CN105111287B - 一种用于体内外凋亡成像探针的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于体内外凋亡成像探针的多肽及其用途，所述多肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；该多肽对诱导凋亡后的细胞具有显著的结合能力，并可以特异性地结合到在凋亡细胞胞浆内大量聚集的HSP60蛋白上。本发明的多肽可应用于体外细胞凋亡成像或者体内凋亡染色方面，该多肽类探针在体内易于清除，为肿瘤等疾病的研究和治疗提供了重要的新技术和新方法。

Description

一种用于体内外凋亡成像探针的多肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多肽及其用途，尤其涉及一种用于体内外凋亡成像探针的多肽及其用途。

背景技术

细胞凋亡是最常见的一种细胞程序性死亡的方式，不仅在生长发育等生理过程中发挥着重要作用，同时更与许多疾病的发生、发展以及治疗过程息息相关。比如，心脏中心肌细胞的过度凋亡是心力衰竭等心血管疾病的重要诱因；而组织中过少的细胞凋亡也可能导致增生性疾病、癌症等的发生。更值得注意的是，目前已有研究表明，在癌症治疗过程中，化疗和放疗会引起肿瘤组织中细胞凋亡的明显增加，这种由治疗诱导的凋亡可以作为评价肿瘤治疗效果的一个重要指标。因此凋亡探针的研发及其在细胞凋亡成像中的应用研究将为肿瘤等疾病的研究和治疗提供重要的新技术和新方法。

目前体外应用最为广泛的凋亡探针主要有两大类：(1)针对在凋亡期间从细胞膜内侧翻至外侧的磷脂酰丝氨酸(PS)的膜联蛋白(annexin V)；(2)在凋亡过程中高度活化的半胱天冬酶(caspase)激酶家族为靶标的抗体。对于体内成像研究，目前主要集中在对已有的体外探针进行修饰，比如采用放射性元素修饰膜联蛋白(annexin V)，以此作为显影剂，可在单光子发射计算机断层成像(SPECT)或正电子发射计算机断层成像(PET)上对体内凋亡进行成像。然而由于这类大分子蛋白类物质在体内清除速率较慢，从而造成信噪比较低，难以应用到临床。除了上述两种探针之外，其他类别的探针极少有文献报道。

热休克蛋白60(HSP60)是一种主要存在于线粒体内的分子伴侣。曹智等研究了热休克蛋白60的抗细胞凋亡与促细胞凋亡作用，其提出：线粒体HSP60发挥抗凋亡作用主要有两条途径：1)直接影响线粒体内的凋亡相关因子，抑制线粒体凋亡通路的激活：2)保护线粒体呼吸链的完整性，减少氧自由基产生，间接抑制凋亡。胞浆中的HSP60可通过影响凋亡相关因子而抑制凋亡(参见曹智等，“热休克蛋白60的抗细胞凋亡与促细胞凋亡作用”，节能环保和谐发展-2007中国科协年会论文集(二)，2007年9月1日)。因此HSP60是细胞凋亡成像的潜在靶点。

由于多肽易于合成，在人体内易于代谢并且不会带来毒副作用和严重的免疫反应，目前已有一些文献报道了将多肽用于靶向凋亡细胞，例如CN102177174A公开了一种以特异方式靶向正在凋亡的凋亡细胞的肽，其可以有效靶向肿瘤、心肌梗塞、中风及动脉硬化组织里发生的凋亡，可与影像物质结合而广泛应用于细胞凋亡成像。CN102014970A公开了将99mTc标记的含19个氨基酸的多肽作为磷脂酰乙醇胺结合分子探针用于检测细胞凋亡/坏死。CN101965356A公开了一种以特异方式与磷脂酰丝氨酸结合的多肽，该多肽与磷脂酰丝氨酸的组成物可作为有效成分用于检测凋亡细胞及肿瘤细胞以及成像。然而，由于磷脂酰丝氨酸也会表达在正常细胞上，比如活化的B细胞或T细胞，因此针对该靶点的多肽应用于体内时容易造成假阳性。同时采用放射性核素标记进行显影，不仅合成成本相对较高，而且由于放射污染，对实验环境也有严格的限制，不利于科学研究和临床推广。

从目前的研究来看，并未发现能够特异性结合到凋亡细胞中热休克蛋白60(HSP60)上的多肽，因此，研发一种新型体外、体内凋亡成像的多肽类探针，为肿瘤等疾病的研究和治疗提供可能的新技术和新方法，是目前亟待解决的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种多肽及其用途，特别提供了一种用于体内外凋亡成像探针的多肽及其在体外细胞凋亡成像或者体内凋亡染色方面的用途。该多肽类探针在人体中易于清除，为肿瘤等疾病的研究和治疗提供了重要的新技术和新方法。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于体内外凋亡成像探针的多肽，所述多肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：1具有如下氨基酸序列：

