CN109922817A - 用于诊断和治疗与细胞外基质周转相关的疾病的剂和方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容一般性地涉及靶向生物组织中细胞外基质周转区域的剂及其用于诊断或治疗与细胞外基质周转相关的状况的用途，其中所述剂包含含有氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)的多肽。

Description

用于诊断和治疗与细胞外基质周转相关的疾病的剂和方法

本公开内容的领域

本公开内容一般性地涉及靶向生物组织中细胞外基质周转(turnover)区域的剂及其用于诊断或治疗与细胞外基质周转相关的状况诸如动脉粥样硬化和纤维化的用途。

本公开内容的背景

动脉粥样硬化的特征在于在血管腔内形成动脉粥样硬化斑块。尽管大多数斑块持续多年保持无症状(quiescent)，但一些变得不稳定，导致斑块破裂或侵蚀。目前，不稳定斑块的破裂是全世界死亡率和发病率的主要原因之一。随着人口高度密集的国家像中国、印度和印度尼西亚中肥胖和糖尿病发生率的增加以及西方生活方式的适应，患有动脉粥样硬化和相关医学问题的患者的数目显著上升。动脉粥样硬化的两种主要的并发症是心肌梗塞(MI)和中风。除了是直接死亡的主要原因(在澳大利亚所有死亡中～20％是由MI引起的)，MI或中风后存活的患者的后果经常是毁灭性的，导致生活质量大幅度下降和残疾。动脉粥样硬化相关问题给我们的医疗保健系统带来的经济成本也是巨大的。

胶原构成动脉粥样硬化斑块的纤维帽(fibrous cap)的约60％，并且是结构稳定性的重要决定因素。调查不稳定斑块的大量研究已经证明了纤维帽厚度、胶原含量和破裂风险之间的直接关系。小于65μm的帽厚度和胶原含量的降低已经被用于指示不稳定性和破裂的高风险。

因此，预防由动脉粥样硬化引起的并发症，诸如MI和中风的关键是鉴定易于破裂的不稳定的、易损的动脉粥样硬化斑块。各种侵入性的、基于导管的方法已经被开发，目的是鉴定不稳定的动脉粥样硬化斑块，其中血管内超声(IVUS)、光学相干断层扫描(OCT)和近红外光谱(NIRS)是最突出的。然而，这些方法通常仅检测易损斑块的一些特征。尽管存在无可争议的医学需求、巨大的商业潜力和已经来自医疗设备公司的大量投资，包括大型临床试验，但是目前仍然不存在允许在体内可靠检测和区分不稳定的动脉粥样硬化斑块的可用的技术。

尽管非侵入性成像方法诸如计算机断层扫描(CT)、血管内超声(IVUS)、光学相干断层扫描(OCT)和近红外光谱(NIRS)的能够检测动脉粥样硬化斑块的一些属性，但是这些方法没有一种能够可靠地鉴定不稳定的、易于破裂的斑块并将其与稳定斑块区分。冠状动脉造影术已经成为评估冠状动脉疾病，包括动脉粥样硬化的金标准。然而，冠状动脉造影术仅提供关于管腔的信息；即是否存在血管限制(狭窄)。然而，在血管腔中形成的易损斑块不一定导致狭窄。事实上，导致狭窄的斑块经常是稳定的且不易破裂的斑块。因此，冠状动脉造影术不太适合于鉴定不稳定的、易损的动脉粥样硬化斑块。因此，对鉴定不稳定的、易破裂的动脉粥样硬化斑块并将其与稳定斑块区分的方法仍然存在迫切的需求。

尽管不稳定的动脉粥样硬化斑块的特征在于不充足的细胞外基质沉积和/或周转，但诸如慢性心力衰竭、慢性肾衰竭和慢性阻塞性肺病的状况中的组织纤维化的特征还在于不良的细胞外基质沉积和/或周转，导致成纤维细胞积累和细胞外基质蛋白的过量沉积，其导致扭曲的器官结构和功能。

目前用于组织纤维化的体内成像的技术具有显著的限制。例如，目前用于将心脏纤维化成像的技术是基于MRI的，并且包括心房壁的延迟钆增强(late gadoliniumenhancement；LGE)和在AF和HF环境中的T1映射。虽然前者允许纤维化的空间鉴定并且与电压映射良好相关，但是它受图像质量、不确定的再现性和高度的操作者依赖性的限制，这主要是由于心房壁薄以及因此有限的分辨率。T1映射已经与由电压映射检测到的心房疤痕和AF消融后的临床结果相关，但是，它在空间分辨率方面受到限制——需要对心房区域进行区域评估，并且在组织学上尚未被验证。类似地，尽管越来越多地在临床上使用并且已经证明与不良结果相关，通过心肌的LGE对弥漫性心室纤维化的检测伴随着显著的限制，包括没有检测弥漫性纤维化的能力、成像方案标准化的缺乏以及依赖于可能因研究而不同的任意范围的信号强度。

因此，对于用于与不希望的细胞外基质周转和纤维化相关的状况的诊断和预后的更好的剂和方法仍然存在迫切的需求。

本公开内容的概述

本公开内容基于(is predicated on)本发明人的令人惊讶的发现，即多肽TLTYTWS(SEQ ID NO:1)可以在体内与不稳定的动脉粥样硬化斑块和胶原周转区域差异地结合。本发明人还令人惊讶地示出，该多肽可以被用作成像剂中的靶向部分，以在体内鉴定不稳定的动脉粥样硬化斑块和胶原周转(纤维化)区域，以及可以被用作用于将治疗剂递送至体内不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化区域的治疗构建体的靶向部分。

因此，在本公开内容的一个方面中，提供了一种成像剂，所述成像剂包含与可检测标记物连接的多肽，其中该多肽包含氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)。

在本文公开的实施方案中，多肽由氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)组成。在本文公开的实施方案中，可检测标记物被附接至络合剂(complexing agent)。在本文公开的实施方案中，络合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或5-(8-甲基-3,6,10,13,16,19-六氮杂-双环[6.6.6]二十烷-1-基氨基)-5-氧代戊酸(MeCOSar)。在本文公开的实施方案中，络合剂是MeCOSar。在本文公开的实施方案中，可检测标记物选自由放射性同位素、成像染料、顺磁材料或微泡组成的组。在本文公开的实施方案中，可检测标记物是放射性同位素。在本文公开的实施方案中，放射性同位素是⁶⁴Cu。

在本公开内容的另一个方面中，提供了一种体内检测受试者的血管腔中的不稳定的动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括：a)向需要其的受试者施用如本文描述的成像剂；和b)检测成像剂的可检测标记物，其中可检测标记物在受试者的血管腔内的存在指示成像剂与不稳定的动脉粥样硬化斑块的结合。

在本公开内容的另一个方面中，提供了一种体内检测受试者中的纤维化的方法，所述方法包括：a)向需要其的受试者施用如本文描述的成像剂；和b)检测成像剂的可检测标记物，其中可检测标记物在受试者中的存在指示成像剂与纤维化区域的结合。

在本文公开的实施方案中，用于检测可检测标记物的方法选自由以下组成的组：单光子发射计算机断层扫描；正电子发射断层扫描；近红外荧光成像；d)超声成像；和磁共振成像。在本文公开的实施方案中，用于检测可检测标记物的方法是正电子发射断层扫描(PET)。在本文公开的实施方案中，受试者是人。在本公开内容的另一个方面中，提供了一种用于离体检测生物组织样品中不稳定的动脉粥样硬化斑块和/或纤维化的方法，所述方法包括：a)使从受试者获得的生物组织样品与如本文描述的成像剂接触；和b)检测成像剂的可检测标记物，其中可检测标记物的存在指示成像剂与组织样品中的不稳定的动脉粥样硬化斑块和/或纤维化区域的结合。

在本公开内容的另一个方面中，提供了一种治疗构建体，所述治疗构建体包含与靶向部分连接的治疗部分，其中该靶向部分包含含有氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)的多肽。

在本文公开的实施方案中，多肽由氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)组成。在本文公开的实施方案中，靶向部分还包括细胞渗透剂。在本文公开的实施方案中，细胞渗透剂包含多于一个带正电荷的氨基酸残基。在本文公开的实施方案中，细胞渗透剂包含多于一个D-精氨酸残基。在本文公开的实施方案中，多肽经由接头被附接至细胞渗透剂。在本文公开的实施方案中，接头被基质金属蛋白酶(MMP)特异性裂解。在本文公开的实施方案中，接头被MMP2特异性裂解。在本文公开的实施方案中，接头包含氨基酸序列PLGC(Me)AG(SEQ IDNO:2)。在本文公开的实施方案中，接头由氨基酸序列PLGC(Me)AG(SEQ ID NO:2)组成。在本文公开的实施方案中，治疗部分包括能够抑制或激活细胞外基质周转的化合物。在本文公开的实施方案中，治疗部分包括能够抑制或激活基质金属蛋白酶(MMP)活性的化合物。在本文公开的实施方案中，化合物能够抑制MMP活性。在本文公开的实施方案中，化合物是MMP14抑制剂。在本文公开的实施方案中，MMP14抑制剂是萘并荧光素。在本文公开的实施方案中，治疗部分还包括载体。在本文公开的实施方案中，载体是纳米颗粒。在本文公开的实施方案中，载体是聚(2-二异丙基氨基乙基甲基丙烯酸酯(PDPA)纳米颗粒。

在本公开内容的另一个方面中，提供了一种治疗或预防受试者中与不希望的细胞外基质周转相关的状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用如本文描述的治疗构建体。

在本文公开的实施方案中，状况选自由以下组成的组：心血管疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、中风、脑血管疾病、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、人新月体性肾小球肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、胰腺炎、血管炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植排斥、全身性硬化症、神经退行性紊乱和脱髓鞘疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺病、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛和癌症。在本文公开的实施方案中，状况选自由以下组成的组：动脉粥样硬化心肌梗塞后心脏重塑和中风。

附图简述

本文参考以下附图仅通过非限制性实例的方式来描述本公开内容的实施方案：

图1示出了T-肽-LPETG肽的质谱分析的结果。

图2示出了T-肽-ACPP-炔肽的质谱分析的结果。

图3示出了GGG-T-肽-ACPP-半胱氨酸肽的质谱分析的结果。

图4A-图4C是小鼠颈动脉的动脉粥样硬化斑块的组织切片的代表性显微照片。图4A示出了T-肽-FITC缀合物与不稳定的动脉粥样硬化斑块的切片的结合。图4B示出了不存在对照肽-FITC缀合物与不稳定的动脉粥样硬化斑块的串联切片的血管腔的结合。图4C示出了不存在T-肽-FITC缀合物与小鼠颈动脉内的稳定的动脉粥样硬化斑块的结合：IEL：内弹性层(Internal elastic lamina)，MEL：中间弹性层(Middle elastic lamina)，EEL：外弹性层(External elastic lamina)。明视野叠加(20倍物镜)下FITC通道中的荧光显微术。

图5A-图5C是小鼠颈动脉的动脉粥样硬化斑块的组织切片的代表性显微照片。图5A示出了在静脉内施用T-肽-FITC后不稳定的颈动脉斑块。图5B示出了在静脉内施用对照肽-FITC后不稳定的颈动脉斑块。图5C示出了在静脉内施用T-肽-FITC后稳定的主动脉弓斑块：内弹性层(IEL)、中间弹性层(MEL)和外弹性层(EEL)；来自20倍物镜下FITC通道中的荧光显微术的叠加图像。

图6A-图6D是在与T-肽-FITC缀合物(图6A、图6B和图6D)或对照肽-FITC缀合物(图6C)一起孵育后包被有未消化的胶原IV或MMP2-预消化的胶原IV的载玻片的代表性显微照片。图6A是与T-肽-FITC缀合物一起孵育的MMP2-预消化的胶原IV包被的载玻片。图6B是已经与T-肽-FITC缀合物一起孵育的未消化的胶原IV包被的载玻片。图6C示出了与对照肽-FITC缀合物一起孵育的MMP2-预消化的胶原IV包被的载玻片。图6D示出了与未标记的T-肽，随后与T-肽-FITC缀合物一起孵育的MMP2预消化的胶原IV包被的载玻片；明视野叠加(4倍物镜)下FITC通道中的荧光显微术。示出了来自n＝3的代表性显微照片。比例尺＝300mm。

图7A示出了人颈动脉斑块的代表性显微照片，所述显微照片示出了T-肽-GFP缀合物结合至斑块的部分上。图7B示出了人颈动脉斑块的代表性显微照片，所述显微照片未示出对照肽(GGG)-GFP缀合物与斑块结合的证据；4倍物镜下FITC通道中的荧光显微术；FC＝纤维帽。

图8是胶原归巢T-肽与可激活的细胞穿透肽(ACPP)的附接的示意图。ACPP包含通过U形肽接头(5-氨基-3-氧杂戊酰基柔性亲水接头)被保持在一起的与8个D-谷氨酸的聚阴离子序列形成拉链的9个D-精氨酸的聚阳离子序列，该U形肽接头包含优选被MMP2裂解的PLGC(Me)AG的氨基酸序列。运载药物的聚合物纳米海绵(nanosponge)通过硫醇烯点击反应(thiolene-click reaction)被附接至ACPP的聚阳离子臂，并且随后负载萘并荧光素。

图9示出了在醛接头附接至运载药物的聚合物纳米海绵后的核磁共振(NMR)谱。

图10示出了在T-肽附接至运载药物的聚合物纳米海绵后的核磁共振(NMR)谱。

图11示出了在Cy3酰肼染料附接至运载药物的聚合物纳米海绵后的核磁共振(NMR)谱。

图12示出了在加入MMP2后的ACPP细胞进入。用SHIP探针加标签的ACPP在聚阳离子臂的细胞进入后示出细胞内TRITC信号(比例尺10mm)。(A)DIC叠加，(B)荧光信号。

图13示出了酸处理的萘并荧光素对HT1080细胞中的MMP14抑制的影响。

图14示出了HT1080细胞和Cy3(红色)标记的纳米海绵的摄取的共焦图像。图像以Z堆栈(Z stack)的细胞层中部拍摄，示出细胞内信号。(a)研究溶酶体位置的RAW细胞的共焦显微术。(b)RAW细胞的Z堆栈共焦图像的2D重建，所述RAW细胞摄取的Cy3(红色)标记的纳米海绵被示出为红色点，而溶酶体呈蓝色。(c)示出红色点和蓝色点在空间上分开的3D快照。比例尺＝8μm。

