常规化疗剂相比，用TNF减少肿瘤体积的另一种潜在好处是：它不是一种免疫抑制剂，但相反，它是一种重要的免疫反应激活剂。TNF确实能够激活抗原呈递细胞，所述细胞是免疫反应重要的关键介质，并且TNF能够激活各种促成有效免疫反应的机制。
不幸的是，由于存在剂量限制性系统性毒性并且治疗指数差，目前TNF作为抗癌症药物的临床应用局限于局部区域性治疗。
可溶性生物活性TNF是一种同源三聚体蛋白，在皮摩尔水平时缓慢解离为无活性的单体亚单位(1)。当三聚体TNF与55-60kDa和75-80kDa这两种不同的细胞表面受体(2)p55TNFR和p75TNFR分别作用并随后形成同型群集时，诱导生物学活性。据认为，所述p55TNFR介导大多数TNF效应(3，4，5，6，7，)，而所述p75TNFR由于其有更高的亲和性(Kd＝0.1 x 10-9M，而p55TNFR是0.5 x 10-9M)，在增加TNF的局部浓度和将所述配体传递到p55TNFR的过程中起重要作用(8，9)。除了这些支持性或者调节性的效应外，p75TNFR介导的直接信号传递也能够促成几种细胞反应，例如胸腺细胞、成纤维细胞和天然杀伤细胞的增殖、GM-CSF分泌(2，10，11)，并且可以用于局部确定TNF内源膜结合形式诱导的局部限制性反应。
证明TNF抗肿瘤功效的临床试验显示：给予治疗有效性大剂量TNF伴随着不可接受的高水平系统性毒性，剂量限制性毒性通常是高血压。因此，基本上已经停止为肿瘤患者系统性给予TNF的尝试。然而，TNF在一些动物模型中的显著抗肿瘤活性使得人们仍然有可能在人体内治疗应用TNF。然而，这需要寻找在系统性给药时降低TNF毒性的方法，或者将TNF以相对或绝对选择性传递到实际的治疗靶(肿瘤)的方法。
快速浓注TNF(静脉内)的人体最大耐受剂量是218-410μg/m2(28)，比动物体内的有效剂量低约10倍(29)。根据来自鼠模型的数据，相信在人体内获得抗肿瘤效应需要高至少10倍的剂量。
一种曾经探索利用TNF的抗肿瘤活性同时避免其系统性毒性的方法是区域性或局部给药。由此，TNF局部给药在卡波西肉瘤、浆细胞瘤、卵巢腺癌和肝内各种转移性肿瘤中显示鼓舞人心的反应率(30，31)。至于区域性给药，在将高剂量TNF与美法仑在孤立性肢体灌注中联合应用以治疗肢端黑素瘤和肉瘤时，获得惊人的结果。该方法获得90-100％的完全反应率，使肿瘤出现出血性坏死(32)，该观察结果与来自一些实验动物肿瘤模型的临床前研究一致。
虽然这些结果是鼓舞人心的，但这些方法的应用性由于两个主要原因而可能仍然受到限制。第一，现在以及将来，在可以设想应用局部区域疗法的大多数情况下，有可能应用其它公知的干预方法(如外科手术、放射疗法)更多。第二，根据定义，恶性肿瘤倾向于扩散，并且在预先排除局部区域疗法的情况下，对于新治疗方法的医学需要最迫切。在关于高温孤立性肢体灌注的第一个临床研究中，单剂量4mg
TNF与美法仑和干扰素γ联合给药获得高反应率(32)。其它研究工作显示：可以省略干扰素γ，并且甚至更低剂量的TNF足以诱导治疗反应(33，34)。由于这些治疗并非没有毒性风险，因此用TNF衍生物靶向血管可能代表在该情况下降低毒性效应的一种替代方法。
发明详述
下面通过非限制性举例的方式描述本发明的各种优选特征和实施方案。
虽然本文提到的技术一般是本领域内众所周知的，但可以参考尤其是Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版，JohnWiley & Sons，Inc(以及Current Protocols in Molecular Biology完整版)。
缀合物
本发明涉及一种缀合物，所述缀合物是通过遗传融合或化学偶联形成的分子，包含连接至少一个细胞因子的至少一个靶向部分/多肽。“连接”指第一个和第二个序列相互连接，以便所述第二个序列能够借助所述第一个序列转运到靶细胞。由此，缀合物包括其中所述转运蛋白与一种细胞因子通过它们的多肽骨架而连接的融合蛋白，所述融合蛋白如下获得：遗传表达编码这些蛋白的DNA分子，直接合成蛋白，然后通过交联剂连接预先形成的序列，形成偶联蛋白。该术语在本文中也包括所述细胞因子与所述靶向蛋白的缔合，如聚集。根据一个实施方案，所述第二个序列可包括多核苷酸序列。该实施方案可以视为蛋白/核酸复合物。
所述第二个序列可以与所述第一个序列来自同一物种但在本发明的缀合物中以不同于天然状态的方式存在，或者来自不同物种。
本发明的缀合物能够靶向细胞，以便连接所述转运序列的多肽序列所对应的效应物功能能够起作用。
所述肽可以直接偶联到所述细胞因子上，或者通过一个间隔区间接连接到所述细胞因子，所述间隔区可以是一个氨基酸、一个氨基酸序列或一个有机残基，例如6-氨基辛酰基-N-羟基琥珀酰亚胺。
所述肽配体最好连接到所述细胞因子的N末端，以便最小化所述修饰细胞因子与其受体结合的任何干扰。或者，所述肽可以连接到氨基或羧基键合受体的氨基酸残基，该氨基酸残基可以在所述分子上天然存在，或者使用遗传工程技术人工插入。最好使用5′-连续序列编码所述肽的cDNA，制备所述修饰细胞因子。
根据一个优选实施方案，提供TNF与CNGRC序列之间的缀合产物，其中所述TNF的氨基末端通过间隔区G(甘氨酸)连接到所述CNGRC肽。
细胞因子
药物穿透进入瘤细胞对于实体瘤化疗的有效性是至关重要的。化疗药物要到达实体瘤中的癌症细胞，必须进入肿瘤血管，然后穿过血管壁，最后迁移穿过间质。异质性肿瘤灌注、血管渗透性和细胞密度以及间质压力增加是限制药物进入瘤细胞并由此限制化疗有效性的关键障碍。因此，具有影响这些因素的效应的细胞因子可用于本发明中。可用于本发明的细胞因子非限制性实例有：TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、12、15、EMAP II、血管内皮生长因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趋化因子。
TNF
TNF作为炎症因子起作用，具有诱导内皮屏障功能改变、降低肿瘤间质压力以及增强化疗药物穿透作用和肿瘤血管损害的效应。
基于下面的观察，首次提出存在肿瘤坏死因子的想法：肿瘤患者在细胞感染后偶尔出现肿瘤的自发性退化。随后在20世纪60年代的研究指出：细胞产物作用下产生的宿主相关性(或内源性)介质有可能引起所述观察到的效应。1975年，显示一种细菌诱导的循环因子对植入小鼠皮下的肿瘤有很强的抗肿瘤活性。该因子被命名为肿瘤坏死因子(TNF)，随后得到分离、克隆，并发现它是一个参与免疫调节和炎症的分子家族的原型。TNF受体和TNF超家族的其它成员也构成相关蛋白的超家族。
TNF相关配体通常具有多种共同的特性。这些特性不包括高度总氨基酸(aa)序列同源性。除神经生长因子(NGF)和TNF-β外，所有配体都作为II型跨膜蛋白(细胞外C末端)合成，包含一个短的胞质区段(10-80个氨基酸残基)以及一个相对长的细胞外区(140-215个氨基酸残基)。NGF在结构上与TNF无关，但也包括在该超家族中，仅仅因为它能够结合TNFRSF低亲和性NGF受体(LNGFR)。NGF具有典型信号序列肽，属于分泌型。与此不同，TNF-β虽然也完全分泌，但具有与II型跨膜蛋白更相关的一级结构。可以认为TNF-β是具有无功能或无效跨膜区段的II型蛋白。一般地说，TNFSF成员形成三聚体结构，它们的单体由β链组成，形成两个β折叠结构。这些分子的三聚体结构提示：TNSF和TNFRSF超家族的配体和受体在信号转导的过程中经历“群集”。
TNF-α：人类TNF-α是一种由233个氨基酸残基组成的未糖基化多肽，或者是跨膜蛋白，或者是可溶性蛋白。当TNF-α作为26kDa膜结合蛋白表达时，包括一个29氨基酸残基的胞质结构域、一个28氨基酸残基的跨膜区段以及一个176氨基酸残基的细胞外区。所述可溶性蛋白由一种85kDa TNF-α转化酶(TACE)介导的蛋白水解切割产生，获得一种17kDa、157个氨基酸残基的分子，该分子通常作为同源三聚体循环。
TNF-β/LT-α：TNF-β也称为淋巴毒素α(LT-α)，该分子的克隆与TNF-α的克隆同时发生。虽然TNF-β作为一种171个氨基酸、25kDa的糖基化多肽进入循环，但已经发现长度为194个氨基酸残基的更大形式。人类TNF-β cDNA编码一个205个氨基酸残基(在小鼠中是202个氨基酸残基)的可读框，在分泌过程中可能发生某种类型的蛋白水解加工。与TNF-α一样，循环中的TNF-β作为非共价连接的三聚体存在，并且已知其与TNF-α结合同样的受体。
在一个实施方案中，所述TNF是TNF的一种突变形式，能够选择性结合其中一种TNF受体(Loetscher H等(1993)J Biol Chem 268：26350-7；Van Ostade X等(1993)Nature 361：266-9)。
已经探索了几种目标在于降低TNF的系统性毒性并保持其抗肿瘤活性的方法。虽然最终目的与前一部分相同，即增加治疗指数，但基本原理却显著不同。在前面的情形中，一般性增强一种生物活性，即细胞毒性，最初被认为是TNF体外相关性抗肿瘤活性；而在当前情形中，选择性修饰TNF的生物学表现，保存一些活性，而丧失另一些活性。
根据后一种原理进行的工作大部分是利用这样一种可能性：即工程化TNF突变体，使其仅结合所述两种TNFR中的其中一种。这一方向的努力开始于下面的观察：人类TNF仅结合两种小鼠TNFR中的其中一种(p55TNFR)，与小鼠p75TNFR之间的相互作用是物种特异性的(2)。体内研究显示：当给予正常小鼠时，人类TNF的系统性毒性比小鼠TNF低约50倍，而抗肿瘤活性相当(44)。这些观察提示：保持与p75TNFR结合的TNF突变体可能比天然TNF有更有利的治疗指数。之后通过定点诱变方法确实获得这样的受体选择性TNF突变体(4，45)。用p55TNFR特异性突变体进行的研究显示：在体内抗肿瘤活性上它与天然TNF一样有效，对于嗜中性粒细胞和内皮细胞的活性则被大大降低，而这两种细胞类型相信在TNF诱导的系统性毒性中起重要作用(6)。
虽然考虑到这些突变体在抗肿瘤疗法中的可能治疗应用，这些结果是非常鼓舞人心的，但观察到p55TNFR在灵长类动物体内也在系统性毒性中起重要作用(46)，以及当所述突变体与增加对TNF敏感性的试剂(如IL-1、LPS或者在该情况中最重要的是在肿瘤本身存在下，所述试剂使生物对TNF敏感，其作用方式与前人提到的外源给药物质相似)联合给药时毒性降低的效果减少(47)，使这种希望大大受挫。
基于以上考虑，我们提出：将这些或者其它TNF突变蛋白与一种αvβ3配体偶联，可能改善它们的治疗指数。
许多其它炎性细胞因子也具有增加内皮血管渗透性的性质，并且认为本发明可以与增加所述细胞因子表达的试剂一起应用于所述细胞因子。炎性细胞因子也称为促炎细胞因子，是多种分子量在5kDa到70kDa之间的多肽和糖蛋白。它们对于炎症反应有刺激性效应。最重要的炎性细胞因子是TNF、IL-1、IL-6和IL-8。
下表显示一些被归类为炎性细胞因子的细胞因子。
炎性细胞因子
 
组别 各个细胞因子
