CN102821777B - 神经丝肽用于神经胶质瘤的治疗的用途 - Google Patents

神经丝肽用于神经胶质瘤的治疗的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种治疗恶性神经胶质瘤的新药，神经胶质瘤是中枢神经系统（CNS）原发性肿瘤最普遍的类型。本发明的确显示分离的NFL-TBS40-63肽对于神经胶质瘤细胞是高度特异性的，在其中其引发凋亡。因此呈现于此处用在用于治疗恶性神经胶质瘤的方法中。本发明还涉及NFL-TBS40-63肽用于体内、或体外特异性检测神经胶质瘤细胞、或用于向所述肿瘤细胞递送化学化合物的用途。

Description

神经丝肽用于神经胶质瘤的治疗的用途
背景技术
恶性神经胶质瘤是中枢神经系统（CNS）原发性肿瘤最普遍的类型。患有胶质母细胞瘤的患者的症状取决于中枢神经系统的哪个部分受到影响。作为升高的颅内压的结果，脑神经胶质瘤可以引起头痛、恶心和呕吐、痉挛和颅神经异常。视神经的神经胶质瘤可导致视力丧失。脊髓神经胶质瘤可引起四肢疼痛、无力或麻木。神经胶质瘤不通过血流转移，但它们可以通过脑脊液扩散，并引起“下行转移”至脊髓。
高级别的神经胶质瘤是高度血管性的肿瘤，并具有浸润的倾向。它们具有大面积的坏死和缺氧。通常肿瘤的生长引起肿瘤附近的血脑屏障的破坏。作为一个规则，高级别的神经胶质瘤几乎总是甚至在外科切除之后重新长出。
神经胶质瘤不能治愈。患有高级别的神经胶质瘤的患者的预后通常较差，对于年长的患者尤其如此。每年诊断出10,000个美国人患有恶性神经胶质瘤，只有一半在诊断后1年是活着的，两年后为25％。那些患有间变性星形细胞瘤的存活约三年。多形性胶质母细胞瘤（GBM）具有更差的预后。
脑神经胶质瘤的治疗取决于位置、细胞类型和恶性级别。通常，治疗是采用外科、辐射疗法和化学疗法的组合方法。辐射疗法是外照辐射（external beamradiation）或使用辐射外科的立体定位方法的形式。脊髓肿瘤可以通过外科和辐射治疗。替莫唑胺是一种化学疗法药物，其能够有效地穿过血脑屏障，并且目前正用于疗法中。
胶质母细胞瘤是成人中最常见的原发性CNS恶性神经胶质瘤，并构成近75%的病例。尽管由于在神经影像学、显微外科和辐射上的改善它们的治疗中有着稳步的进展，胶质母细胞瘤仍无法治愈。尽管外科、辐射疗法和化学疗法的组合，患有胶质母细胞瘤的患者的中值生存限制在约一年，积极治疗（包括肿瘤全切除）之后的五年生存率在10％以下。由于在脑中的快速、侵袭性和浸润性的生长，胶质母细胞瘤引起死亡。常规治疗的失败可以归因于i）脑中肿瘤的不稳定的位置、ii）恶性神经胶质瘤的浸润性质阻止所有癌细胞的完全切除，以及iii）抗肿瘤制剂对于新生物组织缺乏特异性导致严重神经毒性。
因此，仍然需要能够治疗神经胶质瘤（如胶质母细胞瘤）而不引发神经毒性的高效抗肿瘤药物。
抗肿瘤药物当中，抗有丝分裂制剂代表着一个重要的类别。药物（比如紫杉烷家族）促进微管的过度稳定。相比之下，长春花（Vinca）生物碱类诱导微管解聚。通过抑制微管的动力学或功能，这种药物导致有丝分裂纺锤体功能的破坏、细胞周期进程的阻滞并最终凋亡（Mollinedo等人，2003）。
WO 2005/121172最近描述了小的多肽，其对应着微管蛋白结合位点（TBS）并位于中间丝蛋白（即神经丝轻链蛋白NFL、角蛋白8、GFAP和波形蛋白）中，渗透到肿瘤细胞（如MCF7、T98G、LS187、Cos或NGP细胞）中，在肿瘤细胞中它们破坏微管网络并降低它们的活力。更具体地，Bocquet等人（2009）显示NFL蛋白（此处称为“NFL-TBS.40-63”）的第二微管蛋白结合位点能够体外抑制神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤细胞系的增殖。
然而，根据这些结果来预期NFL-TBS.40-63的体内行为和活性是不可能的，尤其是在源自恶性神经胶质瘤的细胞系上。
实际上，众所周知，由于两个以下主要原因，基于靶向微管的药物的大多数化学疗法是失败的：第一，通过跨膜外排泵的过度表达或赋予耐受性的微管蛋白同种型和/或突变体的表达所介导的，这种药物通常会导致耐药性的发展（Dumontet等人，1999）。第二，它们对癌细胞缺乏特异性，并因此诱导不必要的毒性（Mollinedo等人，2003）。因此，使用微管相互作用制剂还不适用用于治疗对常规化学疗法有20％以下反应率的恶性神经胶质瘤（Hofer et Herrmann,2001），因为现有治疗通常伴有减弱的毒性副作用（Cavaletti等人，1997）。在脑肿瘤领域的一个主要挑战因此是鉴定这样的抗肿瘤制剂，其显示治疗性效率，但是比靶向微管的制剂具有相对于正常组织对脑肿瘤细胞具有更好的特异性。
在本文中，发明人首次显示微管解聚肽出乎意料地展示出对神经胶质瘤细胞的独特体内特异性，从而破坏了它们的微管网络并抑制它们的增殖而没有明显影响周围健康细胞的活力。
如下显示的结果揭示，当通过立体定位在携带有颅内F98神经胶质瘤的大鼠中注射这种肽时，肿瘤的大小减少约50％，并且动物健康状况显著改善。重要地免疫组织化学染色显示肽只存在于肿瘤组织中，即使在其注射后24天，而当注射于正常动物中脑的相同区域中时它迅速消失。
总之，这些结果表明用于本发明中的肽被细胞培养和动物模型中的神经胶质瘤细胞选择性吸收，在那儿其显著降低它们的增殖。因此，它代表了一种用于治疗恶性神经胶质瘤的有前途的微管蛋白结合候选者。
发明内容
在第一方面中，本发明涉及一种包括NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO1）或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列，用在用于治疗恶性神经胶质瘤的方法中，优选脑恶性神经胶质瘤，更优选多形性胶质母细胞瘤（GBM）。
在第二方面中，本发明涉及包括NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO1）或其生物活性衍生物的氨基酸序列用于体内或体外检测神经胶质瘤细胞的用途。
在一个具体的实施方式中，所述方法是用于体外检测生物样本存在或不存在恶性神经胶质瘤细胞的方法，所述方法包括：
a.将样本的细胞悬浮在适当的培养基中，
b.将包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的氨基酸序列与悬浮的样本的细胞混合，
c.确定含有所述氨基酸序列的细胞的百分比，
其中含有所述氨基酸序列的细胞的百分比对应着样本中神经胶质瘤细胞的百分比。
