DE102008047781B4 - Peptide, die an durch Matrix-Metalloprotease 2 modifiziertes humanes Kollagen IV binden, pharmazeutische Zubereitung und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Ein Oligopeptid mit einer aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 1.

Description

• Technisches Gebiet der Erfindung
• Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Medizin. Dort speziell in der Bereitstellung von Material zur Detektion und Inhibition von Angiogenese durch Verwendung von selektiven Agenzien, welche an proteolytisch modifiziertem Kollagen IV binden.
• Stand der Technik
• Die Angiogenese, die Neubildung von Blutgefäßen, ist ein natürlicher Prozess, welcher bei der Wundheilung, der Reproduktion und der Entwicklung vorkommt. Die physiologische Angiogenese, ist ein hochregulierter Prozess. Sie besteht aus mehreren Phasen, der Permeabilität des Endotheles, der Proliferation von Endothelzellen, der Proteolyse der Baselmembran, der Migration von Zellen und der Entstehung von Lumen und dessen Stabilisierung. Dabei findet eine Interaktion unterschiedlicher Zellmembranrezeptoren, wie den Integrinen, und von Wachstumsfaktoren statt. Zusammenfassend kommt es durch Verlust der Zell-Zell Adhäsion zu einer Permeabilität des Endothels. Es handelt sich um den Verlust von VE-Katherinen der Endothelzellen, welche das Endothel von Blutgefäßen bilden. Durch Ausschüttung von Wachstumsfaktoren kommt es zu einer Proliferation der Endothelzellen. Es folgt die Proteolyse der Basalmembran, die Voraussetzung zur Bildung eines neuen Blutgefäßes. Die aus Kollagen IV, Laminin und Entaktin bestehende Basalmembran, welche das Endothel von den darunterliegenden Muskelzellen und Bindegewebe separiert, wird durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) 2 und 9 gespalten. Durch die Spaltung des Kollagens IV werden bisher verborgene Bereiche freigelegt, die den Endothelzellen als Migrationssignale dienen. Durch die Migration der Endothelzellen kommt es zur Bildung des neuen Gefäßlumens. Einwandernde Muskelzellen umgeben das neu entstandene Gefäß und stabilisieren es (Hangai, M., et al. (2002) Am J Pathol 161(4): 1429–1437), (Xu et al. (2001). J Cell Biol 154(5): 1069–1079), (Milkiewicz et al. (2006) Int J Biochem Cell Biol 38(3): 333–357).
• Obwohl die Angiogenese ein hochregulierter Prozess ist, findet bei einer Vielzahl von Krankheiten eine nicht regulierte Angiogenese statt, welche zu einem Vorschreiten der Erkrankung führt. Beispiele für solche Erkrankungen sind unter anderen pathologischen Wundheilungsstörungen, wie die diabetische Fußulzeration, die Dekubitus-Ulzerationen und den durch Venenstauungen verursachten Ulzerationen. Weiterhin ist die Matrix-Metalloprotease 2 auch bei entzündlichen Prozessen beteiligt (Xue et al. (2006), Expert Opin Ther Targets 10(1): 143–155), (Toy et al. (2005). J Wound Care 14(1): 202).
• Weiterhin wurden angiogene Vorgänge auch bei Erkrankungen des Gehirns durch Schädigung der Blut-Hirn-Schranke, wie die bakterielle Meningitis, multiple Sklerose, der Alzheimer Erkrankung und bei entzündlichen Myopathien und Tumoren des zentralen Nervensystems, wie den Gliomen. (Yong et al. (2001). Nat Rev Neurosci 2(7): 502–511), (Leppert et al. (2000). Clin Infect Dis 31(1): 8084), (Ozenci et al. (2000) J Neuroimmunol 108(1–2): 236–243), (Yong et al. (1998). Trends Neurosci 21(2): 75–80), (Nakada et al. (2003). Front Biosci 8: e261–269).
• Ein weiteres Beispiel für die Aktivität der MMP 2 sind Erkrankungen des Herzens und der Gefäße. So konnte eine Assoziation mit der Bildung und Instabilität von atherosklerotischen Plaques, der Migration von Gefäßmuskelzellen, der Restenose von Gefäßen, der Entwicklung Aortenaneurysmen und dem Herzversagen belegt werden (Galis et al. (1994). J Clin Invest 94(6): 2493–2503), (Lovdahl et al. (1999). Histol Histopathol 14(4): 1101–1112), (Longo et al. (2002). J Clin Invest 110(5): 625–632), (Danielsen et al. (1998). J Mol Cell Cardiol 30(7): 1431–42), (Yamazaki et al. (2004). Eur J Heart Fail 6(1): 41–45).
• Daneben werden aber auch bei anderen Erkrankungen, wie der diabetischen Retinopathie, angiogenetische Vorgänge beobachtet (Carmeliet et al (2000). Nature 407(6801): 249–257).
• Bei Tumorerkrankungen sind die MMPs 2 und 9 essenziell. Sie ermöglichen unter anderem durch Spaltung der Basalmembran die Gefäßneubildung und somit die Versorgung des Tumorgewebes mit Nährstoffen (Malemud (2006). Front Biosci 11: 1696–1701).
• Durch die unkontrollierte Teilung von Tumorzellen, haben sie einen erhöhten Sauerstoff- und Nährstoffbedarf. Das Tumorgewebe kann sich jedoch nur bis zu einer Größe von etwas 0,125 mm² durch Diffusion mit den notwendigen Nährstoffen versorgen. Weitere Zellteilungen führen zur Nährstoff und Sauerstoffunterversorgung und so zur Hypoxie mit anschließender Nekrose. Eine weitere Zunahme des Tumorgewebes und die Metastasierung erfordern daher den Zugang zum Blutgefäßsystem. Dieser Zugang zum Gefäßsystem wird durch eine Neubildung von Blutgefäßen ermöglicht, der Tumor-Angiogenese. Im Rahmen der Angiogenese ist die Proteolyse der Basalmembran ein wichtiger Bestandteil. Sie erfolgt insbesondere durch die MMPs 2 und 9. Durch die Proteolyse werden bisher verborgene Bereiche des Kollagens IV freigelegt. Diese Bereiche enthalten Migrationssignale für Endothelzellen (Hangai (2002), wie oben genannt), (Xu (2001), wie oben genannt), (Davis et al. (2000). Am J Pathol 156(5): 1489–1498), (Roth et al. (2006). Am J Pathol 168(5): 1576–1586).
• Die Angiogenese trägt jedoch nicht nur zur Versorgung des Tumors bei, sondern ist auch der Ausgangspunkt zur hämatogenen Metastasierung eines Primärtumors.
• Das Kollagen IV, welches Bestandteil der Basalmembran ist, gehört zu der Familie der Kollagene. Generell bestehen Kollagene aus 3 Polypeptid-Ketten, den α-Strängen. Sie enthalten sich wiederholende Aminosäuremotive der Form Gly-Xaa-Yaa, wobei Xaa und Yaa jede beliebige Aminosäure außer Glycin sein kann. Diese Stränge bilden eine Tripelhelix. An der Xaa-Position ist häufig Prolin anzutreffen. An der Yaa-Position hingegen findet sich häufig 4-Hydroxyprolin. Das Kollagen IV ist im Gegensatz zu Kollagen I nicht fibrillär, sondern wabenförmig angeordnet. Es bildet sich aus 2 α1(IV) Ketten und einer α2(IV) Kette (Olsen et al. (1999). Collagens. Guidebook to the extracellular matrix, anchor, and adhesion proteins (2nd edition). T. Kreis and R. Vale. New York, USA, Oxford University Press Inc.: 380–408).
