CN112574316A - 用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肿瘤靶向融合蛋白至少包括（i）IL‑15多肽、IL‑15多肽变体、或其功能性片段，（ii）IL‑15Ra多肽、IL‑15Rα多肽变体、或其功能性片段，（iii）Fc结构域、Fc变体、或其功能性片段，和（iv）RGD多肽或其变体。所述融合蛋白的各组分的排列顺序优选为RGD多肽‑Fc结构域‑IL‑15Rα多肽‑IL‑15多肽。该肿瘤靶向融合蛋白，一方面能够提高IL‑15的抗肿瘤功效，另一方面克服了IL‑15的短半衰期问题，同时能够靶向肿瘤部位，针对性地作用于肿瘤细胞。此外，这种肿瘤靶向蛋白可以被高效的表达并纯化，同时具有高效的抗肿瘤活性，具有成为免疫抗肿瘤疗法药物的潜力。

Description

用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白
本申请为申请号为201510378781.2、申请日为2015年07月02日、发明名称为“用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及细胞因子白介素-15在肿瘤靶向治疗中的应用，具体涉及白介素-15融合蛋白的抗肿瘤作用。
背景技术
细胞因子在调节人体免疫系统，包括抗肿瘤免疫反应中起重要作用。一些细胞因子已被证明具有抗肿瘤潜力。白细胞介素-15（IL-15）作为一个有前途的抗肿瘤候选药物已经被广泛研究。IL-15和IL-2共用受体（IL-2 /15βγ）的β和γ链，但结合到不同的α受体链（IL-2Rα/ IL-15Rα）。IL-15的作用主要是通过反式递呈模式，其中IL-15与表达于抗原呈递细胞表面的IL-15Rα结合，然后结合于临近效应细胞表面的IL-15βγ复合物，最终激活效应细胞。类似于IL-2，IL-15能够促进T细胞和自然杀伤（NK）细胞的增殖、促进细胞毒性T细胞扩增和NK细胞的激活。同时，与IL-2不同的是，IL-15不会导致激活诱导的细胞死亡，也不参与调节性T细胞的功能维持。因此，IL-15被美国国家癌症研究所列在最有潜力的癌症免疫治疗药物名单的第一位。
但是，IL-15仍然有一定的不足。首先，研究表明，只有给予高剂量IL-15才能在体内条件下达到抗肿瘤效果。其次，IL-15的另一个不足是较短的半衰期。最后，IL-15的作用是全身性，而不是肿瘤特异性的。细胞毒性T细胞或NK细胞在IL-15刺激下将被扩增，但这一效果并不会仅局限于肿瘤部位，而是全身性的分布。由于免疫系统广泛性激活常常是致命性的，所以一种更理想的治疗药物应当靶向性作用于肿瘤部位同时不影响正常组织。
发明内容
本发明提供一种肿瘤靶向融合蛋白，其一方面能够提高IL-15的抗肿瘤功效，另一方面克服了IL-15的短半衰期问题，同时能够靶向肿瘤部位，针对性地作用于肿瘤细胞。
本发明提供的肿瘤靶向融合蛋白至少包括（i）IL-15多肽、IL-15多肽变体、或其功能性片段，（ii）IL-15Ra多肽、IL-15Ra多肽变体、或其功能性片段，（iii）Fc结构域、Fc变体、或其功能性片段，和（iv）RGD多肽或其变体。
在一个实施方式中，所述融合蛋白的各组分的排列顺序为RGD-Fc-IL-15-IL-15Ra。
在本发明的一个实施方式中，Fc结构域由人IgG1的CH2和CH3构成，其具有SEQ IDNO. 1所示的序列，或在SEQ ID NO.1所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有所述Fc结构域相同功能的衍生序列。
在一个实施方式中，IL-15Ra由 IL-15Rα sushi结构域及外显子3的随后12个氨基酸构成，其具有SEQ ID NO. 2所示的序列，或在SEQ ID NO.2所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有IL-15RA结构域相同功能的衍生序列。
在一个实施方式中，IL-15具有SEQ ID NO. 3所示的序列，或在SEQ ID NO.3所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有IL-15结构域相同功能的衍生序列。
在一个实施方式中，RGD多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列，或在SEQ ID NO.4所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有RGD多肽相同功能的衍生序列。
在优选的实施方式中，所述肿瘤靶向融合蛋白的氨基酸序列选自：（a）如SEQ IDNO. 5所示的序列；（b）由SEQ ID NO. 6所示的核酸序列编码的氨基酸序列；（c）由SEQ IDNO. 6所示的序列的简并序列编码的氨基酸序列；和（d）在SEQ ID NO. 5所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有所述融合蛋白相同功能的衍生序列。
本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明所述的肿瘤靶向融合蛋白以及药学上可接受的附加剂，所述附加剂包括载体、稳定剂和/或赋形剂。
本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含本发明所述的肿瘤靶向融合蛋白以及另一种抗癌剂。
在本发明的一个实施方式中，所述肿瘤为整合素阳性肿瘤，特别是αVβ3整合素阳性肿瘤，例如黑色素瘤、卵巢癌等。在一个实施方式中，所述肿瘤为进行性肿瘤、晚期肿瘤、具有高肿瘤负荷/负担的肿瘤、或转移性肿瘤。