在一个优选实施方式中，所述氨基酸序列是NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO 1）本身。
附图说明
图1表明通过免疫组织化学分析，与大鼠原代星形胶质细胞和神经元相比，NFL-TBS40-63肽（10μM，6h）在大鼠神经胶质瘤细胞（F98和9L）中的渗透的体外特异性（A）。进一步通过流式细胞术分析的不同剂量的NFL-TBS40-63肽（1、5、10、20、50、100μM，1h，37℃）的细胞吸收（B）。
图2表明通过免疫组织化学分析，与正常的人星形胶质细胞相比，NFL-TBS40-63肽（10μM，6h）在人神经胶质瘤细胞（U87-MG和T98G）中的渗透的体外特异性（A）。进一步通过流式细胞术分析的不同剂量的NFL-TBS40-63肽（1、5、10、20、50、100μM，1h，37℃）的细胞吸收（B）。
图3显示通过免疫组织化学分析，与小鼠星形胶质细胞相比，NFL-TBS40-63肽（10μM，6h）在小鼠神经胶质瘤细胞（GL261）中的渗透的体外特异性（A）。进一步通过流式细胞术分析的不同剂量的NFL-TBS40-63肽（1、5、10、20、50、100μM，1h，37℃）的细胞吸收（B）。
图4显示通过MTS分析评价的，各种浓度的NFL-TBS40-63肽存在72h期间大鼠神经胶质瘤细胞（F98和9L）和大鼠原代星形胶质细胞的体外生存（A）。通过免疫组织化学评价的，在神经胶质瘤细胞中而非大鼠星形胶质细胞和神经元中，微管细胞骨架是完全无组织的（B）。
图5显示通过MTS分析评价的，各种浓度的NFL-TBS40-63肽存在72h期间人神经胶质瘤细胞（U87-MG和T98G）和人星形胶质细胞的体外生存（A）。通过免疫组织化学评价的，在神经胶质瘤细胞中而非人星形胶质细胞中，微管细胞骨架是完全无组织的（B）。
图6显示通过MTS分析评价的，各种浓度的NFL-TBS40-63肽存在72h期间小鼠神经胶质瘤细胞（GL261）和小鼠原代星形胶质细胞的体外生存（A）。通过免疫组织化学评价的，在神经胶质瘤细胞中而非小鼠星形胶质细胞中，微管细胞骨架是完全无组织的（B）。
图7显示与紫杉醇（taxol）（40nM，72h）、NFL-SCR（100μM，72h）相比，NFL-TBS40-63肽（100μM，72h）对大鼠细胞（F98、9L、星形胶质细胞，A）、人细胞（U87、T98G、星形胶质细胞，B）和小鼠细胞（GL261、星形胶质细胞，C）的体外抗增殖活性。
图8揭示NFL-TBS40-63肽（100μM，72h）诱导大鼠神经胶质瘤细胞（A）、人和小鼠神经胶质瘤细胞（B）而非相应的星形胶质细胞的体外凋亡。
图9显示注射的NFL-TBS40-63肽（5mM/60μL）选择性地靶向大鼠脑中体内预先植入的神经胶质瘤细胞，因为在第16天（A）、24（B）天或30（C）天，这种肽在冠状切片上只位于肿瘤细胞中。
图10显示在16、24和30天，在冠状切片上，仅一次注射NFL-TBS40-63肽（5mM/60μL）对大鼠脑中预先植入的神经胶质瘤的生长的体内抗增殖作用（A）。在16、24和30天，从肽治疗的或对照动物中冠状切片计算的肿瘤体积的定量（B）。
图11表明通过测量患有神经胶质瘤的动物的体重，仅一次注射NFL-TBS40-63肽（5mM/60μL）的治疗性活性。
图12显示通过MTS分析评价的，和100μM NFL-SCR肽或40nM紫杉醇相比，100μM NFL-TBS40-63肽存在72h期间，手术后分离的原代人胶质母细胞瘤细胞的体外生存。
图13显示NFL-TBS40-63肽的吸收是温度和能量依赖性的（A）。（a）和（c）：20μM荧光素标记的NFL-TBS40-63肽存在时，神经胶质瘤细胞在37℃孵育30分钟。通过用10mM叠氮钠和6mM脱氧葡萄糖预孵育30分钟耗尽（白柱）或未耗尽（黑柱）细胞内的ATP池。（b）和（d）：神经胶质瘤细胞在20μM荧光素标记的NFL-TBS40-63肽存在时在37℃（黑柱）或4℃（白柱）下孵育1小时。
图14显示NFL-TBS2肽可以用来改善脂质纳米胶囊（LNC）在神经胶质瘤细胞中的靶向吸收。用含有亲脂性荧光色素（DiD）的LNC的不同稀释处理GL261细胞6小时、以及处理U87-MG细胞1或6小时。通过FACS测量细胞荧光（A）。在用偶联NFL-TBS2肽的10μL LNC（DiD）处理6小时的细胞中比单独用LNC（DiD）处理的那些中，活GL261细胞的图像显示更高的荧光（B）。LNC（DiD）-NFL-TBS2并入GL261细胞（顶线）和T98G人神经胶质瘤细胞（底线）（C，白棒=25μm）。当在具有GL261肿瘤细胞的C57Bl/6小鼠中施用LNC(DiD)-NFL-TBS2时，它们在肿瘤组织中（右侧）而非在健康组织中（左侧）（D）滞留。
具体实施方式
如前所述，在脑肿瘤领域的主要挑战是鉴定具有和靶向微管的制剂相似的治疗性效率但是对脑肿瘤细胞有更高特异性的制剂。
本发明公开了微管解聚肽NFL-TBS40-63出乎意料的选择性，其对应着神经丝轻链亚基的第二微管蛋白结合位点，正如Bocquet等人所鉴定的（2009）。之前已显示这种肽i）体外抑制微管的聚合，ii）渗透人胶质母细胞瘤细胞系（T98G），和iii）破坏这些细胞的微管细胞骨架并抑制其增殖（Bocquet等人，2009）。
NFL-TBS40-63肽是24个氨基酸长，并具有如下序列：YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS（SEQ ID NO：1）。在本申请的文中，它被称为“用于本发明的肽”。如前所述，它对应着神经丝轻链亚基的第二微管蛋白结合位点（NFL蛋白TBS位点的氨基酸40至63）。
出乎意料的是，用于本发明的肽强烈影响神经胶质瘤细胞的增殖，但是如果不是不可检测的话，对正常的星形胶质细胞或神经元具有差的影响。
不同于常规的抗有丝分裂制剂，如通过被动扩散进入细胞的紫杉醇或长春花生物碱（Gottesman MM和Pastan I,1993），用于本发明的肽选择性渗透神经胶质瘤细胞中。肽吸收的免疫荧光显微镜检查和流式细胞术测量均显示当在体外与星形胶质细胞相比时其优选被神经胶质瘤细胞吸收。此外，FACS分析证明的饱和内在化，以及不存在NFL-SCR乱序重排肽（scrambled peptide）或D-氨基酸肽类似物的内在化，以及在4℃或在ATP-耗竭条件中不存在内在化，所有这些均支持NFL-TBS40-63肽至神经胶质瘤细胞中的活性及选择性的运输。当NFL-TBS40-63肽注射至携带有或没有神经胶质瘤的动物脑中，这种优选吸收也可以体内观察到。这种肽对神经胶质瘤细胞的选择性取向，当与神经系统其它细胞相比时，可能是由于这些细胞的细胞表面表达的受体的选择性表达。这种独特的性质代表了，与常规微管去稳定制剂（即紫杉烷类或长春花生物碱）相比，这种肽的主要优势，因为这导致其对神经系统的其它细胞缺乏毒性。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种包括NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO：1）或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列，用在用于治疗恶性神经胶质瘤的方法中。