内源细胞因子 IL-1、TNF-α、IL-6
正调节 IL-1、TNF-α、IL-6、IFN-α、IFN-β、趋化因子
刺激产生急性期反应物 IL-1、IL-6、IL-11、TNF-α、IFN-γ、TGF-β、LIF、OSM、CNTF
化学引诱物细胞因子
CXC趋化因子 IL-8、PF-4、PBP、NAP-2、β-TG
CC趋化因子 MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-2、MCP-3、RANTES
C趋化因子 淋巴细胞趋化蛋白
刺激炎性细胞因子 IL-12
TGF-β：转化生长因子，LIF：白血病抑制因子；OSM：制癌蛋白M；CNTF：睫状神经营养因子；PF-4：血小板因子4；PBP：血小板碱性蛋白；NAP-2：嗜中性粒细胞激活蛋白2；β-TG：β-血小板球蛋白；MIP：巨嗜细胞炎症蛋白；MCP：单核细胞趋化蛋白。
IL-11、IFN-α、IFN-β以及尤其是趋化因子超家族成员也正调节炎症反应。在一些情况下，TGF-β具有多种炎症效应，包括对嗜中性粒细胞、T淋巴细胞和失活单核细胞的化学引诱物效应。
IL-2
因为IL-2/IL-2R系统在介导免疫和炎症反应中的核心作用，很明显监测和操作该系统有重要的诊断和治疗意义。由于IL-2具有刺激攻击肿瘤性TAK细胞和TIL(肿瘤侵润淋巴细胞)细胞的能力，它已经显示作为一种抗癌症药物的前途。然而，IL-2的毒性仍然是个问题，值得研究。本发明解决了这个问题。
IL-15
白介素15(IL-15)是一种新型细胞因子，与IL-2有许多共同的生物学性质，但与IL-2缺乏氨基酸序列同源性。IL-15最初在用猴肾上皮细胞系(CVI/EBNA)条件化的培养基中根据其对于鼠T细胞系CTLL-2的促有丝分裂活性而得到鉴定。IL-15也独立地作为人成年T细胞白血病细胞系(HuT-102)产生的一种细胞因子被发现，它刺激T细胞增殖，被命名为IL-T。根据IL-2作为T细胞、NK细胞、LAK细胞和TIL的刺激物的活性，目前正在对IL-2进行临床试验，测试其对于治疗癌症和治疗病毒感染的潜在应用。因为IL-15与IL-2有相似生物学活性，因此IL-15也有相似的治疗潜力。
趋化因子
趋化因子是一个绝大部分由小分子分泌蛋白组成的超家族，作用与淋巴细胞运输、募集和再循环。它们也在许多病理生理学过程中起关键作用，所述病理生理学过程例如变态反应、感染性自身免疫病、血管发生、炎症、肿瘤生长和造血发生。这些蛋白中约80％的成熟形式有66到78个氨基酸(aa)。其余蛋白更大，在蛋白核心的上游存在其它氨基酸，或者作为延伸的C末端区段组成部分的其它氨基酸。所有趋化因子都通过七跨膜结构域G蛋白偶联受体进行信号传递。已知至少有十七种趋化因子，许多这些受体表现混杂的结合性质，即几种不同的趋化因子能够通过同一种受体进行信号传递。
根据保守氨基酸序列基序，趋化因子分为亚家族。大多数家族成员具有至少四个保守的半胱氨酸残基，所述四个半胱氨酸残基形成两个分子内二硫键。根据头两个半胱氨酸残基的位置定义亚家族：
● α亚家族，也称为CXC趋化因子，该家族在所述前两个半胱氨酸残基之间有一个氨基酸将这两个残基分开。根据紧接着第一个半胱氨酸残基之前是否存在glu-leu-arg(ELR)氨基酸基序，可以将该组进一步分类。目前有五种CXC特异性受体，它们命名为CXCR1到CXCR5。ELR+趋化因子结合CXCR2，通常作为嗜中性粒细胞化学诱导物和激活物起作用。ELR趋化因子结合CXCR3到5，主要作用于淋巴细胞。在写作本文时，在科技文献上已经报道14种编码CXC趋化因子的不同人类基因，此外还有一些由于可变剪接造成的多样性。
●● β亚家族，也称为CC趋化因子，所述前两个半胱氨酸残基相互临近，没有间插的氨基酸。目前有24种不同的人类β亚家族成员。该组的受体命名为CCR1到CCR11。不同CC家族成员的靶细胞包括大多数类型的白细胞。
● 有两种已知蛋白与趋化因子同源，但不属于α亚家族或β亚家族。淋巴细胞趋化蛋白是已经丧失第一个和第三个半胱氨酸的γ类(C趋化因子)的唯一成员。淋巴细胞趋化蛋白受体命名为XCR1。Fractalkine是δ类的唯一已知成员(CX3C趋化因子)，在前两个半胱氨酸残基之间有三个间插氨基酸。该分子在趋化因子中是独特的，因为它是N末端趋化因子结构域与长粘蛋白样柄融合的跨膜蛋白。fractalkine受体被称为CX3CR1。
VEGF
本发明还可应用于血管内皮生长因子(VEGF)。血管生成是从以前存在的血管系统发育出新血管的过程。VEGF在胚胎发育、组织的正常生长、伤口愈合、雌性生殖循环(即排卵、月经和胎盘发育)中起必不可少的作用，并且在许多疾病中起主要作用。特别关注癌症，因为如果肿瘤没有新的血液供给，其生长大小在数微米范围内。此外，形成血管是肿瘤细胞转移扩散及生长所必需的。
一种最重要的内皮生长存活因子是VEGF。VEGF诱导血管形成以及内皮细胞增殖，其在调节血管形成中具有重要作用。VEGF是一种结合肝素的糖蛋白，作为45kDa的同二聚体分泌。大多数细胞类型分泌VEGF，但内皮细胞本身通常不分泌VEGF。由于VEGF-A(即最先发现的VEGF)增加血管渗透性，因此它被称为血管渗透因子。此外，VEGF引起血管舒张，部分是通过刺激内皮细胞中的一氧化氮合成酶。VEGF也能够刺激细胞迁移并抑制编程性细胞死亡。有几种VEGF-A的剪接变体。主要的几种分别包括121、165、189和206个氨基酸，其中每一种都包含添加的一个特异性的外显子。
EMAP II
内皮细胞-单核细胞激活多肽-II(EMAP-II)是一种细胞因子，作为肿瘤血管发育过程中的抗血管生成因子起作用，并且强烈抑制肿瘤生长。重组人EMAP-II是一种包含166个氨基酸残基的18.3 kDa蛋白。也已经发现EMAP II增加血管内皮的渗透性。
PDGF
也已经有人提出血小板衍生生长因子(PDGF)拮抗剂可能增加许多种类抗肿瘤药剂在普通实体瘤中的药物摄入和治疗效应。PDGF是一种30kDa的细胞因子，受伤时由血小板释放，刺激临近细胞生长并修复伤口。
PD-ECGF
正如它的名字所提示的，血小板衍生细胞生长因子(PD-ECGF)最初从血小板中根据其刺激内皮细胞有丝分裂的能力而被分离。其相关蛋白是胶质抑制素。
靶向部分
我们已经发现：通过将细胞因子靶向肿瘤血管，可以增加所述细胞因子的治疗指数。此外，由于已知肿瘤细胞能够形成肿瘤血管系统内层组成部分，因此本发明包括直接靶向肿瘤细胞以及靶向其血管系统。任何方便的肿瘤或肿瘤血管系统(尤其是内皮细胞)靶向部分可以用于本发明的缀合物。已知许多这样的靶向部分，这些靶向部分和由它们可获得的任何部分都包括在本发明范围内。在一个实施方案中，所述靶向部分是由肿瘤细胞表达的受体的结合配偶体，例如配体；或者是肿瘤细胞相关细胞外基质的一种标记或成分的结合配偶体，例如抗体。更具体地说，所述靶向部分是由肿瘤相关血管表达的受体的结合配偶体，例如配体；或者是与血管生成血管结合的细胞外基质的一种内皮标记或成分的结合配偶体，例如抗体。术语结合配偶体在本文中以其最广泛的意义使用，包括天然和合成的结合结构域，其中包括配体和抗体或其结合片段。因此，所述结合配偶体可以是一种抗体或其片段(如Fab、Fv、单链Fv)、一种肽或一种肽模拟物，肽模拟物即一种类似肽的分子，它能够结合所述受体、所述细胞的胞外成分的标记。
下面描述合适靶向结构域的非限制性实例以及所述缀合物可以靶向的受体/标记。
CD13
已经惊人地发现：通过将某些细胞因子偶联到氨肽酶-N受体的配体(CD13)，可以显著改善它们的治疗指数，增强它们的免疫治疗效应。CD13是一种在各种物种中高度保守的150kDa跨膜糖蛋白。它在正常细胞表面表达，也在骨髓肿瘤细胞系中表达，在形成血管性内皮以及一些上皮中表达。CD13受体通常被鉴定为“NGR”受体，因为它的肽配体共有氨基酸“NGR”基序。所述配体最好是包含NGR基序的直链或环状肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环状CVLNGRMEC或环状CNGRC，或者更优选是肽CNGRC。其它细节可以见我们的WO01/61017，该文通过引用结合到本文中。
TNF受体
与TNF超家族的成员一样，TNF受体超家族(TNFRSF)的成员也共有许多特性。具体地说，TNFRSF中的分子都是I型(N末端在胞外)跨膜糖蛋白，在它们的细胞外结构域中包含一个到六个结合配体的富含半胱氨酸的40氨基酸残基基序。此外，有功能的TNFRSF成员一般是通过内部半胱氨酸二硫键稳定的三聚体或多聚体复合物。与TNFSF的大多数成员不同，TNFRSF成员以膜结合形式和可溶形式两种形式存在。最后，虽然所述超家族成员胞内结构域之间的氨基酸序列同源性不超过25％，多种受体能够在多种细胞中转导编程性细胞死亡信号，这提示它们有共同的功能。
CD40：CD40是一种50kDa的277个氨基酸残基的跨膜糖蛋白，主要与B细胞增殖和分化有关。人类CD40 cDNA在多种细胞类型中表达，编码一个20氨基酸残基的信号序列、一个173氨基酸残基的细胞外区、一个22氨基酸残基的跨膜区段以及一个62氨基酸残基的胞质结构域。在细胞外区内有四个富含半胱氨酸的基序，这些基序伴随着富含丝氨酸和苏氨酸的近膜序列。在多种已知表达CD40的细胞中，包括内皮细胞。
TNFRI/p55/CD120a：TNFRI是一种55kDa的455个氨基酸残基的跨膜糖蛋白，看起来由几乎所有具核的哺乳动物细胞表达。该分子具有一个190氨基酸残基的细胞外区、一个25氨基酸残基的跨膜区段和一个220氨基酸残基的胞质结构域。TNF-α和TNF-β都结合TNFRI。在多种已知表达TNFRI的细胞中，内皮细胞是其中一种。
TNFRII/p75/CD120b：人类TNFRII是一种75kDa的461氨基酸残基的跨膜糖蛋白，最初从人类肺成纤维细胞文库中分离。该受体包括一个240氨基酸残基的细胞外区、一个27氨基酸残基顶跨膜区段和一个173氨基酸残基的胞质结构域。已经鉴定TNFRII的可溶形式，该可溶形式看起来是来自名为TRRE(TNF受体释放酶)的金属蛋白酶的蛋白水解切割。该脱落过程看起来与可溶性TNFRI的脱落过程相互独立。在多种已知表达TNFRII的细胞中，内皮细胞是其中一种。
CD134L/OX40L：OX40即OX40L的受体，是一种有限表达的T细胞激活标记物，看起来在炎症位点促进CD4+T细胞的存活(并且有可能延长免疫反应)。OX40L也显示有限的表达。根据目前的报道，仅有激活的CD4+、CD8+T细胞、B细胞和血管内皮细胞表达该因子。人类配体是一种32kDa的183氨基酸残基的糖基化多肽，包括21氨基酸残基的胞质结构域、一个23氨基酸残基的跨膜区段和一个139氨基酸残基的细胞外区。
VEGF受体家族
