CN101824406B

CN101824406B - 重组β-内酰胺酶与RGD融合蛋白及其在医学中的应用

Info

Publication number: CN101824406B
Application number: CN2009100680381A
Authority: CN
Inventors: 周晓靓; 吕茜茜; 王浩; 施培基; 王荣先
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Tianjin Tianyi Keyuan Technology Co. Ltd.
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2029-03-06
Also published as: CN101824406A

Abstract

本发明公开了β-内酰胺酶-RGD融合蛋白及其制备方法。该重组β-内酰胺酶-RGD融合蛋白的氨基酸序列包含了源于β-内酰胺酶的蛋白序列以及含短肽RGD的序列。本发明的重组β-内酰胺酶-RGD融合蛋白既具有β-内酰胺酶的结构和功能，又具有细胞粘附活性，这种融合蛋白能够定位到肿瘤部位具有较好的靶向性。可用于抗体导向酶前药疗法，与头孢菌素类前药合用可以用于治疗乳腺癌等一系列实体瘤，效果优于单用美法仑且毒性很小。

Description

重组β-内酰胺酶与RGD融合蛋白及其在医学中的应用

技术领域

本发明属于抗体导向酶-前药疗法(ADEPT)技术领域，更具体的说是一种重组β-内酰胺酶与RGD融合蛋白及其在治疗乳腺癌中的应用。

背景技术

高选择性肿瘤化疗是目前肿瘤研究的重要课题之一，大多数化疗药物缺乏对肿瘤组织的高选择性，往往在对肿瘤组织发挥作用的同时也对身体的正常组织产生毒副作用。单克隆抗体技术问世以来，为肿瘤的导向治疗提供了基础。前药是一类本身无活性或活性很低，但在体内可转化为活性物质的药物。利用抗体做为载体携带前药的专一性活化酶，可以选择性地结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，这种方法被称为“抗体导向酶-前药疗法(antibody-directedenzyme prodrug therapy，ADEPT)。自1987年Bagshawe提出ADEPT这一概念，已引起了人们的广泛的关注，他克服了以往化学免疫偶联物和免疫毒素存在的许多问题。Bagshawe从绿脓杆菌中分离羧肽酶G2并且克隆入人大肠杆菌中，最初是用来降解甲氨蝶呤，后来用来切除苯甲酸氮芥的衍生物上谷氨酸部分使之活化。这是目前最具代表性的一套ADEPT系统，而且已进入小规模临床试验阶段。只需要少量的酶-抗体交联物就可以在肿瘤部位催化大量的前体药物变为有毒性作用的活性药物。ADEPT方案的优势在于一个酶分子可以转化很多个分子的前体药物，在肿瘤部位产生高浓度的活性药物，这样可以弥补临床应用中免疫联物结合力较低的缺点，另有证据表明，在肿瘤表面产生高浓度药物比全身应用同等浓度的活性药物更加有效。

β-内酰胺酶是由抗生素处理过的耐药菌株产生的一类外源性酶。内酰胺类的药物用于治疗细菌感染已经在临床上使用很多年了。β-内酰胺类化合物对人体的毒性很低，而且不会被人体内源性的酶水解。而且，β-内酰胺酶是一个单链的蛋白，分子量相对较小，性质稳定且易于纯化。一种β-内酰胺酶的突变体具有更好的免疫学性质，更适用于ADEPT。将β-内酰胺酶融合到一段单链抗体后，能够富集于肿瘤部位，在血浆很快的清除。β-内酰胺酶可以激活一系列化疗药的前药，而且，作为一种可溶性蛋白，β-内酰胺酶可以在大肠杆菌中量产，便于今后临床使用。

细胞与细胞外基质或细胞培养的支架材料等的粘附是细胞生存与增殖所必需的，这种粘附主要通过一种被称为整合素的物质来介导。癌细胞表面的整合素与正常组织粘连，造成癌转移。整合素分子最重要的识别序列是蛋白质中的Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸，简称RGD)序列，大多数整合素都可识别它。所以如果ADEPT中的β-内酰胺酶与RGD序列进行融合表达，它就可以特异性的将β-内酰胺酶定位于癌细胞表面，特异性的在癌细胞表面对前药进行活化，从而发挥抗肿瘤作用。