更确切地说，在这方面中，本发明涉及包括神经丝轻链亚基的第二微管蛋白结合位点（即NFL-TBS40-63（SEQ ID NO 1））或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列用于制造治疗恶性神经胶质瘤的药物组合物的用途。
本发明的分离的氨基酸序列还包括NFL-TBS40-63肽，但不能是整个神经丝轻链亚基本身，因为这种蛋白没有和其片段（即NFL-TBS40-63肽）相同的生物活性。尤其是，整个NFL蛋白不能够渗透到神经胶质瘤细胞中，并且对这些细胞没有抗增殖活性。本发明分离的氨基酸序列还包括只要其不是整个神经丝轻链（NFL）亚基本身的NFL-TBS40-63肽。
一般情况下，分离的氨基酸序列包括不超过100个氨基酸，优选50个氨基酸。
在优选的实施方式中，本发明分离的氨基酸序列由NFL-TBS40-63肽（SEQ IDNO 1）或其生物活性衍生物组成。优选，它由NFL-TBS40-63肽本身组成。
本发明利用“NFL-TBS40-63肽的生物活性衍生物”。如此处所用，术语“肽衍生物”包括其所涉及的肽的变体和片段。因此，神经丝轻链亚基的第二微管蛋白结合位点的“衍生物”（即NFL-TBS40-63（SEQ ID NO 1））包括NFL-TBS40-63肽的变体和片段。更具体的是，在本发明文中，衍生物表明这种肽的“生物活性的”变体和片段，即保留母体NFL-TBS40-63肽的生物活性和特异性的变体和片段。因此，在本发明文中，NFL-TBS40-63肽的“生物活性的”衍生物，和母体NFL-TBS40-63肽一样，需显示抑制神经胶质瘤细胞增殖的高生物能力，并需显示对脑的神经胶质瘤肿瘤细胞的高特异性。优选，如通过常规增殖技术体外评估的，NFL-TBS40-63肽的衍生物对神经胶质瘤细胞的抗增殖作用具有母体NFL-TBS40-63肽的抗增殖作用的至少约70％，优选80％和90％之间，更优选90％和99％之间，甚至更优选100％。此外，如通过常规细胞吸收实验体外评估的，NFL-TBS40-63肽的衍生物优选和母体NFL-TBS40-63肽具有对神经胶质瘤细胞相同的特异性。
在一个优选的实施方式中，NFL-TBS40-63肽的衍生物是NFL-TBS40-63肽的生物活性片段。所述片段包括母体NFL-TBS40-63肽的至少12个连续氨基酸，优选至少16个，更优选至少18个氨基酸，并且特征在于其保留了母体NFL-TBS40-63肽的生物活性和特异性。
在另一个优选实施方式中，NFL-TBS40-63肽的衍生物是NFL-TBS40-63肽的生物活性变体。所述变体可以是肽的等位基因变体、或肽的拟肽类（peptidomimetic）变体。“肽的等位基因变体”具有和NFL-TBS40-63肽相同的氨基酸序列，除了一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代或抑制，最终肽保留母体NFL-TBS40-63肽的生物活性和特异性。优选，这种等位基因变体和母体NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO 1）相比具有70％，优选80％，更优选90％以及甚至更优选95％同一性。例如，这种等位基因变体可以是鹌鹑神经丝轻链亚基的TBS基序（SEQ ID NO：3），其保留了NFL-TBS40-63肽的20/24的氨基酸。肽的变体也可以是拟肽类变体，其是模拟母体肽的一些性质的有机分子，所述性质包括至少一个或多个优选是生物活性的兴趣性质。优选的拟肽类是通过根据本发明的肽的结构修饰获得的，优选使用非天然氨基酸、D氨基酸而非L氨基酸、构象限制、同配取代、环化或其它修饰。其它优选的修饰包括不限于其中一个或多个酰胺键被非酰胺键取代，和/或一个或多个氨基酸侧链被不同的化学部分取代，或一个或多个N端、C端或一个或多个侧链被保护基团保护，和/或双键和/或环化和/或立体特异性被引入氨基链以增加刚性和/或亲和力的那些。和母体NFL-TBS40-63肽相比，还有其它优选修饰包括旨在增强对酶降解的耐受性、改善生物利用度以及更通常地药代动力学性质的那些。所有这些变化是本领域公知的。因此，考虑到NFL-TBS40-63肽的肽序列，使得本领域技术人员能够设计和生产具有和这种肽相似的或优于这种肽的生物学特性的拟肽类。NFL-TBS40-63肽的优选拟肽类变体至少保留了NFL-TBS40-63肽的生物活性和特异性。
可以使用本领域公认的技术方便地合成用于本发明的肽（即包括NFL-TBS40-63肽或其片段、其拟肽类或等位基因变体的氨基酸序列）。
如此处所用，两条氨基酸序列之间的“同一性百分比”表示最好的比对（最佳比对）之后获得的待比较的两条序列之间相同的氨基酸残基的百分比，这种百分比是纯统计学上的，并且两条氨基酸序列之间的差异随机分布并沿着其整个长度。可以用例如网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html上可获得的BLAST程序进行两条氨基酸序列之间的序列比较，使用的参数是默认给出的（尤其地，对于参数“空位开放罚分”：5，以及“空位扩展罚分”：2，选择矩阵为例如程序推荐的“BLOSUM 62”矩阵，直接通过程序计算待比较的两条序列间的同一性百分比）。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种通过向有此需求的受试者施用有效量的药物组合物来治疗性治疗恶性神经胶质瘤的方法，该药物组合物包括含有NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO 1）或其生物活性衍生物的至少分离的氨基酸序列。
恶性神经胶质瘤也被称为高级别的神经胶质瘤。它们可以影响脑和脊髓。本发明的治疗性方法优选专门治疗携带选自间变性星形细胞瘤（AA）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、间变性少突神经胶质瘤（AO）和间变性少突星形细胞瘤（AOA）的脑恶性神经胶质瘤的受试者，以及更优选携带如上定义的多形性胶质母细胞瘤（GBM）的受试者。
