CN101671396A - 与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用 - Google Patents

与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用 Download PDF

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CN101671396A CN200810222219A CN200810222219A CN101671396A CN 101671396 A CN101671396 A CN 101671396A CN 200810222219 A CN200810222219 A CN 200810222219A CN 200810222219 A CN200810222219 A CN 200810222219A CN 101671396 A CN101671396 A CN 101671396A
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戴建武
张晶
赵燕南
陈冰
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Abstract

本发明公开了一种与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用。与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子是通过连接肽将胶原结合结构域融合到血管内皮生长因子的氨基或羧基末端得到的重组蛋白；所述胶原结合结构域的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第178位－第184位。本发明还公开与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子的编码基因。本发明的与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子有利于解决血管内皮生长因子在体内扩散造成的低活性和高风险，为心肌损伤的修复提供了新方法。

Description

与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用
技术领域
本发明涉及与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用。
背景技术
血管内皮生长因子(VEGF)是一类富含半胱氨酸的糖蛋白，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，它们具有特定的信号肽可以分泌到细胞外发挥作用。其中VEGF165的应用最为广泛，它能促进血管内皮细胞增值、分化、抑制内皮细胞凋亡和促进血管平滑肌细胞的迁移等功能(Ferrara N，Houck K，JakemanL，Leung DW.Molecular and biological properties of the vascular endothelialgrowth factor family of proteins.Endocr Rev.1992；13(1)：18-32.YancopoulosGD，Davis S，Gale NW，Rudge JS，Wiegand SJ，Holash J.Vascular-specificgrowth factors and blood vessel formation.Nature.2000；407(6801)：242-248.)。在治疗心血管疾病中，VEGF有重要的功能。在心肌缺血疾病中，VEGF能通过促进血管形成来改进心肌功能。
目前VEGF治疗途径主要包括：(1)直接将VEGF蛋白注射到心肌内(Pearlman JD，Hibberd MG，Chuang ML，Harada K，Lopez JJ，Gladstone SR，Friedman M，SellkeFW，Simons M.Magnetic resonance mapping demonstrates benefits ofVEGF-induced myocardial angiogenesis.Nat Med.1995；1(10)：1085-1089.Harada K，Friedman M，Lopez JJ，Wang SY，Li J，Prasad PV，Pearlman JD，EdelmanER，Sellke FW，Simons M.Vascular endothelial growth factor administrationin chronic myocardial ischemia.Am J Physiol.1996；270(5Pt 2)：H1791-1802.)；(2)将VEGF的基因转入宿主心肌缺血部位(Ferrarini M，Arsic N，Recchia FA，Zentilin L，Zacchigna S，Xu X，Linke A，Giacca M，Hintze TH.Adeno-associatedvirus-mediated transduction of VEGF165 improves cardiac tissue viabilityand functional recovery after permanent coronary occlusion in conscious dogs.Circ Res.2006；98(7)：954-961.Vale PR，Losordo DW，Milliken CE，Maysky M，Esakof DD，Symes JF，Isner JM.Left ventricular electromechanical mappingto assess efficacy of phVEGF(165)gene transfer for therapeutic angiogenesisin chronic myocardial ischemia.Circulation.2000；102(9)：965-974.)。但蛋白注射后由于体液的冲刷，因子很快扩散而使得局部浓度很难达到治疗要求，如果大量注射则会对生物体产生负作用，而基因治疗则有安全性隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用。
本发明所提供的与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子，命名为VEGF-CBD，是通过连接肽将胶原结合结构域融合到血管内皮生长因子的氨基或羧基末端得到的重组蛋白；所述胶原结合结构域的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第178位-第184位。