本发明另一方面提供一种编码本发明所述肿瘤靶向融合蛋白的核酸序列、包含所述核酸序列的表达载体、或用所述表达载体转化或转染的宿主。
本发明另一方面还提供一种试剂盒，其包含本发明所述肿瘤靶向融合蛋白、编码本发明所述肿瘤靶向融合蛋白的核酸序列、包含所述核酸序列的表达载体、或用所述表达载体转化或转染的宿主。
本发明提供一种肿瘤靶向融合蛋白，其一方面能够提高IL-15的抗肿瘤功效，另一方面克服了IL-15的短半衰期问题，同时能够靶向肿瘤部位，针对性地作用于肿瘤细胞。此外，这种肿瘤靶向蛋白可以被高效的表达并纯化，同时具有高效的抗肿瘤活性，具有成为免疫抗肿瘤疗法药物的潜力。
附图说明
图1为本发明的肿瘤靶向融合蛋白的一个实施方式（PFC-1）的蛋白结构示意图。SP，信号肽；RGD，精氨酸，甘氨酸-天冬氨酸肽基序； Fc，人IgG1的CH 2和CH3；IL-15Ra，IL-15Rα sushi结构域+外显子3的随后12个氨基酸；L1：SS；L2：G4S；L4：SG2SG4SG3SG4SLQ。
图2为融合蛋白PFC-1的在非还原（NR）或还原（R）的条件下用10％的SDS-PAGE电泳展开并用考马斯蓝染色图。
图3 显示PFC-1和rhIL-15对mo7e细胞的增值刺激实验。PFC-1摩尔浓度按照单体分子量计算。实验结果为平均值加减标准差显示，实验结果代表至少三次独立实验。
图4 显示PFC-1和rhIL-15对CTLL-2细胞的增值刺激实验。PFC-1摩尔浓度按照单体分子量计算。实验结果为平均值加减标准差显示，实验结果代表至少三次独立实验。
图5显示融合蛋白PFC-1对PBMC的体外增殖刺激。 PBMC细胞用CFSE标记后与各种浓度的rhIL-15或PFC-1共同培养6天，随后通过流式细胞术评估细胞增殖程度。 A. 代表性流式细胞术实验结果图。B. PBMC细胞增殖率，实验结果为平均值加减标准差显示，实验结果代表至少三次独立实验。
图6显示流式细胞术分析融合蛋白PFC-1对HUVEC细胞系的结合作用。实验结果代表至少3次独立实验。
图7显示流式细胞术分析融合蛋白PFC-1对SKOV-3肿瘤细胞系的结合作用。实验结果代表至少3次独立实验。
图8显示流式细胞术分析融合蛋白PFC-1对LS74T肿瘤细胞系的结合作用。实验结果代表至少3次独立实验。
图9显示激光共聚焦显微技术分析融合蛋白PFC-1在HUVEC细胞和SKOV3肿瘤细胞模型上与抗人CD51/61（αVβ3整合素）抗体的共定位结果。
图10显示融合蛋白PFC-1的小鼠体内抗肿瘤作用。背部皮下接种有B16F10小鼠黑色素瘤肿瘤的小鼠，在肿瘤长到100mm3体积后，每3天腹腔注射接受5或20 μg的PFC-1治疗，或者200ul的PBS。总共接受2次药物注射并相应测量肿瘤体积。实验结果为平均值加减标准差，每组有5~8只小鼠。通过T检验分析实验数据统计学显著性，**代表p<0.01。
图11显示融合蛋白PFC-1的小鼠体内抗肿瘤作用。背部皮下接种有B16F10小鼠黑色素瘤肿瘤的小鼠，在肿瘤长到1000mm3体积后，在制定日期接受10 μg PFC-1的尾静脉注射治疗，或者200ul的PBS。总共接受3次药物注射并每天测量肿瘤体积。实验结果为平均值加减标准差，每组有5~8只小鼠。通过T检验分析实验数据统计学显著性，**代表p<0.01。
图12显示流式细胞术分析图10中实验小鼠接受PFC-1治疗后体内CD8+ T细胞表型变化。实验结果为平均值加减标准差，每组有5~8只小鼠。通过T检验分析实验数据统计学显著性，**代表p<0.01，***代表p<0.005。
图13显示流式细胞术分析图10中实验小鼠接受PFC-1治疗后体内NK细胞表型变化。实验结果为平均值加减标准差，每组有5~8只小鼠。通过T检验分析实验数据统计学显著性，**代表p<0.01，***代表p<0.005。
图14显示流式细胞术分析图10中实验小鼠接受PFC-1治疗后体内CD8+ T细胞和NK细胞表面CD44抗原表型变化，以分析细胞激活比例。实验结果为平均值加减标准差，每组有5~8只小鼠。通过T检验分析实验数据统计学显著性，**代表p<0.01，***代表p<0.005。
图15显示融合蛋白PFC-1在C57BL/6小鼠体内抗肿瘤恶心迁移实验结果。C57BL/6小鼠在day0通过尾静脉注射5*105 B16F10黑色素瘤肿瘤细胞，并于同一天通过尾静脉注射接受10 μg PFC-1或者200ul等体积PBS。第21天，小鼠被安乐死并取出肺部在双目显微镜下检查肺部肿瘤窦的情况和数目。上图为代表性小鼠肺部照片。Mock，未接受肿瘤细胞注射小鼠肺部；vehicle，接受肿瘤细胞注射的对照组；PFC-1，接受PFC-1注射治疗组。实验结果为平均值加减标准差，每组有5只小鼠。通过T检验分析实验数据统计学显著性。
具体实施方式
融合蛋白
在本发明中，“融合蛋白”、“PFC-1”、“PFC-1重组融合蛋白”或“融合分子”可互换使用，它们是指生物活性多肽，通常为通过重组、化学或其他合适方法共价性连接（即融合）在一起的蛋白质或肽序列。融合蛋白可通过接头序列在一个或多个位点与其他肽或蛋白质序列融合。或者，接头序列可被用来协助构建融合分子。融合蛋白可以单体或多聚体（例如二聚体）的形式存在。
在本发明中，“融合蛋白”至少包括（i）IL-15多肽、IL-15多肽变体、或其功能性片段，（ii）IL-15Ra多肽、IL-15Ra多肽变体、或其功能性片段，（iii）Fc结构域、Fc变体、或其功能性片段，和（iv）RGD多肽或其变体。在该融合蛋白中，组分（i）（ii）共同构成了效应模块或效应分子，其能够引起效应细胞（细胞毒性T细胞、NK细胞）的激活。组分（iii）用于延长IL-15的循环半衰期。组分（iv）为靶向分子，其以高亲和性和特异性作用于肿瘤细胞表面表达的受体分子，从而将融合蛋白的其他部分富集于肿瘤灶，进而杀死肿瘤细胞。