在VEGF受体家族中有三种受体。它们与多种IgG样细胞外结构域和酪氨酸激酶活性具有共同特征。VEGF受体1(VEGF R1，也称为Flt-1)、VEGF R2(也称为KDR或Flt-1)和VEGF R3(也称为Flt-4)的酶结构域由一个插入序列分开。内皮细胞也表达其它VEGF受体，即Neuropilin-1和Neuropilin-2。VEGF-A结合VEGF R1和VEGF R2，也结合Neuropilin-1和Neuropilin-2。P1GF和VEGF-B结合VEGF R1和Neuropilin-1。VEGF-C和VEGF-D结合VEGF R3和VEGF R2。也已经发现HIV-tat和由其衍生的肽靶向VEGFR。
PDGF受体
在大多数常见的实体瘤中，PDGF受体在基质部分表达。在一个大鼠结肠癌模型中，抑制基质表达的PDGF受体将降低肿瘤间质压力并增加肿瘤跨毛细管转运。
PSMA
前列腺特异性膜抗原(PSMA)也是一种极好的肿瘤内皮细胞标记，可以由此产生PSMA抗体。
细胞粘着分子(CAM)
细胞粘着分子(CAM)是细胞表面蛋白，涉及细胞(通常是白细胞)之间的相互结合，或者白细胞结合内皮细胞，或者白细胞结合细胞外基质。损伤和感染时产生的特异性信号控制某些这些粘着分子的表达和激活。这些CAM结合它们的受体/配体而引发的相互作用和反应在介导炎症反应和免疫反应中起重要作用，而所述炎症反应和免疫反应构成机体抵抗这些攻击的一道防线。大多数已经表征的CAM分为三大蛋白家族：免疫球蛋白(Ig)超家族、整联蛋白家族或选择蛋白家族。
L-选择蛋白是细胞表面分子选择蛋白家族的一个成员，包含一个NH2末端C型凝集素结构域、一个EGF样结构域、两个补体控制结构域(complement control domain)、一个15氨基酸残基间隔区、一个跨膜序列和一个短的胞内结构域。
已经鉴定内皮细胞表面L-选择蛋白的三种配体，这三种配体都包含O-糖基化粘蛋白或粘蛋白样结构域。第一种配体GlyCAM-1几乎仅在外周淋巴结和肠系膜淋巴结的高内皮小静脉内表达。第二种L-选择蛋白配体最初称为sgp90，现在已知是CD34。这种唾液粘蛋白样糖蛋白通常用作纯化多能干细胞的表面标记，在广泛多种非淋巴组织的血管中表达，并且在外周淋巴结的毛细血管内表达。L-选择蛋白的第三种配体是MadCAM-1，一种在粘膜淋巴结高内皮小静脉上存在的粘蛋白样糖蛋白。
P-选择蛋白是细胞表面分子选择蛋白家族的一个成员，包括一个NH2末端C型凝集素结构域、一个EGF样结构域、九个补体控制结构域、一个跨膜结构域和一个短的胞质结构域。
已经鉴定四糖唾液酸Lewisx(sLex)是P-选择蛋白以及E-选择蛋白的配体，但P-选择蛋白、E-选择蛋白和L-选择蛋白都可以在合适条件下结合sLex和sLea。据报道，P-选择蛋白也选择性结合在鼠骨髓细胞表面存在的160kDa糖蛋白以及在骨髓细胞、血液嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面存在的一种称为P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1)的糖蛋白，PSGL-1配体也能够结合E-选择蛋白。特异性针对PSLG-1的单克隆抗体能够完全抑制P-选择蛋白介导的白细胞滚动反应，提示即使P-选择蛋白能够在体外条件下结合多种糖蛋白，但可能生理上重要的结合受到更多限制。许多证据指示：P-选择蛋白参与骨髓细胞以及B细胞和一个T细胞亚群粘着激活的内皮。
Ig超家族CAM
Ig超家族CAM是不依赖于钙的跨膜糖蛋白。Ig超家族的成员包括细胞间粘着分子(ICAM)、血管细胞粘着分子(VCAM-1)、血小板-内皮细胞粘着分子(PECAM-1)和神经细胞粘着分子(NCAM)。每一种Ig超家族CAM都有一个细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个与细胞骨架相互作用的胞内结构域，其中所述细胞外结构域包含保守半胱氨酸残基的几个Ig样链内二硫键结合环。一般地说，它们结合整联蛋白或其它Ig超家族CAM。所述神经元CAM涉及神经元模式化。内皮CAM在免疫反应和炎症中起重要作用。
更具体地说，血管细胞粘着分子(VCAM-1、CD106或INCAM-110)、血小板内皮细胞粘着分子(PECAM-1/CD3)和细胞间粘着分子1、2 & 3(ICAM-1、2 & 3)是五种在功能上相关的CAM/IgSF分子，在白细胞-结缔组织/内皮细胞相互作用中起关键作用。这些分子主要在内皮细胞中表达，通常调节白细胞迁移穿过血管壁，并且是血管生成过程中产生内皮附着位点，这些分子都是本发明的合适靶。
人类CD31是一种130kDa的I型(细胞外N末端)跨膜糖蛋白，属于细胞粘着分子(CAM)或者IgSF1的C2样亚组。成熟分子长711个氨基酸(aa)残基，包含一个574氨基酸残基的细胞外区、一个19氨基酸残基的跨膜区段以及一个118氨基酸残基的胞质尾。在所述细胞外区中，有九个潜在的N连接糖基化位点；由于其预测分子量是80kDa，因此看起来大部分这些位点都被占据。所述细胞外区最惊人的特性是存在六个Ig同源性单位，所述Ig同源性单位类似于IgSF的C2结构域。虽然它们在数量上不同，但这些组件的存在是所有IgSF粘着分子(ICAM-1、2、3 & VCAM-1)的共同特征。
整联蛋白
整联蛋白是α亚单位和β亚单位非共价结合的异二聚体。目前，已经鉴定16种α亚单位和8种β亚单位。它们能够以不同方式结合，形成不同类型整联蛋白受体。针对几种整联蛋白的受体是粘着细胞外基质(ECM)蛋白，例如纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白。许多整联蛋白识别氨基酸序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，该氨基酸序列RGD存在于它们结合的纤连蛋白或其它粘着蛋白上。可以使用包含所述RGD序列的肽和蛋白片段调节识别RGD的整联蛋白的活性。因此，本发明可以使用整联蛋白识别的肽作为靶向部分。这些肽传统上称为“包含RGD的肽”。这些肽可以包括已经鉴定为结合整联蛋白的肽基序。这些基序包括氨基酸序列DGR、NGR和CRGDC。所述肽基序可以是线性或环状的。所述基序在下面通过引用结合到本文的与RGD肽描述有关的专利中有更详细的描述：美国专利5,536,814，该专利描述环状CRGDCL、CRGDCA和GACRGDCLGA。美国专利4,578,079涉及通式为X-RGD-T/C-Y的合成肽，其中X和Y是氨基酸。美国专利5,547,936描述一种包含序列X-RGD-XX的肽，其中X可以是氨基酸。美国专利4,988,621描述多种包含RGD的肽。美国专利4,879,237描述通式为RGD-Y的一般肽以及肽G-RGD-AP，其中Y是氨基酸。美国专利5,169,930描述结合αvβ1整联蛋白的肽RGDSPK。美国专利5,498,694和5,700,908涉及β3整联蛋白亚单位的胞质结构域，虽然该结构域确实包含序列RDG，但严格来说该序列不是包含RGD的肽。WO97/08203描述作为结构模拟物或RGD结合位点的环状肽。美国专利5,612,311描述15种包含RGD的肽，所述肽能够或者通过C-C连接环化，或者通过其它基团如青霉胺或疏基正丙酸类似物而环化。美国专利5,672,585介绍了一种包括含RGD肽的通式结构。一类优选的肽是那些RGD的天冬氨酸残基衍生成为O-甲氧基酪氨酸衍生物的肽。美国专利5,120,829描述一种RGD细胞粘着促进结合位点和一种疏水附着结构域。美国专利5,587,456中描述D形式。美国专利5,648,330描述一种对于GP Iib/IIIa有高亲和力的环状包含RGD的肽。
在本发明一个优选实施方案中，所述靶向部分是αvβ3或αvβ5整联蛋白的配体。
以前已经报道应用αvβ3配体传递细胞毒性化疗药物到肿瘤(WPI99-215158/199918)。然而，在这些专利申请中，其目的是将毒性化合物传递到肿瘤血管，例如化疗药物或毒素或抗血管生成化合物。
与此不同，TNF是一种内皮细胞和免疫细胞功能的激活物，而不是抑制剂或毒性化合物。例如，相信TNF是一种促血管生成分子，而不是一种抗血管生成分子。此外，尽管发现TNF对几种肿瘤细胞系有细胞毒性，但已知在保护性机制没有被阻断(例如用转录/翻译抑制剂阻断)的情况下，TNF极少能杀死培养细胞。
因此，看起来TNF的抗肿瘤活性是基于其对各种细胞的激活效应，甚少或并不是基于对肿瘤细胞或内皮细胞的直接细胞毒性效应。因此，可以将TNF视为生物学反应调节剂，而不是传统的细胞毒性化合物。
因此，仅根据专利WPI99-215158/199918，传递到αvβ3的TNF的治疗性质是不明显的。
预期包含ACDCRGDCFCG基序的分子靶向激活的鼠血管以及人血管(72)。因此，技术人员预期人类RGD-TNF将比人类TNF在患者体内有更好的抗肿瘤特性，正如我们在小鼠体内用鼠RGD-TNF所观察到的那样。
人体快速浓注TNF(静脉内)的最大耐受剂量是218-410μg/m2(28)，约比动物体内的有效剂量低10倍(29)。根据来自鼠模型的数据，相信在人体内获得抗肿瘤效应需要10-50倍的剂量(35)。在关于高温孤立性肢体灌注的第一个临床研究中，单剂量4mg TNF与美法仑和干扰素γ联合给药获得高反应率(32)。其它工作显示：可以省略干扰素γ，并且甚至更低剂量的TNF足以诱导治疗反应(33，34)。由于这些治疗并非没有毒性风险(35)，因此应用RGD-TNF可能代表至少在该情况下降低毒性效应的一种替代方法。
此外，可以使用RGD-TNF cDNA替代TNF基因用于基因治疗目的(76)，而原则上可以联合应用生物素化RGD-TNF和生物素化抗体和抗生物素蛋白预靶向肿瘤(71)，以进一步增加其治疗指数。
活化素
已知表达ActRII的细胞包括内皮细胞。ActRIIB表达与ActRII表达同时出现，在内皮细胞中也观察到这种现象。已知表达ActRI的细胞包括血管内皮细胞。也已经在内皮细胞中鉴定出ActRIB。
血管生成素
血管生成素(ANG)是一种14kDa的非糖基化多肽，因为其诱导新血管生长的能力而得名。
膜联蛋白V
膜联蛋白V是具有血管抗凝剂活性的蛋白的钙和磷脂结合家族的一个成员。膜联蛋白V存在各种不同名称：胎盘蛋白4(PP4)、胎盘抗凝蛋白I(PAP I)、钙磷脂结合蛋白I(CPB-I)、依赖于钙的磷脂结合蛋白33(CaBP33)、血管抗凝蛋白α(VACa)、锚定蛋白CII、脂皮质蛋白V、内联蛋白II和组织促凝血酶原激酶抑制剂。据报道，在肿瘤细胞上的膜联蛋白V结合位点是6-24 x 106个/细胞，在内皮细胞上的结合位点是8.8 x 106个/细胞。
CD44
另一种明显涉及白细胞粘着事件的分子是CD44，该分子在造血细胞和非造血细胞中广泛表达。CD44有显著的产生可变剪接形式的能力，它的许多可变剪接形式在活性上不同。这种显著的灵活性使人们猜测：CD44通过其变化的性质，在肿瘤细胞用以成功生长和转移的一些方法中起作用。CD44是一种80-250kDa I型(细胞外N末端)跨膜糖蛋白。已知表达CD44H的细胞包括血管内皮细胞。