• Die Matrix-Metalloproteinasen (MMP) stellen eine seit längerem bekannte Familie Zinkabhängiger Kollagen spaltender Endopeptidasen dar, welche sowohl als lösliche als auch als membrangebundene Proteine vorliegen können.
• Die MMPs 2 und 9 sind diejenigen Proteasen, welche am häufigsten Kollagen IV spalten (Somerville et al. (2003). Genome Biol 4(6): 216). Auf Grund der Beteiligung von Matrix-Metalloproteasen an einer Vielzahl von Experimenten wurden MMP-Inhibitoren entwickelt. Allerdings zeigten die klinischen Studien dieser Stoffe ein eher nachteiligen Effekt für die Patienten, so dass sie abgebrochen werden mussten (Coussens, et al. (2002) Science 295(5564): 2387–92). An Kollagen bindende Peptide sind aus US 2005/00 48 063 A1 und WO 2004/073 649 A2 bekannt.
• Es besteht daher das Bedürfnis nach Verbindungen, die in der Behandlung von Krankheiten, bei denen angiogene Prozesse involviert sind, nützlich sind. So sind Stoffe, welche zur Detektion von proteolytisch verändertem Kollagen IV verwendet werden, hilfreich bei dem Auffinden von Entzündungen, Tumoren, Metastasen und anderen angiogenen Prozessen. Da die Angiogenese ein essenzieller Bestandteil des Tumorwachstums ist, können Stoffe, welche sich dort einfinden gezielt therapeutische Agenzien transportieren.
• Beschreibung der Erfindung
• Wie hierin verwendet, bedeutet „Peptid” eine polymere Form von Aminosäuren jeder Länge, welche chemisch synthetisiert werden kann durch Verfahren, die einem Fachmann mit durchschnittlichem Können bekannt sind. Beispielsweise sei hier die Festphasensynthese genannt.
• Wie hierin verwendet, folgen die Namen von natürlich vorkommenden Aminosäuren größten Teils den Benennungskonventionen, die von der IUPAC Kommission über die Nomenklatur der organischen Chemie vorgeschlagen wurden und der IUPAC-IUB Kommission der biochemischen Nomenklatur, wie dargelegt in Nomenclature of α-Amin Acids (Recommendations, 1974), Biochemistry, 14(2), (1975). Dementsprechend beziehen sich die Ausdrücke „Ala”, „Arg”, „Asn”, „Asp”, „Cys”, „Gln”, „Glu”, „Gly”, „His”, „Ile”, „Leu”, „Lys”, „Met”, „Phe”, „Pro”, „Ser”, „Thr”, „Trp”, „Tyr” und „Val” auf die Aminosäuren Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin, und auf ihre entsprechenden Aminoacylreste in Peptiden in ihren L-, D- oder D, L-Formen. Wo keine spezifische Konfiguration angegeben ist, würde jemand, der im Fachgebiet bewandert ist, verstehen, dass die Stereochemie des α-Kohlenstoffs der Aminosäuren und Aminoacrylresten in Peptiden, welche in dieser Beschreibung beschrieben sind, die natürlich vorkommende oder „L” Konfiguration, mit der Ausnahme des achiralen Moleküls Glycin und mit der weiteren Ausnahme von irgendwelchen Aminosäuren, welche achiral sind oder anderweitig als „D”- bezeichnet sind.
• Wie hierin verwendet, bedeutet „Peptid gekoppelte Verbindung”, die chemische Kopplung von anderen Stoffen, wie beispielsweise paramagnetische Nanopartikel, an ein Peptid. Die Methodik der Kopplungschemie ist dem Fachmann bekannt und die benötigten chemischen Verbindungen, wie beispielsweise N-[A-Maleimidoacetoxy] Succimidester sind kommerziell erhältlich. Welche Kopplungschemie benutzt wird bleibt dem Fachmann in Bezug auf die zu koppelnden Stoffe überlassen.
• Wie hierin verwendet, bedeutet „Escherichia coli ER2738”, ein Bakterium der Spezies Escherichia coli K 12 mit dem Gentyp F'proA⁺B⁺ lacI^q Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10(Tet^R)/fhuA2 glnV Δ(lac-proAB) thi – 1 Δ(hsdS-mcrB)5, welches kommerziell von der Firma New England Biolabs, Deutschland bezogen wurde und in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, 10 g/l NaCl) kultiviert wurde.
• Wie hierin verwendet, bedeutet „TLTYTWS-Phage”, ein M13-Bakteriophage, welcher rekombinant die Peptidsequenz Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Trp-Ser am aminoterminalen Ende der 5 Kopien des Hüllproteins 3 präsentiert. Die Herstellung von rekombinanten Phagen ist einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Dieser Phage wurde bei einem Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek, welche dem Fachmann bekannt ist und kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erworben wurde, gefunden (Noren et al. (2001), Methods, 23, 169–178). Die Methodik des Phage Display ist dem Fachmann bekannt (Szardenings (2003) J Recept Signal Transduct Res. 2003; 23(4): 307–49), (Ruoslahti, E. (2002). Nat Rev Cancer 2(2): 83–90).
• Wie hierin verwendet, bedeutet „SRPQITN-Phage”, ein M13-Bakteriophage, welcher rekombinant die Peptidsequenz Ser-Arg-Pro-Gln-He-Thr-Asn am aminoterminalen Ende der 5 Kopien des Hüllproteins 3 präsentiert. Die Herstellung von rekombinanten Phagen ist einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Dieser Phage wurde bei einem Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek, welche dem Fachmann bekannt ist und kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erworben wurde, gefunden (Noren et al. (2001), wie oben angegeben). Die Methodik des Phage Display ist dem Fachmann bekannt (Szardenings (2003) wie oben angegeben), (Ruoslahti, E. (2002) wie oben angegeben).
• Wie hierin verwendet, bedeutet „GLGYGWS-Phage”, ein M13-Phage, bei dem rekombinant die DNA-Sequenz 5'-GTACCTTTCTATTCTCACTCTGGTCTTGGTTATGGGTGGTCTGGTGGAGGTTC zwischen die Schnittstellen KpnI und EagI des für das Hüllprotein 3 kodierenden den Gens mittels Ligation eingefügt worden ist. Die M13-DNA ist kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich.
• Die so erhaltene rekombinant veränderte Bakteriophagen-DNA wurde in Escherichia coli ER2738 Bakterien, welche kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich sind, transformiert.
• Die Vorgänge und die Durchführung einer Ligation und einer Transformation sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Dieser Phage präsentiert statt der Peptid-Seqenz Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Trp-Ser die Sequenz Gly-Leu-Gly-Tyr-Gly-Trp-Ser.