在本发明中，融合蛋白中的各个组分以合理的顺序排列以使得融合蛋白整体上实现本发明的预期目的。在一个实施方式中，所述融合蛋白中各组分的排列顺序为RGD多肽-Fc结构域-IL-15多肽-IL-15Ra多肽。在另一个实施方式中，所述融合蛋白中各组分的排列顺序为RGD多肽-Fc结构域- IL-15Ra多肽-IL-15多肽。在另一个实施方式中，所述融合蛋白中各组分的排列顺序为RGD多肽-IL-15Ra多肽-IL-15多肽-Fc结构域。在另一个实施方式中，所述融合蛋白中各组分的排列顺序为RGD多肽- IL-15多肽-IL-15Ra多肽-Fc结构域。本领域技术人员可通过基因工程技术和相关的技术得到不同顺序组成的所述融合蛋白并验证其生物学功能，而不需要付出创造性的劳动。
Fc结构域
“Fc结构域”或“Fc片段”是指免疫球蛋白重链的“可结晶片段”区。一般而言，Fc结构域能与另一Fc结构域相互作用而形成二聚体复合物。Fc结构域可结合细胞表面受体（Fc受体）和/或补体系统的蛋白质，或者可被修饰而削弱或增强这种结合活性。Fc结构域可来源于IgG、IgA、IgD、IgM或IgE抗体并产生免疫功能，例如调理作用、细胞裂解、肥大细胞脱颗粒等其他Fc受体依赖性进程。
IgG类型的免疫球蛋白是人类血液中含量最丰富的蛋白质之一，其循环半衰期可长达21天。已有报道过IgG的Fc区与另一蛋白质的结构域结合。原型融合蛋白为经由IgG的Fc铰链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚蛋白质，形成的分子类似于没有重链可变区、CH1结构域和轻链的IgG分子。包含Fc结构域的融合蛋白的二聚体性质可能有利于结合至其他分子（例如二价或双特异性结合）。由于结构上的同源性，Fc融合蛋白质显示与具有相似同种型的人类IgG相当的体内药代动力学曲线。为了延长IL-15或IL-15融合蛋白质的循环半衰期，本发明将IL-15/ IL-15Rα复合物连接至人IgG蛋白重链的Fc部分。
天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选为人源性的免疫球蛋白，优选为IgG1和IgG2。在本发明中，Fc结构域优选由人IgG1的CH2和CH3构成。
在某些实施方式中，“Fc变体”是指由天然Fc修饰而仍可结合Fc受体的分子或序列。“Fc变体”包括由非人类天然Fc经人源化的分子或序列。此外，由于某些结构特征或生物活性非本发明融合分子所需要的，所以天然Fc的某些位点可被移除。因此，在某些实施方式中，“Fc变体”包括缺乏一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列。“Fc结构域”包括如上所述的天然Fc及Fc变体的分子或序列，其包含单体形式或多聚体形式的分子，可由完整抗体分解得到，或通过基因重组表达得到或通过其他手段得到。
RGD多肽
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）多肽作为细胞粘附序列是Pierschbacher和Rouslahti于1984年在FN中发现的，他们发现RGD多肽能使整合素（intergrin）α5β1从亲和柱洗脱，固定在基质材料后能粘附细胞。其后，人们相继发现细胞外基质中很多糖蛋白（如LM）、胶原蛋白、纤维蛋白原（Fb）等均含有高度保守的RGD多肽，并证实RGD多肽在介导细胞与细胞、细胞与胞外基质蛋白的相互作用中发挥重要作用。
RGD多肽与细胞的结合也是与细胞表面整合素的结合。整合素于20世纪90年代中期被发现，是一个依赖Ca2+的细胞表面受体家族，每一种整合素包括2个亚基：α亚基和β亚基，迄今发现18种α亚基和8种β亚基，构成24种整合素。能识别RGD多肽并与之结合的整合素受体有：α3β1、α5β1、αIIbβ3、α5β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8等，尤其是对αvβ3整合素具有极强的选择性和亲和性。αvβ3整合素在多种肿瘤细胞和肿瘤相关的血管生成的内皮细胞中出现高度过表达。
本发明通过将药物与RGD多肽偶联或融合，利用RGD多肽引导融合的蛋白大分子药物在肿瘤组织部位选择性富集，增加局部浓度来增强肿瘤杀伤作用并限制全身性毒性。
单纯的RGD三肽生物活性很低，与RGD三肽相连的第4位氨基酸对其活性影响很大，与RGD三肽相连的第5位氨基酸对肽的结合专一性也起到重要的作用。已有研究证明，在RGD三肽的前端加残基不影响细胞的粘附，如RGD三肽与GRGD四肽对细胞粘附力无显著响应，但在其C末端增加氨基酸参加将影响它与细胞的粘附，如在RGD的天冬氨酸后有丝氨酸残基将增强其细胞粘附作用，若用右旋残基取代左旋残基将使得细胞粘附下降。
在本发明的一个实施方式中，RGD多肽序列为ACDCRGDCFCG，即Ala Cys Asp CysArg Gly Asp Cys Phe Cys Gly，其在第5至第7个氨基酸位置包含RGD基序。
在本发明中，RGD变体是指与本发明的RGD多肽序列具有至少一个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列，但仍能够维持RGD的整合素受体结合功能。本领域技术人员能够根据本发明给出的教导以及现有技术设计出其他满足本发明目的的一个或多个RGD多肽变体。示例性的RGD变体包括GRGD，GRGDSPC，GRGDDSY，EPRGDNYR等。
接头序列
本发明的融合蛋白还包括位于各组分之间的接头序列，通常为4-20个氨基酸构成的短肽。这些接头序列使得各组分之间被合理地定位而实现各组分的功能活性。