GDQNLQGPMLQGDPGFQRCIDGNVRLVFLFRG(P17)

本发明的多肽可通过人工化学合成制得。

本发明的多肽能够特异性地与凋亡细胞结合。

作为本发明进一步的改进，所述多肽可以特异性地结合到凋亡细胞胞浆内的HSP60蛋白上。由于在细胞凋亡过程中，HSP60在细胞内表达量大，使得结合该靶点的多肽在凋亡细胞内的结合量极高，相比于已有探针，应用该多肽更容易区分凋亡细胞和正常细胞。

本发明的多肽对诱导凋亡后的细胞具有显著结合能力，而在正常生长的细胞上结合极少。所述多肽对诱导凋亡细胞的结合能力通过多肽探针在细胞模型上的凋亡成像和流式细胞仪检测细胞内荧光强度方法进行检测。

本发明的多肽随着细胞凋亡程度增加，结合量逐渐增加，呈现出正相关关系。随着细胞凋亡程度增加，所述多肽的结合量逐渐增加，呈现出线性关系。

本发明所述细胞包括但不限于：体细胞、肿瘤细胞或白血病细胞，优选为白血病细胞。

作为本发明进一步的改进，所述体细胞为心肌母细胞。

作为本发明进一步的改进，所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞或乳腺癌细胞。

第二方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码如本发明第一方面所述的多肽的核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如本发明第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本发明还提供了一种用于检测凋亡细胞的组合物，其包含如本发明第一方面所述的多肽。

第五方面，本发明还提供了一种用于成像患肿瘤病症部位的组合物，其包含如本发明第一方面所述的多肽。

第六方面，本发明还提供了根据本发明第一方面所述的多肽在制备体外细胞凋亡成像或体内凋亡染色用制剂中的用途。

第七方面，本发明还提供了根据本发明第一方面所述的多肽在制备用于治疗、预防或诊断肿瘤或白血病的药物或成像制剂中的用途。

作为本发明进一步的改进，所述肿瘤为宫颈癌或乳腺癌。

本发明的多肽在成瘤小鼠注射抗癌药物治疗后，可以在肿瘤内部聚集。

作为本发明进一步的改进，所述肿瘤为乳腺癌。

作为本发明进一步的改进，所述抗癌药物为环磷酰胺。

本发明的多肽能够结合在肿瘤组织中的凋亡区域，并且可以进行体内凋亡染色。

作为本发明进一步的改进，所述肿瘤为乳腺癌。

本发明的多肽能够用于评价肿瘤或白血病的治疗效果。

作为本发明进一步的改进，所述肿瘤为宫颈癌和乳腺癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所述的多肽可以高效地结合到凋亡细胞上，其在凋亡细胞上的结合强度比正常细胞高出10倍以上，通过荧光显微镜观察或流式细胞术检测的方法均能将凋亡细胞与正常细胞明显区分出来。该多肽特异性地结合到凋亡细胞胞浆内的HSP60蛋白上，其对诱导凋亡后的细胞具有显著结合能力，在体内能够结合在肿瘤组织中的凋亡区域，并且可以进行体内凋亡染色，在人体中易于清除，为评价肿瘤或白血病治疗效果提供了可行的方法和技术。

附图说明

图1为P17多肽探针体外细胞凋亡成像结果图；

其中，图1A-1B为P17多肽探针在Jurkat细胞模型上的凋亡成像结果图；图1C-1D为P17多肽探针在THP-1细胞模型上的凋亡成像结果图；图1E-1F为P17多肽探针在K-562细胞模型上的凋亡成像结果图；图1G-1H为P17多肽探针在Hela细胞模型上的凋亡成像结果图；图1I-1J为P17多肽探针在DU4475细胞模型上的凋亡成像结果图；

图2为P17多肽探针体外检测细胞凋亡流式结果图；

其中，图2A为P17多肽探针在Jurkat细胞模型上的凋亡流式结果图，图2B为P17多肽探针在THP-1细胞模型上的凋亡流式结果图，图2C为P17多肽探针在Hela细胞模型上的凋亡流式结果图，图2D为P17多肽探针在MDA-MB-231细胞模型上的凋亡流式结果图，图2E为P17多肽探针在K-562细胞模型上的凋亡流式结果图，图2F为P17多肽探针在H9c2细胞模型上的凋亡流式结果图；