• Wie hierin verwendet, bedeutet „TGTYTWS-Phage”, ein M13-Phage, bei dem rekombinant die DNA-Sequenz 5'-GTACCTTTCTATTCTCACTCTACGGGTACGTATACGTGGTCTGGTGGAGGTTC zwischen die Schnittstellen KpnI und EagI das für das Hüllprotein 3 kodierende Gen mittels Ligation eingefügt worden ist. Die M13-DNA ist kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich. Die so erhaltene rekombinant veränderte Bakteriophagen-DNA wurde in Escherichia coli ER2738 Bakterien, welche kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich sind, transformiert. Die Vorgänge und die Durchführung einer Ligation und einer Transformation sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Dieser Phage präsentiert statt der Peptid-Seqenz Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Trp-Ser die Sequenz Thr-Gly-Thr-Tyr-Thr-Trp-Ser.
• Wie hierin verwendet, bedeutet „TLTYTGS-Phage”, ein M13-Phage, bei dem rekombinant die DNA-Sequenz 5'-GTACCTTTCTATTCTCACTCTACGCTTACGTATACGGGTTCTGGTGGAGGTTC zwischen die Schnittstellen KpnI und EagI das für das Hüllprotein 3 kodierende Gen mittels Ligation eingefügt worden ist. Die M13-DNA ist kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich. Die so erhaltene rekombinant veränderte Bakteriophagen-DNA wurde in Escherichia coli ER2738 Bakterien, welche kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich sind, transformiert. Die Vorginge und die Durchführung einer Ligation und einer Transformation sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Dieser Phage präsentiert statt der Peptid-Seqenz Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Trp-Ser die Sequenz Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Gly-Ser.
• Wie hierin verwendet, bedeutet „LKQNGGNFSL-Phage”, ein M13-Phage, bei dem rekombinant die DNA-Sequenz 5'-GTACCTTTCTATTCTCACTCTCTGAAGCAGAATGGGGGTAATTTTTCGCTGGGTGG AGGTTC zwischen die Schnittstellen KpnI und EagI das für das Hüllprotein 3 kodierende Gen mittels Ligation eingefügt worden ist. Die M13-DNA ist kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich.
• Die so erhaltene rekombinant veränderte Bakteriophagen-DNA wurde in Escherichia coli ER2738 Bakterien, welche kommerziell bei New England Biolabs, Deutschland erhältlich sind, transformiert. Die Vorgänge und die Durchführung einer Ligation und einer Transformation sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Dieser Phage präsentiert statt der Peptid-Seqenz Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Trp-Ser die Sequenz Leu-Lys-Gln-Asn-Gly-Gly-Asn-Phe-Ser-Leu, welche bereits bekannt ist (Brooks, PCT, WO 2004/073649A2 ).
• Die Erfindung stellt Stoffe in Form von Peptiden bereit, welche an durch Matrix-Metalloprotease 2 gespaltenes Kollagen IV bindet.
• Die in dieser Erfindung beschriebenen selektiv Matrix-Metalloprotease 2 gespaltenes Kollagen IV bindenden Peptide oder Peptid gekoppelte Substanzen enthalten die Sequenz Thr-Leu-Thr-Tyr-Thr-Trp-Ser (Seq Id No. 1).
• In einer Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Peptid bereit, welches die in der Seq Id No. 1 offenbarten Peptidsequenz aminoterminal enthält und durch anfingen der Peptide Gly-Gly-Gly-Ser gekennzeichnet sind (Seq Id No. 2). Diese Ausführungsform kommt in dem oben beschriebenen TLTYTWS-Phagen vor.
• In einer weiteren Ausführungsform stellt diese Erfindung ein chemisch synthetisiertes Peptid bereit, welches die in der Seq Id No. 1 offenbarten Peptidsequenz aminoterminal enthält und durch anfügen der Peptide Gly-Gly-Gly-Lys-Lys-Cys gekennzeichnet sind (Seq Id No. 3).
• Das chemisch synthetisierte Peptid, welches die in der Seq Id No. 3 offenbarte Sequenz enthält, ist in der Lage Angiogenese zu inhibieren.
• In einer weiteren Ausführungsform stellt diese Erfindung eine Peptid gekoppelte Verbindung bereit, welche durch Kopplung des in der Seq Id No. 3 offenbarten Peptids an paramagnetische Partikel gekennzeichnet ist. Die Herstellung dieser Kopplung selbst kann durch beliebige Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, erfolgen.
• Beispielhaft kann die Kopplung mit Hilfe von N-[α-Maleimidoacetoxy] Succimidester an eine mit NH₂-Gruppen beschichtete Oberfläche erfolgen (Chen et al. (2003) J Biol Chem, 278(48): 48348–48356). Obige paramagnetische Partikel können beispielsweise aus einem paramagnetischcn Isotop, wie ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn oder ⁵⁶Fe bestehen. Diese Peptid gekoppelte Verbindungen finden insbesondere bei der Magnetresonanz Bildgebung (MRI) Verwendung.
• In einer weiteren Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Peptid bereit, welches die in der Seq Id No. 1 offenbarten Peptidsequenz aminoterminal enthält und durch anfügen der Peptide Gly-Gly-Gly-Lys-Lys (Seq Id No. 4) und eines Fluorochroms, wie beispielsweise Fluorescein, an die carboxyterminale Aminosäure gekennzeichnet ist.
• Weitere Ausführungsformen zur in-vivo Detektion beinhalten die chemische Kopplung von Metallchelatoren, wie beispielsweise Diethylentriaminpentaessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure oder Tetraazacyclododecantetraessigsäure, an den Carboxyterminus von Peptide, welches die in der Seq Id No. 1 offenbarten Peptidsequenz aminoterminal enthalten.
• Diese Ausführungsformen sind beispielsweise durch Bindung von radioaktiven Isotopen von Metallionen zur diagnostischen Bildgebung geeignet. Die Auswahl des geeigneten radioaktiven Isotops ist abhängig von dem Detektionsgerät und erfolgt durch den Fachmann. Beispiele für diese radioaktiven Isotope sind ^99mTC, ¹²³I, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga.
• Weitere Ausführungsformen der Erfindung enthalten Peptid gekoppelte Verbindungen, welche die in der Seq Id No. 1 offenbarten Peptidsequenz aminoterminal enthalten und carboxyterminal ein radioaktives Isotop tragen, welches diagnostisch und/oder therapeutisch genutzt werden kann. Ein Beispiel ist ¹⁸F, welches zur Positronen-Emissions-Tomographie (PET) genutzt werden kann. Methoden zur Bindung von radioaktiven Isotopen an Peptide sind dem Fachmann bekannt.
• Weitere Ausführungsformen der Erfindung enthalten Peptid gekoppelte Verbindungen, welche die in der Seq Id No. 1 offenbarten Peptidsequenz aminoterminal enthalten und carboxyterminal ein therapeutisches Agens tragen. Beispiele für ein solches Agens sind Chemotherapeutika, welche in der Tumortherapie Verwendung finden. Methoden zur Kopplung von therapeutischen Agenzien an Peptide sind dem Fachmann bekannt.
• Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, nicht aber zu begrenzen. Die Erfindung findet ihre Begrenzung ausschließlich in den Ansprüchen.
• Die in dieser Beschreibung genannten Publikationen werden durch Bezugnahme eingefügt.
• Ausführungsbeispiele
• Beispiel 1
• Untersuchung der Bindungsspezifität in Bezug auf unterschiedlich behandeltes humanes Kolagen IV
• Eine Mikrotiterplatte (Greiner BioOne GmbH, Deutschland) wurde zunächst mit 10 μg humanem Kollagen IV (Sigma, Deutschland), welches in 100 μl Dulbeccos Phosphat gepufferter Salzlösung (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄) (DPBS, Invitrogen, Deutschland) pro Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur beschichtet. Alternativ wurden die Vertiefungen mit 10 μg humanem Kollagen IV (Sigma, Deutschland), welches zuvor bei 99°C für 6 Minuten erhitzt wurde, in einem Volumen von 100 μl DPBS, wie oben beschrieben, pro Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur beschichtet. Alternativ wurden Vertiefungen mit 10 μg bovinem Serumalbumin (Reinheitsgrad 96%) (BSA, Sigma, Deutschland), welches in 100 μl Wasser, welches durch eine Millipore-Filteranlage gereinigt wurde (Leitfähigkeit 18,2 MΩcm), pro Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur beschichtet. Nicht gebundenes Kollagen beziehungsweise BSA wurde durch dreimaliges Waschen mit je 200 μl einer DPBS Lösung, welche 0,05% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, pro Vertiefung entfernt. Anschließend wurden je Vertiefung 200 μl einer 1%igen BSA (wie oben beschrieben)/DPBS-Lösung (wie oben beschrieben), welche 0,05% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, zugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte dreimaliges Waschen mit je 200 μl einer DPBS Lösung, welche 0,05% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, pro Vertiefung. In Vertiefungen, welchen keine Matrix-Metalloprotease zugegeben werden sollte, wurden jeweils 200 μl Wasser (wie oben beschrieben) eingefüllt. In weitere mit humanem Kollagen IV beschichtete Vertiefungen wurden unterschiedliche Matrix-Metalloproteasen, wie im Folgenden beschrieben, zugesetzt. Es wurden jeweils 260 ng der rekombinant hergestellten aktiven humanen Matrix-Metalloproteasen 2 und 9 (Calbiochem, Deutschland) verwendet. Sie wurden in einem Volumen von 100 μl in MMP 2 und 9-Puffer (25 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 20% Glycerol, 0,005 Brij-35, pH 7,5) verwendet. Es wurden jeweils 260 ng der humanen Matrix-Metalloproteasen 1 und 8 (Calbiochem, Deutschland) verwendet.
• Die humanen Matrix-Metalloproteasen 1 und 8 wurden mit 1 mM 4-Aminophenylquecksilberacetat aktiviert (Grant et al. (1987) J Biol Chem, 262, 5886), (Mallya et al. (1990) Biochemistry, 29,10628). Diese Proteasen wurden in einem Volumen von 100 μl MMP 1 und 8 Puffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 μM ZnCl₂, 0,05% Brij-35, pH 7,0) verwendet. Die Mikrotiterplatte wurde mit Parafilm (Sigma, Deutschland) abgedeckt und für mindestens 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Verbliebende Matrix-Metalloprotease wurde durch 30maliges Waschen mit jeweils 200 μl einer DPBS-Lösung, welche 0,2% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, pro Vertiefung entfernt. Den gewaschenen Vertiefungen wurden 200 μl Wasser, wie oben beschrieben, zugesetzt und mit Parafilm abgedeckt in einem Kühlschrank bei 8°C aufbewahrt. Die so beschichtete Mikrotiterplatte wurde jedoch innerhalb von 7 Tagen verwendet.
• Die Vertiefungen wurden mit jeweils 1 × 10¹¹ plaque forming units der zu untersuchenden Phagen, dem TLTYWS-Phagen und dem SRPQITN-Phagen, in einem Volumen von jeweils 100 μl in einer DPBS-Lösung, welche 0,2% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, in die wie oben beschrieben beschichteten Vertiefungen gegeben. Sie wurden unter Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht gebundene Phagen wurden durch 10maliges Waschen mit jeweils 200 μl einer DPBS-Lösung, welche 0,2% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, pro Vertiefung entfernt. Durch Zugabe von 100 μl einer Escherichia coli ER2738-Suspension mit einer optischen Dichte, gemessen bei 600 nm (OD_600nm), von 0,45 bis 0,5 und folgender Inkubation bei 37°C wurden die gebundenen Phagen von den Vertiefungen eluiert. Die Menge der eluierten Phagen wird durch Austitern mit einem Plaque-Assay bestimmt. Dazu wurden von der Bakterien-/Phagen-Suspension Verdünnungen in einer geometrischen Reihe in LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, 10 g/l NaCl) erstellt. 10 μl jeder Verdünnung wurden zu 200 μl einer Escherichia coli ER2738 Bakterien-Suspension mit einer OD_600nm von 0,48 bis 0,5 gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der so hergestellten Phagen/Bakterien-Mischung wurden 3 ml Top-Agarose (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl, 6 g/l Agarose) mit einer Temperatur zwischen 45°C und 50°C zugegeben und in einer Petrischale, welche LB-Medium unter Zusatz von 10 g/l Agar, 300 mg/l 3,4-Cyclohexeneoesculetin-β-D-galactopyranosid Natriumsalz (S-Gal^®, Sigma, Deutschland) und 1 mM Isopropyl β-D-thiogalactosid (IPTG, Sigma, Deutschland) enthielt, ausplattiert.
• Nach Erhärten der Top-Agarose wurden die Platten umgedreht bei 37°C für mindestens 18 Stunden inkubiert. Bei jeder Platte wurden anschließend die schwarz gefärbten Löcher im Bakterienrasen gezählt. Die Anzahl der Löcher im Bakterienrasen (Plaques) wurden mit der verwendeten Verdünnung multipliziert und gaben so die Anzahl der eluierten Phagen in einem Volumen von 10 μl ausgedrückt in der Einheit „plaque forming unit” (pfu) an. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 3 dargestellt. In der sind jeweils die ermittelten arithmetischen Mittelwerte dargestellt. Weiterhin wurde die Signifikanz der Ergebnisse mit dem t-Test für kleine Probenumfänge (Moore (1957), Biometrika 44 (3–4), 482–489) ermittelt. Die Ergebnisse des Signifikanz-Tests sind als Fehler 1. Ordnung (p-Werte) bezogen auf die Bindung des TLTYTWS-Phagen an MMP 2 modifiziertes humane Kollagen IV in den Tabellen 2 und 4 dargestellt. Tabelle 1