在一些实施方式中，在本发明的融合蛋白中，IL-15多肽通过接头序列共价连接至IL-15Ra多肽，从而使得IL-15和IL-15a结构域能够相互作用而形成复合物。在某些实施方式中，IL-15和IL-15Ra结构域的定位使得它们与免疫细胞之间相互作用，以启动或抑制免疫反应，或者抑制或刺激细胞发育。
在一些实施方式中，在本发明的融合蛋白中，IL-15或IL-15Ra结构域通过接头序列共价连接至免疫球蛋白Fc结构域。该接头序列应当使得Fc结构域、IL-15或IL-15Ra结构域能够合理地定位从而发挥每个结构域的功能活性。在某些实施方式中，Fc结构域被有效地定位从而能够形成适当的融合蛋白复合物以及使该融合蛋白复合物在体内有延长的半衰期。
在一些实施方式中，在本发明的融合蛋白中，RGD多肽通过接头序列共价地结合至Fc结构域。该接头序列应当使得RGD多肽和Fc结构域被合理地定位从而发挥各个结构域的功能活性。在某些实施方式中，RGD多肽被有效地定位从而能够以高亲和性和特异性结合肿瘤细胞表面的整合素分子。
优选地，接头序列包括2至20个氨基酸序列，更优选为5至20个氨基酸。接头序列优选为柔性接头序列，因而其不会限制效应分子或多肽在单个不期望的构象中。接头序列可被用来例如将识别位点与融合蛋白隔开。接头序列优选主要由具有小侧链的氨基酸构成，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，从而提供所述柔性。优选地，接头序列的约80以上或更多比例的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。合适的接头序列的例子有GGGGS（G4S），即Gly Gly Gly Gly Ser，例如用于连接本发明中的RGD多肽与Fc结构域，以及Fc结构域与IL-15Ra多肽；或SG2SG4SG3SG4SLQ，即Ser Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln，例如用于连接本发明中的IL-15和IL-15Ra结构域。也可以使用其他不同的接头序列，包括已被成功地用于连接不同抗体可变区的多种柔性接头设计。接头序列的大小和序列组成可通过常规的电脑建模及技术来确定。
在本发明中，“多肽”是指基本上由20种天然氨基酸中的任何几个所组成的任何长度的聚合物。虽然“蛋白质”或“蛋白”通常是指氨基酸长度较大的聚合物，而“肽”通常是指氨基酸长度较小的聚合物，但是这两个术语之间通常没有明显的界限，而且经常范围上有重叠。“多肽变体”通常是指与对照多肽相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，但仍能够维持多肽的生物学功能的氨基酸序列。
在本发明中，“载体”为能够在宿主细胞中自主复制且可接受外源DNA的核酸分子。载体带有其自身的复制起始位点，可用于插入外源DNA的限制性内切酶识别位点，以及通常的选择性标记（如编码抗生素抗性的基因），常常还包括用于表达插入的DNA的识别序列（如启动子和增强子）。常见的载体包括质粒载体和噬菌体载体。
试剂与材料
抗体：重组人IL-2（AF-200-02）和粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（300-03）购买Peprotech公司。 重组人IL-15（247-IL-105）得自R＆D Systems公司购得。
抗MsCD3e（145-2C11）-PerCP，抗MsCD8a （53- 6.7）-FITC，抗MsNK1.1（PK136）-FITC，抗MsCD44（IM7）-PE和抗MsCD122（TM-Bta1）-PE分别购自BD Pharmingen。 抗人CD51 /61（αVβ3整合素）纯化单克隆抗体购自eBioscience。 山羊抗-人IgG（H + L）-AlexaFluor488和山羊抗小鼠IgG（H + L）-AlexaFluor 488，647购自Invitrogen。
细胞系和实验动物：SKOV-3，CTLL-2和Mo7e细胞来自上海细胞库。HUVEC细胞由四川大学高会乐博士慷慨赠送。
CTLL-2细胞培养在20％胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，同时添加30ng/ml的IL-2和1％ 非必需氨基酸 。 Mo7e细胞培养在10％胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，同时添加10ng/ml GM-CSF，和1％ 非必需氨基酸 。 SKOV-3和HUVEC细胞均培养在10％FBS的DMEM培养基中。
PBMC从健康志愿者血液中利用Ficoll离心法提取，细胞培养在10%FBS的RPMI-1640培养基中。 C57BL / 6小鼠从中山大学动物实验中心购买。人体血液采集和动物实验，均经过学校主管部门的伦理审查和同意。
融合蛋白的表达与纯化
一般而言，本发明的融合蛋白的制备可通过本发明公开的程序和重组DNA技术来制备，例如PCR、质粒DNA提取、DNA的限制性内切酶消化、DNA连接、mRNA分离、将DNA导入合适的细胞、宿主细胞的转化或转染、宿主细胞的培养等。此外，融合蛋白可利用适当试剂和熟知的方法被分离和纯化，例如电泳、离心、色谱方法等。
PFC-1重组融合蛋白的基因序列被克隆到含有小鼠κ链的信号肽的pcDNA3.1载体中。利用瞬时转染技术将表达载体转染到293细胞中进行表达。瞬时转染后的细胞在100ml细胞培养基中培养3天后，收集细胞并利用Protein-A琼脂糖亲和纯化法纯化得到重组融合蛋白。
融合蛋白PFC-1的结构如图1所示，主要由IL15/IL15Ra复合物，Fc结构域，和RGD多肽三个模块构成。模块之间由GGGGS短肽连接，同时在蛋白C末端加入His-tag标签（图1）。DNA序列被亚克隆到pcDNA3.1（+）载体中，通过瞬时转染使载体进入HEK293细胞并被表达。