在一个优选的实施方式中，所述受试者是哺乳动物，优选小鼠、大鼠、猫或狗，以及更优选人类。
这种药物组合包括含有NFL-TBS40-63（SEQ ID NO 1）或其生物活性衍生物以及药学上可接受的载体的分离的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，待并入本发明药物组合物的分离的氨基酸序列是NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO 1）或其生物活性衍生物以及优选NFL-TBS40-63肽本身。
在另一个实施方式中，肽可以物理或化学地连接有放射活性部分、细胞毒性成分、或连接至适当的载体（如脂质纳米胶囊，如下实施例3.4所示）。本发明的肽将这些成分特异性地递送至神经胶质瘤细胞，从而影响它们。
出于本发明的目的，合适的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐溶液（如氯化钠）、醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、如乳糖、直链淀粉或淀粉的碳水化合物、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。药物制备物可以经灭菌，并且如果需要的话，和辅助制剂混合，如不与活性化合物发生有害反应的润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色、调味和/或芳香物质等。如果需要的话，组合物也可以含有少量的润湿或乳剂、或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉剂。口服制剂可以包括标准载体比如制药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。例如在Remington,The Science and Practice ofPharmacy,第19版，1995,Mack Publishing Company中已描述了一些适当的精确的制剂。
药物组合物可以根据例行程序制剂成适于向个体静脉施用的组合物。通常情况下，用于静脉施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。
在一个优选实施方式中，本发明的药物组合物是专门通过脑内注射以及更优选通过肿瘤内注射施用的液体组合物。所述肿瘤内注射可以例如通过使用立体定位神经外科而获得。旨在去除脑肿瘤的外科手术之前或之后可以进行这种施用。在第一种情况下，组合物使得能够抑制肿瘤的生长，并避免神经胶质瘤细胞的传播和受试者上严重症状的发生；在第二种情况下，组合物可用于破坏外科手术期间未去除的所有神经胶质瘤细胞。
根据本发明的化合物的有效剂量在众多参数的函数中是不同的，比如，例如，所选择的施用方法、体重、年龄、性别和待治疗的个体的灵敏度。因此，必须由医学专家在相关参数的函数中确定个体最佳剂量。为了根据如下呈现的第一个动物研究预测人类中的预期活性剂量，还可以使用由Rocchetti等人描述的k2和CT值（2007）。
据预计，使用单次立体定位注射（60μl），用于治疗动物（例如大鼠）的有效剂量范围在约0.1微摩尔和5毫摩尔之间，优选约0.2和0.5微摩尔之间。人脑比大鼠脑平均重700倍，可以预见，用于治疗人神经胶质瘤的有效剂量范围将在约0.07和0.7mmol之间，优选约0.14mmol和0.35mmol之间。这些指示的剂量显然是要根据临床治疗性研究的情况进行调整的。
如在本申请的实验部分中所显示的，NFL-TBS40-63肽能够体外以及体内特异性渗透至神经胶质瘤细胞中。因此，死于凋亡之前，神经胶质瘤细胞以特异性方式对NFL-TBS40-63肽染色阳性，并且可以在其它健康的脑细胞中（尤其是星形胶质细胞和神经元）被鉴别出来。因此NFL-TBS40-63肽是一种体外或体内检测神经胶质瘤细胞的有前景的工具。
因此，在第二方面中，本发明涉及包括NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO 1）或其生物活性衍生物的氨基酸序列用于检测神经胶质瘤细胞，优选胶质母细胞瘤细胞的用途。
此前已描述了预期的氨基酸序列及其生物活性衍生物的特征。
在一个优选的实施方式中，所述氨基酸序列经标记从而其易于通过常规技术检测含有肽的细胞的存在或不存在。
如此处所用术语“标记的”是指可用于提供可检测的（优选可定量的）效果，可以附着至氨基酸序列的任何原子或分子。标记包括但不限于染料、放射标记如32P、结合部分如生物素、半抗原如洋地黄毒甙、发光的（luminogenic）、磷光的或荧光的部分、质量标签；以及单独的或与通过荧光共振能量转移（FRET）可以抑制或转移发射光谱的猝灭剂组合的荧光染料。所述标记可提供通过荧光、放射性、比色法、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质量特征或受质量影响的行为（如MALDI，飞行时间质谱）等，优选通过荧光，可检测的信号。标记可能是带电荷的部分（正或负电荷）或者作为替代可能是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白质序列或由核酸或蛋白质序列组成，只要包括标记的序列是可检测的。
优选，所述标记是荧光染料。合适的荧光染料包括，例如：
1.荧光素和衍生物，像六氯-荧光素、四氯-荧光素、羧基荧光素（TAMRA）、CAL（从BIOSEARCH TECHNOLOGIES可获得的CAL绿色荧光素520、CAL金色荧光素540、CAL橙色荧光素560、CAL红色荧光素590、CAL红色荧光素635）、羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯（6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素的琥珀酰亚胺酯（HEXTM）或6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’二甲氧基荧光素的琥珀酰亚胺酯（JOETM））；
2.罗丹明和衍生物，如5-或6-羧基-X-罗丹明（ROX）、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明；
3.花菁和衍生物，如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5；