  TLTYTWS-Phage	arithmetischer Mittelwert (pfu/μl)
  hKollagen IV	3,48E+04
  hKollagen IV + rhMMP2	8,52E+05
  hKollagen IV + rhMMP9	8,18E+04
  hKollagen IV + hMMP1	1,30E+05
  hKollagen IV + hMMP8	3,66E+04
  hitze denaturiertes hKollagen IV	2,15E+03
  BSA	2,17E+04

  Tabelle 2

  TLTYTWS-Phage	p-Wert
  hKollagen IV	< 0,01
  hKollagen IV + rhMMP9	< 0,01
  hKollagen IV + hMMP1	< 0,01
  hKollagen IV + hMMP8	< 0,01
  hitze denaturiertes hKollagen IV	< 0,01
  BSA	< 0,02

  Tabelle 3

  SRPQITN-Phage	arithmetischer Mittelwert (pfu/μl)
  hKollagen IV	4,21E+04
  hKolllagen IV + rhMMP2	4,86E+04
  hKollagen IV + rhMMP9	3,32E+04
  hKollagen IV + hMMP1	4,58E+04
  hKollagen IV + hMMP8	8,00E+04
  hitze denaturiertes hKollagen IV	1,97E+04
  BSA	3,36E+04

  Tabelle 4

  SRPQITN-Phage	p-Wert
  hKollagen IV	< 0,05
  hKollagen IV + rhMMP2	< 0,01
  hKollagen IV + rhMMP9	< 0,01
  hKollagen IV + hMMP1	< 0,01
  hKollagen IV + hMMP8	< 0,01
  hitze denaturiertes hKollagen IV	< 0,01
  BSA	< 0,05