图3为P17多肽探针结合量与细胞凋亡程度线性相关图；

图4为P17多肽探针与靶蛋白HSP60共定位结果图；

其中，图4A为P17多肽与凋亡细胞结合图；图4B为HSP60抗体与凋亡细胞结合图；图4C为P17多肽与HSP60抗体合并图；

图5为P17多肽探针体内凋亡成像结果图；

图6为P17多肽探针凋亡组织染色结果图；

其中，图6A为DAPI对细胞核染色的结果图；图6B为经尾静脉注射后P17多肽在肿瘤组织中染色结果图；图6C为TUNEL检测法对相同组织区域染色结果图；图6D为DAPI、P17多肽与TUNEL染色合并结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

除非特别指明，以下实施例中所用的体细胞系人心肌细胞(H9c2)、肿瘤细胞系宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺上皮细胞(DU4475)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和白血病细胞系(K-562、Jurkat、THP-1)均购自中国医学科学院。

实施例1：P17多肽的合成

按照如下序列合成P17多肽(由上海科肽生物科技有限公司合成，纯度为98％)，实验前配制成合适浓度的母液。

GDQNLQGPMLQGDPGFQRCIDGNVRLVFLFRG

实施例2：P17多肽探针在Jurkat细胞模型上的凋亡成像

向正常生长的Jurkat细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M异硫氰酸荧光素(FITC)标记的P17多肽(FITC-P17)，37℃孵育2h。用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞以除去未结合的P17多肽，之后使用核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。

采用激光共聚焦显微镜进行观察，如图1A-1B所示，在488nm激发下，可见P17绿色荧光；在405nm激发下，可见细胞核蓝色荧光。说明P17多肽对诱导凋亡后的细胞具有显著结合能力，而在正常生长的细胞上结合极少。

实施例3：P17多肽探针在THP-1细胞模型上的凋亡成像

向正常生长的THP-1细胞培养体系中加入100ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M异硫氰酸荧光素(FITC)标记的P17多肽(FITC-P17)，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，之后使用DAPI对细胞核进行染色。

采用激光共聚焦显微镜进行观察，如图1C-1D所示，在488nm激发下，可见P17绿色荧光；在405nm激发下，可见细胞核蓝色荧光。说明P17多肽对诱导凋亡后的细胞具有显著结合能力，而在正常生长的细胞上结合极少。

实施例4：P17多肽探针在K-562细胞模型上的凋亡成像

向正常生长的K-562细胞培养体系中加入100ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的P17多肽(FITC-P17)，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，之后使用DAPI对细胞核进行染色。

采用激光共聚焦显微镜进行观察，如图1E-1F所示，在488nm激发下，可见P17绿色荧光；在405nm激发下，可见细胞核蓝色荧光。说明P17多肽对诱导凋亡后的细胞具有显著结合能力，而在正常生长的细胞上结合极少。

实施例5：P17多肽探针在Hela细胞模型上的凋亡成像

向正常生长的Hela细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，之后使用DAPI对细胞核进行染色。

采用激光共聚焦显微镜进行观察，如图1G-1H所示，在488nm激发下，可见P17绿色荧光；在405nm激发下，可见细胞核蓝色荧光。说明P17多肽对诱导凋亡后的细胞具有显著结合能力，而在正常生长的细胞上结合极少。

实施例6：P17多肽探针在DU4475细胞模型上的凋亡成像

向正常生长的DU4475细胞培养体系中加入100ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，之后使用DAPI对细胞核进行染色。

采用激光共聚焦显微镜进行观察，如图1I-1J所示，在488nm激发下，可见P17绿色荧光；在405nm激发下，可见细胞核蓝色荧光。说明P17多肽对诱导凋亡后的细胞具有显著结合能力，而在正常生长的细胞上结合极少。

实施例7：P17多肽探针在Jurkat细胞模型上的凋亡检测

向正常生长的Jurkat细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，同时使用annexin V/溴化丙啶(PI)双染法对细胞凋亡程度进行检测。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。如图2A所示，P17对诱导凋亡后的细胞的结合强度显著高于正常生长的细胞，该结果与annexin V/PI检测结果一致。

实施例8：P17多肽探针在THP-1细胞模型上的凋亡检测

向正常生长的THP-1细胞培养体系中加入100ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，同时使用annexin V/PI双染法对细胞凋亡程度进行检测。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。如图2B所示，P17对诱导凋亡后的细胞的结合强度显著高于正常生长的细胞，该结果与annexin V/PI检测结果一致。

实施例9：P17多肽探针在Hela细胞模型上的凋亡检测

向正常生长的Hela细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，同时使用annexin V/PI双染法对细胞凋亡程度进行检测。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。如图2C所示，P17对诱导凋亡后的细胞的结合强度显著高于正常生长的细胞，该结果与annexin V/PI检测结果一致。