4.发色团，如4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚（indacene）-3-丙酸、4,4-二氟-5,p-甲氧基苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚-3-丙酸、4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼烷-3a,4-二氮杂-a-S-茚-丙酸、4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚-3-丙酸、4,4-二氟-5,p-乙氧基苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚3-丙酸和4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-S-茚-丙酸；
5.Texas和衍生物；
6.芘三磺酸如APTS、HPTS（CASCADE）；以及
7.曙红和衍生物。
更优选，所述荧光染料选自荧光素和衍生物，如六氯-荧光素、四氯-荧光素、羧基荧光素（TAMRA）、CAL（从BIOSEARCH TECHNOLOGIES可获得的CAL绿色荧光素520、CAL金色荧光素540、CAL橙色荧光素560、CAL红色荧光素590、CAL红色荧光素635）、羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯（6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素的琥珀酰亚胺酯（HEXTM）或6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’二甲氧基荧光素的琥珀酰亚胺酯（JOETM））。
在本发明文中，检测这种荧光染料标记的氨基酸序列的优选常规技术包括但不限于流式细胞术或荧光显微镜。
在一个优选的实施方式中，用于检测神经胶质瘤细胞的本发明的氨基酸序列由NFL-TBS40-63肽（SEQ ID NO 1）或其生物活性衍生物组成。
在一个更优选的实施方式中，本发明的氨基酸序列NFL-TBS40-63肽本身，其偶联有例如羧基荧光素染料或生物素标签。
在本发明的另一个实施方式中，本发明涉及包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列用于体内检测神经胶质瘤细胞的用途，或换言之，包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列，其用于体内检测神经胶质瘤细胞。
这对于医务人员精确评估肿瘤细胞的位置可以是尤其有用的。即神经胶质瘤细胞通常不位于受限制的区域，因为它们能够浸润原始肿瘤的周边区域。此外，神经胶质瘤细胞的体内标记可以帮助外科医生精确确定肿瘤和健康组织之间的边界，从而他们可以更彻底地去除肿瘤细胞避免去除健康组织。
在这种情况下，本发明的氨基酸序列要在外科手术之前例如一小时前，脑内和优选靠近肿瘤施用，从而它渗透于肿瘤细胞内并指导医生去除所有并且只有肿瘤细胞。
在这一具体的实施方式中，本发明的氨基酸序列优选直接标记有或通过可以在外科手术期间在安全条件下被检测到的适当载体（如纳米胶囊）标记有发荧光的染料或发光的染料。
例如，本发明提供一种体内检测恶性神经胶质瘤细胞存在的方法，所述方法包括：
a）用发荧光的或发光的染料，直接或通过适当的载体（如纳米胶囊），标记包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的氨基酸序列，
b）外科手术前脑内注射所述氨基酸序列，
c）手术期间，将具有特定波长的光（取决于发荧光的或发光的染料）施加到肿瘤区域上，以便显示神经胶质瘤细胞。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列用于体外检测神经胶质瘤细胞，例如用于诊断神经胶质瘤或至少生物样本中神经胶质瘤细胞的存在的用途。
例如，本发明提供一种用于体外检测生物样本存在或不存在恶性神经胶质瘤细胞的方法，所述方法包括：
1.将样本的细胞悬浮在适当的培养基中，
2.将包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的氨基酸序列与悬浮的样本的细胞混合，
3.确定含有所述氨基酸序列的细胞的百分比，
其中含有所述氨基酸序列的细胞的百分比对应着样本中神经胶质瘤细胞的百分比。
如此处所用，术语“生物样本”或“样本”指在体外处理的细胞培养物。培养物中的细胞可以是谱系来源的或原代来源的。在这第二种情况下，细胞可以在活检或外科手术后从动物脑中提取。
在本发明的体外方法中，含有所述氨基酸序列的细胞的百分比“对应着”样本中神经胶质瘤细胞的百分比。这意味着含有用于本发明的氨基酸序列的细胞的百分比相当于或多或少约5％的生物样本中神经胶质瘤细胞的百分比。当样本中细胞的绝对数目已知时，也可以从本发明的方法推断出或多或少约5％的样本中神经胶质瘤细胞的绝对数目。
悬浮细胞并使其在体外生长于适当的培养基中。这种培养基是本领域技术人员熟知的，并包括有利的葡萄糖和L-谷氨酰胺、胎牛血清（如10％）、和青霉素/链霉素。细胞被保存在37℃下具有5％CO2气体的湿润温箱中。
在这种方法的第一步中，例如通过涡旋振荡悬浮细胞，从而使本发明的氨基酸序列能去接触样本的所有细胞。
优选，要添加的氨基酸序列的浓度包括1和200μM之间，更优选2和150μM之间，甚至更优选5和50μM之间。
优选，氨基酸序列被添加到细胞上持续至少30分钟，优选1小时的时间，然后充分冲洗细胞以去除游离的剩余的肽。
在此方法中，可直接用如前所述的染料或常规标签（如生物素）或可以偶联至适当的载体（如纳米胶囊）上来标记要添加的氨基酸序列。在这种情况下，通过用于在细胞模式（in cellulo）检测染料或标签的惯用手段（如流式细胞术、免疫组织化学等...如在下面的实施例中所描述的）进行氨基酸序列的存在的分析。
或者，不标记要添加的氨基酸序列，通过使用例如抗所有或部分氨基酸序列的抗体的常规手段间接进行其检测。在这种情况下，可以使用间接检测的常规技术（如流式细胞术、免疫组织化学，免疫印迹，等）。
优选，本发明的氨基酸序列直接地或通过适当的载体偶联至发荧光的染料，通过流式细胞术显示细胞中的存在（如在下面实施例中所解释的）。更优选，发荧光的染料包含在也偶联至本发明的肽的脂质纳米胶囊中。
在一个优选的实施方式中，检测神经胶质瘤细胞的体外方法使用NFL-TBS40-63肽本身。更优选，它使用羧基荧光素标记的NFL-TBS40-63肽或生物素标签的NFL-TBS40-63肽。