• Beispiel 2
• Auswirkung von Veränderungen der Peptidsequenz des Phagen auf die Bindung an durch Matrix-Metalloprotease 2 modifiziertem humanem Kollagen IV
• Wie im Beispiel 1 beschrieben wurden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, welche mit 10 μg humanem Kollagen IV beschichtet waren und anschließend mit jeweils 260 ng rekombinanter aktiver humaner Matrix-Metalloprotease 2 inkubiert wurden, verwendet. Je Vertiefung wurden jeweils 1 × 10¹¹ plaque forming units den zu untersuchenden Phagen, dem GLGYGWS-Phagen, dem TGTYTWS-Phagen, dem TLTYTGS-Phagen und dem LKQNGGNFSL-Phagen in einem Volumen von jeweils 100 μl in einer DPBS-Lösung, welche 0,2% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, in die wie oben beschrieben beschichteten Vertiefungen gegeben. Sie wurden unter Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht gebundene Phagen wurden durch 10maliges Waschen mit jeweils 200 μl einer DPBS-Lösung, welche 0,2% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, pro Vertiefung entfernt. Durch Zugabe von 100 μl einer Escherichia coli ER2738-Suspension mit einer optischen Dichte, gemessen bei 600 nm (OD_600nm), von 0,45 bis 0,5 und folgender Inkubation bei 37°C wurden die gebundenen Phagen von den Vertiefungen eluiert. Die Menge der eluierten Phagen wird durch Austitern mit einem Plaque-Assay bestimmt. Dazu wurden von der Bakterien-/Phagen-Suspension Verdünnungen in einer geometrischen Reihe in LB-Medium erstellt. 10 μl jeder Verdünnung wurden zu 200 μl einer Escherichia coli ER2738 Bakterien-Suspension mit einer OD_600nm von 0,48 bis 0,5 gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der so hergestellten Phagen/Bakterien-Mischung wurden 3 ml Top-Agarose (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl, 6 g/l Agarose) mit einer Temperatur zwischen 45°C und 50°C zugegeben und in einer Petrischale, welche LB-Medium unter Zusatz von 10 g/l Agar, 300 mg/l S-Gal^® (Sigma, Deutschland) und 1 mM IPTG (Sigma, Deutschland) enthielt, ausplattiert. Nach Erhärten der Top-Agarose wurden die Platten umgedreht bei 37°C für mindestens 18 Stunden inkubiert. Bei jeder Platte wurden anschließend die schwarz gefärbten Löcher im Bakterienrasen gezählt. Die Anzahl der Löcher im Bakterienrasen (Plaques) wurden mit der verwendeten Verdünnung multipliziert und gaben so die Anzahl der eluierten Phagen in einem Volumen von 10 μl ausgedruckt in der Einheit „plaque forming unit” (pfu) an. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 dargestellt. In der sind jeweils die ermittelten arithmetischen Mittelwerte dargestellt.
• Weiterhin wurde die Signifikanz der Ergebnisse mit dem t-Test für kleine Probenumfänge (Moore (1957), wie oben genannt) ermittelt. Die Ergebnisse des Signifikanz-Tests sind als Fehler 1. Ordnung (p-Werte) bezogen auf die Bindung des TLTYTWS-Phagen an MMP 2 modifiziertes humane Kollagen IV in der Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 5

  Phage	arithmetischer Mittelwert (pfu/μl)
  LKQNGGNFSL-Phage	2,02E+03
  GLGYGWS-Phage	8,59E+03
  TGTYTWS-Phage	1,67E+04
  TLTYTGS-Phage	3,81E+04
  TLTYTWS-Phage	8,52E+05

  Tabelle 6

  Phage	p-Wert
  LKQNGGNFSL-Phage	< 0,01
  GLGYGWS-Phage	< 0,01
  TGTYTWS-Phage	< 0,01
  TLTYTGS-Phage	< 0,01

• Beispiel 3
• Inhibition der Bindung des TLTYTWS-Phagen an durch MMP 2 modifiziertem humanem Kollagen IV durch Inkubation mit dem chemisch synthetisierten Peptid, welches als Sequenzidentifikations-Nr 3 offenbart wurde.
• Wie im Beispiel 1 beschrieben wurden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, welche mit 10 μg humanem Kollagen IV beschichtet waren und anschließend mit jeweils 260 ng rekombinanter aktiver humaner Matrix-Metalloprotease 2 inkubiert wurden, verwendet. Zunächst erfolgte die Zugabe unterschiedlicher Mengen des in der Seq Id No. 3 offenbarten Peptids in die einzelnen Vertiefungen in einem Volumen von 100 μl DPBS-Lösung. Es folgte eine einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Anschließend wurde die überstehende Lösung entfernt. In jeder der so behandelten Vertiefungen wurden 1 × 10¹¹ plaque forming units der TLTYTWS-Phagen in einem Volumen von 100 μl in einer DPBS-Lösung, welche 0,2% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, in die wie oben beschrieben vorbehandelten Vertiefungen gegeben. Sie wurden unter Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht gebundene Phagen wurden durch 10maliges Waschen mit jeweils 200 μl einer DPBS-Lösung, welche 0,2% Tween20 (Sigma, Deutschland) enthielt, pro Vertiefung entfernt. Durch Zugabe von 100 μl einer Escherichia coli ER2738-Suspension mit einer optischen Dichte, gemessen bei 600 nm (OD_600nm), von 0,45 bis 0,5 und folgender Inkubation bei 37°C wurden die gebundenen Phagen von den Vertiefungen eluiert. Die Menge der eluierten Phagen wird durch Austitern mit einem Plaque-Assay bestimmt Dazu wurden von der Bakterien-/Phagen-Suspension Verdünnungen in einer geometrischen Reihe in LB-Medium erstellt. 10 μl jeder Verdünnung wurden zu 200 μl einer Escherichia coli ER2738 Bakterien-Suspension mit einer OD_600nm von 0,48 bis 0,5 gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der so hergestellten Phagen/Bakterien-Mischung wurden 3 ml Top-Agarose (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl, 6 g/l Agarose) mit einer Temperatur zwischen 45°C und 50°C zugegeben und in einer Petrischale, welche LB-Medium unter Zusatz von 10 g/l Agar, 300 mg/l S-Gal^® (Sigma, Deutschland) und 1 mM IPTG (Sigma, Deutschland) enthielt, ausplattiert. Nach Erhärten der Top-Agarose wurden die Platten umgedreht bei 37°C für mindestens 18 Stunden inkubiert. Bei jeder Platte wurden anschließend die schwarz gefärbten Löcher im Bakterienrasen gezählt.
• Die Anzahl der Löcher im Bakterienrasen (Plaques) wurden mit der verwendeten Verdünnung multipliziert und gaben so die Anzahl der eluierten Phagen in einem Volumen von 10 μl ausgedrückt in der Einheit „plaque forming unit” (pfu) an. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 dargestellt. In der sind jeweils die ermittelten arithmetischen Mittelwerte dargestellt. Zusätzlich wurde eine Trendlinie eingefügt, welche die Dosisabhängigkeit der Inhibition zeigt. Weiterhin wurde die Signifikanz der Ergebnisse mit dem t-Test für kleine Probenumfänge (Moore (1957), wie oben genannt) ermittelt. Die Ergebnisse des Signifikanz-Tests sind als Fehler 1. Ordnung (p-Werte) bezogen auf die Bindung des TLTYTWS-Phagen an MMP 2 modifiziertes humane Kollagen IV in der Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 6