其中，VEGF-CBD具体可为如下a)或b)或c)或d)的蛋白：
a)其氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1位-第184位；
b)其氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1位-第186位；
c)其氨基酸序列为序列表中序列2；
d)将a)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与胶原特异结合的由a)衍生的多肽。
为了使本发明的a)的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2自氨基末端第1位-第186位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
  标签   残基   序列
  Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR
  Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH
  FLAG   8   DYKDDDDK
  Strep-tagII   8   WSHPQFEK
  c-myc   10   EQKLISEEDL
上述c)中就提供了在b)的蛋白的羧基末端连接上Poly-His标签的蛋白。
所述c)或d)中的VEGF-CBD可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)或c)中的VEGF-CBD可通过将序列表中序列1自5′末端第1-558位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
序列表中序列2由192个氨基酸残基组成。其中，序列表中序列2自N末端第1-166位为VEGF的氨基酸序列；序列表中序列2自N末端第178-184位为胶原结合结构域(CBD)的氨基酸序列；序列表中序列2自N末端第187-192位为组氨酸标签。
所述VEGF-CBD的编码基因也属于本发明的保护范围。
其中，所述VEGF-CBD的编码基因具体可为①至⑤中任一所述的基因；
①其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端第1-552位；
②其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端第1-558位
③其核苷酸序列是序列表中序列1；
④在严格条件下与①限定的DNA片段杂交且编码能与胶原特异结合的血管内皮生长因子的DNA分子；
⑤与①的基因具有90％以上的同源性，且编码能与胶原特异结合的血管内皮生长因子的DNA分子。
所述步骤⑤中的基因，与①的基因最好有95％以上的同源性。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
其中，序列表中序列1由579个核苷酸组成。序列表中序列1自5′末端第1-498位为VEGF的编码序列，编码序列表中序列2自N末端第1-166位所示的多肽；序列表中序列1自5′末端第532-552位为胶原结合结构域(CBD)的编码序列，编码序列表中序列2自N末端第178-184位所示的多肽；序列表中序列1自5′末端第559-576位为编码组氨酸标签的核苷酸序列。
含有所述编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的实验结果表明，VEGF-CBD蛋白在体内能促进血管新生，因此，VEGF-CBD蛋白可用于治疗由于血管损伤或者局部缺血引起的血管疾病，如急性或慢性心梗。
本发明的发明人根据心肌部位有大量I型和III型胶原存在，通过将胶原结合结构域(CBD)与血管内皮生长因子(VEGF)融合的方法来构建与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子(VEGF-CBD)。实验结果表明，VEGF-CBD有比天然VEGF165更好的胶原结合能力，使VEGF-CBD能与心肌部位的胶原结合，更好的促进心肌损伤的修复，从而加强天然VEGF165在治疗心肌损伤等疾病中的效果。VEGF-CBD有利于解决VEGF蛋白在体内扩散造成的低活性和高风险，为心肌损伤的修复提供了新方法。
附图说明
图1为VEGF-CBD和VEGF蛋白结构示意图
图2为VEGF-CBD和VEGF在体外与胶原的结合能力及解离常数
图3为VEGF-CBD的活性检测实验及体外功能实验
图4为胶原膜-VEGF-CBD复合物在大鼠皮下包埋
图5为免疫组化染色vWF检测受损心肌附近血管生成
具体实施方式
图1中为VEGF-CBD和VEGF蛋白结构示意图。
下述实施例详细介绍图1所示的VEGF-CBD和VEGF蛋白的制备方法及其功能。
实施例1、重组蛋白VEGF-CBD的制备
根据人VEGF165的cDNA序列(GenBank号为：7422)设计PCR扩增引物，并在下游引物中引入胶原结合结构域(CBD)“TKKTLRT”的编码序列“ACTAAGAAAACCCTGCGTACT”。
引物序列如下：
上游引物：
S1：5′-ATTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATG-3′；
S2：5′-CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3′。
下游引物：
X1：5′-TACTCGAGAGTACGCAGGGTTTTCTTAGTACCGCCAGAACCCGCAGCACTGC-3′；
X2：5′-GCCAGAACCCGCAGCACTGCCCGCGCTACCCCGCCTCGGCTTGTCACATC-3′；
X3：5′-TACTCGAGCCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3′。