图15示出了来自小鼠体内研究的颈动脉斑块切片的偏振光显微术(天狼猩红染色)：与用(b)PBS、(c)游离药物和(d)空纳米海绵治疗的对照小鼠相比，(a)用靶向药物构建体治疗的小鼠示出丰富的胶原。比例尺＝100μm。HT1080细胞和Cy3(红色)标记的摄取的共焦图像。

图16示出了如以斑块面积的百分比表示的胶原含量，示出小鼠处理组之间的显著差异。ns＝不显著；*＝p<0.05。

图17示出了荧光显微术的显微照片，所述显微照片示出T-肽-FITC与由实验性LAD诱导的梗塞小鼠心肌中的心肌纤维化区域的特异性结合(A)。对照肽-FITC缀合物与心肌纤维化区域的结合不明显(B)。

图18示出了(A)S-肽-MeCOSar缀合物(对照)和(B)T-肽-MeCOSar缀合物的电喷雾电离(ESI)质谱扫描。

图19示出了⁶⁴Cu-T-肽-MeCOSar示踪剂结合至快速起搏的绵羊心脏的右心房(RA)中的纤维化区域的PET/CT成像，在健康的右心室(RV)中没有检测到信号。

图20示出了与对照动物(Ntg)相比，使用⁶⁴Cu-T-肽-MeCOSar示踪剂或加扰(scrambled)对照肽示踪剂(s-肽/Dtg)的小鼠心力衰竭模型(Dtg)中纤维化的PET成像。

详细描述

贯穿本说明书和所附的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括/包含(comprise)”及变形诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。

冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“剂”意指一种剂或多于一种剂。

在本说明书的上下文中，术语“约”被理解为指的是本领域技术人员在实现相同功能或结果的上下文中将认为等同于所引述的值的数字的范围。

成像剂

如本文别处提到的，本公开内容基于本发明人的令人惊讶的发现，即多肽TLTYTWS(SEQ ID NO:1)可以在体外、离体和体内与不稳定的动脉粥样硬化斑块和胶原周转(纤维化)区域差异地结合。通过使用该多肽作为靶向部分的部分，本发明人已经开发了一种新型成像剂，用于在体内鉴定不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化，用于诊断和/或预后目的。

因此，在本公开内容的一个方面中，提供了成像剂，所述成像剂包含与可检测标记物连接的多肽，其中该多肽包含氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)。

如本文使用的术语“多肽”意指由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物。本领域技术人员将理解，SEQ ID NO:1的多肽可以包含附接至其N-末端和/或C-末端的一个或更多个另外的氨基酸残基，而不会降低该多肽在体外或体内特异性结合不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化区域的能力。以该方式修饰的多肽在本文中还被称为变体。在本文公开的实施方案中，SEQ ID NO:1的多肽的变体在其N-末端和/或C-末端处包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个另外的氨基酸。也在本领域技术人员的能力内的是确定将一个或更多个另外的氨基酸残基加入到SEQ ID NO:1的多肽的N-末端和/或C-末端是否将降低修饰的多肽在体外或体内特异性结合不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化区域的能力。确定如本文描述的多肽变体在体外或体内特异性结合不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化区域的能力的合适的方法的说明性实例在本文别处被公开(参见实施例部分)。

变体还可以由功能等同的氨基酸取代产生；即，当实现氨基酸取代时导致多肽保留SEQ ID NO:1的亲本多肽的至少一些特异性，例如其特异性结合MMP2消化的胶原IV的能力，如本文别处描述的。本领域技术人员可以通过使用本领域已知的任何合适的方法容易地确定SEQ ID NO:1的多肽的变体是否保留了亲本分子(即SEQ ID NO:1)的至少一些功能，所述合适的方法的说明性实例包括本文别处描述的体外、离体和体内方法(参见实施例部分)。在本文公开的实施方案中，变体衍生自保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”意指用具有与被替代的氨基酸残基大致等同的大小、电荷和/或极性的不同氨基酸残基替代氨基酸残基。氨基酸的天然保守取代的说明性实例包括以下8个取代基团(由常规的单字母代码命名)：(1)M、I、L、V；(2)F、Y、W；(3)K、R；(4)A、G；(5)S、T；(6)Q、N；(7)E、D和(8)C、S。

在本文公开的实施方案中，多肽由氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)组成。

包含氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)的多肽在本文中也可互换地称为“靶向肽”或“靶向部分”；即，在施用至受试者后，在体内被受试者的特定部位选择性摄取或定位在受试者的特定部位的化合物。

可检测标记物

合适的可检测标记物将是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括放射性同位素、成像染料、顺磁材料或微泡。在本文公开的实施方案中，可检测标记物选自由放射性同位素、成像染料、顺磁材料或微泡组成的组。

本领域技术人员将理解，可检测标记物的选择将取决于检测成像剂将采用的方法。例如，在成像剂将用于体外或离体检测不稳定的动脉粥样硬化斑块或纤维化区域的情况下，可以期望使用成像染料，诸如荧光团。合适的荧光团将是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括荧光素(FITC)、Cy3、Cy3.5和Cy5。在成像剂将用于体内检测不稳定的动脉粥样硬化斑块或纤维化区域的情况下，可以期望使用造影剂，诸如放射性标记物或放射性同位素。因此，在本文公开的实施方案中，可检测标记物是放射性同位素。

术语“放射性标记物”、“放射性同位素”等在本文中用于表示一种化合物，其中一个或更多个原子被具有原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现(即，天然存在)的原子质量或质量数的原子替代或取代。在一个实施方案中，可检测标记物是选自由以下组成的组的放射性同位素：碳-11、氮-13、氧-14、氧-15、氟-18、铁-52、铜-62、铜-64、锌-62、锌-63、镓-68、砷-74、溴-76、铷-82、钇-86、锆-89、锝-94m、铟-110m、碘-122、碘-123、碘-124、碘-131或铯-137。在一些配置中，放射性核素可以选自碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铁-52、铜-64、镓-68、钇-86、溴-76、锆-89、碘-123和碘-124。

铜-64(⁶⁴Cu)具有长的半衰期(约12.7小时)和产生高质量图像的正电子能量，并且因此是用于PET成像的有前景的可选择的同位素。⁶⁴Cu的较长半衰期具有与PET示踪剂的集中产生和分布相关的优势，以及允许在较长时间点成像，通常导致较好的信噪比。因此，在本文公开的实施方案中，放射性同位素是⁶⁴Cu。

在一些实施方案中，可以使用多于一种可检测标记物。

可检测标记物可以通过任何合适的缀合方法被连接至多肽。将可检测标记物与本文公开的多肽缀合的合适的方法将是本领域技术人员已知的。将可检测标记物与多肽缀合的合适的方法的说明性实例在本文的别处被描述(参见实施例部分)。缀合方法的选择可以取决于待采用的可检测标记物。

在一些实施方案中，将可检测标记物与本文公开的多肽缀合的方法需要将接头附接至SEQ ID NO:1的多肽或其变体的N-末端或C-末端，以促进缀合。合适的接头将是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括包含N-末端LPETG、N-末端ACPP-炔和C-末端GGG的多肽或其任何组合。

络合剂

在一些实施方案中，可以期望将可检测标记物附接至络合剂，以将可检测标记物最大化保留至成像剂，并且从而使可检测标记物从成像剂的损失或降解最小化，特别地在生理条件下。因此，在本文公开的实施方案中，可检测标记物被附接至络合剂，用于将可检测标记物保留在成像剂中。用于该目的的合适的络合剂将是本领域技术人员已知的，其说明性实例是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。因此，在本文公开的实施方案中，络合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。

本发明人令人惊讶地发现，基于六胺大双环笼(hexaaminemacrobicyclic cage)结构的螯合剂，例如5-(8-甲基-3,6,10,13,16,19-六氮杂-双环[6.6.6]二十烷-1-基氨基)-5-氧代戊酸(MeCOSar)，在室温以快速络合动力学结合放射性标记物，例如⁶⁴Cu，以形成在生理条件下稳定的具有高热力学和动力学稳定性的络合物。因此，在本文公开的实施方案中，络合剂是5-(8-甲基-3,6,10,13,16,19-六氮杂-双环[6.6.6]二十烷-1-基氨基)-5-氧代戊酸(MeCOSar)。

MeCOSar是一种双功能螯合剂，其借助于笼胺(sarcophagine)配体形成具有优异稳定性的铜络合物。与第一代配体例如(DOTA)相比，除了GMP认证的靶向肽的产生和纯化及其与MeCOSar的偶联之外，MeCOSar不需要特定的无金属产生条件(参见Paterson等人,Dalton Trans.2014,21；43(3):1386-96)。令人惊讶地发现，由本发明人开发的基于MeCOSar的成像剂具有在体内选择性结合不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化区域的独特性质，同时在生理条件下保持高热力学和动力学稳定性。

检测方法

如本文别处提到的，本公开内容基于本发明人的令人惊讶的发现，即多肽TLTYTWS(SEQ ID NO:1)可以在体外、离体和体内与不稳定的动脉粥样硬化斑块和胶原周转(纤维化)区域差异地结合。因此，本文还实现了体外、离体或体内检测不稳定的动脉粥样硬化斑块和胶原周转(纤维化)区域的方法，用于与不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化相关的状况的诊断和/或预后。

在本公开内容的方面中，提供了一种体内检测受试者的血管腔中的动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括：a)向需要其的受试者施用如本文描述的成像剂；和b)检测成像剂的可检测标记物，其中可检测标记物在受试者的血管腔内的存在指示成像剂与不稳定的动脉粥样硬化斑块的结合。

在本公开内容的另一个方面中，提供了一种体内检测受试者中的纤维化的方法，所述方法包括：a)向需要其的受试者施用如本文描述的成像剂；和b)检测成像剂的可检测标记物，其中可检测标记物在受试者中的存在指示成像剂与纤维化区域的结合。

体内检测受试者中的可检测标记物(在本文中也被称为“体内成像”)的合适的方法将是本领域技术人员所熟悉的，并且通常指的是产生受试者的整体或部分，更具体地受试者的内部方面的图像或一系列图像的非侵入性方法。将理解，方法的选择将取决于所使用的可检测标记物的类型。合适的成像技术将是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括单光子发射计算机断层扫描、正电子发射断层扫描(PET)、近红外荧光成像、超声成像和磁共振成像。在本文公开的实施方案中，用于检测可检测标记物的方法选自由以下组成的组：单光子发射计算机断层扫描；正电子发射断层扫描；近红外荧光成像；超声成像；和磁共振成像。

核成像的强度是其在功能水平上的定量信息，其信号灵敏度显著高于MRI或CT的信号灵敏度。目前，核医学中最有前景的模式是PET，它获取人中的图像，具有以mm范围计的空间分辨率，从而改进单光子发射计算机断层扫描(SPECT)的性能，所述单光子发射计算机断层扫描(SPECT)具有10mm-15mm的分辨率。PET比SPECT显著地更灵敏，因为准直仪阻断了SPECT检测器环内所有入射辐射的99％。此外，PET固有地是定量的，并且给出了组织内精确的活性分布，这在SPECT中在一定程度上是不可能的。因此，在本文公开的实施方案中，用于检测可检测标记物的方法是正电子发射断层扫描(PET)。

如本文别处描述的，可检测标记物在成像剂被施用至其的受试者的血管腔内的存在指示成像剂与不稳定的动脉粥样硬化斑块的结合。同样如本文别处描述的，可检测标记物在成像剂被施用至其的受试者中的存在指示成像剂与纤维化区域(在本文中也被称为疤痕或纤维化病变)的结合。在一些实施方案中，可以期望在将成像剂施用至受试者后立即或至少不久进行体内成像，因为在将成像剂施用至受试者后由可检测标记物提供的信号的强度可能随时间减弱；例如通过随时间推移成像剂从受试者的清除和/或通过在生理条件下来自成像剂的可检测标记物的逐渐损失。在一些实施方案中，体内成像在将成像剂施用至受试者后至少30分钟内、至少1小时内、至少2小时内、至少3小时内、至少4小时内、至少6小时内、至少7小时内、至少8小时内、至少9小时内或至少10小时内进行。在将成像剂施用至受试者后进行体内成像的最佳时间段将是已知的，或者至少可以由本领域技术人员在没有过度实验的情况下确定，并且通常将取决于所采用的可检测标记物的类型。

本领域技术人员将理解，由可检测标记物产生的较高信号在成像剂被施用至其的受试者的血管腔内的存在指示成像剂与不稳定的动脉粥样硬化斑块的结合。这与可以通过体内成像检测的可检测标记物的任何背景水平形成对比。类似地，本领域技术人员将理解，由可检测标记物产生的较高信号在成像剂被施用至其的受试者内的存在指示成像剂与纤维化区域的结合，这与可以通过体内成像检测的可检测标记物的任何背景水平形成对比。

将理解，本文公开的成像剂也可适用于离体检测受试者中的不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化的方法。例如，根据本文公开的方法，怀疑包含动脉粥样硬化斑块或纤维化病变的组织样品可以从患者获得(例如，经由活检)，并且分析不稳定的动脉粥样硬化斑块和/或纤维化病变的存在或不存在。适合于离体检测成像剂的可检测标记物的方法的说明性实例在本文的实施例部分中给出。用于离体检测成像剂的可检测标记物的其他合适的方法将是本领域技术人员所熟悉的。

因此，在本公开内容的另一个方面中，提供了一种离体检测受试者中的不稳定的动脉粥样硬化斑块或纤维化的方法，所述方法包括：a)使从受试者获得的生物组织样品与如本文描述的成像剂接触；和b)检测成像剂的可检测标记物，其中可检测标记物的存在指示成像剂与组织样品中的不稳定的动脉粥样硬化斑块或纤维化区域的结合。

如本文使用的术语“受试者”指的是哺乳动物，并且包括人、灵长类动物、家畜动物(例如绵羊、猪、牛、马、驴)、实验室测试动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(例如狗、猫)和圈养野生动物(例如狐狸、袋鼠、鹿)。在本文公开的实施方案中，受试者是人或实验室测试动物。在一个实施方案中，受试者是人。在本文公开的实施方案中，受试者患有或怀疑患有与不希望的细胞外基质周转(例如纤维化)相关的状况。与不希望的细胞外基质周转相关的状况将是本领域技术人员已知的，并且可以包括与不希望的细胞外基质沉积或减少的细胞外基质降解(例如，组织纤维化)或不希望的细胞外基质降解或减少的细胞外基质沉积(例如，如在不稳定的动脉粥样硬化斑块中观察到的)相关的状况。与不希望的细胞外基质周转相关的状况的说明性实例包括心血管疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、中风、脑血管疾病、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、人新月体性肾小球肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、胰腺炎、血管炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植排斥、全身性硬化症、神经退行性紊乱和脱髓鞘疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺病、哮喘、子宫内膜异位、神经性疼痛、炎性疼痛和癌症。因此，在本文公开的实施方案中，状况选自由以下组成的组：心血管疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、中风、脑血管疾病、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、人新月体性肾小球肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、胰腺炎、血管炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植排斥、全身性硬化症、神经退行性紊乱和脱髓鞘疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺病、哮喘、子宫内膜异位、神经性疼痛、炎性疼痛和癌症。在本文公开的实施方案中，状况选自由以下组成的组：动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、子宫内膜异位和中风。