在还原性SDS-PAGE电泳图（图2）中的60kDa处可观察到单一条带；在非还原性SDS-PAGE电泳图中，约120kDa处可观察到一条主要条带，同时在约60kDa处有一个次要条带。实验结果表明，通过哺乳动物细胞表达和亲和纯化，我们得到了单一均质的PFC-1融合蛋白，并且绝大多数PFC-1蛋白以二聚体形式存在。
细胞因子依赖性细胞增殖实验
在细胞因子依赖性细胞增殖实验中，收获处于对数生长期的CTLL-2和Mo7e细胞，PBS洗涤两次，在检测培养基中培养4小时（补充有10％FBS，1％NEAA的RPMI 1640培养基），使实验细胞达到细胞因子饥饿状态。在测定培养基中将IL-15和PFC-1稀释到终浓度为10nM并进行梯度稀释。将添加有IL-15或PFC-1的CTLL-2或Mo7e 细胞继续培养48或72小时。最后使用CCK-8试剂测定活细胞的数量并计算细胞增殖比例。
CTLL-2是小鼠细胞毒性T淋巴细胞系，为IL-15Rα链和IL-15βγ复合物阳性表达；而Mo7e是人巨核细胞白血病细胞系，为IL-15βγ复合物单一阳性表达。这两种细胞都依赖细胞因子刺激细胞增殖，因此可用于分析融合蛋白PFC-1的IL-15复合物的细胞因子功能。与IL-15的效果类似，PFC-1在体外实验中能明显刺激Mo7e和CTLL-2细胞系的增殖（图3和4），表明纯化得到的PFC-1融合蛋白具有细胞因子活性。
对于Mo7e细胞，rhIL-15表现出比PFC-1略高的细胞因子活性，但随着细胞因子浓度的增加，两种蛋白之间的细胞因子活性差异开始缩小，在10nM浓度下两种蛋白之间几乎没有差别（图3）。对于CTLL-2细胞，PFC-1的细胞因子活性大约是rhIL-15的2至4倍（图4）。
PBMC增殖实验
PBMC调整为2×106细胞/ml的单细胞悬浮液，用5μM的CFSE（eBioscience公司）进行染色。CFSE染色后的PBMC调整到5×105细胞/ml，并在1nM或10nM终浓度的重组人IL-15或PFC-1刺激下分别培养6天。用Cytomic FC500（Beckman Coulter公司）流式细胞仪进行数据收集，用Kaluza软件（Beckman Coulter公司）进行数据分析分析。
为了检测PFC-1对人源免疫细胞的细胞因子活性，PBMC用CFSE染色后与rhIL-15或PFC-1在体外共同培养6天。在1nm或10nM浓度下，rhIL-15和PFC-1均能显著刺激的PBMC的增殖（图5）。然而，与Mo7e和CTLL-2细胞因子依赖性增殖实验结果不同的是，PFC-1在PBMC增殖实验中表现出比rhIL-15高10倍的细胞因子活性。10nM的rhIL-15平均增殖率为20.71％的，1nm的PFC-1为22.05％（图5）。这可能是由于在PFC-1中IL-15/IL-15Rα复合物比rhIL-15有更高的生物活性。
PFC-1与整合素的共定位
根据文献可发现，HUVEC或卵巢癌细胞系SKOV3是αVβ3整合素高表达细胞系。同时，流式细胞分析术显示，无论HUVEC（图6）还是卵巢癌细胞SKOV3（图7）都是αVβ3整合素表达阳性。同时，直肠癌细胞系LS174T为Vβ3整合素表达阴性（图8）。因此，以上三种细胞系被用于验证PFC-1与整合素的共定位。
将对数生长期的HUVEC和SKOV3细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整为4×105细胞/ml密度，并37℃下培养2小时使细胞表面标志物蛋白表达得到恢复。随后用PBS洗涤充分洗涤细胞，以2×105细胞每管进行流式抗体或PFC-1标记，并用相应荧光二抗染色，随后立即上机检测。
PFC-1与HUVEC或SKOV3共孵育后，在流式细胞分析术中显示有明显阳性信号，提示PFC-1可以结合到HUVEC（图6）和SKOV3细胞（图7）上。PFC-1的阳性信号强度比抗αVβ3整合素单克隆抗体的信号弱。但是，无论是PFC-1还是抗αVβ3整合素单克隆抗体与LS174T细胞共孵育后均无阳性信号（图8）。流式细胞术分析结果可初步说明PFC-1可特异性结合于HUVEC或SKOV3细胞表面。
激光共聚焦显微实验
将对数生长期的HUVEC和SKOV3细胞提前一天接种至激光共聚焦显微镜专用培养皿中，使细胞在上机检测时约为70%细胞融合度。第二天，用冷PBS彻底洗涤细胞，随后用4％多聚甲醛室温固定15min，固定的细胞用为2μg抗人CD51 /61（αVβ3整合素）抗体或 PFC-1在室温下孵育1小时，随后用相应的荧光二抗分别在室温下染色1小时，用DAPI对细胞核进行染色后立即上机检测检测PFC-1和抗人CD51 /61的共定位效应。本实验使用蔡司LSM710共聚焦显微镜。
在激光共聚焦显微实验中，以HUVEC和SKOV3细胞为模型，用PFC-1和抗αVβ3整合素单克隆抗体共同孵育细胞，可明显发现PFC-1和抗αVβ3整合素单克隆抗体在两种细胞表面均有明显的共定位现象（图9），说明PFC-1与抗αVβ3整合素单克隆抗体结合同一种细胞表面蛋白，但是作用于不同的蛋白表位而结合。在本实验的情景下，为αVβ3整合素。
流式细胞术和激光共聚焦显微实验的结果共同表明，PFC-1可通过RGD模块特异性结合于αVβ3整合素，从而在体外实验条件下实现针对αVβ3整合素高表达的肿瘤细胞特异性结合。
PFC-1具有高效的体内抗肿瘤效果
为了评估的PFC-1的体内抗肿瘤功效，我们在4-6周龄雌性C57BL / 6小鼠于右侧背部被注射5×105 B16F10小鼠黑色素瘤细胞。大约10-12天后，肿瘤直径（day0）达到5-8mm。当移植瘤长到50-100mm3体积开始给予不同剂量的PFC-1或阴性对照（PBS）。并在指定日期测量小鼠肿瘤大小。实验结果显示，5μg PFC-1剂量组中肿瘤生长率出现70％抑制，而20μg PFC-1剂量组中则有100％抑制（图10）。