用TRizol法提取乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，以S2和X2为引物扩增，获得的片段进行回收并纯化后，作为第二次PCR的模板，以S1和X1为引物进行第二次PCR扩增，扩增的片段回收并纯化后，用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切，连接入同样双酶切的pET28a(Novagen)载体上，构建重组表达载体pET28a-VEGF-CBD-6His。对该载体进行测序，测序结果表明，扩增片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码序列表中序列2的蛋白。其中，序列表中序列1由579个核苷酸组成。序列表中序列1自5′末端第1-498位为VEGF的编码序列，编码序列表中序列2自氮末端第1-166位所示的多肽；序列表中序列1自5′末端第532-552位为胶原结合结构域(CBD)的编码序列，编码序列表中序列2自N末端第178-184位所示的多肽；序列表中序列1自5′末端第559-576位为编码组氨酸标签的核苷酸序列。
用TRizol法提取乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，以S2和X3为引物扩增，获得的片段进行回收并纯化后，作为第二次PCR的模板，以S1和X3为引物进行第二次PCR扩增。扩增片段进行回收并纯化后，用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切，连接入同样双酶切的pET28a(Novagen)载体上，构建重组表达载体pET28a-VEGF-6His。对该载体进行测序，测序结果表明，扩增片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，编码序列表中序列4的蛋白。其中，序列表中序列3自5′末端第1-498位为VEGF165的编码序列，编码序列表中序列4自N末端第1-166位所示的多肽；序列表中序列3自5′末端第505-525位为编码组氨酸标签的核苷酸序列。
将重组表达载体pET28a-VEGF-CBD-6His和pET28a-VEGF-6His分别转入大肠杆菌BL21(D3)中，得到重组菌BL21VEGF-CBD和BL21VEGF。
重组菌BL21VEGF-CBD和BL21VEGF分别接种于10ml新鲜的LB培养基，在37℃，200rpm培养12小时左右，然后按2ml/100ml的比例将培养的重组菌BL21VEGF-CBD和BL21VEGF分别接种到150ml新鲜LB培养基，在37℃，200rpm培养3小时左右，当OD600达到0.8-1时，加入诱导物IPTG(IPTG终浓度1mM)诱导5小时。8000g离心10min收集菌体。100W超声破碎菌体，离心分离沉淀，沉淀溶解于含有尿素(终浓度8M)的Tris缓冲液中，以氧化还原体系进行蛋白复性。复性后的蛋白以镍柱亲和层析，咪锉梯度洗脱分离后，用脱盐柱将盐去除，获得VEGF-CBD和VEGF。
实施例2、VEGF-CBD和VEGF分别与胶原结合特性的分析
a)VEGF-CBD和VEGF分别与胶原的结合实验
提取鼠尾胶原，方法如下：
鼠尾先用中性盐溶液(0.1M Tris，0.2M Nacl，0.1M EDTA，PH 7.6)搅拌3小时，然后离心12000g 30分钟，弃上清，沉淀溶于0.5M的醋酸溶液中，过夜，然后13000g离心1小时，弃沉淀，上清加入等量的4M的Nacl溶液中，沉淀20分钟，然后13000g离心30分钟，将沉淀收集，重新溶解到0.2M乙酸中，透析除掉Nacl后，得到胶原溶液。
VEGF-CBD和VEGF分别与胶原的结合实验的方法如下：
1)上述制备的胶原溶液用PBS配成100μg/ml的溶液，按100μl/每孔加入96孔酶标板，4℃过夜吸附；
2)次日将过夜包被的酶标板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3％(质量百分比)BSA(用PBS配制不含Tween20，)封闭，100μl/每孔，37℃，1.5小时；
3)用PBS彻底洗2)中的沉淀4次后加入不同浓度的VEGF-CBD或VEGF(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μM)，100μl/每孔，37℃，2.5小时；
4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加一抗(anti-his，用PBS按体积比为1∶2000稀释)，100μl/每孔，37℃，1.5小时；
5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加二抗(anti-mouse IgG，用PBS按体积比为1∶10000稀释)，100μl/每孔，37℃，1hr；
6)用PBS洗5)中的沉淀4次，加AP显色液P-NPP(2mg/ml)，80μl/每孔，避光反应，加等体积0.2M NaOH终止反应。
7)取100μl 6)中终止反应后的溶液100μl，用酶标仪测定405nm下的OD值。
VEGF-CBD和VEGF分别与胶原的结合实验结果如图2A所示，表明VEGF-CBD比VEGF与胶原有更好的结合能力。
b)计算VEGF-CBD和VEGF分别对胶原的解离常数(Kd)
以与胶原结合VEGF-CBD或VEGF/游离型的VEGF-CBD或VEGF的值作为纵坐标，VEGF-CBD或VEGF的浓度作为横坐标做标准曲线，所做直线斜率的负倒数就是VEGF-CBD和VEGF分别对胶原的解离常数(Kd)。
VEGF-CBD和VEGF分别对胶原的解离常数的计算结果如图2B所示，表明VEGF-CBD对胶原的解离常数为Kd(VEGF-CBD)＝277.8nM，VEGF对胶原的解离常数为Kd(VEGF)＝909.1nM。Kd值越小，表明蛋白的结合能力越强，因此VEGF-CBD与胶原有有更高的结合能力。
图2中“1”代表VEGF；“2”代表VEGF-CBD。
实施例3、VEGF-CBD的生物活性
人脐带内皮细胞分离培养：离体的人脐带用PBS缓冲液冲洗内壁，将血细胞去除，然后脐带内灌入0.25％的胰酶，两边用止血钳封闭，37度放置15分钟，然后将胰酶消化后的液体收集，并用PBS冲洗内壁数十下，液体一并收集，离心后所得细胞在20％胎牛血清及10ng/ml VEGF及10ng/ml bFGF的M199培养基中培养，扩增后即为人脐带内皮细胞。
为了测定VEGF-CBD的生物活性，将上述分离的人脐带内皮细胞培养于48孔细胞培养板中，加入等摩尔(0、1、2、3、4和5nM)的CBD-VEGF或VEGF，三天后通过MTT检测细胞的增值情况。
为了检测在有胶原存在的情况下CBD-VEGF和VEGF的促内皮细胞增值能力，将48孔细胞培养板先铺上实施例2的a中制备的胶原，然后分别加入等摩尔(10、39、156、625和2500nM)的CBD-VEGF和VEGF孵育3小时，用PBS缓冲液洗培养板，然后将人内皮细胞接种到培养板中。三天后MTT检测细胞增值情况。