治疗构建体

如本文别处提到的，本发明人令人惊讶地发现，多肽TLTYTWS(SEQ ID NO:1)可以在体外、离体和体内与不稳定的动脉粥样硬化斑块和胶原周转(纤维化)区域差异地结合。因此，本文还实现了治疗构建体，其利用如本文描述的SEQ ID NO:1的多肽或其变体作为靶向部分，以将治疗剂递送至需要其的受试者中的不稳定的动脉粥样硬化斑块和胶原周转(纤维化)区域。因此，在本公开内容的另一个方面中，提供了治疗构建体，所述治疗构建体包含与靶向部分连接的治疗部分，其中该靶向部分包含含有氨基酸序列TLTYTWS(SEQ IDNO:1)的多肽。

在本文公开的实施方案中，靶向部分包括SEQ ID NO:1的多肽的变体，如本文别处描述的。在本文公开的另一个实施方案中，多肽由氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)组成。

在本文公开的实施方案中，靶向部分还包括细胞渗透剂，其目的是促进治疗部分穿过或进入细胞。合适的细胞渗透剂将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括包含多于一个带正电荷的氨基酸残基的支链肽或直链肽。因此，在本文公开的实施方案中，细胞渗透剂包含多于一个带正电荷的氨基酸残基。在实施方案中，细胞渗透剂包含多于一个D-精氨酸残基。

在本文公开的实施方案中，多肽经由接头被附接至细胞渗透剂。

在一个实施方案中，细胞渗透剂是可激活的细胞渗透剂。“可激活的”意指当被施用至受试者时，细胞渗透剂是非活性的或惰性的，但是在特定的生理条件下被激活。例如，可激活的细胞渗透剂可以被附接至使细胞渗透剂失活的部分(例如接头)，并且其中该部分在生理条件下被裂解以激活细胞渗透剂并促进治疗剂进入细胞。在一些实施方案中，可激活的细胞渗透剂被附接至其的部分是多肽或其变体被附接至细胞渗透剂的接头。

合适的可激活的接头将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括被基质金属蛋白酶(MMP)特异性裂解的接头。因此，在本文公开的实施方案中，接头被基质金属蛋白酶(MMP)特异性裂解。在本文公开的实施方案中，接头被MMP2特异性裂解。在本文公开的实施方案中，接头包含氨基酸序列PLGC(Me)AG(SEQ ID NO:2)。在本文公开的实施方案中，接头由氨基酸序列PLGC(Me)AG(SEQ ID NO:2)组成。

如本文使用的，术语“治疗部分”包括当被施用至需要其的受试者时能够引发治疗或预防效果的化合物或化学结构。在本文公开的实施方案中，治疗部分包括能够抑制或激活细胞外基质周转的化合物。合适的治疗化合物将是本领域技术人员所熟悉的，其选择将取决于待治疗的状况。例如，在治疗构建体将被用于治疗不稳定的动脉粥样硬化斑块的情况下，可以期望使用例如，通过增强细胞外基质(例如胶原)的产生，或通过抑制由MMP引起的细胞外基质降解来减少细胞外基质周转来促进细胞外基质沉积的治疗化合物。通过促进细胞外基质沉积，本来易损的动脉粥样硬化斑块被稳定，最小化破裂的风险和由此产生的不良后果。促进细胞外基质沉积的合适的治疗化合物将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括能够抑制MMP活性的化合物。因此，在本文公开的实施方案中，治疗部分包括能够抑制MMP活性的化合物。这样的化合物可以通过抑制或以其他方式减少MMP从细胞或细胞群体的表达或释放来抑制MMP活性。合适的MMP抑制剂将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括奈非那韦(Nelfinavir)、坦诺司他(Tanomastat)(4-(4'-氯联苯基-4-基)-4-氧代-2-[(苯硫烷基)甲基]丁酸)、沙奎那韦、茚地那韦、BB-1101、多西环素、马立马司他(N-[2,2-二甲基-1-(甲基氨基甲酰基)丙基]-2-[羟基-(羟基氨基甲酰基)甲基]-4-甲基-戊酰胺)、TNF-α蛋白酶抑制剂-0(TAPI-0；CAS号143457-40-3)及其结构类似物(例如TAPI-1、TAPI-2)、磷酸阿米酮、藤黄菌素、阿仑膦酸钠、邻菲咯啉、4-表-金霉素、放线酰胺素、DL-塞奥芬(Thiorphan)、4-表-地美环素、甲基丙烯酸锌、Funalenone、凯拉花菁(Keracyanin)和萘并荧光素。

在本文公开的实施方案中，化合物是MMP14抑制剂。合适的MMP14抑制剂将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例是萘并荧光素。在本文公开的实施方案中，MMP14抑制剂是萘并荧光素。

对于一些情况，可以期望使用例如，通过抑制细胞外基质(例如胶原)的产生，或通过促进由MMP引起的细胞外基质降解来增强细胞外基质周转来抑制细胞外基质沉积的治疗化合物。该方法可以特别适合于与组织纤维化相关的状况，例如心肌梗塞(MI)后或与MI不相关的慢性心力衰竭期间心肌组织中发展的纤维化。通过抑制细胞外基质沉积，组织内的纤维化被最小化，其结果是组织完整性和功能的改进。抑制细胞外基质沉积的合适的治疗化合物将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括吡非尼酮、松弛素、半乳凝素-3、修饰的柑桔果胶、N-乙酰半胱氨酸、皮质类固醇、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、环磷酰胺、抗TGFβ1单克隆抗体CAT-192(Metelimumab)、核心蛋白聚糖、伊马替尼((4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-N-(4-甲基-3-{[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)苯甲酰胺)、达沙替尼(BMS-354825)、尼罗替尼(Nilotinib)(4-甲基-N-[3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基]-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]苯甲酰胺)、曲尼司特、曲尼司特衍生物(例如FT011；Fibrotech Therapeutics)和美国专利第8,765,812号、第8,652,540号和第8,283,323号中描述的抗纤维化化合物。在本文公开的实施方案中，治疗部分包括放射性同位素，其说明性实例在本文别处被描述。

在本文公开的实施方案中，治疗部分还包括载体。合适的载体将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括聚合物纳米颗粒、树状聚合物、碳纳米管、金纳米颗粒、脂质体和胶束。在本文公开的实施方案中，载体是纳米颗粒。合适的纳米颗粒将是本领域技术人员所熟悉的，其说明性实例包括聚(2-二异丙基氨基乙基甲基丙烯酸酯(PDPA)纳米颗粒。纳米颗粒目前被开发用于生物医学应用，诸如感测、生物反应和药物递送。为了待进行的这些应用，纳米颗粒通常需要负载功能性货物，诸如脂质体、酶或治疗化合物，并靶向特定的作用位点，诸如器官。期望通过使用不可渗透的材料或通过将货物缀合至纳米颗粒壳，功能性货物优选地被保留在纳米颗粒中。缀合提供了一些优势，诸如对连接部分的化学控制，这可以是pH、氧化还原或酶响应性，而不可渗透的纳米颗粒提供了其他优势，例如基于其壳性质诸如酶降解，以及pH或盐诱导的溶胀的更高药物负载和响应性。除了保留功能性货物之外，纳米颗粒通常需要受控的表面，用于生物医学应用，诸如隐形和靶向功能，用于部位特异性的药物递送。通过控制纳米颗粒的表面，颗粒和其周围环境之间的相互作用也被控制，并且因此，由封装的或缀合的货物产生的特定功能可以被定位到由纳米颗粒靶向的特定环境。因此，货物保留和适当定位是用于体内有效药物递送的另外两个考虑因素。本发明人已经开发了一种具有高药物负载和小分子保留的聚合物平台，用于在体内将负载治疗剂的颗粒靶向递送至细胞外基质周转区域，诸如不稳定的动脉粥样硬化斑块。

在本文公开的实施方案中，载体是聚(2-二异丙基氨基乙基甲基丙烯酸酯(PDPA)纳米颗粒。在一些实施方案中，可以期望将纳米颗粒功能化以增强其稳定性，特别地在生理条件下。

治疗方法

目前用于治疗不稳定的动脉粥样硬化斑块或纤维化的选择是高侵入性的(导管球囊和支架术)，或需要终生高剂量的药物治疗，导致相当大的副作用。理想地，向不稳定的动脉粥样硬化斑块或组织纤维化区域递送治疗化合物必须是特异性的，以避免对健康组织的脱靶效应。此外，由于细胞外基质沉积和周转是发展不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化病变中的持续过程，因此通常需要在长时间段内的持续水平的治疗化合物。目前的治疗选择，诸如全身性他汀类治疗，在二级预防方面示出了有前景的结果，但未能治疗导致急性血栓形成事件的高度发炎的斑块。

本文公开的方法通过提供一种治疗不稳定的动脉粥样硬化斑块和纤维化病变的改进的方式来解决或至少部分地缓解这样的问题，这样的方式通过允许将治疗剂特异性靶向递送至不稳定斑块和纤维化区域，从而避免现有治疗通常带来的对健康组织的不良脱靶效应。

因此，在本公开内容的另一个方面中，提供了一种治疗受试者中与不希望的细胞外基质周转相关的状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用如本文描述的治疗构建体。

如本文使用的，术语“细胞外基质周转(extracellular matrix turnover)”包括细胞外基质沉积和降解。细胞外基质材料包括但不限于胶原(例如胶原I、胶原II、胶原III和胶原IV)和纤连蛋白。

与不希望的细胞外基质周转相关的状况将是本领域技术人员已知的，并且可以包括与不希望的细胞外基质沉积或减少的细胞外基质降解(例如，组织纤维化)或不希望的细胞外基质降解或减少的细胞外基质沉积(例如，如在不稳定的动脉粥样硬化斑块中观察到的)相关的状况。与不希望的细胞外基质周转相关的状况的说明性实例包括心血管疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、中风、脑血管疾病、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、人新月体性肾小球肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、胰腺炎、血管炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植排斥、全身性硬化症、神经退行性紊乱和脱髓鞘疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺病、哮喘、子宫内膜异位、神经性疼痛、炎性疼痛和癌症。

因此，在本文公开的实施方案中，状况选自由以下组成的组：心血管疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、中风、脑血管疾病、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、人新月体性肾小球肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、胰腺炎、血管炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植排斥、全身性硬化症、神经退行性紊乱和脱髓鞘疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺病、哮喘、子宫内膜异位、神经性疼痛、炎性疼痛和癌症。

在本文公开的实施方案中，状况选自由以下组成的组：动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、子宫内膜异位和中风。

在本说明书的上下文中，涉及蛋白的术语“活性”意指由蛋白或其任何片段施加的任何细胞功能、作用、效果或影响。由蛋白产生的细胞功能、作用、效果或影响可以直接或间接施加。

通常将理解，本文描述的治疗方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的治疗构建体的步骤。如本文使用的，术语“治疗有效量”在其含义内包括无毒但足以提供期望效果的构建体的量或剂量。所需的确切量或剂量将取决于诸如所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗的状况的严重程度、所施用的治疗化合物或剂、施用的模式等等因素，从受试者到受试者变化。因此，详细说明确切的“治疗有效量”是不可能的。然而，对于任何给定的情况，适当的“治疗有效量”可以由本领域普通技术人员之一仅使用常规实验确定。

如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是补救状况或症状，防止状况或疾病的建立，或以其他方式防止、阻止、减缓或以无论任何方式逆转状况或疾病或其他不期望症状的进展的任何和所有用途。因此，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”应在其最广泛的上下文中考虑。例如，治疗不一定暗示患者被治疗直到完全恢复。在显示多种症状或以多种症状为特征的状况中，治疗或预防不一定需要补救、防止、阻止、减缓或逆转所有所述症状，而是可以防止、阻止、减缓或逆转一种或更多种所述症状。在一些紊乱的上下文中，本公开内容的方法涉及在减少或改善与紊乱相关的高度不期望事件的发生或紊乱的进展的不可逆结果的方面来“治疗”紊乱，但是其本身可以不防止事件或结果的初始发生。因此，治疗包括改善特定紊乱的症状或防止或以其他方式降低发展特定紊乱的风险。

本文描述的治疗构建体可以根据本公开内容以药物组合物的形式施用，药物组合物通常包含一种或更多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这样的组合物可以以任何方便或合适的途径施用，诸如通过肠胃外途径(例如静脉内)。在一个实施方案中，施用是经由静脉内途径。

单次或多次施用可以以由治疗医师选择的剂量水平和模式进行。宽范围的剂量可以是可应用的。在一些实施方案中，对于人类受试者有效的量在约4mg/kg至约6mg/kg体重的范围内。然而，应理解，剂量方案可以被调整以提供最佳的治疗响应。例如，若干分开的剂量可以每天、每周、每月或其他合适的时间间隔被施用，或剂量可以如由情况的紧迫性指示的按比例减少。

组合物可以方便地以单位剂量形式呈现，并且可以通过药学领域熟知的任何方法来制备。方法可以包括使组合物的组分与载体缔合的步骤，所述载体例如液体载体或精细分散的固体载体，所述载体构成一种或更多种辅助成分。

药学上可接受的载体或稀释剂的实例是脱矿质水或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油诸如花生油(peanut oil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachisoil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，诸如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，诸如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，诸如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；卡拉胶；黄蓍胶或阿拉伯树胶，以及凡士林油。通常，一种或多种载体将形成组合物的按重量计的从10％至99.9％。

适合于可注射使用的药物形式包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌的可注射溶液或分散体的无菌粉末。制剂在制造和储存的条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒径和通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来引起，所述多种抗细菌剂或抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的剂例如单硬脂酸铝和明胶引起。