实施例10：P17多肽探针在MDA-MB-231细胞模型上的凋亡检测

向正常生长的MDA-MB-231细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，同时使用annexin V/PI双染法对细胞凋亡程度进行检测。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。如图2D所示，P17对诱导凋亡后的细胞的结合强度显著高于正常生长的细胞，该结果与annexin V/PI检测结果一致。

实施例11：P17多肽探针在K-562细胞模型上的凋亡检测

向正常生长的K-562细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，同时使用annexin V/PI双染法对细胞凋亡程度进行检测。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。如图2E所示，P17对诱导凋亡后的细胞的结合强度显著高于正常生长的细胞，该结果与annexin V/PI检测结果一致。

实施例12：P17多肽探针在H9c2细胞模型上的凋亡检测

向正常生长的H9c2细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。分别向正常生长组和诱导凋亡组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，同时使用annexin V/PI双染法对细胞凋亡程度进行检测。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。如图2F所示，P17对诱导凋亡后的细胞的结合强度显著高于正常生长的细胞，该结果与annexin V/PI检测结果一致。

实施例13：P17多肽探针结合量与细胞凋亡程度的相关性

向正常生长的Jurkat细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，在37℃孵育分别孵育6h、12h、24h，诱导不同程度细胞凋亡。分别向正常生长组和不同凋亡程度组加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17，同时使用annexin V/PI双染法对细胞凋亡程度进行检测。采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。如图3所示，流式结果表明，随细胞凋亡程度增加，P17结合量逐渐增加，呈现出线性关系。

实施例14：P17多肽探针与靶蛋白HSP60共定位

向正常生长的Jurkat细胞培养体系中加入10ng/mL的TRAIL蛋白，37℃孵育24h，诱导细胞凋亡。然后加入10M的FITC-P17，37℃孵育2h。用PBS洗涤细胞以除去未结合的P17。之后使用HSP60抗体进行染色，用PBS洗去未结合的抗体。使用DAPI对细胞核进行染色。采用激光共聚焦显微镜进行观察，如图4A-4C所示，在488nm激发下，可见P17绿色荧光；在647nm激发下，可见HSP60抗体红色荧光；在405nm激发下，可见细胞核蓝色荧光；图中有大片P17与HSP60抗体的共染色区域，表明P17结合的靶蛋白是HSP60。

实施例15：P17多肽探针体内凋亡成像

BALB/c小鼠腹股沟皮下接种4T1肿瘤，8天后，已明显成瘤。腹腔注射环磷酰胺。一天后，尾静脉注射100nmol的FITC-P17，一小时后，处死小鼠，取出肿瘤进行活体成像。从图5中可以看到，与注射生理盐水的对照组相比，注射P17的肿瘤内可见明显荧光信号，说明P17在环磷酰胺治疗后，在肿瘤内部聚集。

实施例16：P17多肽探针凋亡组织染色

BALB/c小鼠腹股沟皮下接种4T1肿瘤，8天后，已明显成瘤。腹腔注射环磷酰胺。一天后，尾静脉注射100nmol的FITC-P17，一小时后，处死小鼠，取出肿瘤组织，迅速冻于液氮中。制作厚度为10m的冰冻切片。然后进行标准凋亡试剂TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)染色。最后采用DAPI对细胞核进行染色，中性树胶封片后，于激光显微镜下观察。从图6A-6D中可以明显看出P17的绿色荧光和TUNEL的红色荧光，且两者几乎定位在相同区域，证明P17结合的是肿瘤组织中的凋亡区域，表明P17可以进行体内凋亡染色。

上述实验显示：本发明所述的用于体内外凋亡成像探针的多肽可以特异性地结合到凋亡细胞上，对诱导凋亡后的细胞具有显著的结合能力，在体内能够结合在肿瘤组织中的凋亡区域，并且可以进行体内凋亡染色，该多肽序列为评价肿瘤或白血病治疗效果提供了可行的方法和技术。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.一种用于体内外凋亡成像探针的多肽，其特征在于，所述多肽为如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述多肽特异性地与凋亡细胞结合。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽特异性地结合到凋亡细胞胞浆内的HSP60蛋白上。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述细胞为体细胞、肿瘤细胞或白血病细胞。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述细胞为白血病细胞。

5.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述体细胞为心肌母细胞；所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞或乳腺癌细胞。

6.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求6所述的DNA片段。

8.一种用于检测凋亡细胞的组合物，其特征在于，其包含如权利要求1所述的多肽。

9.一种用于成像患肿瘤病症部位的组合物，其特征在于，其包含如权利要求1所述的多肽。

10.根据权利要求1所述的多肽在制备体外细胞凋亡成像或体内凋亡染色用制剂中的用途。

11.根据权利要求1所述的多肽在制备用于治疗、预防或诊断肿瘤或白血病的药物或成像制剂中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌或乳腺癌。