发明内容：

本发明的一个目的是克服现有技术的不足之处，提供一种具有细胞粘附活性的β-内酰胺酶-RGD融合蛋白及其编码的多核苷酸。特别是具有RGD4C：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly的β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供β-内酰胺酶-RGD融合蛋白在乳腺癌药物治疗中的应用。

本发明提供的β-内酰胺酶-RGD融合蛋白，它的氨基酸序列包含了源于β-内酰胺酶的序列以及含短肽RGD的序列。为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种β-内酰胺酶-RGD融合蛋白，其所具有的氨基酸序列如下：

CDCRGDCFC GGGGS TPVSEKQLAE VVANTITPLM AAQSVPGMAV AVIYQGKPHY YTFGKADIAA NKPVTPQTLF ELGSISKTFT GVLGGDAIAR GEISLDDAVTRYWPQLTGKQ WQGIRMLDLA TYTAGGLPLQ VPDEVTDNAS LLRFYQNWQPQWKPGTTRLY ANASIGLFGA LAVKPSGMPY EQAMTTRVLK PLKLDHTWINVPKAEEAHYA WGYRDGKAVR VSPGMLDAQA YGVKTNVQDMANWVMA NMAPENVADASLKQ GIALAQSRYW RIGSMYQGLG WEMLNWPVEA NTVVEGSDSKVALAPLPVAE VNPPAPPVKA SWVHKTGSTG GFGAYVAFIPEKQIGIVMLA NTSYPNPARVEAAYHILEALQ。

本发明所述的β-内酰胺酶-RGD融合蛋白核苷酸序列如下：

TGTGACTGTCGTGGCGATTGTTTCTGTGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCAGAGGTGGTGGCGAACACGATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTTATTTATCAGGGCAAACCGCATTACTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACTCCACAAACCCTGTTCGAACTGGGGAGTATTTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATTGCCCGCGGGGAAATTAGTCTGGACGATGCTGTAACCCGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGGCAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGGCGACATACACAGCCGGGGGGCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAGGTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTTTATCAGAACTGGCAACCACAATGGAAACCAGGCACAACACGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGGCGCTCTGGCTGTTAAACCAAGCGGTATGCCGTATGAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAACTGGACCATACGTGGATCAACGTACCAAAAGCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCAGTACGCGTGTCGCCAGGGATGCTGGACGCCCAGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTGGGTAATGGCTAATATGGCACCAGAGAATGTGGCCGATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCCGTTATTGGCGTATCGGGTCCATGTATCAAGGTCTGGGCTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACCGTCGTTGAGGGCTCGGACTCAAAAGTGGCACTGGCCCCGCTGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCCGGTCAAAGCGTCATGGGTCCATAAAACGGGTTCTACGGGTGGTTTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAAAAACAAATCGGCATCGTAATGCTGGCTAATACAAGTTACCCGAACCCGGCGCGCGTAGAGGCGGCATATCACATTCTGGAAGCTCTGCAG。

所述β-内酰胺酶-RGD融合蛋白含有源于β-内酰胺酶的序列形成融合蛋白的结构区和短肽RGD的序列形成融合蛋白的功能区。

所述β-内酰胺酶包括所有野生型的β-内酰胺酶及其突变体。例如β-内酰胺酶(genebank No：X07234)的一个突变型(K21/A，S324/A)。

所述含短肽RGD的序列为包括含有氨基酸序列Arg-Gly-Asp的所有多肽。例如含短肽RGD的序列为：

RGD：Arg-Gly-Asp

NGR：Asn-Gly-Arg

GRGD：Gly-Arg-Gly-Asp

RGDS：Arg-Gly-Asp-Ser

RGDSP：Arg-Gly-Asp-Ser

GRGDS：Gly-Arg-Gly-Asp-Ser

RGD4C：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly

优选含短肽RGD的序列为GRGDS

更加优选含短肽RGD的序列为RGD4C

本发明提供一种β-内酰胺酶-RGD融合蛋白的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)融合基因的构建：包括合成低聚核苷酸，使用PCR技术将序列融合至β-内酰胺酶成熟肽；