无菌的可注射溶液通过以下来制备：在适当的溶剂中掺入需要的量的治疗构建体与上文列举的多种其他成分(按需要)，然后过滤灭菌。

本公开内容还设想了组合疗法，其中剂，本公开内容的主题，与其他合适的剂共施用，这可以促进期望的治疗或预防结果。“共施用”意指经由相同或不同途径在相同制剂或两种不同的制剂中同时施用，或者通过相同或不同途径顺序施用。“顺序”施用意指两种类型的剂的施用之间从数秒、数分钟、数小时或数天的时间差异。施用可以是任何顺序。

在本说明书中对任何先前的出版物(或来源于其的信息)或对任何已知的物质的引用不是并且不应当被视为确认或承认或以任何形式暗示该先前的出版物(或来源于其的信息)或已知的物质形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。

本公开内容通过参考以下非限制性实施例来进一步描述。

实施例

实施例1：T-肽的合成

T-肽(TLTYTWS；SEQ ID NO:1)的若干形式由GL Biochem(上海)有限公司使用固相肽合成法来合成，如下文描述的。制备了T-肽-LPETG(SEQ ID NO:15)、T-肽-ACPP-炔(SEQID NO:3)和GGG-T-肽-ACPP-半胱氨酸(SEQ ID NO:4)的肽序列。这些形式允许使用分选酶方法(其需要LPETG序列；SEQ ID NO:5)、铜点击反应(使用炔基团)和硫醇点击(使用半胱氨酸官能SH基团)来测试位点特异性生物缀合方法并且评估在T-肽序列的N-末端处的另外的氨基酸是否将导致靶识别的空间位阻和/或前导苏氨酸残基的氨基基团在T-肽与其靶结合中是否是重要的。制备第三种肽形式(GGG-T-肽-ACPP-半胱氨酸)以评估在T-肽序列的N-末端处的另外的氨基酸是否将导致靶识别的空间位阻，而C-末端处的半胱氨酸允许硫醇点击生物缀合。在T-肽序列的N末端处加入氨基酸残基没有减少或消除T-肽与MMP2-预消化的胶原IV纤维的结合。

1.T-肽-LPETG的合成方法：

肽序列：

HTLTYTWSGGCLPETGGHHHHHH-OH(SEQ ID NO：6)

使用的材料

氨基酸：

Fmoc-His(trt)-OH

Fmoc-Pro-OH

Fmoc-Gly-OH

Fmoc-Leu-OH

Fmoc-Ser(tbu)-OH

Fmoc-Trp(Boc)-OH

Fmoc-Thr(tbu)-OH

Fmoc-Tyr(tbu)-OH

树脂：H-Cys-2Cl-Trt-Cl-树脂

偶联试剂和碱：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N-甲基吗啉(NMM)

溶剂：DMF、DCM、甲醇、哌啶

用于合成的其他试剂

Kaiser测试溶液：

A：80％苯酚+20％无水乙醇

B：蒸馏吡啶

C：5g茚三酮+100mL无水乙醇

Fmoc脱保护溶液：

在DMF中的20％哌啶

裂解溶液：

87.5％TFA+5％苯基甲基茴香硫醚+2.5％苯酚+2.5％EDT+2.5％H2O

用于合成肽的程序

a.制备树脂：允许经称重的H-Cys-2Cl-Trt-Cl-树脂在DCM中溶胀持续30min，并且然后在真空下干燥。

b.制备用于偶联反应的氨基酸和HBTU溶液：将3当量的氨基酸和2.85当量的HBTU溶解在DMF中。

c.偶联反应：将在DMF中的氨基酸和HBTU的溶液加入到树脂中，并且然后加入6当量的N-甲基吗啉(NMM)。将树脂使用N2流搅动持续30min。

d.洗涤：通过抽吸去除反应溶液，并通过DMF洗涤树脂(3×2min)。

e.Kaiser测试：在偶联反应后将少量树脂放置在试管中，加入Kaiser测试溶液(A、B和C)各2滴。在110℃加热树脂/溶液持续3min。如果溶液是浅色的并且树脂是澄清的，则偶联反应完成。

f.Fmoc脱保护：将树脂用脱保护溶液处理，同时用N2流搅动持续30min，然后用DMF洗涤(6×2min)，在真空下干燥。

g.重复步骤b至步骤f，直到最后的氨基酸被附接至肽。

h.最后洗涤树脂：在裂解前树脂需要大量洗涤，以去除来自反应的任何试剂。将树脂用甲醇(1×2min)，并且然后用DCM(3×2min)、甲醇(2×2min)洗涤，并且然后在裂解前在真空下干燥持续12h。

裂解肽以产生粗制肽

对于每1g树脂，它需要10ml的裂解溶液。将树脂和裂解溶液的混合物在25℃放置在振荡器上持续2h。将获得的裂解溶液过滤以去除树脂。向滤液(溶液)中加入6～8体积的二乙醚，同时搅拌以使粗制肽沉淀。离心醚混合物，并倾析(decant)上清液。将肽用二乙醚洗涤，并且然后再次离心混合物。将上清液丢弃。重复该洗涤程序总计5次，以给出作为白色粉末的粗制肽。将以上经洗涤的肽在真空下干燥持续24h。将粗制肽称重，并且然后通过高效液相色谱法(HPLC)纯化。T-肽-LPETG肽的质谱分析在图1中示出。

2.T-肽-ACPP-炔的合成方法：

肽序列：

TLTYTWSGLASPAAPAP-eeeeeeee-(Aop)-PLGC(Me)AG-rrrrrrrrr-GAASPApG(SEQ IDNO：7)

小写体表示D-氨基酸

Aop＝5-氨基-3-氧杂戊酰基

C(Me)＝(S-甲基)半胱氨酸

pG＝L-炔丙基甘氨酸

使用的材料

氨基酸：

Fmoc-Ala-OH

Fmoc-Pro-OH

Fmoc-Gly-OH

Fmoc-Cys(Me)-OH

Fmoc-Leu-OH

Fmoc-Aop-OH

Fmoc-Ser(tbu)-OH

Fmoc-Trp(Boc)-OH

Fmoc-Thr(tbu)-OH

Fmoc-Tyr(tbu)-OH

Fmoc-D-Arg(pbf)-OH

Fmoc-D-Glu(Otbu)-OH

树脂：H-Cys-2Cl-Trt-Cl-树脂

偶联试剂和碱：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N-甲基吗啉(NMM)

溶剂：DMF、DCM、甲醇、哌啶

用于合成的其他试剂

Kaiser测试溶液：

A：80％苯酚+20％无水乙醇

B：蒸馏吡啶

C：5g茚三酮+100mL无水乙醇

Fmoc脱保护溶液：

在DMF中的20％哌啶

裂解溶液：

87.5％TFA+5％苯基甲基茴香硫醚+2.5％苯酚+2.5％EDT+2.5％H2O

用于合成肽的程序：

a.制备树脂：允许经称重的H-Cys-2Cl-Trt-Cl-树脂在DCM中溶胀持续30min，并且然后在真空下干燥。

b.制备用于偶联反应的氨基酸和HBTU溶液：将3当量的氨基酸和2.85当量的HBTU溶解在DMF中。

c.偶联反应：将在DMF中的氨基酸和HBTU的溶液加入到树脂中，并且然后加入6当量的N-甲基吗啉(NMM)。将树脂使用N2流搅动持续30min。

d.洗涤：通过抽吸去除反应溶液，并通过DMF洗涤树脂(3×2min)。

e.Kaiser测试：在偶联反应后将少量树脂放置在试管中，加入Kaiser测试溶液(A、B和C)各2滴。在110℃加热树脂/溶液持续3min。如果溶液是浅色的并且树脂是澄清的，则偶联反应完成。

f.Fmoc脱保护：将树脂用脱保护溶液处理，同时用N2流搅动持续30min，然后用DMF洗涤(6×2min)，在真空下干燥。

g.重复步骤b至步骤f，直到最后的氨基酸被附接至肽。

h.最后洗涤树脂：在裂解前树脂需要大量洗涤，以去除来自反应的任何试剂。将树脂用甲醇(1×2min)，并且然后用DCM(3×2min)、甲醇(2×2min)洗涤，并且然后在裂解前在真空下干燥持续12h。

裂解肽以产生粗制肽

对于每1g树脂，它需要10ml的裂解溶液。将树脂和裂解溶液的混合物在25℃放置在振荡器上持续2h。将获得的裂解溶液过滤以去除树脂。向滤液(溶液)中加入6～8体积的二乙醚，同时搅拌以使粗制肽沉淀。离心醚混合物，并倾析上清液。将肽用二乙醚洗涤，并且然后再次离心混合物。将上清液丢弃。重复该洗涤程序总计5次，以给出作为白色粉末的粗制肽。将以上经洗涤的肽在真空下干燥持续24h。将粗制肽称重，并且然后通过高效液相色谱法(HPLC)纯化。T-肽-ACPP-炔肽的质谱分析在图2中示出。

3.GGG-T-肽-ACPP-半胱氨酸的合成：

肽序列：

GGGWWSSASPAATLTYTWSGLPAPASPA-eeeeeeee--(Aop)-PLGC(Me)AG-rrrrrrrrr-GAGAPAC(SEQ ID NO：8)

小写体表示D-氨基酸

AOP＝5-氨基-3-氧杂戊酰基

C(Me)＝(S-甲基)半胱氨酸

使用的材料

氨基酸：

Fmoc-Ala-OH

Fmoc-Pro-OH

Fmoc-Gly-OH

Fmoc-Cys(Me)-OH

Fmoc-Leu-OH

Fmoc-Aop-OH

Fmoc-Ser(tbu)-OH

Fmoc-Trp(Boc)-OH

Fmoc-Thr(tbu)-OH

Fmoc-Tyr(tbu)-OH

Fmoc-D-Arg(pbf)-OH

Fmoc-D-Glu(Otbu)-OH

树脂：H-Cys-2Cl-Trt-Cl-树脂

偶联试剂和碱：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N-甲基吗啉(NMM)

溶剂：DMF、DCM、甲醇、哌啶

用于合成的其他试剂：

Kaiser测试溶液：

A：80％苯酚+20％无水乙醇

B：蒸馏吡啶

C：5g茚三酮+100mL无水乙醇

Fmoc脱保护溶液：

在DMF中的20％哌啶

裂解溶液：

87.5％TFA+5％苯基甲基茴香硫醚+2.5％苯酚+2.5％EDT+2.5％H2O

用于合成肽的程序：

a.制备树脂：允许经称重的H-Cys-2Cl-Trt-Cl-树脂在DCM中溶胀持续30min，并且然后在真空下干燥。

b.制备用于偶联反应的氨基酸和HBTU溶液：将3当量的氨基酸和2.85当量的HBTU溶解在DMF中。

c.偶联反应：将在DMF中的氨基酸和HBTU的溶液加入到树脂中，并且然后加入6当量的N-甲基吗啉(NMM)。将树脂使用N2流搅动持续30min。

d.洗涤：通过抽吸去除反应溶液，并通过DMF洗涤树脂(3×2min)。

e.Kaiser测试：在偶联反应后将少量树脂放置在试管中，加入Kaiser测试溶液(A、B和C)各2滴。在110℃加热树脂/溶液持续3min。如果溶液是浅色的并且树脂是澄清的，则偶联反应完成。

f.Fmoc脱保护：将树脂用脱保护溶液处理，同时用N2流搅动持续30min，然后用DMF洗涤(6×2min)，在真空下干燥。

g.重复步骤b至步骤f，直到最后的氨基酸被附接至肽。

h.最后洗涤树脂：在裂解前树脂需要大量洗涤，以去除来自反应的任何试剂。将树脂用甲醇(1×2min)，并且然后用DCM(3×2min)、甲醇(2×2min)洗涤，并且然后在裂解前在真空下干燥持续12h。

裂解肽以产生粗制肽

对于每1g树脂，它需要10ml的裂解溶液。将树脂和裂解溶液的混合物在25℃放置在振荡器上持续2h。将获得的裂解溶液过滤以去除树脂。向滤液(溶液)中加入6～8体积的二乙醚，同时搅拌以使粗制肽沉淀。离心醚混合物，并倾析上清液。将肽用二乙醚洗涤，并且然后再次离心混合物。将上清液丢弃。重复该洗涤程序总计5次，以给出作为白色粉末的粗制肽。将以上经洗涤的肽在真空下干燥持续24h。将粗制肽称重，并且然后通过高效液相色谱法(HPLC)纯化。GGG-T-肽-ACPP-半胱氨酸肽的质谱分析在图3中示出。

使用固相肽合成法的一个优势是氨基酸测序的精确性。T-肽-LPETG可用于与荧光染料诸如GGG-GFP或GGG-NIR的分选酶缀合。

实施例2：T-肽-LPETG与荧光标记物的分选酶偶联

根据荧光成像评价T-肽的结合需要肽与荧光染料例如绿色荧光蛋白(GFP)缀合，以用于在488nm FITC通道中可视化，或与近红外(NIR)染料缀合，以用于800nm通道可视化。该偶联步骤还测试了使用分选酶反应在肽的C末端与肽进行位点特异性缀合的可行性。

1.T-肽-GFP的制备

该反应中使用的T-肽的序列是：

H-TLTYTWSGGGLPTGGHHHHHH-OH(SEQIDNO：9)

序列中的N-末端“H”表示游离胺，并且C末端“OH”表示游离酸。

使用3GGG:1LPETG:3分选酶的摩尔比进行反应，使用1553mg的分选酶A酶在分选酶反应缓冲液中使2422mg的GGG-GFP与70mg的T-肽-LPETG在37℃反应持续5小时。使用抗His-标签镍包被的珠以用于去除过量的分选酶和未结合的T-肽-LPETG(包含6His-标签序列)。然而，由于T-肽缀合的GFP和未结合的GGG-GFP之间的小的尺寸差异，清除过量的未结合的GGG-GFP是有难度的。

2.T-肽-NIR的制备

为了将近红外染料附接至T-肽，我们使用了加标签到近红外染料(L-半胱氨酸Dylight 800C5马来酰亚胺基)的小的商业合成的GGG肽。

GGG-NIR肽的序列是：

H-GGGWWSS-(L-半胱氨酸Dylight 800C5马来酰亚胺基)-OH(SEQ ID NO:10)。

序列中的N-末端“H”表示游离胺，并且C末端“OH”表示游离酸。

使用3GGG:1LPETG:3分选酶的摩尔比进行反应，使用7769mg的分选酶A酶在分选酶反应缓冲液中使796mg的GGGNIR与350mg的T-肽-LPETG在37℃反应持续5小时。使用抗His-标签镍包被的珠以用于去除过量的分选酶和未结合的T-肽-LPETG(包含his-标签序列)。然而，由于未结合的GGG-NIR(mw：1836道尔顿)和T-肽-LPETG(mw：2419道尔顿)之间的小的尺寸差异，清除过量的未结合的GGG-NIR是有难度的。