在本发明的另一个实施方式中，本发明涉及包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列用于体外或体内向神经胶质瘤细胞递送化合物或将化合物靶向至神经胶质瘤细胞的用途。换言之，本发明涉及包括NFL-TBS40-63肽或其生物活性衍生物的分离的氨基酸序列，其用于体内向神经胶质瘤细胞递送化学化合物或将化学化合物靶向至神经胶质瘤细胞。此外，本发明公开了一种用于在有所需求的受试者中体内向神经胶质瘤细胞递送化学化合物或将化学化合物靶向至神经胶质瘤细胞的方法，以及用于体外向神经胶质瘤细胞递送化学化合物或将化学化合物靶向至神经胶质瘤细胞的方法。
这种化学化合物可以直接偶联至本发明的肽，或者可以包含在偶联至本发明的肽的适当载体中（如纳米胶囊、脂质体、胶束或本领域技术人员已知的任何包囊手段）。
所述化学化合物可以是药物化合物和/或标记标志物比如荧光分子。
所述药物化合物优选是细胞毒性药物，例如抗有丝分裂药物。
化学化合物优选包囊在脂质纳米胶囊中，如下所述。
在一个优选的实施方式中，靶向神经胶质瘤细胞的体外和体内方法使用NFL-TBS40-63肽本身。
如下的实施例描述NFL-TBS40-63肽的高特异性和治疗效率。然而，尤其是关于本发明氨基酸序列的性质以及使用它的实验条件，它们不是限制性的。
实施例
1.材料
对应着标记的NFL微管蛋白结合位点（NFL-TBS40-63，SEQ ID NO：1）以及相似标记的乱序重排肽（NFL-SCR，SEQ ID NO：2）的生物素化的或羧基荧光素标记的肽由Millegen合成（法国Toulouse），并以1或5mM的浓度溶于水。在NFL-TBS-生物素肽中，生物素分子连接至肽的N端。并且，羧基荧光素分子连接至肽的N端。
F98和9L神经胶质瘤细胞系获自ATCC（Manassas,VA,美国）。细胞在充有5％CO2（37℃）气体的湿润温箱中，在含有10％胎牛血清（Lonza法国）、1％青霉素/链霉素（Sigma）的带有葡萄糖和L-谷氨酰胺（Lonza法国）的DMEM培养基中生长，直到达到80-90％的汇合。
如原先描述的（McCarthy和de Vellis,1980）从大脑皮质培养物获得大鼠原代星形胶质细胞。简言之，从新生大鼠解剖大脑皮层，在组织匀浆、胰蛋白酶消化和离心之后回收细胞。它们在充有5％CO2（37℃）气体的湿润温箱中，在含有10％胎牛血清（Lonza法国）、1％青霉素/链霉素（Sigma）的带有葡萄糖和L-谷氨酰胺（Lonza法国）的DMEM培养基中生长3周的时间。
根据Ray等人1993以及Kaech和Banker 2006，从新生大鼠脑制备海马神经元培养物。简言之，回收2天以下的动物海马，切碎并在37℃在0.01％胰蛋白酶中消化一小时。离解的细胞以2×105/ml的密度涂覆于预包被有5μg/ml聚-l-赖氨酸和7μg/ml胶原蛋白的盖玻片上，并在37℃用5％CO2氛围中孵育。二十四小时后，用B-27神经细胞基础培养基替换涂覆溶液，第二天添加阿糖胞苷（20μM）来淘汰非神经细胞。涂覆后7天进行实验。
U87-MG和T98G的人胶质母细胞瘤细胞系获自ATCC（Manassas,VA,美国）。GL261小鼠神经胶质瘤细胞系由博士P Walker（瑞士，日内瓦大学医院，肿瘤免疫实验室）友情提供。人星形胶质细胞获自Lonza法国。如原先描述的，通过机械解离方法从大脑皮层培养物获得纯化的新生小鼠原代星形胶质细胞（McCarthy和de Vellis,1980）。
人胶质母细胞瘤细胞、GL261神经胶质瘤细胞和小鼠原代星形胶质细胞在充有5％CO2（37℃）气体的湿润温箱中，在含有10％胎牛血清（Lonza法国）、1％青霉素/链霉素（Sigma）的带有葡萄糖和L-谷氨酰胺（Lonza法国）的DMEM培养基中生长，直到达到80-90％的汇合。人星形胶质细胞在补充有AGMSingleQuots生长因子（Lonza）的星形胶质细胞基础培养基（ABM）（Lonza）中培养。根据制造商的说明书维持细胞。
从手术期间在人脑中提取的组织样本中获得的原代人胶质母细胞瘤细胞置于含有葡萄糖、L-谷氨酰胺、10％胎牛血清、10％青霉素/链霉素（Sigma）的DMEM培养基中培养。在MW96中涂覆细胞（每cm220000个细胞），使其在37℃时在充有5％CO2气体的湿润温箱中生长。涂覆后48小时添加肽和/或药物。
如之前描述的，进行脂质纳米胶囊（LNC）（Heurtault等人，2002）。简言之，在室温下Solutol HS-15、S75-3、氯化钠、Labrafac CC和水通过磁力搅拌（200rpm）混合产生油/水乳液。加热后，在70℃可以观察到透明度的间隔（intervalof transparency），在85-87℃获得倒置相“油包水”。施加从60至87℃交替的三个温度循环，然后在最后的温度下降之前，用12.5mL冷水（接近0℃）稀释混合物并搅拌15分钟。就在最后的稀释之前加入DiD。LNC表征之后，369μL的NFL-TBS2（1mM）加入到1mL LNC（DiD）中在18℃进行24小时的肽吸收。然后，进行新的LNC表征。
2.方法
2.1 细胞活力和增殖的分析
通过MTS细胞毒性分析和通过直接计数细胞的数目评价肽对神经胶质瘤细胞或星形胶质细胞增殖的影响。对于MTS分析（Promega），500个细胞接种于96孔板，在37℃时培养24小时，并在特定浓度下用肽或用载体（PBS或水）处理24、48和72小时。每天更换培养基和肽。在DMEM中制备肽，紫杉醇（Paclitaxel）以2mM浓度溶于DMSO并进一步在DMEM中稀释。通过台盼蓝染色确定活力。对于手工计数，用0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA处理细胞，离心，并在加入台盼蓝染料后用血细胞计数器计数。每次，对每处理3至6孔进行计数。
为了评估细胞增殖，使用5-溴脱氧尿苷（BrdU）免疫组织化学。细胞涂覆在盖玻片上，并在含有生物素化的肽（100μM）的培养基中培养72小时，以及存在1mg/mL BrdU（Sigma）时孵育4小时。然后在PBS中洗涤细胞，在3％多聚甲醛中固定10分钟并用PBS中的1％Triton X-100渗透10分钟。细胞经酸化来变性DNA（2N HCl，10分钟），中和（0.1M硼酸钠，10分钟）以及然后在PBS中充分冲洗。用10％NGS（10分钟）封闭后，用单克隆抗BrdU抗体（1/400），随后是Alexa 568nm抗小鼠抗体（1/200）标记细胞。用4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma）对核进行染色。用Leica DMI6000倒置显微镜观察染色的细胞。用CoolSNAPHQ2相机获得图像，并用Metamorph 7.1.7.0软件分析。对最少200个细胞进行BrdU并入的评分，实验至少重复3次。