(2)融合蛋白表达载体的构建：将高分子DNA连接入表达用质粒，并转化表达用大肠杆菌宿主细胞后振荡培养，以IPTG诱导蛋白质的表达；

(3)细胞冻干后用B-PER提取细菌蛋白，得到可溶性蛋白；

(4)破菌离心后收集上清液用金属镍螯合亲和层析纯化，再经冷冻干燥收集目的蛋白，既β-内酰胺酶-RGD融合蛋白。

本发明提供的低聚核苷酸的长度为1200个碱基或以下。

本发明进一步公开了β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白在ADEPT治疗乳腺癌药物中的应用，具体内容如下：

1.融合蛋白与头孢美法仑的离体细胞试验

取对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞，用胰蛋白酶消化后，用培养基制成细胞悬浮液，接种于96孔板中，温孵培养24hr，每孔加入100ng/ml的β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白在4℃温孵30min，洗板四次后，加入不同浓度的头孢美法仑、美法仑温孵48hr后，每孔中加入20μlMTT(5mg/L)继续培养4hr，1000转x10min离心后弃上清，每孔加入DMSO 100μl，振荡10min使其充分溶解后，于570nm测定A值。每个浓度作3个复孔，计算肿瘤细胞的生长抑制率。

2.β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白/头孢美法仑的体内分布试验：

用¹²⁵I标记融合蛋白，静脉注射入移植乳腺癌细胞的裸鼠体内，不同时间段进行显像。观察抗体的定位情况。如图6所示，可见融合蛋白能够定位到肿瘤部位具有较好的靶向性。

本发明提供的β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白与现有技术相比所具有的积极效果在于：

[1].本发明提供了一种利用基因重组和原核细胞表达得到双功能的融合蛋白，即具有β-内酰胺酶的活性又具有细胞粘附活性，解决了在ADEPT中单抗与酶融合后引起的免疫原性问题。

[2].本发明的重组蛋白可用于ADEPT治疗，特异性的靶向于肿瘤新生血管在局部活化前药，从而实现肿瘤的靶向治疗。

附图说明：

图1为本发明的重组β-内酰胺酶-RGD融合蛋白的基因构建示意图；

图2为本发明β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图；其中M：蛋白Marker，Con：空白对照，1-4：质粒不同时间诱导产物，5：沉淀，6：上清液。

图3为本发明实施例中的融合蛋白(β-内酰胺酶-RGD4C)的氨基酸序列；

图4为本发明的融合蛋白结合乳腺癌细胞株的活性；

图5为前体药物对乳腺癌细胞的杀伤曲线；

图6为融合蛋白在动物体内分布的小动物活体成像系统显像。

具体实施方式

本实施例中所使用的一种氨基酸序列来自于β-内酰胺酶(genebankNo：X07234)的一个突变型(K21/A，S324/A)。另外，本发明中采用的另一个氨基酸序列Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。其特殊之处在于：序列中包含了Arg-Gly-Asp，即RGD序列。利用基因重组技术构建了β-内酰胺酶-RGD4C融合基因，并且对该融合基因进行了原核表达和活性测定。

实施例1

β-内酰胺酶-RGD4C融合基因的构建：

(1)根据融合蛋白的氨基酸序列，利用OptimumGene^TM基因优化软件对蛋白的DNA序列进行优化，得到DNA序列如下：

TGTGACTGTCGTGGCGATTGTTTCTGTGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCAGAGGT

GGTGGCGAACACGATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTTATTTATCAGG

GCAAACCGCATTACTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACTCCACAAACCCTGTTC

GAACTGGGGAGTATTTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATTGCCCGCGGGGAAATTAGTCT

GGACGATGCTGTAACCCGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGGCAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGG

CGACATACACAGCCGGGGGGCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAGGTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTT

TATCAGAACTGGCAACCACAATGGAAACCAGGCACAACACGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGG

CGCTCTGGCTGTTAAACCAAGCGGTATGCCGTATGAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAAC

TGGACCATACGTGGATCAACGTACCAAAAGCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCA

GTACGCGTGTCGCCAGGGATGCTGGACGCCCAGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTG

GGTAATGGCTAATATGGCACCAGAGAATGTGGCCGATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCC

GTTATTGGCGTATCGGGTCCATGTATCAAGGTCTGGGCTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACC

GTCGTTGAGGGCTCGGACTCAAAAGTGGCACTGGCCCCGCTGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCC

GGTCAAAGCGTCATGGGTCCATAAAACGGGTTCTACGGGTGGTTTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAAA

AACAAATCGGCATCGTAATGCTGGCTAATACAAGTTACCCGAACCCGGCGCGCGTAGAGGCGGCATATCACATTCTGGAAGCTCTGCAG。

全DNA的合成工作由公司(金思特科技有限公司)提供，得到了融合蛋白的质粒DNA，测序报告和含重组质粒的甘油茵一份。

实施例2

β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白的表达：

将测序验证的β-内酰胺酶-RGD4C融合基因克隆入载体pET30a(+)转化感受态细胞BL21(DE3)细菌，挑取单菌接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后以1∶100接种于含25-170μg/ml氯霉素的液体培养基，当OD₆₀₀达到0.5-1.0左右时，加入诱导剂IPTG诱导蛋白质表达，IPTG的浓度为0.5mM。继续培养2小时后经15000g转速离心10min。镍柱亲和层析纯化后，冷冻干燥得到融合蛋白β-内酰胺酶-RGD4C，诱导表达的融合蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明的特殊之处在于：诱导表达的时间和温度可以根据实际情况，如目的蛋白的可溶性，稳定性和表达量进行调整，可调整为30℃诱导4小时以上，或者20℃或12℃诱导过夜。扫描SDS-PAGE的蛋白条带。

实施例3

β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白的酶活性和细胞粘附活性测定：

用包被液稀释纯化后的β-内酰胺酶-RGD4C融合蛋白，使其终浓度分别为30000、20000、10000、6000、2000、500、200ng/ml，以每孔100μl的体积加入到96孔细胞培养板，4℃包被过夜。0.9％的NaCl洗板3次后，每孔中加入封闭液200μl，37℃封闭2hr，再用0.9％的NaCl洗板3次。MCF-7乳腺癌细胞用0.9％的NaCl洗涤3遍后，用不完全培养基重悬细胞。每孔加入100μl细胞悬液，培养1hr，洗板，除去未黏附的细胞。黏附在培养孔内的细胞用固定液固定后，0.5％的结晶紫染色，倒置显微镜观察细胞黏附情况并照相。结果如图所示，被融合蛋白包被的孔内有细胞黏附，且黏附细胞数量随蛋白浓度增加而增多，而被β-内酰胺酶包被的孔内没有细胞黏附。结果表明，β-内酰胺酶-RGD4C在体外对乳腺癌细胞MCF-7具有黏附性，证实了其靶向性。

酶活性试验使用头孢硝噻吩工作液进行检测：25℃情况下，以200μg/ml的酶10微升同不同浓度的头孢硝噻吩混匀(0.2-400μmol/L)，迅速测定260nm吸收值，利用lineweaver-Burk曲线计算融合蛋白的米氏常数Km＝20.1±6.0μmol/L，能够完全的水解原药。

实施例4

β-内酰胺酶-GRGDS融合蛋白的表达

该融合蛋白的基因序列如下，全基因的合成由金思特(南京)科技有限公司完成

GGTCGTGGCGATAGCGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCAGAGGTGGTGGCGAACAC

GATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTTATTTATCAGGGCAAACCGCATTA

CTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACTCCACAAACCCTGTTCGAACTGGGGAGTAT

TTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATTGCCCGCGGGGAAATTAGTCTGGACGATGCTGTAAC

CCGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGGCAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGGCGACATACACAGCCGG

GGGGCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAGGTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTTTATCAGAACTGGCAACC

ACAATGGAAACCAGGCACAACACGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGGCGCTCTGGCTGTTAAACC

AAGCGGTATGCCGTATGAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAACTGGACCATACGTGGATCAA

CGTACCAAAAGCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCAGTACGCGTGTCGCCAGGGAT

GCTGGACGCCCAGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTGGGTAATGGCTAATATGGCACC

AGAGAATGTGGCCGATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCCGTTATTGGCGTATCGGGTCCAT

GTATCAAGGTCTGGGCTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACCGTCGTTGAGGGCTCGGACTCAAA

AGTGGCACTGGCCCCGCTGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCCGGTCAAAGCGTCATGGGTCCATAA

AACGGGTTCTACGGGTGGTTTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAAAAACAAATCGGCATCGTAATGCTGGC

TAATACAAGTTACCCGAACCCGGCGCGCGTAGAGGCGGCATATCACATTCTGGAAGCTCTGCAG。

将测序验证的β-内酰胺酶-GRGDS融合基因克隆入载体pET30a(+)转化感受态细胞BL21(DE3)细菌，挑取单菌接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后以1∶100接种于含25-170μg/ml氯霉素的液体培养基，当OD₆₀₀达到1.0时，加入诱导剂IPTG诱导蛋白质表达，IPTG的浓度为-2mM。继续培养5小时后经10000转/min离心10min。收集上清液，用his镍柱纯化，即得到β-内酰胺酶-GRGDS重组蛋白，对该重组蛋白进行SDS-PAGE电泳。