GFP与T-肽的缀合可用于测试T-肽与不稳定斑块的体内结合，因为仅2419道尔顿的小肽，当通过加入GFP增加另外的27,900道尔顿重量时，将具有更长的循环时间，因为它将不会被肾过滤快速清除。缀合2种相似尺寸的肽(T-肽和GGG-NIR)使得通过重量差异进行纯化相当有难度。

实施例3：T-肽-FITC缀合物与不稳定的小鼠斑块的离体结合

T-肽(TLTYTWS)-FITC(Alexa 488)的缀合物和对照肽(Con-肽)-FITC的缀合物是使用固相肽合成法商业合成的(GL Biochem,中国上海)，如上文描述的。合成的肽-FITC缀合物的浓度为1mg/ml。

T-肽-FITC缀合物：H-TLTYTWSGK-(FITC)-OH(SEQ ID NO:11)

对照肽是包含序列H-GLGYGWSGK(FITC)-OH(SEQ ID NO:12)的加扰非结合肽，其中T-肽序列的苏氨酸残基被甘氨酸残基替代。

创建不稳定斑块的TS小鼠模型：

在12周龄和开始高脂肪饮食后6周，ApoE-/-小鼠(C57BL/6J背景)通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物来麻醉。在颈部制造切口，并且通过解剖周围结缔组织暴露右侧颈总动脉。引入了具有150μm外径的串联狭窄，其中远侧狭窄被放置距离颈动脉分叉1mm并且近侧狭窄被放置距离远侧狭窄3mm。将6-0蓝色编织聚酯纤维缝合线绑缚在颈动脉和150μm针头周围，以实现150μm的狭窄直径，并且随后在缝合线被固定后取出针头。将切口伤口缝合闭合，并且小鼠恢复其高脂肪饮食。串联狭窄的存在产生了血液动力学模式，其与高脂肪饮食一起，在近侧狭窄之前，在颈动脉区域产生斑块，其不稳定性的组织学特征类似于人类不稳定斑块。

将载玻片上的串联狭窄小鼠颈动脉不稳定斑块和主动脉弓稳定斑块的冷冻的6mm组织切片在室温解冻持续30分钟。将T-肽-FITC缀合物和对照肽-FITC缀合物稀释至0.1mg/ml的浓度。将20ml的T-肽-FITC缀合物或对照肽-FITC缀合物加入到冷冻的不稳定的颈动脉斑块切片和稳定的主动脉弓切片，并且将载玻片在室温在含有湿纸巾的加盖加湿盒中孵育持续60分钟。当孵育完成时，将载玻片在PBS中洗涤3次，以清除可能与组织切片非特异性结合的任何过量缀合物。然后通过荧光显微术(IX81Olympus显微镜)在FITC488nm通道中检查载玻片。

如图4A中示出的，T-肽-FITC缀合物结合至小鼠颈动脉中的不稳定斑块，如通过腔内的强荧光信号所证明的。不稳定斑块是大的并且几乎完全阻塞了血管腔。相比之下，对照肽-FITC缀合物未示出与同一不稳定斑块的串联切片的显著结合，尽管沿弹性层存在自体荧光的迹象(图4B)。类似地，在小鼠颈动脉内稳定斑块的血管腔内不存在荧光信号，表明T-肽与稳定的主动脉弓斑块不存在结合(图4C)。

这些数据证明，T-肽与不稳定的动脉粥样硬化斑块特异性结合。

实施例4：T-肽-FITC与不稳定的小鼠斑块的体内结合

进行该实验以证明当经由静脉内剂量施用至串联狭窄小鼠时，T-肽是否能够进入并与不稳定的动脉粥样硬化斑块在体内特异性结合。

方法：

T-肽-FITC(Alexa 488)及其对照加扰肽，对照肽-FITC，是使用固相肽合成法商业合成的(GL Biochem.中国上海)，如本文别处描述的。合成肽的浓度均为1mg/ml。

T-肽-FITC序列：H-TLTYTWSGK-(FITC)-OH(SEQ ID NO:11)

对照肽-FITC序列：H-GLGYGWSGK-(FITC)-OH(SEQ ID NO:12)

具有25g平均重量的每只小鼠将接受1:2稀释的100mg的T-肽-FITC或100mg的对照肽-FITC，以给出0.5mg/ml的浓度，这测算为每g体重4mg肽。100ml的稀释的肽将作为团注物(bolus)被给予到左侧颈外静脉，并且剩余的100ml通过使用输注泵以每分钟5ml的速率输注，所述输注泵连接到插入左侧颈外静脉的塑料导管。进行团注剂量、随后输注的方法是优化血液水平和循环肽的持续时间，以增强肽的斑块进入和血管组织保留，因为小分子量的肽处于通过肾脏被快速清除的风险中。

在12周龄，在开始高脂肪饮食(21％脂肪、0.15％胆固醇，Specialty Feeds PtyLtd,Glen Forrest，Western Australia)后6周，根据Chen等人(2013；Circ Res.113(3):252-65)的论文中使用的方法，ApoE-/-小鼠(C57/Black6背景)被给予串联狭窄至其右侧颈总动脉。在适当位置提供串联狭窄7周后，施用T-肽-FITC。

通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)混合物来麻醉小鼠。在颈部制造切口，并且解剖结缔组织以暴露右侧颈总动脉以及左侧颈外静脉。将连接到塑料导管的23-G皮下针头插入到左侧颈外静脉，以施用静脉内肽。暴露的颈部结构用湿纱布保持湿润。在施用结束时，将小鼠保持麻醉持续另外的30分钟，随后将右侧颈总动脉区段1(不稳定斑块)和主动脉弓区段5(稳定斑块)解剖出来并包埋在OCT低温基质(cryomatrix)中用于冷冻。使用Leica低温恒温器(CM 1950,Leica Biosystems Nussloch)对冷冻斑块组织进行6mm厚度的低温切片，并封固在载玻片上。允许载玻片在室温干燥持续30分钟，然后储存在-80℃冰箱中。

将冷冻的切片载玻片在室温解冻持续30分钟，然后在荧光显微镜(IX81Olympus显微镜)下在FITC488nm通道中检查。

结果

如图5A中示出的，在将T-肽-FITC缀合物静脉内施用至小鼠后，T-肽-FITC缀合物与不稳定斑块存在强结合。尽管存在来自内弹性层(IEL)、中间弹性层(MEL)和外弹性层(EEL)的自体荧光的证据，但不存在在静脉内施用后对照肽-FITC缀合物与不稳定斑块结合的证据(图5B)。类似地，在静脉内施用后，T-肽-FITC缀合物与稳定的主动脉弓斑块不存在结合(图5C)。

这些数据示出，T-肽-FITC缀合物能够在体内渗透不稳定的动脉粥样硬化斑块并与之特异性结合，而在区段5主动脉弓中存在的稳定斑块中不存在明显的结合。由于构成弹性层的各种弹性蛋白纤维的存在，小鼠动脉中动脉壁的弹性层示出自体荧光。

实施例5：T-肽-FITC与MMP2消化的胶原IV的体外结合

方法

T-肽-FITC(Alexa 488)缀合物和对照肽-FITC缀合物、以及未标记的T-肽-LPETG肽是使用固相肽合成法商业合成的(GL Biochem.中国上海)，如本文别处描述的。合成肽的浓度均为1mg/ml。

T-肽-FITC序列：H-TLTYTWSGK-(FITC)-OH(SEQ ID NO:11)

对照肽-FITC序列：H-GLGYGWSGK-(FITC)-OH(SEQ ID NO:12)

与MMP2消化的胶原IV的结合

将胶原IV应用于包被有聚赖氨酸的载玻片。

1.制备在0.15M硼酸盐缓冲液(pH 8.3)中的0.1mg/ml的聚赖氨酸(MW为30,000-70,000)，并用0.22mm孔径的膜注射器式过滤器(Syringe Filter,Millipore)过滤。

2.将胶原IV(来自人成纤维细胞培养物的胶原IV型，Sigma Aldrich)用Hank平衡盐溶液(HBSS)1:10稀释至0.04mg/ml。

3.对于MMP2消化，活性重组人MMP2酶(在CHO细胞中表达)购自Calbiochem。根据制造商的建议，将MMP2储备溶液用PBS稀释以产生0.01μg/μl MMP2浓度。

4.对于使用加入的MMP2的T-肽-FITC测试，将20μl聚赖氨酸点制到若干载玻片上，并在室温留置过夜至干燥。这形成了用于胶原随后粘附的包被基底。

5.为了用MMP2预消化一些胶原IV，将3μl的(0.1mg/ml)MMP2与35.8μl的稀释的胶原IV溶液和1.2μl的100mM CaCl₂(3mM钙最终浓度)在Eppendorf管中混合，并在Eppendorf温控混匀器中在37℃以600rpm振荡孵育持续2小时。

6.为了产生完整的胶原IV包被的载玻片，将20ml的稀释的胶原IV溶液滴到载玻片上干燥的聚赖氨酸点上。

7.为了产生MMP2预消化的胶原IV包被的载玻片，将20ml的MMP2预消化的胶原IV滴到载玻片上干燥的聚赖氨酸点上。

8.在测试前，将含有胶原IV的载玻片在未覆盖的情况下干燥过夜。

9.第二天，将10ml的T-肽-FITC(0.1mg/ml)加入到MMP2预消化的胶原点，将10ml的T-肽-FITC(0.1mg/ml)加入到完整的胶原载玻片，并将10ml的对照肽-FITC(0.1mg/ml)加入到MMP2预消化的胶原载玻片，并且将载玻片在室温在具有湿纸巾的加盖加湿盒中孵育持续60分钟。

10.对于“阻断的表位”载玻片，将10ml的未标记的T-肽-LPETG(0.1mg/ml)加入到MMP2预消化的胶原载玻片，并且类似地孵育持续60分钟。该步骤结合胶原IV上存在的表位，并防止与FITC标记的T-肽进一步结合。接下来，将10ml的T-肽-FITC(0.1mg/ml)加入到相同的区域，并孵育持续60分钟。

11.在荧光显微术(IX81Olympus显微镜)下检查所有被处理的载玻片。

结果

当MMP2-预消化的胶原IV包被的载玻片与T-肽-FITC缀合物一起孵育时，存在强FITC信号，指示T-肽与MMP2-预消化的胶原IV的结合(图6A)。相比之下，当将T-肽-FITC缀合物加入到未消化的胶原IV包被的载玻片时，不存在FITC信号，指示T-肽与完整的胶原IV纤维不结合(图6B)。类似地，当将对照肽-FITC缀合物加入到MMP2-预消化的胶原IV包被的载玻片时，不存在FITC信号，指示对照肽与MMP2-预消化的胶原IV不结合(图6C)。当将T-肽-FITC缀合物加入到已经与未标记的T-肽预先孵育的MMP2-预消化的胶原IV包被的载玻片时，不存在显著的FITC信号。这表明，未标记的T-肽结合至胶原IV纤维的通过MMP2-预消化暴露的靶表位，并且随后阻断通过T-肽-FITC缀合物的结合。

该研究证明，T-肽与MMP2消化的胶原IV特异性结合，而不与完整的胶原IV特异性结合。

实施例6：T-肽-GFP在人斑块上的离体结合

绿色荧光蛋白(GFP)是一种非亲脂性的水溶性染料。与高度亲脂性的且在离体实验期间与斑块组织上的脂肪组织非特异性结合的近红外染料(L-半胱氨酸Dylight 800C5马来酰亚胺基)不同，T-肽-GFP可能更适合于离体斑块测试。

方法：

使用1553mg的分选酶将70mg的T-肽-LPETG(SEQ ID NO:15)与2422mg的GGG-GFP缀合，其中分选酶反应摩尔比为3GGG-GFP:1T-肽-LPETG:3分选酶。用抗His-标签镍包被的珠清洁反应混合物，以去除未结合的T-肽-LPETG和过量的分选酶，并用PBS制成500ml体积。然而，过量的GGG-GFP不能被去除，并且当处理离体斑块样本以去除非特异性背景荧光时，将需要仔细的洗涤步骤以清除过量的GFP。未反应的GGG-GFP用作非结合对照。假定缀合收率为50％，分选酶和未结合的T-肽-LPETG的his-标签清洁(clean up)收率为100％，则反应混合物将含有35mg的与GFP缀合的T-肽，以及1614mg的未结合的GGG-GFP。

将载玻片上的人颈动脉内膜切除术斑块的冷冻的6mm切片在室温解冻持续30分钟。将50ml的T-肽-GFP混合物(含有3.5ml的具有GFP标签的T-肽和161.4ml的未结合的GFP)加入到冷冻切片，并在室温孵育持续60分钟。对于对照，将161.4mg的GGG-GFP在PBS中混合至50ml的体积，并且将其加入到“对照”冷冻的人颈动脉斑块切片，并类似地孵育持续60分钟。在孵育后，将载玻片在PBS中洗涤3次，以清除过量的构建体和过量的未结合的GGG-GFP。然后通过荧光显微术(IX81Olympus显微镜)在FITC488nm通道中检查载玻片。

结果：

如图7A中示出的，T-肽-GFP缀合物结合至人颈动脉粥样硬化斑块的部分，而不存在对照肽GGG-GFP缀合物在斑块上结合的证据(图7B)。

该离体实验证明了MMP2消化的胶原IV在具有T-肽的隐蔽结合表位的人颈动脉斑块上的存在。

实施例7：T-肽-FITC与MMP2-预消化的肾脏切片的离体结合

进行该实验以确定T-肽与小鼠肾脏中MMP2-预消化的胶原IV的特异性结合，小鼠肾脏包含一定丰度的胶原IV，特别地在肾小球内。

方法：

该研究利用分选酶缀合的T-肽-GFP作为标记的T-肽，用于在肾脏切片上的胶原结合。所使用的对照是未反应的GGG-GFP。使用3GGG:1LPETG:3分选酶的摩尔比进行反应，使用1553μg的分选酶A酶在分选酶反应缓冲液中使2422μg的GGG-GFP与70μg的T-肽-LPETG在37℃反应持续5小时。使用抗His-标签镍包被的珠以用于去除过量的分选酶和未结合的T-肽-LPETG(包含6His-标签序列)。然而，由于T-肽缀合的GFP和未结合的GGG-GFP之间的小的尺寸差异，清除过量的未结合的GGG-GFP是有难度的。假定缀合收率为50％，分选酶和未结合的T-肽-LPETG的his-标签清洁收率为100％，则反应混合物将含有35μg的与GFP缀合的T-肽和1614μg的未结合的GGG-GFP。