在一个类似的小鼠实验中，4-6周龄的雌性C57BL / 6小鼠于背部皮下被移植B16F10黑色素瘤，并建立大肿瘤负担模型。模型建立之后，小鼠被连续两天静脉内注射10μg的PFC-1（图11）。PFC-1表现出良好的体内肿瘤生长抑制效果。实验开始后第五天，相比于实验开始时的肿瘤体积，在PFC-1治疗小鼠组中肿瘤缩小到原始体积的75％（图11），在第六天，给予PFC-1治疗组小鼠一次额外的PFC-1静脉内注射，肿瘤体积持续缩小到原始体积的54％。
流式细胞分析细胞表型
小鼠麻醉后从眼眶静脉采集外周静脉血，并立即进行抗凝血和红细胞裂解处理。小鼠人道处死后，取出脾脏并立即采集脾脏细胞，并通过70uM尼龙筛（BD）的过滤和红细胞裂解处理后得到脾脏单细胞悬液。同时取出肿瘤组织，用镊子轻轻破坏肿瘤组织结构后在37℃下用0.2 mg/ml Collagenase IV和为0.1mg / ml的DNAse I消化15分钟。收集单细胞悬液并且将剩余的肿瘤组织继续用上述酶溶液消化25分钟。合并得到的单细胞悬液用70微米的尼龙网过滤。外周血单细胞，脾脏细胞和肿瘤细胞用流式抗体染色后用4%多聚甲醛溶液固定并避光保存或立即上机检测细胞表型。
经过抗体染色后用流式细胞术分析可发现，经过PFC-1（图12）治疗的小鼠的外周血、脾脏和肿瘤组织中的CD8+T细胞比例急剧提高。同时，小鼠的外周血和脾脏细胞组织中的CD8+T细胞的表面抗原CD44表达量同样出现明显提高，在肿瘤组织中的CD8+T细胞的表面抗原CD44表达量出现相对微弱的提高。CD44在CD8+T细胞表面的表达量可反映CD8+T细胞的激活程度。在该实验结果提示两种融合蛋白不仅能够增加CD8+T细胞群落的比例，同时还能促进CD8+T细胞的激活。另外，流式细胞术分析还显示，PFC-1能够有效动员NK细胞能多的渗透进入肿瘤组织（图13），这进一步提示PFC-1能有效激活免疫系统从而杀灭肿瘤细胞。
PFC-1抑制小鼠体内B16肿瘤恶性转移
将5×105 B16F10小鼠黑色素瘤细胞通过尾静脉注射方式接种至4-6周龄雌性C57BL / 6小鼠体内。在模型小鼠体内，肿瘤细胞迅速转移到肺部并且形成明显可见的肿瘤窦。第二天，通过腹膜内注射方式给予小鼠10μg PFC-1或同等体积的PBS（100ul）。第21天，将小鼠人道处死，取出肺部，用PBS彻底清洗后保存在10％的甲醛中。随后用双目显微镜（Leica M125）检查并计数不同组小鼠肺部的肿瘤转移灶数量。
实验证明，单次腹腔注射10μg PFC-1可有效抑制肿瘤恶性迁移。相比于对照组，给药组的肺部肿瘤窦平均值从61下降到11.4，降低幅度超过80%（图15）。这表明，PFC-1可有效激活免疫系统从而杀灭转移的肿瘤细胞。抑制肿瘤恶性转移对于防止肿瘤复发和促进肿瘤预后有着积极的意义。
本领域技术人员会容易意识到，本发明可容易改造而获得本文所述的那些目的和优点以及隐含在本文中的那些目的和优点。在本文中以当前优选实施方式的代表的形式描述的方法、变体和组合物是示例性的，并不意在限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，可对它们做出改变或将其用于其他用途，但这都包括在如所附权利要求定义的本发明的范围内。
虽然本发明已通过优选实施方式和任选的特征具体公开，但本领域技术人员可对本文公开的想法做出修改和变化，而这些修改和变化仍属于所附权利要求定义出的本发明的范围之内。
序列表
<110> 博际生物医药科技（杭州）有限公司
<120> 用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白
<130> 14221CN2
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 2
<211> 77
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr
35 40 45
Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro
50 55 60
Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
20 25 30
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
35 40 45
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
50 55 60
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
65 70 75 80
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
100 105 110
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115 120 125
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
130 135 140
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
145 150 155 160
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
165 170 175