2.2 通过流式细胞术的细胞吸收分析
为了通过FACS评价荧光素标记的NFL-TBS40-63肽的内在化，神经胶质瘤细胞或星形胶质细胞接种在35mm皿中，并在37℃在含有提高浓度的荧光素标记的NFL-TBS40-63肽或载体（PBS）的培养基中培养1小时。胰蛋白酶消化细胞，在37℃用胰蛋白酶（1mg/mL）孵育15分钟前在冷PBS中洗涤两次。为了研究可能的能源依赖性的肽吸收机制，用20μM荧光素标记的NFL-TBS2肽（15分钟4℃的预孵育之后）在4℃孵育细胞1小时，或加入20μM荧光标记的NFL-TBS2肽之前在6mM 2-脱氧-D-葡萄糖存在时用10mM叠氮钠，在4℃孵育细胞1小时以耗尽细胞内ATP。然后洗涤一次细胞，重悬于含50μg/mL碘化丙啶（Sigma,Saint-QuentinFallavier,法国）的500μl中，用FACSCalibur流式细胞仪分析。对每个细胞类型重复三次实验。在各实验中分析每样本20,000个结果。
2.3 通过流式细胞术的细胞死亡分析
为了检测可能的凋亡过程，细胞接种在35mm皿中，并在含有生物素化的肽（100μM）或只有PBS的培养基中培养72小时。紫杉醇（40nM）被用来作为阳性对照来诱导细胞凋亡（Terzis等人，1997）。然后胰蛋白酶消化细胞，在冷PBS中洗涤，在室温下在膜联蛋白缓冲液中用膜联蛋白V-FITC（BD Pharmingen）染色15分钟。最后，它们用50μg/mL碘化丙啶（Sigma）复染，并用FACSCalibur流式细胞仪分析。对每个细胞类型重复三次实验。在各实验中分析每样本20,000个结果。
2.4 免疫组织化学
细胞涂覆在盖玻片上并在含有生物素化的肽（10μM）的培养基中培养6小时。PBS洗涤后，细胞在4％多聚甲醛中固定10分钟，并在PBS中洗涤3次。然后，它们在0.5％triton X-100渗透液中孵育10分钟，在封闭液（5％BSA）中15分钟的孵育之前，在PBS中洗涤三次。在4℃，用小鼠抗β微管蛋白抗体（Sigma）1/200过夜孵育神经胶质瘤细胞和星形胶质细胞，以及用小鼠抗βIII微管蛋白抗体1/200过夜孵育神经元。分别使用Alexa 568nm抗小鼠抗体和链霉亲和素Alexa 488nm（分子探针）1/200对微管蛋白和生物素化的肽进行一小时定位，随后在PBS中洗涤。用3μM 4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma）对制备物复染5分钟，用PBS洗涤两次。用抗褪色液（antifading solution）装载盖玻片。
用奥林巴斯共聚焦显微镜（BX50）使用Fluoview.3.1软件或Leica DMI6000倒置显微镜进行观察。用CoolSNAP-HQ2相机获得图像，并用Metamorph 7.1.7.0软件分析。对肽染色呈阳性的细胞以及具有破坏的微管网络的细胞进行计数。每个细胞类型重复至少3次实验，对每个实验分析最少200个细胞。
2.5 动物研究
9至10周大小的雌性同系Fisher 344只大鼠获自法国查尔斯河实验室（L’Arbresle,法国）。动物被饲养在温度和湿度可控的房间中，12小时的开关光周期，并给予随意获取的食物和水。
按照法国政府的指导并经地区动物实验伦理委员会批准进行所有的实验程序和动物护理。
处于70％汇合的大鼠F98细胞经胰蛋白酶消化，在血细胞计数器上计数，并通过台盼蓝排斥检查活力。在DMEM中洗涤两次细胞，并获得DMEM中5×104个细胞/mL的最终悬浮物。通过腹腔注射氯胺酮10％（0.8μl/g）和甲苯噻嗪2％（0.5μl/g）的混合物麻醉动物。采用立体定位框（stereotaxic frame）（David Kopfinstruments,Tujunga,CA,美国），穿过皮肤做一个矢状（sagital）切口来暴露颅，并使用小牙钻在颅骨中在前囟（bregma）前1mm和侧2mm处打一个钻孔（burrhole）。在距离颅外部边界4mm深的深度处，使用带有32-G针头（Hamilton）的10μl Hamilton注射器（Hamilton玻璃注射器700系列RN）以2μl/min的流速，将10μl体积的单独的DMEM或含500个肿瘤细胞的DMEM注射至大鼠纹状体。针额外留在原地5分钟，避免悬浮物从脑中排出，然后慢慢撤出（0.5mm/min）。
神经胶质瘤植入后六天，在肿瘤细胞坐标处使用带有32-G针头的10μlHamilton注射器进行60μl输注。这种注射器通过套管（CoExTM PE/PVC管，HarvardApparatus）连接到含有肽的100μl Hamilton 22-G注射器（Harvard Apparatus,LesUlis,法国）上。用渗透泵（Harvard Apparatus）以0.5μl/min的速度进行2小时缓慢输注对流增强输送（Convection-enhanced delivery）程序（CED）来获得60μl的总体积（参考）。输注后，除去针头，缝合伤口。
脑内肿瘤细胞植入后（第0天），大鼠随机分为4组。植入后六天（第6天），按如下通过CED处理大鼠：组1：对照（60μl载体；n=10）；组2：60μl 1mMNFL-TBS40-63肽（n=7）；组3：60μl 1mMNFL-SCR肽（n=7）；组4：60μl 5mMNFL-TBS40-63肽（n=7）。
每天对动物监测它们的临床状况（体重减少、共济失调和眶周出血）（Redgate等人，1991）。当患有偏瘫或至少20％体重减少时对它们实施安乐死。在第16天、第23天、和第30天（n=3/组）处死动物并去除它们的脑，在-30℃冷冻在异戊烷中，并储存在-80℃。
使用Leica低温恒温器对冷冻的脑进行连续切片，20μm切片经HE染色用于组织形态学和肿瘤体积的测量。使用Leica Z16APO放大观测器（macroscope）用Leica应用套件2.8.1软件捕获HE染色的切片的图像。手工勾勒肿瘤区域的轮廓，使用Image J软件测量。知道切片的厚度和数目，计算各肿瘤的总体积。每组测量三只动物的肿瘤体积。