将载玻片上的正常C57/Black6小鼠肾脏冷冻切片(6μm)在室温解冻持续30分钟。为了实现肾小球基底的外源MMP2消化，我们使用购自Calbiochem的活性重组人MMP2酶(在CHO细胞中表达)。根据制造商的建议，将MMP2储备溶液用PBS稀释以产生0.01μg/μl MMP2浓度。将4μl的MMP2加入到每个冷冻的肾脏载玻片，并且将载玻片放置在具有湿纸巾的加盖盒中，以在孵育期间保持环境湿润并防止载玻片干燥。将这些载玻片在37℃烘箱中孵育持续2小时。所使用的最佳MMP2量为4μl，因为这减少了洗涤步骤后肾组织的变位(dislodgement)。

然后将“预消化的”肾脏切片用20μl的T-肽-GFP混合物(含有1.4μg的具有GFP标签的T-肽和64.5μg的未结合的GFP)或被制成20μl体积的作为对照的在PBS中的64.5μg的GGG-GFP处理。将载玻片在室温孵育持续60分钟。将载玻片用PBS冲洗3次，以洗去过量的或非特异性粘附的构建体或GFP。然后根据荧光显微术(IX81Olympus显微镜)在FITC通道中检查载玻片。

MMP2-预消化的肾皮质组织切片示出广泛的FITC信号，指示T-肽-GFP与肾组织的结合。相比之下，当与对照GGG-GFP一起孵育时，MMP2-预消化的肾皮质组织切片未示出FITC信号。当与T-肽-GFP一起孵育时，未消化的肾皮质组织切片示出少量的FITC信号，这表明T肽与肾组织存在某种结合。类似地，当与对照GGG-GFP一起孵育时，未消化的肾皮质组织切片未示出FITC信号。

结果证明T-肽与MMP2-预消化的肾皮质的特异性结合。肾脏组织确实包含一些内源MMP2，这解释了为什么未处理的肾脏切片在与T-肽-GFP一起孵育时示出少量的FITC信号。

实施例8：T-肽-NIR在人颈动脉切片上的离体结合

进行该实验以评估T-肽与可能存在于人颈动脉斑块中的胶原表位结合的能力。

方法：

使用分选酶反应，将796μg的GGG-NIR(NIR是L-半胱氨酸Dyligh t800C5马来酰亚胺基)与350μg的T-肽-LPETG混合，并用7769μg的分选酶在具有分选酶反应缓冲液的1000μL反应体积中在37℃催化持续5小时。用抗His-标签包被的镍珠的His标签清洁去除了过量的分选酶和未结合的T-肽。因为T-肽-NIR和GGG-NIR之间小于2千道尔顿的小的尺寸差异，从反应混合物分离出未结合的GGG-NIR在技术上具有挑战性，因此将His-标签用于清洁反应混合物而无透析。假定反应缀合率为50％，并且His-标签清洁去除了50％的T-肽(未缀合的)和100％的分选酶，并在反应混合物中留下50％的未结合的GGG-NIR。基于该假定，将一定量的反应混合物分配用于实验，其中适当量的未反应的GGG-NIR和未反应的T-肽用于对照测试。在1/3的GGG-NIR与T-肽偶联后，假定的浓度为0.175μg/μl的T-肽-NIR和0.264μg/μl的未结合的GGG-NIR，因为对于反应混合物，摩尔比为1LPETG:3GGG以便优化缀合率，但实际的缀合是1LPETG偶联1GGG。

将人颈动脉内膜切除术冷冻样本解冻持续30分钟至室温，并放置在载玻片上。将6μl的反应混合物(含有1.05μg的T-肽-NIR和1.584μg的未结合的GGG-NIR)用24μl PBS进一步稀释，以制成30μl体积。将其加入到动脉内膜切除术样本中，并在室温在黑暗中孵育持续60分钟。对于阴性对照，将1.05μg的未反应的T-肽-LPETG和1.584μg的未反应的GGG-NIR与PBS混合至30μl的最终体积，并且加入到来自同一样本的另一个动脉内膜切除术切片中并在黑暗中孵育持续60分钟。

在孵育后，将PBS用于彻底洗涤样本4次，以去除任何未结合的过量GGG-NIR染料。

实验9：开发一种用于静脉内使用的负载有特定的MMP14抑制剂药物的肽缀合的纳米海绵，所述纳米海绵对不稳定斑块具有特异性归巢能力。

设计的构建体是一种“智能”纳米载体，其整合了3种功能成分，以便实现斑块靶向特异性、环境触发的有效负载进入斑块细胞以及持续药物释放机制。T-肽用作归巢(靶向)剂，以结合MMP消化的胶原IV。该方法赋予向具有被MMP2活性减弱的胶原IV的斑块区域中的特异性归巢，如通过本文别处描述的数据所示。

材料和方法

所有实验室试剂、化学品、抗体和溶剂购自Bio-Rad(Hercules,CA,USA)、EMDMillipore Cooperation(Billerica,MA,USA)、Fisher Chemicals(New Jersey,NJ,USA)、R&D Systems(Minneapolis,MN,USA)、Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)、Merck(New Jersey,NJ,USA)、Pierce(Rockford,IL,USA)和Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，并根据制造商的说明使用。实验室消耗品来自以下商业来源：Eppendorf(Westbury,NY,USA)和BDBioscience(Bedford,MA,USA)。缓冲液和溶液根据标准方案来制备。

MMP14FRET肽的Cy 3.5信号的检测使用FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH 96微孔板荧光读取器进行，该读取器对于以下被标准化：激发544nm和发射590nm的光学设置，在37℃的温度设置，在120分钟的持续时间内每10分钟进行一次读取，并且在每个循环前以4mm 1秒的宽度进行双轨道振荡。所有共焦活细胞研究使用具有活细胞成像室(由Monash Microimaging设计)的Nikon A1r+倒置显微镜(Tokyo,Japan)进行。组织切片使用Leica CM1950低温恒温器(Leica Microsystems,Germany)通过低温切片冷冻组织获得。

1.醛接头与聚酯纳米颗粒的附接

将配备有搅拌棒和隔膜的1打兰小瓶进行火焰干燥并用氮气净化。将聚酯纳米颗粒(4.6％AVL，4.9％EVL，80.0mg，5.33×10^-7mol，1.0当量)加入到小瓶中，并且将小瓶用氮气再次净化。经由注射器通过隔膜加入最少量的二甲基亚砜来溶解颗粒。在DMSO中制备N-琥珀酰亚胺基-对甲酰苯甲酸酯的储备溶液，并且经由注射器通过隔膜加入接头(4.0mg，1.60×10^-5mol，30.0当量)。然后允许反应在室温搅拌过夜。使用Snakeskin管道(10K MWCO)通过针对二氯甲烷的透析持续24小时来纯化产生的混合物。1H NMR(400MHz,d-DMSO)δ:0.92(6H,d,CH3),1.47-1.78(8H,m,CH2),1.86(1H,m,CH),2.14-2.52(5H,m,CH2,CH),3.50-3.65(14H,m,CH2),4.08(4H,m,CH2),5.04(2H,m,CH2)5.73(1H,m,CH),7.90-8.10(4H,m,CH),10.06(1H,s,CH)(参见图9)。

2.T-肽与聚酯纳米颗粒的附接

将配备有搅拌棒和隔膜的1打兰小瓶进行火焰干燥并用氮气净化。将聚酯纳米颗粒(4.6％AVL，4.9％EVL，50.0mg，3.33×10^-7mol，1.0当量)和T-肽(TLTYTWS；SEQ ID NO:1；21.2mg，3.33x 10^-6mol，0.15当量/烯丙基)加入到小瓶中，并且将小瓶用氮气再次净化。通过隔膜加入d-DMSO来溶解颗粒和肽。在d-DMSO中制备2.2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的储备溶液，并且经由注射器将光引发剂(1.12mg，4.37x 10^-6mol，0.2当量/烯丙基)加入到反应混合物中。将反应小瓶放置在长波UV光下，并允许在室温搅拌过夜。肽的附接百分比使用在粗NMR谱中观察到的在5.04ppm和5.73ppm处的烯丙基峰的减少来计算(参见图10)。

3.Cy3酰肼染料与聚酯纳米颗粒的附接

向配备有搅拌棒的1打兰小瓶中加入先前用N-琥珀酰亚胺基-对甲酰苯甲酸酯醛接头官能化的聚酯纳米颗粒(50.0mg，3.33×10^-7mol，1.0当量)。未用T-肽官能化的颗粒作为干粉加入，而用T-肽官能化的颗粒从NMR管转移回到原始的反应小瓶中。在DMSO中制备Cy3单酰肼的储备溶液，并且经由注射器将染料(1.58mg，2.90×10^-6mol，8.7当量)加入到反应小瓶中。允许反应在室温在光的不存在下搅拌过夜。使用Snakeskin管道(10K MWCO)通过针对乙腈和甲醇的50:50v/v混合物透析持续48小时来纯化产生的混合物。染料的成功附接通过不存在10.06ppm处的醛峰来验证(参见图11)。

4.用萘并荧光素负载聚酯纳米颗粒

向Eppendorf管中加入先前均被溶解在DMSO中的D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(0.0125mg，0.59μL)、萘并荧光素(0.17375mg，2.60μL)和完全官能化的聚酯纳米颗粒(1.06375mg，31.9μL)。将溶液充分混合，直到获得均匀的混合物。将细胞培养水(1.00mL)加入到管中，并且将产生的溶液充分混合。将产生的溶液冷冻，并且然后冻干以获得药物负载的颗粒。

5.用靶向构建体处理的活细胞的共焦成像

使HT1080鼠纤维肉瘤细胞和RAW鼠巨噬细胞在具有用10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(NEAA)和1％青霉素/链霉素混合物强化的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)的1.5号(0.17+/-0.01mm)Menzel-Glaser盖玻片上生长。将细胞与通过Cy3染料产生荧光的靶向纳米海绵一起孵育，并在37℃在5％CO₂的情况下用萘并荧光素药物负载过夜。第二天，在共焦成像前，将细胞用细胞示踪剂绿(Cell Tracker Green)(Invitrogen)复染持续30分钟。将细胞盖玻片封固在包含500μl DMEM的共焦显微镜孔中，用于活细胞成像。为了定位RAW鼠巨噬细胞内溶酶体的存在，我们在共焦成像前5分钟加入了溶酶体示踪剂蓝(Lysotracker Blue)(Invitrogen)。为了确定纳米颗粒的定位和移动，使用配备有60倍水浸物镜(Nikon 60x Plan Apo VC,WI NA 1.2)的Nikon A1r+共焦显微镜(Tokyo,Japan)收集荧光和透射光图像。图像是用405、488和568激光器顺序收集的，以最小化渗出。

6.用与FITC缀合的T-肽对小鼠进行体内测试

通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物来麻醉小鼠。将50μl的FITC标记的胶原归巢肽的团注剂量给予至测试小鼠的尾静脉，随后立即在20分钟内以每分钟2.5μl连续输注FITC肽，并且以相同的方式向对照小鼠给予相似剂量的FITC标记的加扰对照肽。该连续输注的方式是为了确保肽-FITC缀合物的足够的循环时间，该肽-FITC缀合物具有小于10kDa的低分子量并且因此可能被肾脏快速清除。在20分钟输注结束时，将小鼠杀死。在下腔静脉中制造切口后，每只小鼠通过心脏穿刺用注射器灌注PBS，以净化(purge)来自循环的所有血液。将右侧颈动脉解剖出来并包埋在冷冻组织基质(OCT)中，在-80℃冷冻，并进行低温切片(Leica低温恒温器)为6μm厚的组织切片，封固在载玻片上。根据荧光显微术读取载玻片，并且用IX81Olympus显微镜在FITC通道中以20倍拍摄图像。

7.具有Cy3的胶原肽靶向的纳米海绵的进入的体内测试

通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物来麻醉小鼠。将2.5mg团注剂量的靶向纳米海绵用Cy3标记。由于纳米海绵的尺寸为150kDa，其高于50kDa的肾过滤阈值，因此它可以以单次团注剂量给予至尾静脉，并将保持在循环中持续至少若干小时。将Cy3标记的非靶向纳米海绵对照以相同的方式给予对照小鼠。在注射后1小时将小鼠杀死。在下腔静脉中制造切口后，每只小鼠通过心脏穿刺用注射器灌注PBS，以净化来自循环的所有血液。将右侧颈动脉解剖出来并包埋在冷冻组织基质(OCT)中，在-80℃冷冻，并进行低温切片(Leica低温恒温器)为6μm厚的组织切片，封固在载玻片上。根据荧光显微术读取载玻片，并且用IX81Olympus显微镜在TRITC/Cy3通道中以20倍拍摄图像。

8.用萘并荧光素处理的细胞中的MMP14活性的测定

将优选被MMP14裂解的肽序列用于产生具有N末端Cy3.5和C末端BHQ(Black HoleQuencher)的FRET探针：Cy3.5SGRIGFLRTACBHQ2(SEQ ID NO:13)。MMP14活性的存在裂解了该肽，并将Cy3.5与BHQ分离。将HT1080鼠纤维肉瘤细胞(MMP的天然生产者)在含有用10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(NEAA)和1％青霉素/链霉素混合物和20μM的萘并荧光素强化的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)的烧瓶中生长持续1周。对照细胞类似地生长，但没有萘并荧光素。在1周后，在不使用胰蛋白酶的情况下，通过使用细胞刮取器将细胞从烧瓶中取出。这是为了防止广谱蛋白酶胰蛋白酶不加区分地消化MMP14FRET肽。将细胞以4000rcf离心持续5分钟，将细胞沉淀物重悬于含有钙和镁的PBS中，并使用血细胞计数器计数。将约50,000个细胞接种到96孔微孔板中的每个测试孔中。对照孔含有PBS，其中加入了各种酶：活性MMP2酶、活性MMP14、凝血酶。将96孔微孔板在FluorSTAROptima荧光微孔板读取器中在37℃孵育持续2小时，同时每10分钟获取(Ex544，Em590)通道中的Cy3.5信号读数。Cy3.5信号从时间零时至时间120分钟的增加被视为FRET探针上MMP14活性的量子增加。在Prism软件中将读数绘制为条形图。