存在多种CD44配体，包括骨桥蛋白、纤连蛋白、I型和IV型胶原蛋白和透明质酸。据报道，与纤连蛋白的结合局限于表达硫酸软骨素的CD44变体，其中硫酸软骨素附着位点位于外显子v8-v11。有人提出，透明质酸结合可能事实上存在于所有CD44同种型。主要结合位点之一可能在外显子2的中心，涉及赖氨酸残基和精氨酸残基。除已知透明质酸结合基序简单表达外的其它因素看起来对于透明质酸结合也是必需的。表达外显子、独特胞质尾、糖基化模式和细胞活性状态综合促进成功的透明质酸结合。因此，就其透明质酸结合功能而言，每一种表达CD44的细胞都存在大量“潜在的”灵活性。
成纤维细胞生长因子(FGF)
术语“成纤维细胞生长因子”(FGF)是对于该细胞因子家族局限性描述。FGF的功能不限于细胞生长。虽然某些FGF确实诱导成纤维细胞增殖，但目前已经知道，最初的FGF分子(FGF-2或碱性FGF)也诱导内皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、黑色素细胞和其它细胞的增殖。它还能够促进脂肪细胞分化、诱导巨噬细胞和成纤维细胞产生IL-6、刺激星形胶质细胞迁移和延长神经元的存活。目前，FGF超家族包括23种成员，所有成员都包含一个保守的120氨基酸(aa)核心区，该区包含六个相同的散在分布的氨基酸。
FGF-1：人类FGF-1(也称为酸性FGF、FGFa、ECGF和HBGF-1)是一种17-18kDa的未糖基化多肽，在三个胚层的各种细胞中表达。其结合分子可能是一种FGF受体。已知表达FGF-1的细胞包括内皮细胞。
FGF-2：人类FGF-2也称为碱性FGF、HBGF-2和EDGF，是一种18Da未糖基化多肽，已知具有细胞内活性和细胞外活性。FGF-2分泌后，在细胞表面HS或者基质糖胺聚糖上汇集。虽然FGF-2作为单体分泌，但细胞表面HS看起来将单体FGF-2二聚体化成为非共价连接的边对边构型，该构型随后能够使FGF受体二聚体化并将其激活。已知表达FGF-2的细胞包括内皮细胞。
FGF-3：人类FGF-3是int-2基因的产物[即由整合区2衍生，该区是小鼠染色体7上的一个区，包含在反转录病毒插入后被偶然激活的基因(int-2/FGF-3)]。该分子作为28-32kDa的222个氨基酸的糖蛋白合成，包含多种肽基序。已经报道表达FGF-3的细胞局限于发育细胞和肿瘤。已知表达FGF-3的肿瘤包括乳腺癌和结肠癌细胞系。
FGF-4：人类FGF-4是一种22kDa的176个氨基酸的糖蛋白，是受到发育调节的基因的产物。该分子作为206个氨基酸前体合成，包含一个大的还未定义的30个氨基酸序列以及两个肝素结合基序(氨基酸51-55和140-143)。所述肝素结合位点与FGF-4活性直接相关：肝素/类肝素调节FGF-4激活FGFR1和FGFR2的能力。已知表达FGF-4的细胞包括肿瘤细胞和胚胎细胞。在人类胃癌中也鉴定出该分子，使其获得另一个命名(/hst-1/hst)；在卡波西肉瘤中也分离出该分子，使其又获得一个命名(K-FGF)。
IL-1R
IL-1通过结合于特异性受体而起作用。已经鉴定两种不同的IL-1受体结合蛋白以及一种非结合的信号传导辅助蛋白。上述每一种蛋白都有三个细胞外免疫球蛋白样(Ig样)结构域，因此它们都是IV型细胞因子受体家族的成员。这两种受体结合蛋白分别称为I型IL-1受体(IL-1 RI)和II型IL-1受体(IL-1 RII)。人类IL-1 RI是一种552个氨基酸的80kDa跨膜糖蛋白，该蛋白已经从内皮细胞分离出来。
RTK
已经发现这个受体酪氨酸激酶(RTK)新家族，即Eph受体及其配体肝配蛋白，参与血管装配、血管生成、肿瘤发生和转移。也已经发现A类Eph受体和它们的配体在肿瘤和相关的血管系统中水平提高。
MMP
已经发现基质蛋白酶(MMP)涉及肿瘤生长、血管发生、侵袭和转移。也有人提议将它们作为肿瘤标记。
NG2
NG2是一种大的整合于膜上的硫酸软骨素蛋白聚糖，它首先被鉴定为未成熟神经细胞表达的一种细胞表面分子。随后发现NG2在广泛范围内的未成熟细胞内以及几种极度恶性的肿瘤内表达。人们已经提议使用NG2作为肿瘤血管系统靶分子。具体地说，胶原酶-1(C1)是一种在新形成的微血管中存在的主要基质金属蛋白酶，是新血管形成的标记。
癌胚纤连蛋白
已经发现血管生成期间纤连蛋白癌胚片段(Fn-f)的表达增加，有人提出将它作为肿瘤血管生成的一种标记。在一个实施方案中，TTM是针对纤连蛋白癌胚ED-B结构域的抗体或其片段。在Halin等(2002)Nature Biotechnology 20：264-269中描述所述抗体的制备及其与IL-12的缀合。
腱生蛋白
腱生蛋白是在包括脑癌和乳腺癌以及黑素瘤等恶性肿瘤中发现的基质糖蛋白。它在恶性但没有完全分化的肿瘤中表达，它与肿瘤血管的联系使其成为了解恶性肿瘤生物学和血管生成的重要靶，并且也是治疗癌症的靶和标记。
所述靶向部分最好是能够结合肿瘤细胞或肿瘤血管系统表面分子的多肽。除上面提到的分子外，其它已知或可获得的类似表面分子也可以成为这种重要序列的靶。
可以认识到，技术人员可以应用常规蛋白结合测定以鉴定结合表面分子的分子。也可以认识到，技术人员可以应用基于结构的药物设计来发展结合表面分子的序列。
如上文针对合成化合物所描述的高通量筛选也可以用于鉴定靶向分子。
本发明还设想应用竞争性药物筛选测定，其中能够特异性结合靶的中和抗体与受试化合物竞争结合靶。
结合配偶体(BP)
靶向部分通常采用表面分子结合配偶体(BP)的形式，包含一个或多个结合结构域或者由一个或多个结合结构域组成。
配体
本发明的靶向部分可以为配体形式。配体可以是天然的或合成的。术语“配体”也指化学修饰配体。BP的一个或多个结构域可以构成例如一种受体的天然配体，天然配体可以是粘着分子或生长因子受体配体(如表皮生长因子)，或者保持与所述受体的结合活性的天然配体的片段。
合成配体包括设计配体。在本文中，术语“设计配体”指其三维形状与受体三维形状的比较，有可能结合所述受体的试剂。
抗体
一方面，所述结合结合域可以来自免疫球蛋白(Ig)可变区的重链序列和轻链序列。所述可变区可以来自天然人类抗体或者来自另一物种的抗体，如啮齿动物抗体。另一方面，所述可变区可以来自一种工程化抗体(如人源化抗体)，或者来自免疫或未免疫动物的噬菌体展示文库或者来自经过诱变的噬菌体展示文库。在第二种情况下，所述可变区可以来自单链可变片段(scFv)。所述BP可以包括其它序列，所述序列促成多聚体化，或者所述序列作为各结合结构域之间的间隔区，或者所述序列来自在编码所述BP的基因中插入限制性位点，包括Ig绞链序列或新型间隔区以及工程化的接头序列。
除一个或多个免疫球蛋白可变区外，所述BP可以包括全部或部分Ig重链恒定区，并且可以因此包括整个天然Ig、工程化的Ig、工程化的Ig样分子、单链Ig或者单链Ig样分子。所述BP也可以包含来自另一蛋白如毒素的一个或多个结构域。
本文使用的“抗体”指一种蛋白，该蛋白包括一个或多个实质上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽。抗体可以是完整的免疫球蛋白，或者是多个片段，包括不同肽酶消化产生的已经明确鉴定的片段。虽然根据完整蛋白的消化已经定义各种抗体片段，但技术人员可以认识到，可以通过化学方法或利用重组DNA方法从新合成抗体片段。因此，本文所用的术语抗体也包括对完整抗体进行修饰而产生的抗体片段，或者使用重组DNA方法从新合成的抗体片段。术语“抗体”涵盖的抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFV双抗体和Fd片段。
本发明还提供针对所述表面蛋白的单克隆或多克隆抗体。因此，本发明还提供产生针对本发明多肽的单克隆或多克隆抗体的方法。
假如需要多克隆抗体，就用携带一种或多种表位的免疫原性多肽免疫选定哺乳动物(如小鼠、兔、山羊、马等)。收集来自所述免疫动物的血清，根据已知程序处理。假如血清在包含针对一种表位的多克隆抗体的同时，还包含针对其它抗原的抗体，那么可以通过免疫亲合层析纯化所述多克隆抗体。产生和处理多克隆抗血清的方法是本领域内已知的。为制备所述抗体，本发明还提供半抗原化到另一种多肽的本发明多肽或其片段，用作动物或人类的免疫原。
本领域内技术人员也可以容易地产生针对所述多肽中结合细胞表面表位的单克隆抗体。通过杂交瘤制造单克隆抗体的一般方法是众所周知的。可以通过细胞融合产生无限增殖的抗体生产细胞系，或者利用其它方法，例如用癌性DNA直接转化B淋巴细胞，或者用EB病毒转染B淋巴细胞。可以根据各种特性筛选针对表位产生的各组单克隆抗体，即筛选同种型和表位亲和性。
另一种方法涉及筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在它们的衣壳表面表达携带各种互补决定区(CDR)的scFv片段。该技术是本领域内众所周知的。
为本发明的目的，术语“抗体”包括完整抗体中保持对靶抗原的结合活性的片段，特别指出与该定义相反的情况除外。如上文提到的，所述片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段以及单链抗体(scFV)。此外，所述抗体及其片段可以是人源化抗体，例如在EP-A-239400中描述的人源化抗体。
筛选
本发明的一个方面涉及筛选能够结合肿瘤或肿瘤血管系统细胞表面分子的试剂的方法。所述方法包括将所述细胞表面分子与一种试剂接触，然后确定所述试剂是否结合所述细胞表面分子。
本文中术语“试剂”包括但不限于可从天然或非天然的任何合适来源获得或产生的化合物，例如受试化合物。可以从化合物文库设计或获得所述试剂，所述化合物文库可以包括肽以及其它化合物，例如小的有机分子，尤其是新型前导化合物。例如，所述试剂可以是天然物质、生物大分子或生物学材料(例如细菌、真菌或动物(尤其是哺乳动物)细胞或组织)提取物、有机或无机分子、合成的受试化合物、半合成的受试化合物、结构或功能模拟物、肽、肽模拟物、衍化受试化合物、从完整蛋白切割下来的肽、用合成方法(例如使用肽合成仪)或通过重组技术或综合方法而合成的肽、重组受试化合物、天然或非天然受试化合物、融合蛋白或其等同物、以及上述物质的突变体、衍生物或它们的组合物。
所述试剂可以是氨基酸序列或其化学衍生物。所述物质甚至可以是有机化合物或其它化合物。所述试剂甚至可以是核苷酸序列，所述核苷酸序列可以是有义序列或反义序列。
蛋白
术语“蛋白”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在所述多个多肽的复合物中，各个组成多肽通过共价或非共价方式连接。术语“多肽”包括两个或多个氨基酸长度(通常超过5个、10个或20个氨基酸)的肽。
多肽同源物
可以知道，在本发明中应用的多肽序列不限于具体序列或其片段，而且包括从任何来源获得的同源序列，例如相关病毒/细胞蛋白、细胞同源物和合成肽以及它们的变体或衍生物。本发明的多肽序列也包括由本发明多核苷酸编码的多肽。
多肽变体、衍生物和片段
有关本发明氨基酸序列的“变体”或“衍生物”包括所述序列中一个或多个氨基酸的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或添加，只要获得的氨基酸序列最好具有靶向活性，优选具有序列表中多肽的至少25-50％的活性，更优选在实质上具有至少相同活性。