本发明的特殊之处在于：诱导表达的时间和温度可以根据实际情况，如目的蛋白的可溶性，稳定性和表达量进行调整，可调整为30℃诱导4小时以上，或者25℃或15℃诱导过夜。扫描SDS-PAGE的蛋白条带。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

序列表

<110>中国医学科学院放射医学研究所

<120>重组β-内酰胺酶与RGD融合蛋白及其在医学中的应用

<160>2

<210>1

<211>1125

<212>DNA

<213>β-内酰胺酶

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1125)

<400>1

tgtgactgtc gtggcgattg tttctgtggc ggtggcggca gcacaccagt tagtgaaaaa 60

caactggcag aggtggtggc gaacacgatt accccactga tggctgctca atccgttcca 120

ggtatggcag tggcagttat ttatcagggc aaaccgcatt actatacttt cgggaaagcg 180

gatatcgcgg ccaacaaacc agtcactcca caaaccctgt tcgaactggg gagtatttcc 240

aaaacgttta cgggtgtact gggcggcgac gctattgccc gcggggaaat tagtctggac 300

gatgctgtaa cccgttactg gccacaactg actgggaaac agtggcaggg tatccgcatg 360

ctggacctgg cgacatacac agccgggggg ctgccactgc aggtcccaga tgaggttact 420

gacaacgcct ctctgctgcg tttttatcag aactggcaac cacaatggaa accaggcaca 480

acacgcctgt acgcaaatgc atcgattggt ctgtttggcg ctctggctgt taaaccaagc 540

ggtatgccgt atgaacaggc aatgacgacc cgcgttctga aaccactgaa actggaccat 600

acgtggatca acgtaccaaa agccgaagag gcccactacg cctggggtta tcgtgacggg 660

aaagcagtac gcgtgtcgcc agggatgctg gacgcccagg cttatggcgt caaaaccaat 720

gtacaagata tggcgaactg ggtaatggct aatatggcac cagagaatgt ggccgatgcg 780

tcactgaaac aaggcatcgc actggcgcaa tcccgttatt ggcgtatcgg gtccatgtat 840

caaggtctgg gctgggagat gctgaactgg ccggttgagg cgaacaccgt cgttgagggc 900

tcggactcaa aagtggcact ggccccgctg ccagtagcgg aggtgaatcc accggcaccg 960

ccggtcaaag cgtcatgggt ccataaaacg ggttctacgg gtggtttcgg cgcttacgtt 1020

gcattcatcc cagaaaaaca aatcggcatc gtaatgctgg ctaatacaag ttacccgaac 1080

ccggcgcgcg tagaggcggc atatcacatt ctggaagctc tgcag 1125

<210>2

<211>375bp

<212>PRT

<213>β-内酰胺酶

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(375)

<400>2

Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro

1 5 10 15

Val Ser Glu Lys Gln Leu Ala Glu Val Val Ala Asn Thr Ile Thr Pro

20 25 30

Leu Met Ala Ala Gln Ser Val Pro Gly Met Ala Val Ala Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Gly Lys Pro His Tyr Tyr Thr Phe Gly Lys Ala Asp Ile Ala Ala

50 55 60

Asn Lys Pro Val Thr Pro Gln Thr Leu Phe Glu Leu Gly Ser Ile Ser

65 70 75 80

Lys Thr Phe Thr Gly Val Leu Gly Gly Asp Ala Ile Ala Arg Gly Glu

85 90 95

Ile Ser Leu Asp Asp Ala Val Thr Arg Tyr Trp Pro Gln Leu Thr Gly

100 105 110

Lys Gln Trp Gln Gly Ile Arg Met Leu Asp Leu Ala Thr Tyr Thr Ala

115 120 125

Gly Gly Leu Pro Leu Gln Val Pro Asp Glu Val Thr Asp Asn Ala Ser

130 135 140

Leu Leu Arg Phe Tyr Gln Asn Trp Gln Pro Gln Trp Lys Pro Gly Thr

145 150 155 160

Thr Arg Leu Tyr Ala Asn Ala Ser Ile Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala