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
180 185 190
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
195 200 205
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
210 215 220
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
225 230 235 240
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His
245 250 255
Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr
260 265 270
Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr
275 280 285
Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro
290 295 300
Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala
305 310 315 320
Pro Pro Ser Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
325 330 335
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Asn Trp Val Asn Val Ile Ser
340 345 350
Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala
355 360 365
Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala
370 375 380
Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly
385 390 395 400
Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn
405 410 415
Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu
420 425 430
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe
435 440 445
Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
450 455
<210> 6
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aagcttctga gatcaccggc gaaggagggc caccatgtac aggatgcaac tcctgtcttg 60
cattgcacta agtcttgcac ttgtcacgaa ttcggcttgc gattgccgag gcgattgctt 120
ttgtggcctc gagggaggag gaggctccga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc 180
acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct 240
catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc 300
tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc 360
gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca 420
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc 480
catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct 540
gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg 600
cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta 660
caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac 720
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc 780
tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag atatcggagg 840
aggaggctcc ccccctccta tgagcgtgga acatgctgac atttgggtga agtcttactc 900
tctgtacagt cgggagagat atatctgcaa ctcagggttc aagcgaaaag ccggaacaag 960
ctccctgact gaatgtgtgc tgaacaaggc cactaatgtc gctcactgga ccacacctag 1020
cctgaaatgc attagggacc cagcactggt gcatcagcga ccagcaccac cttcaaccgt 1080