因此，可以修饰序列以用于本发明。通常进行修饰以保持所述序列活性。因此，在一个实施方案中，可以进行氨基酸取代，例如从1、2或3到10、20或30个氨基酸取代，只要修饰后的序列保持至少约25到50％或基本相同的活性。然而，在替代实施方案中，可以有意对本发明多肽氨基酸序列进行修饰，以降低所述多肽的生物学活性。例如可以使用仍然能够结合靶分子但缺少功能效应物结构域的截短的多肽。
一般地说，与序列表中描述的对应区相比，最好改变变体或衍生物20％、10％或5％以下的氨基酸残基。
氨基酸取代可以包括应用非天然类似物，例如增加作为治疗药物给予的多肽的血浆半衰期(详见下文关于生产用于治疗的肽衍生物)。
可以进行保守性取代，例如根据下表制造。第二列同一栏内的氨基酸，最好第三列同一行内的氨基酸可以相互取代：
Figure A200810186837D00711
本发明的多肽也包括上述多肽及其变体的片段，包括所述序列的片段。优选片段包括那些包括表位的片段。合适片段至少长约5个氨基酸，例如10个、12个、15个或20个氨基酸。它们的长度也可以少于200个、100个或50个氨基酸。所述蛋白及其等位基因变体和物种变体的多肽片段可以包含一个或多个(如2、3、5或10个)取代、缺失或插入，包括保守取代。当例如通过重组技术进行取代、缺失和/或插入时，最好改变少于序列表氨基酸残基的20％、10％或5％。
通常通过重组方法生产本发明的蛋白，所述重组方法例如下面所述的方法。然而，可以使用技术人员众所周知的技术，通过合成方法制造所述蛋白，例如固相合成。用于肽化学合成的各种技术的综述见Borgia和Fields，2000，TibTech 18：243-251，在该文的参考文献中详细描述了这些技术。
制备
在WO01/61017中已经描述制备CD13L-IFN的方法。例如，可以通过遗传工程或化学合成使干扰素γ与CNGRC肽融合。考虑到干扰素γ的二聚体结构，在N末端或C末端携带两个CNGRC部分的缀合物优选提供多价高亲合力相互作用。
使用相似方法，可制备与CNGRC-TNF联合使用的CRGDC-IFN-γ缀合物。
技术人员可以容易地制备αvβ3-L-TNF与抗体或抗体片段的缀合物，所述抗体或抗体片段针对肿瘤细胞或肿瘤相关血管，进一步增加该TNF衍生物到肿瘤的靶向。例如，αvβ3L-TNF可以偶联抗肿瘤相关抗原的抗体或抗其它肿瘤抗原性标记(如基质金属蛋白酶(57)和血管内皮生长因子(58))的抗体，或者偶联靶向细胞外基质成分的抗体，例如抗腱生蛋白抗体或抗纤连蛋白EDB结构域抗体。
可以通过各种方法制备所述αvβ3L-TNF缀合物。例如，所述αvβ3L是一种抗体或其片段，最好是人类来源的抗体或携带人源化支架结构的抗体。在本发明优选的实施方案中，所述αvβ3L是一种肽。例如，最近已经使用噬菌体肽文库发现结合αvβ3的一种肽。该肽的特征在于存在序列CRGDC。可以使用众所周知的重组DNA技术或通过化学缀合，将肽或抗体偶联到TNF。也可以通过间接缀合制备这些分子：例如，可以使它们生物素化，然后使用四价抗生物素蛋白作为非共价交联剂偶联。
治疗肽
可以将本发明的肽作为治疗药物给予患者。优选使用不仅仅包括天然氨基酸、而且包括修饰氨基酸的肽，例如以便降低免疫原性、增加其在患者体内的循环半衰期、增加生物利用率和/或增强功效和/或特异性。
已经使用多种方法修饰用于治疗应用的肽。一种方法是将所述肽或蛋白连接到多种聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，见例如美国专利申请5,091,176、5,214,131和5,264,209。
也可以使用多种非编码性氨基酸或修饰氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸取代天然氨基酸，对肽进行修饰。
另一种方法是使用双功能交联剂，例如N-琥珀酰亚胺基3-(2吡啶基二硫基)丙酸酯、琥珀酰亚胺基6-[3-(2吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯和磺基琥珀酰亚胺基6-[3-(2吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯(见美国专利5,580,853)。
优选使用本发明构象受到限制的肽衍生物。构象限制指肽三维形状的稳定性优选构象。构象限制包括：涉及限制肽内一个残基的构象活动性的局部限制；涉及限制一组残基的构象活动性的区域限制，涉及的残基可以形成某种二级结构单位；以及涉及整个肽结构的整体限制。
可以通过共价修饰如环化，或通过插入γ-内酰胺或其它类型的键，稳定所述肽的活性构象。例如，可以将侧链环化到骨架，以便在相互作用位点的每一侧创造L-γ-内酰胺。一般地，见Hruby等，“合成肽的应用，”Synthetic Peptides：A User’s Guide：259-345(W.H.Freeman& Co.1992)。也可以如下获得环化：例如，形成半胱氨酸桥键，偶联相应末端氨基酸的氨基末端基团和羧基末端基团；或用Asp、Glu或相关类似物的羧基偶联Lys残基或相关类似物的氨基基团。也可以采用碘乙酸酐，使赖氨酸残基的ε氨基基团偶联多肽的α氨基基团。见Wood和Wetzel，1992，Int’l J.Peptide Protein Res.39：533-39。
在美国专利5,891,418中描述的另一种方法是在肽结构中包括螯合金属离子的骨架。通常优选的金属肽骨架基于给定金属离子内配位层所必需的特定配位基团的必需数目。一般地说，大多数有用的金属离子具有配位数四到六。肽链中配位基团包括胺、酰胺、咪唑、胍基官能度的氮原子；硫醇或二硫化物的硫原子；以及羟基、酚、羰基或羧基官能度的氧原子。此外，可以用在化学上改变肽链或各个氨基酸，以包括配位基团，例如肟、肼基、硫氢基、磷酸基、氰基、吡啶子基、哌啶子基或吗啉代。所述肽构建物可以是线性或环状，然而通常优选线性构建物。小线性肽的一个例子是Gly-Gly-Gly-Gly，该肽在骨架上具有四个氮原子(N4复合系统)，能够与配位数为四的金属离子络合。
改善治疗肽性质的另一技术是使用不属于肽的肽模拟物。可以使用多种有用技术阐明肽的精细结构。这些技术包括氨基酸测序、x-射线晶体学、质谱法、核磁共振波谱法、计算机辅助分子建模、肽作图以及它们的组合。对肽的结构分析一般提供大量数据，其中包括所述肽的氨基酸序列和其原子成分的三维位置。根据该信息，可以设计不属于肽的肽模拟物，所述肽模拟物具有治疗活性所需的化学官能性但更稳定，例如对于生物学降解更不敏感。美国专利5,811,512中提供了该方法的一个例子。
化学合成本发明治疗性肽的技术在上面参考文献中描述，另见综述Borgia和Fields，2000，TibTech 18：243-251，而且详见所述文献中的参考文献。
双功能衍生物
本发明的另一实施方案是双功能衍生物，在所述双功能衍生物中受到TTM修饰的细胞因子偶联抗肿瘤抗原或其它肿瘤血管生成标记(如αv整联蛋白、金属蛋白酶或血管生长因子)的抗体或它们的片段，或者偶联对抗细胞外基质成分的抗体或其片段，例如抗腱生蛋白抗体或抗纤连蛋白EDB结构域抗体。最近已经报道，制备TNF与胃腺癌和卵巢腺癌表达的抗肿瘤相关TAG72抗原的mAb绞链区之间的融合产物。
本发明的再一实施方案是用生物素蛋白/抗生物素蛋白系统预靶向肿瘤。根据该方法，在不同阶段，在肿瘤抗原性位点获得三元复合物，所述三元复合物由以下部分组成：1)生物素化mAb、2)抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)和3)用TTM和生物素修饰的二价细胞因子。多份资料证明：与用免疫缀合物常规靶向相比，所述预靶向方法实际上增加靶向靶的活性分子与游离活性分子的比例，由此降低治疗毒性。该方法用生物素化TNF产生有利的结果，所述生物素化TNF能够在正常TNF没有活性的条件下，在体外诱导细胞毒性并减少肿瘤细胞生长。也可以使用同时结合肿瘤抗原和修饰细胞因子的双特异性抗体，通过两相程序进行所述预靶向方法。最近已经描述应用对抗癌胚抗原和TNF的双特异性抗体作为TNF肿瘤预靶向的方法。
肿瘤预靶向是最近发展的另一种方法。可以根据“两步骤”或“三步骤”方法(59)，用各种不同类的化合物进行预靶向。一个具体例子可以帮助阐述该原则，该具体例子根据应用于肿瘤放射性免疫闪烁照相术的抗生物素蛋白-生物素系统。在这种情况下，首先给予特异性针对肿瘤相关抗原的生物素化mAb(“靶向”分子，第一步)。第二天，给予抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(“追踪”分子，第二步)；抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白是四价大分子，结合生物素化mAb，促进快速去除多余的循环分子。又一天后，给予放射性核素标记的生物素(“效应物”分子，第三步)。这个时候“靶向”大分子和“追踪”大分子都已经从循环中有效清除。这使得所述效应物能够快速扩散和定位到肿瘤，以及快速排泄多余的循环游离分子。这与直接标记的mAb形成明显对比；直接标记的mAb循环显著更长时间，由此增加放射性免疫闪烁照相术的背景以及放射免疫疗法的毒性副作用。几个报道已经显示：与使用免疫缀合物的常规靶向相比，所述预靶向方法确实可以显著改善靶与血液的比例，并降低治疗毒性(60，61，62，63)。
应用预靶向策略于使用生物素化TNF的肿瘤疗法被认为尤其有价值，因为与TNF-TNFR相互作用的亲和力相比，生物素-抗生物素蛋白相互作用有显著更高的亲和力(10-15M)。预期这将允许生物素化TNF有效地优选结合预中靶细胞而不是表达TNFR的细胞，增强其在肿瘤位点的持久性。在该基本原理的基础上，最近已经描述用三步骤mAb/抗生物素蛋白系统靶向生物素化TNF(Moro，1997)。已经用Thy1.1等位基因转染小鼠RMA淋巴瘤细胞，创造独特的tum，Gasparri等(71)。可以使用一种相似方法进一步增加生物素化αvβ3L-TNF的治疗指数。
所述αvβ3L-TNF预靶向策略不一定限制于“三步骤”方法。文献中描述的“两步骤”方法的例子基于应用双特异性抗体，所述双特异性抗体一个臂特异性针对肿瘤抗原，另一个臂特异性针对TNF。具体地说，最近已经描述应用针对癌胚抗原和TNF的双功能性抗体，将TNF靶向肿瘤(64)。
根据另一实施方案，本发明包含在不同TNF亚单位上缀合TTM以及一种抗体或其片段(直接缀合或通过生物素-抗生物素蛋白桥键缀合)的细胞因子，其中所述抗体或其片段针对在肿瘤细胞表面表达的抗原或肿瘤基质的其它成分，如腱生蛋白和纤连蛋白EDB结构域。这改善所述修饰细胞因子的肿瘤靶向特性，并且在肿瘤微环境中通过三体-单体-三体转化，缓慢释放所述修饰细胞因子。例如TNF缀合物的修饰亚单位可以从靶向化合物解离并重新结合，形成未修饰的三体TNF分子，所述未修饰的三体TNF分子随后扩散到肿瘤微环境中。已经显示，生物活性TNF的释放在靶向24-48小时内出现。