165 170 175

Val Lys Pro Ser Gly Met Pro Tyr Glu Gln Ala Met Thr Thr Arg Val

180 185 190

Leu Lys Pro Leu Lys Leu Asp His Thr Trp Ile Asn Val Pro Lys Ala

195 200 205

Glu Glu Ala His Tyr Ala Trp Gly Tyr Arg Asp Gly Lys Ala Val Arg

210 215 220

Val Ser Pro Gly Met Leu Asp Ala Gln Ala Tyr Gly Val Lys Thr Asn

225 230 235 240

Val Gln Asp Met Ala Asn Trp Val Met Ala Asn Met Ala Pro Glu Asn

245 250 255

Val Ala Asp Ala Ser Leu Lys Gln Gly Ile Ala Leu Ala Gln Ser Arg

260 265 270

Tyr Trp Arg Ile Gly Ser Met Tyr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Met Leu

275 280 285

Asn Trp Pro Val Glu Ala Asn Thr Val Val Glu Gly Ser Asp Ser Lys

290 295 300

Val Ala Leu Ala Pro Leu Pro Val Ala Glu Val Asn Pro Pro Ala Pro

305 310 315 320

Pro Val Lys Ala Ser Trp Val His Lys Thr Gly Ser Thr Gly Gly Phe

325 330 335

Gly Ala Tyr Val Ala Phe Ile Pro Glu Lys Gln Ile Gly Ile Val Met

340 345 350

Leu Ala Asn Thr Ser Tyr Pro Asn Pro Ala Arg Val Glu Ala Ala Tyr

355 360 365

His Ile Leu Glu Ala Leu Gln

370 375。

Claims

1.一种β-内酰胺酶-RGD融合蛋白，所述的融合蛋白由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所编码：

TGTGACTGTCGTGGCGATTGTTTCTGTGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCA

GAGGTGGTGGCGAACACGATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTT

ATTTATCAGGGCAAACCGCATTACTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACT

CCACAAACCCTGTTCGAACTGGGGAGTATTTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATT

GCCCGCGGGGAAATTAGTCTGGACGATGCTGTAACCCGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGG

CAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGGCGACATACACAGCCGGGGGGCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAG

GTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTTTATCAGAACTGGCAACCACAATGGAAACCAGGCACAACA

CGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGGCGCTCTGGCTGTTAAACCAAGCGGTATGCCGTAT

GAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAACTGGACCATACGTGGATCAACGTACCAAAA

GCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCAGTACGCGTGTCGCCAGGGATGCTG

GACGCCCAGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTGGGTAATGGCTAATATGGCA

CCAGAGAATGTGGCCGATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCCGTTATTGGCGTATC

GGGTCCATGTATCAAGGTCTGGGCTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACCGTCGTTGAG

GGCTCGGACTCAAAAGTGGCACTGGCCCCGCTGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCCGGTC

AAAGCGTCATGGGTCCATAAAACGGGTTCTACGGGTGGTTTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAA

AAACAAATCGGCATCGTAATGCTGGCTAATACAAGTTACCCGAACCCGGCGCGCGTAGAGGCGGCATAT

CACATTCTGGAAGCTCTGCAG；

其氨基酸序列由SEQ ID NO：2所示：

CDCRGDCFCGGGGS TPVSEKQLAE VVANTITPLM AAQSVPGMAV AVIYQG KPHYYTFGKADIAA NKPVTPQTLF ELGSISKTFT GVLGGDAIAR GEISLDDAVT RYWPQLTGKQWQGIRMLDLA TYTAGGLPLQ VPDEVTDNAS LLRFYQNWQP QWKPGTTRLY ANASIGLFGALAVKPSGMPY EQAMTTRVLK PLKLDHTWINVP KAEEAHYA WGYRDGKAVR VSPGMLDAQAYGVKTNVQDMANWVMA NMA PENVADASLKQ GIALAQSRYW RIGSMYQGLG WEMLNWPVEANTVVEGSDSK VALAPLPVAE VNPPAPPVKA SWVHKTGSTG GFGAYVAFIPEKQIGIVMLA NTSYPNPARVEAAYHILEALQ。