  Peptid (μg × 10–6)	arithmetischer Mittelwert pfu/μl)
  0	3,20E+04
  1	1,61E+04
  10	2,57E+03
  100	5,55E+03
  1000	4,22E+03
  10000	3,55+03
  100000	4,29E+03

  Tabelle 7

  Peptid (μg × 10–6)	p-Wert
  1	< 0,1
  10	< 0,02
  100	< 0,05
  1000	< 0,02
  10000	< 0,05
  100000	< 0,01

• Beispiel 4
• Untersuchung der Eigenschaft des TLTYTWS-Phagen sich in einem Tumor einzufinden
• Diese Untersuchung wurde an einem Tumor-Maus Modell als drei unabhängige Versuche durchgeführt.
• Einer weiblichen 8 Wochen alten NMRI nu/nu Nacktmaus (Charles River Laboratories, Deutschland) wurden an beiden Oberschenkeln 1 × 10⁷ Lewis-Lung-Carcinoma Zellen (LLC (Cell-Line-Services, Deutschland) unter die Haut mittels einer Insulinspritze (BD Bioscience, Deutschland) injiziert. Innerhalb der folgenden 2 Wochen entwickelten sich an den Oberschenkeln Tumore. Die Haltung der Maus erfolgte entsprechend der tierschutzrechtlichen Bestimmungen bei ad libitum Fütterung. Nach 2 Wochen wurde die Maus mittels Gabe von 250 μl einer Ketamin/Xylazin-Mischung (8% Rompun^®, 10% Ketamin in einer 0,9%igen NaCl-Lösung) in das Peritoneum anästhesiert. Es folgte die Injektion von 1 × 10¹¹ plaque-forming units des zu untersuchenden Phagen, dem TLTYTWS-Phagen oder dem SRPQITN-Phagen (Kontrollphage), in die Schwanzvene mittels Insulinspritze. Nach einer Zirkulationszeit von 10 Minuten wurde der Brustkorb der anästhesierten Maus eröffnet. In die linke Herzkammer des schlagenden Herzens wurden, nach Durchtrennen der Aorta, mindestens 10 ml einer sterilen DPBS-Lösung, wie oben beschrieben, infundiert. Dabei wurden das Blut und darin enthaltene nicht gebundene Phagen aus dem Organismus entfernt. Dem nun toten Tier wurden beide Tumore und folgende Organe entnommen. Bei den zu untersuchenden Organen handelte es sich um das Gehirn, das Herz, die Lunge, die Leber, beide Nieren, die Milz und den Magen. Die entnommenen Organe und die Tumore wurden gewogen und mittels eines Homogenisators in LB-Medium, wie oben beschrieben, zerkleinert. Die so gewonnen Homogenate wurden bei 2700 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Der unlösliche Homogenatanteil wurde anschließend 4 mal mit jeweils 1 ml einer DPBS-Lösung gewaschen. Zur Eluation der Phagen wurden 900 μl einer Escherichia coli ER 2738 Bakteriensuspension mit einer OD_600nm von 0,45 dem gewaschenen Homogenat zugegeben. Es schloss sich eine 30minütige Inkubation bei 37°C an. Nach dieser Inkubation wurden 10 μl der Suspension zur Bestimmung des Phagentiters mittels des oben beschriebenen Plaque-Assays verwendet. Die Werte wurden unter Berücksichtigung der eingesetzten Phagenmenge als „output/input-Verhältnis pro g Gewebe” ausgedrückt (Tabelle 8).
• Zur besseren Darstellung des Versuchsergebnisses wurden die Werte als „fache der Kontrolle” bezogen auf die einzelnen Organe in der dargestellt. Die für die Abbildung verwendeten Werte sind in Tabelle 8a dargestellt. Weiterhin wurde die Signifikanz der Ergebnisse für die Tumorgewebe des TLTYTWS-Phagen und des SRPQITN-Phagen mit dem t-Test für kleine Probenumfänge (Moore (1957), wie oben genannt) ermittelt. Es ergab sich als Fehler 1. Ordnung (p-Werte) für den Unterschied der Phagenmenge im Tumorgewebe von p < 0,5. Tabelle 8

  TLTYTWS-Phage
  Gewebe	Einzelwerte (output/input/g Gewebe)
  Hirn	7,37E–05	6,78E–06	7,09E–06
  Muskel	2,49E–05	6,06E–05	3,17E–05
  Tumor	1,41E–03	2,35E–03
  Magen	1,98E–04	5,07E–05	1,47E–04
  Niere	3,87E–04	7,41E–04	1,03E–03
  Herz	1,39E–04	3,28E–04	8,61E–04
  Lunge	1,66E–02	1,43E–02	8,73E–03
  Milz	9,33E–03	2,39E–02	5,85E–02
  Leber	1,08E–03	1,45E–03	3,51E–03

  SRPQITN-Phage
  Gewebe	Mittelwert (output/input/g Gewebe)
  Hirn	1,72E–04
  Muskel	6,17E–04
  Tumor	5,06E–04
  Magen	1,11E–03
  Niere	3,32E–03
  Herz	8,88E–03
  Lunge	2,39E–02
  Milz	2,44E–02
  Leber	1,41E–02

  Tabelle 8a

  Gewebe	fache des Kontrollphagen
  Hirn	0,17
  Muskel	0,06
  Tumor	3,71
  Magen	0,12
  Niere	0,22
  Herz	0,05
  Lunge	0,55
  Milz	1,25
  Leber	0,14