MTT检测细胞的增值的结果表明VEGF-CBD与VEGF有相似的促内皮细胞增值能力，这说明CBD的偶联不影响VEGF的生物学活性，如图3A所示；VEGF-CBD比VEGF有更强的促内皮细胞增值能力，如图3B所示。因此，说明结合到胶原上的CBD-VEGF仍然有生物活性。
图3中“1”代表VEGF；“2”代表VEGF-CBD。
实施例4、VEGF-CBD体内促进血管新生
将VEGF-CBD和VEGF分别与胶原膜(商品名为海奥口腔修复膜烟台正海生物技术有限公司)结合。
雄性成年SD大鼠15只，随机分成3组，分别为PBS组、VEGF组和VEGF-CBD组，PBS组为对照，VEGF组为将与胶原膜结合后的VEGF包埋到雄性成年SD大鼠皮下，VEGF-CBD组为将与胶原膜结合后的VEGF-CBD包埋到雄性成年SD大鼠皮下，每只雄性成年SD大鼠皮下均包埋0.5nmol与胶原膜结合后的VEGF-CBD或与胶原膜结合后的VEGF，胶原膜为10*10*1mm，14天后取出包埋的材料，进行血管内皮细胞vWF免疫组化染色，检测局部血管新生。
实验结果如图4所示，表明VEGF-CBD比VEGF更能促进胶原膜内部血管生成。
图4中，A为14天后取出包埋的材料的宏观图，B为PBS组的免疫组化染色结果，C为VEGF组的免疫组化染色结果，D为VEGF-CBD组的免疫组化染色结果，E为各组的数据统计结果。
图4中“2”代表VEGF-CBD组；“1”代表VEGF组，“3”代表PBS组。
实施例5、VEGF-CBD治疗大鼠心肌损伤
急性大鼠心肌损伤模型的制备方法如下：
1)动物模型：大鼠麻醉后气管插管控制呼吸，接心电图导联。左第5肋间进胸，切开心包并悬吊，结扎左冠脉前降支。
2)分别将0.5nmol的VEGF-CBD和VEGF注射到梗死区周围。
3)缝合伤口。
4)术后大鼠在清洁级动物房喂养；
5)术后一个月，给大鼠注射过量麻醉剂处死，将心脏取出，福尔马林固定，石蜡包埋，切片，免疫组化检测血管新生的情况。
实验分3组：对照组、VEGF组和VEGF-CBD组。
对照组用生理盐水处理大鼠一个月；VEGF组用VEGF处理大鼠一个月；VEGF-CBD组用VEGF-CBD处理大鼠一个月。每组6只大鼠。
手术后一个月，检测大鼠心肌恢复情况，通过血管内皮细胞vWF(内皮细胞特异标志)免疫组化染色比较新生血管的情况。
实验结果如图5所示，VEGF-CBD比VEGF组有更多的血管形成，表明VEGF-CBD比VEGF有更强的治疗心肌损伤的功能。
图5中，A为对照组的免疫组化染色结果，B为VEGF组的免疫组化染色结果，C为VEGF-CBD组的免疫组化染色结果，D为各组的数据统计结果。
图5中“2”代表VEGF-CBD组；“1”代表VEGF组，“3”代表对照组。
序列表
<110>烟台正海生物技术有限公司中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用
<130>CGGNARW81646
<160>4
<210>1
<211>579
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
atggcaccca tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat     60
gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac    120
cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc    180
tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag    240
attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac    300
aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaatcc ctgtgggcct    360
tgctcagagc ggagaaagca tttgtttgta caagatccgc agacgtgtaa atgttcctgc    420
aaaaacacag actcgcgttg caaggcgagg cagcttgagt taaacgaacg tacttgcaga    480
tgtgacaagc cgaggcgggg tagcgcgggc agtgctgcgg gttctggcgg tactaagaaa    540
accctgcgta ctctcgagca ccaccaccac caccactga                           579
<210>2
<211>192
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val
1               5                   10                  15
Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr
            20                  25                  30
Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe
        35                  40                  45
Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp
    50                  55                  60
Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln
65                  70                  75                  80
Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser
                85                  90                  95
Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala
            100                 105                 110
Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu
        115                 120                 125
Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp
    130                 135                 140
Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly
                165                 170                 175
Gly Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Leu Glu His His His His His His
            180                 185                 190
<210>3
<211>525
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>3
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gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac    120
cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc    180
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<210>4
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<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>4
Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val
1               5                   10                  15
Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr
            20                  25                  30
Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe
        35                  40                  45
Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp
    50                  55                  60
Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln
65                  70                  75                  80
Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser
                85                  90                  95
Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala
            100                 105                 110
Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu
        115                 120                 125
Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp
    130                 135                 140
Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
Cys Asp Lys Pro Arg Arg Leu Glu His His His His His His
                165                 170

Claims (9)

1、一种重组蛋白，是通过连接肽将胶原结合结构域融合到血管内皮生长因子的氨基或羧基末端得到的重组蛋白；所述胶原结合结构域的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第178位-第184位。
2、根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白为如下a)或b)或c)或d)的蛋白：
a)其氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1位-第184位；
b)其氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1位-第186位；
c)其氨基酸序列为序列表中序列2；
d)将a)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能与胶原特异结合的由a)衍生的多肽。
3、权利要求1或2所述重组蛋白的编码基因。
4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下①或②或③或④或⑤的基因
①其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端第1-552位；
②其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端第1-558位；
③其核苷酸序列是序列表中序列1；
④在严格条件下与①限定的DNA片段杂交且编码能与胶原特异结合的血管内皮生长因子的DNA分子；
⑤与①的基因具有90％以上的同源性，且编码能与胶原特异结合的血管内皮生长因子的DNA分子。
5、含有权利要求3或4所述编码基因的重组表达载体。
6、含有权利要求3或4所述编码基因的转基因细胞系或重组菌。
7、扩增权利要求3或4所述编码基因全长或任一片段的引物对。
8、权利要求1或2所述的重组蛋白在制备促进血管新生的药物中的应用。
9、权利要求3或4所述的编码基因在制备促进血管新生的药物中的应用。
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