脂质体形式的细胞因子制剂能够改善其生物活性。事实上，已经观察到TNF氨基基团的酰化作用诱导其疏水性增加，而不损失体外生物学活性。此外，已经报道，结合脂质的TNF的细胞毒性在体外不受影响，免疫调节效应不受影响，体内毒性降低。
将αvβ3L-TNF胶囊化在脂质体中是改善其生物学性质的另一方法。观察到TNF一些氨基基团的酰化导致其疏水性增加而不损失体外生物学活性，这提示该方法的可行性。已经利用该发现，容易地使TNF整合例如脂载体。已经报道，所述结合脂质的TNF具有未受改变的针对肿瘤细胞的体外细胞毒性，以及未受改变的免疫调节效应，同时体内毒性效应降低(48，49)。
用聚乙二醇衍化αvβ3L-TNF(聚乙醇化)可以认为是延长其半衰期的优选选择。
在许多情况下，TNF在体内的测量半衰期并不真实。因此，观察到该参数高度依赖于给药剂量，在增加TNF剂量的情况下观察到不成比例的半衰期增加(50)。对该现象的解释是：在低剂量下，可溶性循环TNFR有效结合TNF(51)。所述可溶性TNFR在用TNF系统性治疗的患者血清内快速增加(52)，通过对表面结合受体的蛋白水解切割产生。在通常用于测量TNF水平的大多数测定中，结合于循环TNFR的TNF可能逃过检测。在所有可溶性TNFR(基础TNFR以及TNF诱导的TNFR)饱和时的阈值水平以上，开始检测到未结合的循环TNF，由此更准确地反映TNF的有效体内半衰期。
清楚的是，TNF的聚乙醇化预期不排除TNFR的清除效应，因此，任何目标在于延长TNF半衰期，一般来说降低TNF给药剂量的方法必需处理以下事实：即为了使TNF有活性，体内TNF水平必须超过可溶性循环TNFR的结合量。然而，解决这个问题的一种可能性是诱变CD13L-TNF，降低其与天然TNF受体相互作用的能力，由此可以给予更高剂量。
联合应用方法
已经探索过的在系统给予TNF时获得更有利治疗指数的最早方法之一是联合应用TNF和其它药物。技术人员希望发展出给予更低剂量TNF、既保持抗肿瘤活性、系统性毒性又低的治疗方法。该原理在很大程度上是猜测的，因为不可能排除所述方法可能在毒性方面出现协同效应，并因此导致与单独应用TNF观察到的相同治疗指数。事实上，在人体中已经研究过的所述联合治疗方案中，已经证明是后一种情况。
其中一种得到最广泛研究的方法是联合应用TNF和IFN-γ(36，37)，具体地说是因为这些细胞因子对于内皮细胞的协同作用。所述第二种方法是与化疗联合应用。
已经在一些实验肿瘤模型中，研究联合应用TNF以及据说与TNF协同作用的一些化合物的方法。不幸的是，这种治疗伴随着系统性毒性增加。
靶向传递TNF到肿瘤血管是最近探索的增加TNF治疗指数的一种方法。WO01/61017描述通过偶联TNF和氨肽酶N(CD13)的一种配体而制备的TNF衍生物，所述TNF衍生物的治疗指数改善，其中所述CD13是在肿瘤血管表达的一种膜蛋白酶。该细胞因子以非常复杂的方式与CD13和TNF受体相互作用，在低剂量选择性激活肿瘤内皮细胞。考虑到TNF与IFN对于内皮细胞的协同效应，推荐用缀合CD13配体的两种细胞因子靶向内皮细胞。然而，技术人员预期这些修饰细胞因子在内皮细胞表面竞争同一受体(CD13)，导致丧失靶向性和活性。WO01/61017教导如何制备该细胞分子与CD13配体的缀合物，如NGR-TNF和NGR-IFN-γ。在我们实验室进行的实验的基本方法是给予同时缀合CD13配体(CNGRC)的TNF和IFN-γ；这些实验显示：当在动物模型中注射这些修饰细胞因子时，它们的治疗活性确实低于单独给药，大概是因为它们竞争同一个靶向受体。
我们已经发现：通过例如将TNF靶向一种不同于CD13的肿瘤血管受体并将IFN-γ靶向CD13(如通过将其偶联到CNGRC肽)，或者相反，可以将这些细胞因子靶向血管而没有交叉结合干扰。
在本发明的该优选实施方案中，TNF偶联到αvβ3的配体，例如包含CRGDC基序的肽。因此，在本发明的一个优选实施方案中，联合应用avb3L-IFN-γ衍生物以及CD13配体-TNF。在另一优选实施方案中，提供avb3L-TNF衍生物与CD13配体-IFN-γ的联合应用。
多核苷酸
用于本发明的多核苷酸包括编码本发明多肽缀合物的核酸序列。技术人员知道，由于遗传密码简并性的结果，多种不同的多核苷酸可以编码同一种多肽。此外，技术人员可以使用常规技术，制造不影响本发明多核苷酸所编码的多肽序列的核苷酸取代，以反应本发明多肽所需要表达的任何具体宿主生物体内的密码子使用。
本发明的多核苷酸可以包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链。它们也可以是在其中包括合成或修饰核苷酸的多核苷酸。本领域内已知多种不同类型寡核苷酸修饰。这些包括甲基磷酸和硫代磷酸骨架、在所述分子3′末端和/或5′末端加入吖啶或聚赖氨酸链。为本发明的目的，可以用本领域内可利用的任何方法修饰本文描述的多核苷酸。可以进行所述修饰以增强本发明多核苷酸的体内活性或寿命。
核苷酸载体
可以将本发明的多核苷酸插入重组复制型载体。所述载体可以用于在相容宿主细胞中复制所述核酸。因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入一种复制型载体，将所述载体引入一种相容的宿主细胞，然后在产生所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞中回收所述载体。合适的宿主细胞包括细菌如大肠杆菌(E.coli)、酵母、哺乳动物细胞系和其它真核细胞系，例如昆虫Sf9细胞。
载体中的本发明多核苷酸最好有效连接一种能够使所述宿主细胞表达编码序列的控制序列，即所述载体是一种表达载体。术语“有效连接”指所述成分处于以既定方式起作用的关系。调节序列与编码序列“有效连接”的方式使得在与所述控制序列相容的条件下表达所述编码序列。
可以修饰所述控制序列，例如通过加入其它转录调节元件，使所述控制序列指导的转录水平对转录调节剂更敏感。
可以将本发明的载体转化或转染进入如下文所述的合适宿主细胞，以表达本发明的蛋白。该过程可以包括以下步骤：在使所述蛋白编码序列的载体表达的情况下，培养用如上文所述表达载体转化的宿主细胞，然后可选地回收所表达的蛋白。
所述载体可以是，例如，具有以下元件的质粒或病毒载体：一个复制起点，任选用于表达所述多核苷酸的启动子和任选所述启动子的调节物。所述载体可以包含一个或多个选择标记基因，例如在细菌质粒中包含氨苄青霉素抗性基因，或者在哺乳动物载体中包含新霉素抗性基因。载体可以用于例如转染或转化宿主细胞。
有效连接本发明蛋白编码序列的控制序列包括启动子/增强子和其它表达调节信号。可以选择与所述表达载体设计使用的宿主细胞相容的控制序列。术语“启动子”是本领域内众所周知的，包括大小和复杂性各不相同的核酸区，从最小启动子到包括上游元件和增强子的启动子。
启动子通常选自在哺乳动物细胞中有功能的启动子，但可以使用原核启动子和在其它真核细胞中有功能的启动子。所述启动子通常来自病毒或真核基因的启动子序列。例如，它可以是来自发生表达的细胞的基因组。至于真核启动子，它们可以是以遍在方式发挥功能的启动子(例如a-肌动蛋白、b-肌动蛋白、微管蛋白启动子)，或者是以组织特异性方式起作用的启动子(例如丙酮酸激酶编码基因的启动子)。也可以使用特异性针对某些细胞的组织特异性启动子。它们也可以是响应特定刺激的启动子，例如结合类固醇激素受体的启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼氏鼠白血病毒长末端重复序列(MMLVLTR)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人类巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
使用诱导型启动子也是有利的，以便可以在细胞的生活周期内调节异源基因的表达水平。诱导型指可以调节使用所述启动子获得的表达水平。
此外，通过加入其它调节序列，修饰任何这样的启动子，例如增强子序列。也可以使用包含来自上文所述两种或多种不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
宿主细胞
可以将本发明的载体和多核苷酸引入宿主细胞，以复制所述载体/多核苷酸和/或表达本发明多核苷酸编码的本发明蛋白。虽然可以使用原核细胞作为宿主细胞，产生本发明的蛋白，但优选使用真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，尤其是哺乳动物细胞。
可以使用本领域内众所周知的各种技术，例如转染、转化和电穿孔，将本发明的载体/多核苷酸引入合适宿主细胞。在将本发明载体/多核苷酸给予动物的情况下，几种技术是本领域内众所周知的，例如用重组病毒载体如反转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒感染、直接注射核酸以及生物弹道转化。
蛋白表达和纯化
可以使用包含本发明多核苷酸的宿主细胞表达本发明的蛋白。可以在允许表达本发明蛋白的合适条件下培养宿主细胞。本发明蛋白的表达可以是组成型的，以便能够持续地生产它们；或者表达是诱导型的，需要刺激以起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时起始表达，例如通过在培养基中加入诱导物例如地塞米松或IPTG。
可以通过本领域内已知的各种技术，从宿主细胞中提取本发明的蛋白，所述技术包括酶裂解、化学裂解和/或渗透裂解和物理破碎。
给药
本发明蛋白优选与各种成分组合制备本发明的组合物。所述组合物优选与药学上可接受的合适载体、稀释剂或赋形剂组合制备药用组合物(可以用于人类或动物)。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲液。赋形剂的详细资料可见The Handbook ofPharmaceutical Excipients，第二版，Eds Wade & Weller，AmericanPharmaceutical Association。可以通过直接注射给予本发明的组合物。可以配制所述组合物，用于胃肠外给药、肌内给药、静脉内给药、皮下给药、眼内给药、口服给药或经皮给药。
一般以约1到10mg的剂量给予所述缀合物。
可以配制所述组合物，以便每日给药、每周给药或每月给药提供所需的日剂量。可以认识到，可以方便地配制所述组合物，以便降低给药频率，例如每2、4、6、8、10或12小时给药一次。
可以将编码多肽成分的多核苷酸/载体作为裸核酸构建物直接给药，所述裸核酸构建物最好还包含与所述宿主基因组同源的侧翼序列。
可以通过几种已知的转染技术增强哺乳动物细胞摄入裸核酸构建物，例如那些包括应用转染剂的技术。这些试剂的例子包括阳离子剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂转染剂(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常将核酸构建物与所述转染剂混合产生组合物。