cagcggaggg tccggaggag gaggatcagg agggggaagc ggcggaggag gcagcctgca 1140
gaactgggtg aatgtcatct ccgacctgaa gaaaatcgag gatctgattc agtccatgca 1200
cattgacgcc actctgtaca ccgaatccga tgtgcatccc tcttgcaagg tcacagctat 1260
gaaatgtttc ctgctggagc tgcaggtcat cagcctggaa agtggcgacg cttctattca 1320
cgataccgtg gagaatctga tcattctggc aaacaattct ctgtctagta acggcaatgt 1380
gacagagagt gggtgcaagg aatgtgagga actggaggaa aagaacatca aagagttcct 1440
gcagagcttt gtgcatatcg tccagatgtt tattaatacc agctgagtgc gacggccggc 1500
aagcccccgc tccccgggct ctcgcggtcg cacgaggatg cttctaga 1548

Claims (16)

1.一种肿瘤靶向融合蛋白至少包括（i）IL-15多肽、IL-15多肽变体、或其功能性片段，（ii）IL-15Rα多肽、IL-15Rα多肽变体、或其功能性片段，（iii）Fc结构域、Fc变体、或其功能性片段，和（iv）RGD多肽或其变体；其中，
所述IL-15Rα多肽由sushi结构域及外显子3的随后12个氨基酸构成。
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向融合蛋白，所述融合蛋白的各组分的排列顺序为RGD多肽-Fc结构域-IL-15Rα多肽-IL-15多肽。
3.根据权利要求1所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中Fc结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示，或在SEQ ID NO. 1所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有所述Fc结构域相同功能的衍生序列。
4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中IL-15Rα的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或在SEQ ID NO. 2所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有IL-15Rα结构域相同功能的衍生序列。
5.根据权利要求1所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中IL-15的序列如SEQ ID NO. 3所示，或在SEQ ID NO. 3所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有IL-15结构域相同功能的衍生序列。
6.根据权利要求1所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中RGD多肽的序列SEQ ID NO. 4所示的序列，或在SEQ ID NO. 4所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有RGD多肽结构域相同功能的衍生序列。
7.根据权利要求1所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中所述肿瘤靶向融合蛋白的氨基酸序列选自：（a）如SEQ ID NO. 5所示的序列；（b）由SEQ ID NO. 6所示的核酸序列编码的氨基酸序列；（c）由SEQ ID NO. 6所示的序列的简并序列编码的氨基酸序列；和（d）在SEQ IDNO. 5所示序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有所述融合蛋白相同功能的衍生序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中所述肿瘤为整合素阳性表达肿瘤。
9.根据权利要求8所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中所述肿瘤为αvβ3整合素阳性表达肿瘤。
10.根据权利要求1-7任一项所述的肿瘤靶向融合蛋白，其中所述肿瘤为进行性肿瘤、晚期肿瘤、具有高肿瘤负荷/负担的肿瘤、或转移性肿瘤。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的肿瘤靶向融合蛋白以及药学上可接受的辅料。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的肿瘤靶向融合蛋白以及另一种抗癌剂。
13.一种编码权利要求1-7任一项所述的肿瘤靶向融合蛋白的核酸。
14.一种包含权利要求13所述的核酸的表达载体。
15.一种用权利要求14所述的表达载体转化或转染的非人宿主细胞。
16.一种试剂盒，其包含权利要求1-7任一项所述的肿瘤靶向融合蛋白、权利要求13所述的核酸、权利要求14所述的表达载体、或权利要求15所述的非人宿主细胞。
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