9.用靶向药物构建体体内治疗小鼠

创建不稳定斑块的TS小鼠模型：

如本文别处描述的，在12周龄和开始高脂肪饮食后6周，ApoE-/-小鼠(C57BL/6J背景)通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物来麻醉。在颈部制造切口，并且通过解剖周围结缔组织暴露右侧颈总动脉。引入了具有150μm外径的串联狭窄，其中远侧狭窄被放置距离颈动脉分叉1mm并且近侧狭窄被放置距离远侧狭窄3mm。将6-0蓝色编织聚酯纤维缝合线绑缚在颈动脉和150μm针头周围，以实现150μm的狭窄直径，并且随后在缝合线被固定后取出针头。将切口伤口缝合闭合，并且小鼠恢复其高脂肪饮食。串联狭窄的存在产生了血液动力学模式，其与高脂肪饮食一起，在近侧狭窄之前，在颈动脉区域产生斑块，其不稳定性的组织学特征类似于人类不稳定斑块。

测试靶向药物负载的纳米海绵对TS小鼠的体内效应：

在串联狭窄手术后5周(在放置串联狭窄后5周)，用靶向药物构建体和一系列对照治疗动物，所述一系列对照包括：对照PBS、游离药物和无药物负载的纳米海绵。间隔2周，经由尾静脉施用2次治疗团注注射物。剂量如下：

表1：

在第二个剂量的治疗后2周，将小鼠杀死。在下腔静脉中制造切口后，每只小鼠通过心脏穿刺用注射器灌注PBS，以净化来自循环的所有血液。将右侧颈动脉解剖出来并包埋在冷冻组织基质(OCT)中，在-80℃冷冻，并且进行低温切片(Leica低温恒温器)为6μm厚的组织切片，封固在载玻片上。

10.小鼠斑块的马松三色(Masson’s trichrome)染色

将冷冻的载玻片解冻至室温，并且然后在Bouin溶液中固定过夜，并用Weighert溶液处理持续5分钟，在自来水下洗涤，并且然后在Biebrich Scarlet-酸性品红中染色持续15分钟，并然后洗涤。施加磷钼酸水合物(3％)和磷钨酸(3％)的水性溶液持续15分钟，然后施加苯胺蓝和乙酸。将染色的载玻片在无水乙醇中脱水，并在二甲苯中透明，随后盖玻片封固在DePex(MERCK,Germany)中。马松三色载玻片的图像使用FSX 100Olympus显微镜系统(Olympus,Hamburg,Germany)获取。

11.小鼠斑块的苏木精和曙红(H&E)染色

将冷冻的载玻片解冻至室温，并且然后用丙酮在-20℃固定持续20min，并用PBS洗涤两次持续5分钟。将它们在Mayer苏木精(Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)中孵育持续6分钟，并且用蒸馏水洗涤。之后，放入Scott自来水中持续30秒，并用蒸馏水洗涤。然后将切片在曙红中孵育持续6分钟，用无水乙醇脱水3次，每次持续5分钟，随后用二甲苯(Recochem^TM,Quebec,Canada)处理两次，每次持续5分钟。最后，使用DePex(MERCK,Germany)将切片与盖玻片封固在一起。H&E载玻片的图像使用FSX 100Olympus显微镜系统(Olympus,Hamburg,Germany)获取。

12.小鼠斑块的天狼猩红染色

将冷冻的载玻片解冻至室温，并浸没在天狼猩红(在饱和的水性苦味酸溶液500ml中的天狼猩红0.5g)溶液中持续1小时。将载玻片放置在0.01M HCl溶液中持续2分钟，并在自来水下冲洗。用无水乙醇脱水，并用二甲苯透明。最后，使用DePex(MERCK,Germany)将切片与盖玻片封固在一起。天狼猩红染色的载玻片的图像使用Olympus IX81显微镜系统(Olympus,Hamburg,Germany)通过偏振光获取。当通过交叉偏振透镜检查时，双折射对胶原是高度特异的——较大的胶原纤维是亮黄色或橙色，而较薄的胶原纤维，包括网状纤维，是绿色的。

13.使用偏振光显微术测量小鼠斑块的胶原含量

天狼猩红载玻片的胶原定量使用Image J软件(National Institute of HealthUSA)进行。对于每只小鼠，以30μm间隔获取的颈动脉的3个切片用来更好地代表整个斑块长度上的胶原分布。对于每个切片，斑块胶原的量表示为斑块内胶原的百分比：

然后对3个切片的胶原百分比求平均值。

14.统计学分析

所有定量数据由PRISM 6(GraphPad Software Inc.)分析，并报告为平均值+/-一个标准偏差。使用ANOVA、随后Tukey多重比较检验来进行统计学分析；认为p<0.05是统计学显著的。用Welch校正的非配对t检验也用于分析小鼠体内治疗实验的胶原定量数据。

结果：

将胶原归巢T-肽连接至被MMP2特异性裂解的可激活的细胞穿透肽(ACPP)。ACPP包含通过U形肽接头(5-氨基-3-氧杂戊酰基柔性亲水接头)被保持在一起的与8个D-谷氨酸的聚阴离子序列形成拉链的9个D-精氨酸的聚阳离子序列，该U形肽接头包含优选被MMP2裂解的PLGC(Me)AG(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。当ACPP在其肽接头处被裂解时，由于其净阳性，它释放D-氨基精氨酸重复的聚阳离子链以穿透细胞膜。附接至该聚阳离子臂的任何有效负载被带入细胞中。运载药物的聚合物纳米海绵通过硫醇烯点击反应被附接至ACPP的聚阳离子臂(图8)。当聚合物随水解而分解时，实现了随时间的缓慢药物释放的机制。与其他MMP不同，MMP14激活是细胞内过程，其需要弗林蛋白酶激活。尝试备用(spare)的不相关的MMP，选择萘并荧光素(一种抑制弗林蛋白酶的近红外荧光团)作为特异性抑制MMP14激活的药物。

通过使用金属催化剂Sn(OTf)₂聚合方法(Passarella等人,Cancer Res2010,70,4550)首先由聚酯前体生成直链聚合物来制备纳米海绵。为了掺入醛接头，将聚酯纳米颗粒加入到配备有搅拌棒和隔膜的1打兰小瓶中，然后用氮气净化。经由注射器通过隔膜加入最少量的二甲基亚砜来溶解颗粒。在DMSO中制备N-琥珀酰亚胺基-对甲酰苯甲酸酯的储备溶液，并且经由注射器通过小瓶隔膜加入接头。然后允许反应在室温搅拌过夜。使用Snakeskin管道(10K MWCO)通过针对二氯甲烷的持续24小时的透析来纯化产生的混合物。使用动态光散射表征纳米海绵的尺寸为约100nm，并且使用静态光散射估计纳米海绵的分子量为150kD。七个氨基酸的胶原结合肽和ACPP通过固相肽合成法来合成，并且使用高效液相色谱法(HPLC)纯化。

通过加入d-DMSO来溶解T-肽、ACPP和纳米颗粒。在d-DMSO中制备2.2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的储备溶液，并且经由注射器将光引发剂加入到反应混合物中。将反应小瓶放置在长波UV光下，并允许在室温搅拌过夜。肽的附接百分比使用在粗NMR谱中观察到的在5.04ppm和5.73ppm处的烯丙基峰的减少来计算。接下来，先前用N-琥珀酰亚胺基-对甲酰苯甲酸酯醛接头官能化的聚酯纳米海绵与在DMSO中制备的Cy3单酰肼的储备溶液在室温在光的不存在下反应过夜。使用Snakeskin管道(10K MWCO)通过针对乙腈和甲醇的50:50v/v混合物的持续48小时的透析来纯化产生的混合物。作为最后的步骤，疏水性小分子药物萘并荧光素通过包埋到聚酯纳米海绵中来负载，该聚酯纳米海绵用肽ACPP和Cy3染料完全官能化。向Eppendorf管中加入先前均被溶解在DMSO中的D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、萘并荧光素和完全官能化的聚酯纳米颗粒。将溶液充分混合，直到获得均匀的混合物。将无菌MilliQ水加入到管中，并且将产生的溶液充分混合。

如图12中示出的，使用特异性杂交内化探针(SHIP)技术(Liu等人,Angew ChemInt Ed Engl 2013,52,5744–5748)证明了在活性MMP2的存在下ACPP的有效细胞穿透。产生具有C-末端炔官能附件(handle)的ACPP变体，用于点击化学。SHIP技术使用两个20聚体ssDNA序列，具有5’荧光团(Cy5)的荧光探针(FIP)和使用铜点击化学“点击”到ACPP上的3’叠氮化物。将FIP官能化的ACPP与非吞噬性隐静脉内皮细胞(SVEC)一起孵育过夜。然后将包含具有3’Black Hole Quencher 2(BHQ2)的互补ssDNA序列的猝灭剂探针(QPC)加入到细胞培养物中，并且在4℃孵育持续30分钟以与任何细胞外FIP杂交；使其荧光猝灭，同时由于QPC不能接近内化材料，内化的FIP的荧光被维持。4℃孵育防止QPC的活性细胞摄取。

随后，组装胶原归巢T-肽、ACPP和负载有Cy3荧光团的纳米海绵。使用鼠纤维肉瘤HT1080细胞系，研究了构建体的细胞摄取。HT1080细胞天然产生MMP，包括MMP2。将这些细胞与T-肽-ACPP-纳米海绵构建体在37℃一起孵育过夜。第二天，将细胞的细胞质染成绿色，并且通过共焦活细胞显微术(Nikon A1)在FITC和TRITC通道中检查细胞。如图13中示出的，Cy3负载的构建体被细胞内化。

为了评估T-肽-ACPP-纳米海绵构建体作为靶向药物系统是否有效，进行实验以确定萘并荧光素在pH 5时抑制MMP14活性是否仍是有效的。用20μM的游离萘并荧光素处理HT1080细胞持续1周。将另一组HT1080细胞暴露于萘并荧光素，该萘并荧光素在pH 5的HCl溶液中预处理持续30分钟，并且然后用NaOH中和pH。将FRET肽设计为具有附接至短氨基酸序列的5’Cy3.5部分，并以3’BHQ2(black hole quencher2)结束，该短氨基酸序列优选可被膜型MMP例如MMP14裂解。随着Cy3.5荧光信号的强度增加，该FRET序列检测到MMP14活性的存在。提供FRET结果的微孔板读取器扫描示出，与未处理的HT1080细胞(473.7±20.93,n＝3)相比，用未改变的萘并荧光素(Cy3.5增加：125.0±17.04,n＝3)和呈现为pH 5的萘并荧光素(126.7±2.728，n＝3)处理的细胞均示出对MMP14活性的显著(p<0.01)抑制，指示萘并荧光素作为MMP14抑制剂的功能在pH 5是稳定的(图13)；我们还研究了纳米颗粒构建体当与鼠巨噬细胞RAW细胞一起孵育时是否进入溶酶体。鼠RAW细胞是天然吞噬性的，并且它们也天然地分泌MMP，包括MMP2。通过掺入被MMP2裂解的ACPP，我们实际上创建了一种纳米海绵有效负载，一旦ACPP的肽接头被裂解，该有效负载具有来自被附接至其的聚阳离子D-精氨酸臂的净正电荷。这提供了一种用于通过质子海绵效应的药物负载的纳米海绵的“溶酶体逃逸”的方法，允许纳米海绵通过内体膜逃逸回到细胞的细胞质中，避免纳米海绵和药物的酸降解。在Cy3负载的纳米颗粒构建体与活RAW细胞孵育过夜后，将RAW细胞的细胞质在第二天和在根据共焦显微术检查细胞前10分钟用细胞示踪剂绿标记，我们将溶酶体示踪剂蓝(Invitrogen)加入到RAW细胞中，以在蓝色DAPI通道中可视化溶酶体。根据共焦显微术，评估了RAW细胞中红色和蓝色荧光信号的共定位，这将指示细胞溶酶体中纳米颗粒构建体的存在(图14)。

为了研究萘并荧光素对不稳定斑块的胶原含量的影响，使用了不稳定斑块的一种新型串联狭窄小鼠模型。将这些Apo E敲除小鼠在高脂肪饮食7周后在右侧颈动脉处放置串联的缝合，以诱导不稳定斑块的形成。在串联狭窄后5周，我们间隔2周给予小鼠萘并荧光素负载的靶向纳米海绵构建体的2次注射，并且将相同的给药方案用于给予PBS、游离萘并荧光素或无药物纳米海绵的对照小鼠。杀死小鼠，并且收获其右侧颈动脉斑块用于使用天狼猩红染色的胶原定量(图15)。胶原量(表示为斑块面积的胶原百分比)揭示了处理(36.88±4.965,n＝5)的小鼠组与用游离药物(18.87±5.308，n＝4)、用PBS(14.40±4.522，n＝4)和用未负载的空纳米颗粒(16.05±1.994，n＝4)处理的对照小鼠组之间的显著差异(图16)。

总之，开发了一种纳米海绵构建体，所述海绵构建体特异性靶向不稳定斑块，具有增强斑块的胶原含量，从而增强其稳定性并最小化其破裂风险的能力。这还说明了肽定向纳米技术在生物应用中的转化能力，并且纳米海绵构建体代表了用于开发在人类中的生物靶向药物递送疗法的潜力，用于预防与不稳定斑块破裂相关的状况，例如心肌梗塞和中风。

实施例10：T-肽与心肌梗塞后小鼠心肌的离体结合

本文别处公开的数据示出，T-肽允许在不稳定的动脉粥样硬化斑块和稳定的动脉粥样硬化斑块之间清晰的区分。为了评估标记的T-肽是否可以与纤维化心肌结合，使用心肌梗塞的小鼠模型(经由冠状动脉左前降支(LAD)阻塞)。该模型反映了梗塞区域中非常明确的纤维化区域。

将小鼠麻醉，LAD用缝合线扎结，并且闭合胸部。在60分钟后，去除缝合线。在6周后并且发展纤维化后，将梗塞心脏的部分进行切片，并与T-肽-FITC和对照肽-FITC构建体一起孵育。如图17中示出的，T-肽-FITC缀合物特异性结合心肌中的局部纤维化区域，而不存在对照肽-FITC缀合物与纤维化心肌的相同区域结合的证据。

实施例11：放射性标记的T-肽成像剂(示踪剂)与心肌梗塞后小鼠心肌的体内结合

为了在更大的动物模型中证实这些结果，将包含T-肽-MeCOSar缀合物的⁶⁴Cu放射性标记的PET示踪剂(成像剂)施用至具有快速起搏诱导的心房颤动(AF)、随后的心肌纤维化和心力衰竭(HF)的绵羊。T-肽-MeCOSar缀合物和对照肽缀合物(S-肽-MeCOSar)使用Wang树脂来制备，并使用MeCOSar NHS缀合，如下：