本发明的多核苷酸或载体最好与药学上可接受的载体或稀释剂组合制备药用组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液。可以配制所述组合物，用于胃肠外给药、肌内给药、静脉内给药、皮下给药、眼内给药或经皮给药。
所述给药途径和剂量方案仅作为指导，因为技术人员能够容易地为任何具体患者和病理状况决定最佳给药途径和剂量方案。
病毒载体
在优选实施方案中，使用病毒载体给予所述缀合物，更优选使用反转录病毒载体。
反转录病毒
用于本发明的反转录病毒载体可以衍生自任何合适的反转录病毒。已经鉴定大量不同的反转录病毒。例子包括：鼠白血病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人类T细胞白血病病毒(HTLV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒29(MC29)和禽成红血细胞性病病毒(AEV)。反转录病毒的详细列表可见Coffin等，1997，“retroviruses”，Cold Spring Harbour Laboratory Press编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，第758-763页。
本领域内有一些反转录病毒基因组结构的详细资料。例如，HIV和Mo-MLV的详细资料可见NCBI Genbank(基因组登记号分别是AF033819和AF033811)。
反转录病毒在广义上可以分为两类：即“简单型”和“复杂型”。反转录病毒甚至可以进一步分为七类。其中五类致癌性反转录病毒。其余两类是慢病毒和泡沫病毒。这些反转录病毒的回顾见Coffin等，1997(同上)。
慢病毒组可以进一步分为“灵长类”和“非灵长类”。灵长类慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其中人类免疫缺陷病毒是人类自身免疫综合征(AIDS)的致病因子。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒”绵羊脱髓鞘性脑白质炎/绵羊肺腺瘤病病毒(VMV)以及相关的羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)以及最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
本发明还涉及应用载体将核苷酸序列形式的缀合物传递到造血干细胞(HSC)。
基因传递涉及将表达盒传递到靶细胞如HSC，所述表达盒由一种或多种核苷酸序列以及控制它们表达的序列组成。可以采用如下程序在活体外执行：在实验室中将所述表达盒转移到细胞，然后将所述修饰细胞给予接受者。或者，可以采用如下程序在体内执行基因转移：将所述表达盒直接转移到个体内的细胞。在这两种策略中，所述转移方法通常使用一种载体的协助，这种载体帮助传递所述表达盒到合适的细胞内位点。
骨髓是用于转导的HSC的传统来源，最近的研究发现：外周血干细胞或脐带血细胞是同样好或更好的靶细胞(Cassel等1993 ExpHematol 21：585-591；Bregni等1992 Blood 80：1418-1422；Lu等1993 JExp Med 178：2089-2096)。
其它抗癌药物
本发明的缀合物可以与一种或多种其它活性药物联合应用，所述其它活性试剂例如一种或多种细胞毒性药物。因此，在本发明的一个方面，所述方法还包括给予另一种活性药物成分，例如细胞毒性药物，所述另一种活性药物成分或者作为与所述缀合物的联合剂型给药，或者作为单独的剂型给药。所述单独的细胞毒性药物剂型可以包括固体口服剂型、口服溶液剂型、糖浆剂型、酏剂剂型、注射剂型、经皮剂型、经粘膜剂型或其它剂型。所述缀合物和其它活性药物成分可以在一种剂型中联合使用，或者作为同时或顺序使用的单独剂型提供。
可用于本发明的细胞毒性药物的例子包括：烷基化药物，例如环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、氮芥、雌莫司汀、曲奥舒凡、塞替派、二溴甘露醇；细胞毒性抗生素，例如多柔比星、表柔比星、阿柔比星、伊达比星、柔红霉素、米托蒽醌、博来霉素、放线菌素D和丝裂霉素；抗代谢药，例如氨甲蝶呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、克拉屈滨、吉西他滨、氟尿嘧啶、雷替曲塞、巯嘌呤、替加氟、硫鸟嘌呤；长春花生物碱，例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨以及依托泊苷；其它肿瘤药物，例如安吖啶、六甲蜜胺、crisantaspase、达卡巴嗪和替莫唑胺、羟基脲、喷司他丁；铂化合物，包括：卡铂、顺铂、奥利沙铂、卟吩姆钠、丙卡巴肼、雷佐生；紫杉烷类，包括：多西他塞和紫杉醇；拓扑异构酶I抑制剂，包括：伊立替康和托泊替康、曲妥单抗和维A酸。
在优选实施方案中，另一种细胞毒性药物是多柔比星或美法仑。
本发明的缀合物也可以用于利用肿瘤细胞和血管对于化合物的渗透性而进行有关诊断。例如，可以使用所述缀合物在对肿瘤的放射性免疫闪烁照相术或放射疗法中增加肿瘤对放射标记抗体或激素(肿瘤成像化合物)的摄入。
附图和实施例
通过下面非限制性的实施例和附图进一步描述本发明，其中：
图1展示在T/SA小鼠乳腺癌模型中，表征TNF的治疗活性和毒性活性，以及表征RGD-TNF与NGR-IFN联合应用的治疗活性和毒性活性。该图更详细地显示：RGD-mTNF与NGR-mIFN-γ联合应用的抗肿瘤活性比mTNF与NGR-mIFN-γ联合应用或者单独应用NGR-mIFN-γ的抗肿瘤活性都强。这些结果指出：将TNF和IFN-γ靶向传递到肿瘤血管系统不同受体能够产生协同效应。
实施例
实施例I
制备TNF和RGD-TNF
在大肠杆菌中通过胞质cDNA表达产生鼠重组TNF和ACDCRGDCFCG(RGD-TNF)。对脂多糖刺激的鼠RAW-264.7单核细胞-巨噬细胞分离的mRNA，使用5′-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′和5′-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3′作为3′和5′引物，通过反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)制备编码鼠Met-TNF1-156(66)的cDNA。
用Nde I和Bam HI(New England Biolabs，Beverley，MA)消化扩增片段，克隆进用同样酶预先消化的pET-11b(Novagen，Madison，WI)，获得pTNF。
对pTNF通过PCR扩增编码ACDCRGDCFCG-TNF1-156的cDNA，使用5′-TGCAGATCATATGGCTTGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTCTCAGATCATCTTCTC-3′作为5′引物，以及上述3′引物。
如上文所述，消化扩增片段并克隆进pET-11b，用于转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)。根据pET11b生产商的说明书，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导TNF和RGD-TNF表达。如下从两升培养物中回收可溶性TNF和RGD-TNF：在2mM乙二胺四乙酸(etilendiaminetetracetic acid)，20mM Tris-HCl，pH 8.0中超声破碎细菌细胞，然后离心(15000xg，20分钟，4℃)。两种提取物都与硫酸铵(25％饱和度)混合，在4℃放置1小时，然后如上文所述离心。然后将上清液中的硫酸铵调整到65％饱和度，在4℃放置24小时，然后离心。每种沉淀物溶解于200ml 1M硫酸铵，50mM Tris-HCl，pH8.0，在苯基琼脂糖6快速柱(Pharmacia-Upjohn)上通过疏水相互作用层析进行纯化(梯度洗脱，缓冲液A：50mM磷酸钠，pH8.0，含1M硫酸铵；缓冲液B：20％甘油，5％甲醇，50mM磷酸钠，pH8.0)。合并包含TNF免疫反应性材料(通过蛋白质印迹鉴定)的组分，对2mM乙二胺四乙酸，20mM Tris-HCl，pH 8.0透析，然后在DEAE琼脂糖快速柱(Pharmacia-Upjohn)上通过离子交换层析纯化(梯度洗脱，缓冲液A：20mM Tris-HCl，pH 8.0；缓冲液B：1M氯化钠，20mM Tris-HCl，pH 8.0)。合并包含TNF免疫反应性的组分，在用150mM氯化钠，50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.3(PBS)预平衡和洗脱的聚丙烯酰胺葡聚糖-S-300 HR(Pharmacia-Upjohn)上通过凝胶过滤层析进行纯化。合并对应于40000-50000 Mr产物的组分，等分并冻存在-20℃。在层析步骤中使用的所有溶液都用无菌无热原的水(Salf，Bergamo，Italy)制备。
如前人所述(65)通过电喷射质谱学测量纯化的TNF和RGD-TNF的分子量。使用商业化蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)，测量蛋白含量。
使用12.5或15％聚丙烯酰胺凝胶，用标准程序进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析。
对TNF的非还原性SDS-PAGE显示只有一条17-18kDa的带，是单体TNF的预期条带。对RGD-TNF的非还原性SDS-PAGE和蛋白质印迹分析则有不一致，显示18、36和50kDa的不同免疫反应型，可能对应于单体、双体和三体。在还原条件下，大多数50和36kDa带转化成18kDa型，这表明存在携带链间二硫键的RGD-TNF分子。所述18kDa带占总物质约1/2。这些电泳结果提示：RGD-TNF是各种三体的混合物，其中包括由三个有正确链内二硫键(10-20％)的单体亚单位组成的三体，其余部分大多数是有一个或多个链间二硫键的三体。
根据电喷射质谱，TNF和RGD-TNF单体的分子量分别是17386.1±2.0Da和18392.8Da。这些值与Met-TNF1-156(17386.7Da)和ACDCRGDCFCG-TNF1-156(18392.9Da)的质量有良好对应。
实施例II
TNF和RGD-TNF的体外细胞毒性活性