• Beispiel 5
• Inhibition der Angiogenese durch das TLTYTWS-Peptid (Seq Id No. 3) in-vitro (Teil a) und in-vivo (Teil b)
• a) Untersuchung in-vitro
• In die Vertiefungen einer „24-well”-Platte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) wurden 100 μl Wachstumsfaktor reduzierte Matrigel (BD, Heidelberg, Deutschland) je Vertiefung gegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Je Vertiefung wurden nun 5 × 10⁴ humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC; PromoCell, Heidelberg, Deutschland) in je 1 ml HUVEC-Wachstumsmedium (PromoCell; enthielt lng/ml basic Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)) gegeben. Weiterhin wurden bei je drei Vertiefungen 0,1; 1 oder 10 μg des Peptides (Seq Id No. 3) zugegeben. Es wurden jeweils Triplikate durchgeführt. Die Platte wurde für 16 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Bei dem sich bildenden tubulären Netzwerk wurden jeweils die Verknüpfungspunkte je Gesichtsfeld gezählt. Je Vertiefung wurden 6 Gesichtsfelder ausgezählt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 und in der dargestellt. In der ist die Reduktion der Verzweigungspunkte in % gegenüber der Peptidmenge dargestellt. Zusätzlich wurde eine Trendlinie eingefügt, welche eine lineare Korrelation zwischen der Reduktion der Verzweigungspunkte und der zugegeben Peptid-Menge zeigt. Weiterhin wurde die Signifikanz der Ergebnisse mit dem t-Test für kleine Probenumfänge (Moore (1957), am angegebenem Ort) ermittelt. Die Ergebnisse des Signifikanz-Tests sind als Fehler 1. Ordnung (p-Werte) bezogen auf das Experiment ohne Zugabe des Peptides sind in der Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 9

  Probe	arithmetrischer Mittelwert	% Reduktion der Verzweigungspunkte
  ohne Peptid	35,3888889	0
  0.1 μg Peptid	27,0555556	23,5478807
  1 μg Peptid	21,6111111	38,9324961
  10 μg Peptid	13,8650794	60,8208118

  Tabelle 10

  Peptid (in μg)	P-Wert
  0,1	< 0,05
  1	< 0,05
  10	< 0,01

• b) Untersuchung in-vivo
• Zur Untersuchung der Angiogenese in-vivo wurde der Matrigel-Plug-Versuch verwendet. Dazu wurden jeweils 500 μl wachstumsfaktor reduziertes Matrigel (BD) mit 200 ng bFGF gemischt. Dieser Mischung wurden 1; 5 oder 10 μg Peptid (Seq Id No. 3) zugegeben. Diese Mischung wurde einer weiblichen CD1-Maus subkutan in die Flanke injiziert. Nach 14 Tagen wurde die Maus getötet, der aus der Injektion entstandene Plug entnommen, durch Ultraschall homogenisiert, und der Hämoglobin-Gehalt nach der Drabkin-Methode (Drabkin (1935) J Biol Chem. 112: 51) bestimmt. Der Hämoglobin-Gehalt des Matrigel-Plugs ist ein Maß für die stattgefundene Angiogenese. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 11 und in der dargestellt. In der ist die Reduktion der Verzweigungspunkte in % gegenüber der Peptidmenge dargestellt. Zusätzlich wurde eine Trendlinie eingefügt, welche einen logarithmischen Zusammenhang in Form einer Sättigungskurve zwischen der Reduktion der Angiogenese und der zugegeben Peptid-Menge zeigt. Weiterhin wurde die Signifikanz der Ergebnisse mit dem t-Test für kleine Probenumfänge (Moore (1957), am angegebenem Ort) ermittelt. Die Ergebnisse des Signifikanz-Tests sind als Fehler 1. Ordnung (p-Werte) bezogen auf das Experiment ohne Zugabe des Peptides sind in der Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 11

  Probe	arithmetrischer Mittelwert	% Reduktion des Hämoglobingehalts
  200 ng bFGF	69,1982627	0
  200 ng bFGF + 1 μg Peptid	23,8113356	76,1886644
  200 ng bFGF + 5 μg Peptid	20,5571811	79,4428189
  200 ng bFGF + 10 μg Peptid	9,76024798	90,239752

  Tabelle 12

  Peptid (in μg)	P-Wert
  1	> 0,1
  5	> 0,1
  10	< 0,05

• Sequenzprotokoll – freier Text
• Zu Seq. ID No. 3:
• Amidation; dieser freie Text bezieht sich auf die Amidierung des C-Terminus des Oligopeptids
• Zu Seq. ID No. 4:
• Binding; Bindung eines Fluorochroms an die Seitenkette des Lysins am C-Terminus des Oligopeptids
• Amidation; dieser freie Text bezieht sich auf die Amidierung des C-Terminus des Oligopeptids

Claims (11)

1. Ein Oligopeptid mit einer aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 1.
2. Ein Oligopeptid mit einer aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 2
3. Ein Oligopeptid mit einer aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 3.
4. Verbindung bestehend aus einem Oligopeptid mit einer Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 4, bei der an die carboxyterminale Aminosäure ein Fluorochrom gebunden ist.
5. Verbindung bestehend aus einem Oligopeptid mit der aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 3 und einem daran gekoppelten paramagnetischen Partikel.
6. Verbindung bestehend aus einem Oligopeptid mit der aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 1 und einem an den Carboxyterminus des Peptids gebundenen Metallchelator.
7. Verbindung bestehend aus einem Oligopeptid mit der aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 1 und einem carboxyterminal gebundenem radioaktivem Isotop.
8. Verbindung bestehend aus einem Oligopeptid mit der aminoterminalen Aminosäure-Sequenz Seq. ID No. 1 und einem carboxyterminal gebundenem therapeutischen Agens.
9. Eine pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet dadurch, dass sie einen Stoff nach den Patentansprüchen 4–8 enthält.
10. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Patentanspruch 9 zur Diagnostik eines pathologischen Zustandes, welcher durch angiogene Vorgänge gekennzeichnet ist.
11. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Patentanspruch 9 zur Therapie eines pathologischen Zustandes, welcher durch angiogene Vorgänge gekennzeichnet ist.

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