肽合成：

使用Fmoc-Lys(Boc)Wang树脂(0.8mmol/g)；

ο0.25mmol规模，约313mg树脂，在附接至真空歧管的烧结塑料注射器中使用；

ο进行固相肽合成(SPPS)：

■树脂使用DCM溶胀，用DMF洗涤；

■使用在DMF中的5％哌嗪进行Fmoc脱保护持续30分钟；

■树脂用3xDMF洗涤，然后用3xDCM洗涤以去除哌嗪；

■测试使用TNBSA测试进行的Fmoc脱保护，以用于检测游离胺(在DMF中的5μL10％TNBSA与在DMF中的5μL 10％DIPEA混合，加入到Eppendorf管中的几个树脂珠中)；

■树脂用DMF洗涤；

■向溶解在最少DMF中的4当量Fmoc-AA-OH(氨基酸)的溶液中加入4当量的HATU，随后加入8当量的DIPEA；

■将溶液振荡持续5分钟，以允许活化，并且然后加入到注射器中并手动搅拌，允许反应持续30分钟；

■用3xDMF洗涤，随后用3xDCM洗涤；

■测试使用TNBSA测试进行的偶联，以用于检测游离胺；

ο测试裂解肽并通过MS分析以确定合成的完成；

ο然后使用95/2.5/2.5TFA/H2O/TIPS(20mL)的溶液裂解肽持续2小时-3小时；

ο过滤树脂，并且将滤液在N2流下减少至～3mL；

ο将溶液用约40mL Et2O稀释，离心(3min@3k RPM)，并倾析Et2O。重复过程3次；

ο将剩余的沉淀物溶解在50/50MeCN/H2O中并冻干。

肽纯化(对照)：

通过将粗制冻干材料溶解在0.1％TFA/H2O中的27.5mL 26％MeCN中，约7.2mg/mL，将2.5mL注入到Kinetex 5μC18 AXIA填充的制备型-HPLC柱，21.2×150mm，以5mL/min运行，进行最初的考察制备型-HPLC运行；

ο方法：

■0min-15min，20％；

■15min-17min，20％-25％；

■17min-72min，25％-80％(1％/min)；

■72min-75min，80％-100％；

■75min-95min，100％；

■在96min时运行完成；

ο含有对照肽的级分在42.5min-45min洗脱；

ο开发了等度法：

■0min-20min，28％；

■20min-75min，35％

ο含有对照肽的级分在44min-65min洗脱；

ο对照肽的近似收率：45.2mg，15％收率。

肽纯化(结合)：

通过将在27.5mL 38％MeCN中的粗制冻干材料溶解在0.1％TFA/H2O中的27.5mL38％MeCN中，约7.67mg/mL，将2.8mL注入到Kinetex 5μC18AXIA填充的制备型-HPLC柱，21.2×150mm，以5mL/min运行，进行最初的考察制备型-HPLC运行；

ο方法：

■0min-15min，20％；

■15min-17min，20％-25％；

■17min-72min，25％-80％(1％/min)；

■72min-75min，80％-100％；

■75min-95min，100％；

■在96min时运行完成；

ο含有对照肽的级分在41.5min-47min洗脱，另外的材料在50.5min-53min洗脱；

ο开发了等度法：

■0min-60min，36％；

ο含有对照肽的级分在33min-46min洗脱；

ο对照肽的近似收率：33.2mg，9.9％收率。

MeCOSar与肽的缀合：

向在无水DMF(1mL)中的Fmoc-GLGYGWSGK-OH(17.3mg)的溶液中加入MeCOSar-NHS(tris-水合物/tris-三氟乙酸盐)(21.2mg，1当量)。将反应在45℃搅拌持续5小时，并通过MS监测，未检测到反应。在5小时后，加入NaHCO3(2mg)以驱动反应完成，并搅拌过夜。通过MS检查反应以示出完全反应和N-末端Fmoc基团的去除。将溶剂在N2流下去除，溶解在具有0.1％TFA的H2O/MeCN 75/25中，并通过制备型-HPLC纯化。

收率为约12.5mg，62.9％。

向在无水DMF(1mL)中的Fmoc-TLTYTWSGK-OH(17.5mg)的溶液中加入MeCOSar-NHS(tris-水合物/tris-三氟乙酸盐)(20.0mg，1当量)。通过加入NaHCO3调节反应的pH，直到达到pH 9。将反应在45℃搅拌过夜，并通过MS监测。在24小时后，加入另外的NaHCO3以驱动反应完成。通过MS检查反应以示出完全反应和N-末端Fmoc基团的去除。将溶剂在N2流下去除，溶解在具有0.1％TFA的H2O/MeCN 75/25中，并通过制备型-HPLC纯化。

收率为约9.5mg，48％。

通过将600MBq的⁶⁴Cu与1mL的T-肽-MeCOSar缀合物(6nM)在乙酸铵缓冲液(0.5mol/L)中在室温孵育持续30分钟来制备⁶⁴Cu放射性标记物到T-肽-MeCOSar缀合物的负载，这通常给出>98％的标记收率。

如图19中示出的，⁶⁴Cu放射性标记的T-肽-MeCOSar PET示踪剂检测到绵羊心脏的右心房中的纤维化组织，而健康右心室中PET示踪剂的结合不是明显的。

还在AF、HF和肺纤维化的遗传小鼠模型中进行PET/CT扫描。小鼠经由尾静脉注射⁶⁴Cu-T-肽-MeCOSar示踪剂或非靶向的⁶⁴Cu-对照肽-MeCOSar。在30min后，对小鼠进行纳米PET/CT扫描。在PET图像中，对应于纤维化组织的心脏和肺的区域是非常明显的(图20)。这些发现证明，本文公开的成像剂可以用于体内检测纤维化并指导治疗干预。

序列表

<110> 贝克IDI心脏和糖尿病研究院控股有限公司

<120> 用于诊断和治疗疾病的剂和方法

<130> 35267840

<150> AU 2016902338

<151> 2016-06-16

<160> 15

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 混杂的

<400> 1

Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> (S-甲基)半胱氨酸

<400> 2

Pro Leu Gly Xaa Ala Gly

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (12)..(12)

<223> 炔

<400> 3

Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser Ala Cys Pro Pro Xaa

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 混杂的

<400> 4

Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser Ala Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (24)..(24)

<223> 羟基基团(OH)

<400> 5

His Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser Gly Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly

1 5 10 15

Gly His His His His His His Xaa

20

<210> 6

<211> 48

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> E

<222> (18)..(25)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> X

<222> (26)..(26)

<223> 5-氨基-3-氧杂戊酰基

<220>

<221> X

<222> (30)..(30)

<223> (S-甲基)半胱氨酸

<220>

<221> R

<222> (32)..(40)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> X

<222> (48)..(48)

<223> L-炔丙基甘氨酸

<400> 6

Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser Gly Leu Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Xaa Pro Leu Gly Xaa Ala Gly

20 25 30

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Ala Ser Pro Ala Xaa

35 40 45

<210> 7

<211> 59

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> E

<222> (29)..(36)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> X

<222> (30)..(30)

<223> 5-氨基-3-氧杂戊酰基

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> X

<222> (41)..(41)

<223> (S-甲基)半胱氨酸

<220>

<221> R

<222> (44)..(52)

<223> D-氨基酸

<400> 7

Gly Gly Gly Trp Trp Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Thr Leu Thr Tyr

1 5 10 15

Thr Trp Ser Gly Leu Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Glu Glu Glu Glu

20 25 30

Glu Glu Glu Glu Xaa Pro Leu Gly Xaa Ala Gly Arg Arg Arg Arg Arg

35 40 45

Arg Arg Arg Arg Gly Ala Gly Ala Pro Ala Cys

50 55

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> 氢

<220>

<221> X

<222> (23)..(23)

<223> 羟基基团(OH)

<400> 8

Xaa Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser Gly Gly Gly Leu Pro Thr Gly Gly

1 5 10 15

His His His His His His Xaa

20

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> 氢

<220>

<221> X

<222> (9)..(9)

<223> (L-半胱氨酸Dylight 800 C5马来酰亚胺基)

<220>

<221> X

<222> (10)..(10)

<223> 羟基基团(OH)

<400> 9

Xaa Gly Gly Gly Trp Trp Ser Ser Xaa Xaa

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> 氢

<220>

<221> X

<222> (11)..(11)

<223> 异硫氰酸荧光素(FITC)

<220>

<221> X

<222> (12)..(12)

<223> 羟基基团(OH)

<400> 10

Xaa Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser Gly Lys Xaa Xaa

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> 氢

<220>

<221> X

<222> (11)..(11)

<223> 异硫氰酸荧光素(FITC)

<220>

<221> X

<222> (12)..(12)

<223> 羟基基团(OH)

<400> 11

Xaa Gly Leu Gly Tyr Gly Trp Ser Gly Lys Xaa Xaa

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (1)..(1)

<223> 花菁3.5 NHS酯(Cy3.2)

<220>

<221> X

<222> (12)..(12)

<223> Black Hole Quencher (BHQ)

<400> 12

Xaa Gly Arg Ile Gly Phe Leu Arg Thr Ala Cys Xaa

1 5 10

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 混杂的

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> (S-甲基)半胱氨酸

<400> 13

Pro Leu Gly Xaa Ala Gly

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 混杂的

<400> 14

Leu Pro Glu Thr Gly

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 混杂的

<400> 15

Thr Leu Thr Tyr Thr Trp Ser Leu Pro Glu Thr Gly

1 5 10

Claims (34)

1.一种成像剂，所述成像剂包含与可检测标记物连接的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)。

2.如权利要求1所述的成像剂，其中所述多肽由所述氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)组成。

3.如权利要求1或权利要求2所述的成像剂，其中所述可检测标记物被附接至络合剂。

4.如权利要求3所述的成像剂，其中所述络合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或5-(8-甲基-3,6,10,13,16,19-六氮杂-双环[6.6.6]二十烷-1-基氨基)-5-氧代戊酸(MeCOSar)。

5.如权利要求4所述的成像剂，其中所述络合剂是5-(8-甲基-3,6,10,13,16,19-六氮杂-双环[6.6.6]二十烷-1-基氨基)-5-氧代戊酸(MeCOSar)。

6.如权利要求1至5中任一项所述的成像剂，其中所述可检测标记物选自由放射性同位素、成像染料、顺磁材料或微泡组成的组。

7.如权利要求6所述的成像剂，其中所述可检测标记物是放射性同位素。

8.如权利要求7所述的成像剂，其中所述放射性同位素是⁶⁴Cu。

9.一种体内检测受试者的血管腔中的不稳定的动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括：a)向需要其的受试者施用根据权利要求1至8中任一项所述的成像剂；和b)检测所述成像剂的所述可检测标记物，其中所述可检测标记物在所述受试者的血管腔内的存在指示所述成像剂与不稳定的动脉粥样硬化斑块的结合。

10.一种体内检测受试者中的纤维化的方法，所述方法包括：a)向需要其的受试者施用根据权利要求1至8中任一项所述的成像剂；和b)检测所述成像剂的所述可检测标记物，其中所述可检测标记物在所述受试者中的存在指示所述成像剂与纤维化区域的结合。

11.如权利要求9或权利要求10所述的方法，其中用于检测所述可检测标记物的方法选自由以下组成的组：单光子发射计算机断层扫描；正电子发射断层扫描；近红外荧光成像；d)超声成像；和磁共振成像。

12.如权利要求11所述的方法，其中用于检测所述可检测标记物的方法是正电子发射断层扫描(PET)。

13.如权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

14.一种治疗构建体，所述治疗构建体包含与靶向部分连接的治疗部分，其中所述靶向部分包含含有氨基酸序列TLTYTWS(SEQ ID NO:1)的多肽。

15.如权利要求14所述的治疗构建体，其中所述多肽由所述氨基酸序列TLTYTWS(SEQID NO:1)组成。

16.如权利要求14或权利要求15所述的治疗构建体，其中所述靶向部分还包括细胞渗透剂。

17.如权利要求16所述的治疗构建体，其中所述细胞渗透剂包含多于一个带正电荷的氨基酸残基。

18.如权利要求17所述的治疗构建体，其中所述细胞渗透剂包含多于一个D-精氨酸残基。

19.如权利要求14至18中任一项所述的治疗构建体，其中所述多肽经由接头被附接至细胞渗透剂。

20.如权利要求19所述的治疗构建体，其中所述接头被基质金属蛋白酶(MMP)特异性裂解。

21.如权利要求20所述的治疗构建体，其中所述接头被MMP2特异性裂解。

22.如权利要求21所述的治疗构建体，其中所述接头包含氨基酸序列PLGC(Me)AG(SEQID NO:14)。

23.如权利要求22所述的治疗构建体，其中所述接头由所述氨基酸序列PLGC(Me)AG(SEQ ID NO:14)组成。

24.如权利要求14至23中任一项所述的治疗构建体，其中所述治疗部分包括能够抑制或激活细胞外基质周转的化合物。

25.如权利要求24所述的治疗构建体，其中所述治疗部分包括能够抑制或激活基质金属蛋白酶(MMP)活性的化合物。

26.如权利要求25所述的治疗构建体，其中所述化合物能够抑制MMP活性。

27.如权利要求26所述的治疗构建体，其中所述化合物是MMP14抑制剂。

28.如权利要求27所述的治疗构建体，其中所述MMP14抑制剂是萘并荧光素。

29.如权利要求14至28中任一项所述的治疗构建体，其中所述治疗部分还包括载体。

30.如权利要求29所述的治疗构建体，其中所述载体是纳米颗粒。

31.如权利要求29所述的治疗构建体，其中所述载体是聚(2-二异丙基氨基乙基甲基丙烯酸酯(PDPA)纳米颗粒。

32.一种治疗或预防受试者中与不希望的细胞外基质周转相关的状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用根据权利要求14至31中任一项所述的治疗构建体。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述状况选自由以下组成的组：心血管疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞后心脏重塑、中风、脑血管疾病、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球肾炎、人新月体性肾小球肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、胰腺炎、血管炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植排斥、全身性硬化症、神经退行性紊乱和脱髓鞘疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺病、哮喘、子宫内膜异位、神经性疼痛、炎性疼痛和癌症。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述状况选自由以下组成的组：动脉粥样硬化心肌梗塞后心脏重塑和中风。