如前人所述(67)，通过基于L-M小鼠成纤维细胞(ATCC CCL1.2)的标准细胞裂解测定估计TNF和RGD-TNF的生物活性。在30ng/ml放线菌素D存在下测定TNF和NGR-TNF对于RMA-T细胞的细胞裂解活性(68)。每种样品在三个不同稀释度下双份分析。结果表示为二至三次独立测定的平均值±SD。
根据使用L-M细胞的标准细胞裂解测定，TNF和RGD-TNF的体外细胞毒性活性分别是(1.2±0.14) x 108单位/mg和(1.7±1) x 108单位/mg。这些结果指出：RGD-TNF分子中的ACDCRGDCFCG部分并不防止折叠、寡聚化和结合TNF受体。
在以前的研究中，我们证实：在30ng/ml放线菌素D存在下TNF能够杀死RMA-T细胞；而在没有转录抑制剂下，这些细胞抵抗TNF，甚至温育几天后也是如此(68)。在放线菌素D存在下，使用TNF((1.2±0.14) x 108单位/mg，作为标准，测得RGD-TNF对于RMA-T细胞的体外细胞毒性活性是(1.6+1.3) x 108单位/mg。
实施例III
表征TNF和RGD-TNF的治疗活性和毒性活性
在RPMI 1640，5％胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.25μg/ml两性霉素B，2mM谷氨酰胺和50μM 2-巯基乙醇中体外维持来自C57BL/6的Rauscher病毒诱导的RMA淋巴瘤(69)。从用编码Thy 1.1等位基因的构建物转染的RMA细胞系获得RMA-T，如Moro，1997#28]所述培养。如前人所述()培养T/SA小鼠乳腺癌细胞。
在动物模型上的体内研究得到San Raffaele H Scientific Institute伦理委员会的批准，按照预定方针执行。分别用5 x 104RMA-T或TSA活细胞在左肋胁皮下攻击16-18g的C57BL/6小鼠(Charles RiverLaboratories，Calco，Italy)。植入肿瘤十到十二天后，用无内毒素0.9％氯化钠溶液稀释的250μl TNF或RGD-TNF溶液腹膜内处理小鼠。初步实验显示：在TNF和RGD-TNF溶液中加入作为载体的人血清白蛋白并不改变抗肿瘤活性。每组5只小鼠，进行每个实验。每日用游标卡尺测量肿瘤大小，以监测肿瘤生长。计算r1 x r2 π，估计肿瘤面积；计算r1 x r2 x r3 x 4/3 π，估计肿瘤体积；其中r1和r2是纵向和横向半径，r3是从正常皮肤表面突出的肿瘤厚度。在肿瘤达到1.0-1.3cm直径之前处死动物。肿瘤大小表示为平均值±SE(每组5-10只动物)，用t检验进行比较。
在C57BL6小鼠中使用RMA-T淋巴瘤和T/SA模型，比较RGD-TNF以及TNF的抗肿瘤活性和毒性。
将鼠TNF给予携带已经建立的皮下RMA-T肿瘤的动物，导致24小时后肿瘤减小和肿瘤中心部分出血性坏死，然后生长明显延迟几天(71)。一次用TNF处理并不诱导该肿瘤的完全退化，甚至在剂量接近LD50时也是如此，因为在坏死区域周围仍然存在活细胞，所以处理后几天肿瘤重新开始生长。在第一组实验中，我们研究TNF或RGD-TNF各种剂量(腹膜内)对于动物存活率的效应。为避免动物过多受苦，当肿瘤直径大于1-1.3cm时处死动物。TNF和RGD-TNF的致死率在处理后3天是不同的(LD50，分别是6μg和12μg)，而它们的抗肿瘤活性明显不同(表1)。例如，1μg RGD-TNF比2μg TNF更有效地延迟肿瘤生长。有趣的是，用16μg RGD-TNF治愈一些动物，而用TNF没有治愈一只动物。已经治愈的动物排斥致肿瘤性剂量RMA-T或野生型RMA细胞的进一步攻击，提示用RGD-TNF的一次处理能够诱导保护性免疫。
因此，在这些条件下，计算得到的RGD-TNF有效性/毒性比例是TNF的4倍。考虑到RGD-TNF制备物中带有正确二硫键的形式占约10-20％，技术人员可以计算得到：RGD-TNF的治疗指数比TNF的治疗指数高约20-40％。
此外，RGD-TNF可以比TNF更有效地诱导保护性免疫反应。
由于RMA-T细胞并不表达αv整联蛋白(通过用抗αv抗体的FACS)，而内皮细胞可以表达该整联蛋白，因此提示其作用机制基于靶向细胞而不是肿瘤细胞如内皮细胞。
表1.植入肿瘤后用TNF或RGD-TNF(静脉内)治疗12天，携带RMA-Thy1.1淋巴瘤的小鼠的存活率(％)
Figure A200810186837D00901
a)两次独立实验(每个处理组5只动物)的累计结果。在研究中不包括腹水瘤动物。
b)存活动物在第90天用50,000个RMA-T细胞再次攻击，然后在第115天用50,000个RMA细胞再次攻击。同时，用同样细胞处理五只正常动物，检查注射剂量的致瘤力。所有对照动物在10天内都出现肿瘤。
上面说明书中提到的所有公开物特此通过引用结合到本文中。本发明所述方法和系统的不偏离本发明范围和精神的各种改变和变化对于本领域内技术人员是显而易见的。虽然已经联系具体优选实施例描述本发明，但应当理解：要求保护的本发明不应当不适当地限制于所述具体实施方案。对于分子生物学或相关领域内技术人员显而易见的、对执行本发明所述方式的各种改变将包括在下面权利要求的范围内。
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Claims (36)

1.一种细胞因子和肿瘤靶向部分(TTM)的缀合物，其前提条件是：当所述细胞因子是TNF-α、TNF-β或IFN-γ时，所述TTM不是CD13配体；当所述细胞因子是IL-2或IL-12时，所述TTM不是抗纤连蛋白抗体；当所述细胞因子是TNF时，所述TTM不是抗转铁蛋白受体抗体；当所述细胞因子是TNF、IFN-γ或IL-2时，所述TTM不是抗TAG72抗原抗体；当所述细胞因子是IFN时，所述TTM不是αvβ3整联蛋白配体；当所述细胞因子是TNF时，所述TTM不是纤连蛋白。
2.依照权利要求1的缀合物，其进一步的前提条件是：当所述细胞因子是TNF-α或TNF-β时，所述TTM不是肿瘤特异性抗体。
3.依照权利要求1或权利要求2的缀合物，其进一步的前提条件是所述缀合物不是生物素化TNF。
4.依照任一项前述权利要求的缀合物，其中所述细胞因子是炎性细胞因子。
5.依照任一项前述权利要求的缀合物，其中所述细胞因子是化疗细胞因子。
6.依照任一项前述权利要求的缀合物，其中所述细胞因子是TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、2、4、6、12、15、EMAP II、血管内皮生长因子(VEGF)、PDGF、PD-ECGF或趋化因子。
7.依照权利要求8的缀合物，其中所述细胞因子是TNFα、TNFβ或IFNγ。
8.依照任一项前述权利要求的缀合物，其中所述TTM是肿瘤血管靶向部分(TVTM)。
9.依照权利要求10的缀合物，其中所述TVTM是肿瘤血管受体、标记或其它细胞外组分的结合配偶体，例如针对肿瘤血管的肽。
10.依照权利要求1到9任一项的缀合物，其中所述TTM是肿瘤受体、标记或其它细胞外组分的结合配偶体。
11.依照任一项前述权利要求的缀合物，其中所述TTM是抗体或配体、或它们的片段。
12.依照任一项前述权利要求的缀合物，其中所述TTM包含NGR或RGD基序；或者所述TTM是HIV-tat、膜联蛋白V、骨桥蛋白、纤连蛋白、I型或IV型胶原蛋白、透明质酸、肝配蛋白；或者所述TTM是癌胚纤连蛋白的结合配偶体；或者所述TTM是上述物质的片段。
13.依照权利要求12的缀合物，其中所述TTM包含NGR基序。
14.依照权利要求13的缀合物，其中所述TTM是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环状CVLNGRMEC、线性或环状CNGRC。
15.依照权利要求12的缀合物，其中所述TTM包含RGD基序。
16.依照权利要求1到11任一项的缀合物，其中所述TTM靶向VEGFR、ICAM 1、2或3、PECAM-1、CD31、CD13、VCAM-1、选择蛋白、Act RII、ActRIIB、ActRI、ActRIB、CD44、氨肽酶A、氨肽酶N(CD13)、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、FGF-1、2、3或4、IL-1R、EPHR、MMP、NG2、腱生蛋白、癌胚纤连蛋白、PD-ECGFR、TNFR、PDGFR或PSMA。
17.依照任一项前述权利要求的缀合物，其为表A中的缀合物。
18.依照任一项前述权利要求的缀合物，其中所述缀合物为融合蛋白形式。
19.依照权利要求1到18任一项的缀合物，其中所述缀合物为核酸形式。
20.一种表达载体，其包含权利要求19的核酸。
21.一种宿主细胞，其为用权利要求20的表达载体转化的宿主细胞。
22.一种制备缀合物的方法，该方法包括在使得表达所述缀合物的条件下培养权利要求21的宿主细胞。
23.一种药用组合物，所述组合物包含任一项前述权利要求的缀合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
24.依照权利要求23的药用组合物，其中所述组合物还包含其它抗肿瘤药物或诊断性肿瘤成像化合物。
25.依照权利要求24的药用组合物，其中所述其它抗肿瘤药物是多柔比星或美法仑。
26.权利要求1到19任一项定义的缀合物或依照权利要求23到25任一项的药用组合物在制备用于治疗或诊断癌症的药物中的应用。
27.一种治疗或诊断癌症的方法，所述方法包括给予需要患者有效量的权利要求1到19任一项定义的缀合物或依照权利要求23到25任一项的药用组合物。
28.一种药用组合物，所述药用组合物包含有效量的TNF与第一种TTM的缀合产物或者编码所述缀合产物的多核苷酸，并且包含有效量的IFN-γ与第二种TTM的缀合产物或者编码所述缀合产物的多核苷酸，其中所述第一种TTM和所述第二种TTM竞争不同受体。
29.依照权利要求28的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
30.依照权利要求28的组合物，其中所述第一种TTM或所述第二种TTM是CD13受体的配体。
31.依照权利要求30的组合物，其中所述第一种TTM或所述第二种TTM包含NGR基序。
32.依照权利要求30的组合物，其中所述第一种TTM或所述第二种TTM是CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环状CVLNGRMEC、线性或环状CNGRC。
33.依照权利要求28的组合物，其中所述第一种TTM或所述第二种TTM是αvβ3受体的配体。
34.依照权利要求33的组合物，其中所述第一种TTM或所述第二种TTM包含RGD基序。
35.依照权利要求28的组合物，其中所述第一种TTM是CD13受体的配体，所述第二种TTM是αvβ3受体的配体。
36.依照权利要求28的组合物，其中所述第一种TTM是αvβ3受体的配体，所述第二种TTM是CD13受体的配体。
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