对于免疫组织化学，用冷甲醇固定12μm切片10分钟，用PBS 5％BSA在室温下封闭一小时之前，在PBS中洗涤3次。在PBS 5％BSA中用小鼠抗GFAP抗体（Sigma）1/200对切片孵育过夜，然后用PBS冲洗（3×5分钟）。分别使用抗小鼠抗体Alexa 568nm和链霉亲和素Alexa 488nm（分子探针），在PBS 5％BSA中1/200稀释，对GFAP和生物素化的肽进行90分钟定位，随后在PBS中洗涤。用3μM 4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma）对制备物复染5分钟，用PBS洗涤两次。抗褪色液装载盖玻片，用Leica DMR荧光显微镜和Leica IM500软件进行观察。
MRI和1H-磁共振谱：用配备有7T的垂直超广口磁铁（superwide-bore magnet）的Bruker Avance DRX 300（德国）装置进行MRI。使用带有弛豫增强（RARE）序列的快速采集获得定性T2加权图像（TR=2000ms；平均回波时间（Tem）=31.7ms；RARE因子=8；FOV=3×3cm；矩阵128×128；9个连续的1mm切片，8个采集）。使用带有水抑制和心触发（Rapid Biomed GmbH,德国）的PRESS序列进行磁共振谱（MRS）。用如下参数获得1H谱：TR/TE=1500/11ms；NEX=128；vowel大小27μl（3×3×3mm）。
2.6 统计分析
数据表示为平均值S.EM.（条）。通过学生t检验使用Prism 3.00版本（GraphPadSoftware,San Diego,CA）分析细胞计数、细胞活力数据、肿瘤体积。星号表示显著水平相对于对照*，p<0.05；**，P<0.005；***，P<0.0001。
3.结果
3.1 NFL-TBS40-63对神经胶质瘤细胞的体外特异性
3.1.1 渗透特异性
为了评价NFL-TBS40-63（10μM）对来自脑的不同细胞类型的特异性，通过免疫荧光显微镜分析它对大鼠F98和9L神经胶质瘤细胞、以及大鼠星形胶质细胞和神经元的原代培养物的作用。
图像分析和细胞计数显示总细胞的50％以上含有可检测的NFL-TBS40-63肽（对于F98，53.5％±1.5，和对于9L，58.2％±9）。在相似的剂量时，肽在星形胶质细胞（9％±4.6）或神经元（17.9％±5.9）中渗透得少得多（图1A）。
有趣的是，用人和小鼠衍生的细胞获得相似的结果（分别为图2A和图3A）。
进行荧光激活的细胞分选（FACS）测量进一步定量羧基荧光素标记的肽的细胞吸收。为了区分膜结合的和内在化的荧光团，FACS分析之前进行细胞的胰蛋白酶处理来避免肽的表面结合。用50μM肽孵育细胞1小时后，89.6％±2.5的F98和100％±0的9L神经胶质瘤细胞含有NFL-TBS40-63肽，而只有28.0％±2.5的星形胶质细胞是阳性的（图1B）。
这些数据显示，NFL-TBS40-63肽在大鼠神经胶质瘤细胞中的优选渗透。
有趣的是；用人和小鼠恶性神经胶质瘤细胞也获得了相似的结果（分别为图2B和图3B）。
当在4℃用肽培养神经胶质瘤细胞时，或当通过用叠氮钠和脱氧葡萄糖预孵育细胞耗尽ATP库（pool）时，观察到显著减少的NFL-TBS2吸收，表明能量依赖性的内在化机制（图13A）。此外，当T98G细胞用10μM的D-氨基酸肽类似物处理并通过免疫组织化学分析时，肽的内在化强烈降低，这表明通过内吞作用的受体介导的内在化（图13B）。
最后，肽也特异性渗透手术后分离的原代人胶质母细胞瘤细胞（数据未显示）。
总之，这些体外结果重要地显示NFL-TBS40-63肽特异性渗透人、大鼠和小鼠来源的神经胶质瘤细胞、渗透细胞系以及原代神经胶质瘤细胞。相反，这些结果指出NFL-TBS40-63肽不进入脑中存在的非肿瘤细胞，即星形胶质细胞和神经元。这一结果将在携带有F98胶质母细胞瘤的大鼠体内模型中进一步证实（见实施例3.2）。
3.1.2 NFL-TBS40-63存在时恶性神经胶质瘤细胞的降低的活力
用NFL-TBS40-63肽或其对照乱序重排序列（NFL-SCR）以不同浓度（0、20、50和100μM）和不同的时间（24、48和72小时）处理大鼠神经胶质瘤细胞（F98和9L）和星形胶质细胞。紫杉醇（40nM）用作细胞毒性的阳性对照。使用MTS细胞毒性分析，其基于活细胞通过其线粒体脱氢酶将MTS转换为甲臜的能力。发现用100μM NFL-TBS.40-63肽处理72小时后，两种大鼠神经胶质瘤细胞系的细胞活力显著降低60.8％±2.8（对于F98）和30.0％±4.4（对于9L）（图4A）。
用人和小鼠恶性神经胶质瘤细胞重复得到这些结果（分别见图5A和6A）。
此外，手术后分离的原代人神经胶质瘤细胞的细胞生存大大受到NFL-TBS.40-63肽的影响：用NFL-TBS.40-63肽（100μM）孵育72小时后，细胞生存减少了50％。有趣的是，当细胞用40nM紫杉醇处理时细胞生存处于同一水平，这表明和熟知的微管解聚药物相比，NFL-TBS.40-63肽对细胞活力具有至少相同的作用（见图12）。
还通过台盼蓝染料排斥测试评价细胞活力。这种负电荷的发色团只渗透至当其膜被破坏时的细胞。因此，所有排斥染料的细胞是活的。已观察到NFL-TBS40-63肽强烈影响大鼠、人和小鼠神经胶质瘤的活性，而星形胶质细胞没有受到影响（数据未显示）。
为了研究潜在解释NFL-TBS.40-63肽存在时降低神经胶质瘤细胞的细胞活力的机制，通过免疫组织化学评估这些细胞的微管细胞骨架。
而未经处理的F98和9L细胞是大的，并充满密集的微管网络，含有NFL-TBS.40-63的那些显示出了非典型性球形，其微管蛋白与胞浆内肽共聚集（未显示）。在总F98细胞的82％±3中以及总9L细胞的76.7％±5.8中观察到这种变化。相比之下，NFL-TBS.40-63肽仅较差地影响星形胶质细胞（4.7％±0.6）和神经元（8.5％±1.5）。此外，乱序重排肽NFL-SCR没有改变神经胶质瘤细胞、星形胶质细胞和神经元的微管网络（图4B）。用人和小鼠衍生细胞获得了相似的结果（分别为图5B和6B）。
总之，这些结果显示NFL-TBS40-63肽破坏来自人、大鼠或小鼠来源的神经胶质瘤细胞的微管细胞骨架并降低活力，而其不会影响也存在脑中的非肿瘤细胞（例如星形胶质细胞和神经元）的微管细胞骨架和活力。重要的是，在非携带肿瘤的大鼠（对照）中也体内重复了这一结果，其中肽基本上没有作用并迅速消除（见实施例3.2）。
3.1.3 抗增殖作用的特异性
MTS分析和台盼蓝测试显示NFL-TBS40-63肽诱导活细胞数目的减少。为了确定这种减少是否反映1）细胞增殖的降低（抑制细胞生长的作用），2）导致细胞死亡的毒性（细胞毒作用），或3）这两种作用的组合，通过测量溴脱氧尿苷（BrdU）（一种胸苷类似物）并入DNA，分析了肽对不同细胞类型（大鼠脑神经胶质瘤细胞系和星形胶质细胞）的增殖的影响。这揭示了BrdU处理期间处于S期的细胞数目，以及而后的增殖细胞的数目。
用100μM NFL-TBS40-63肽处理大鼠神经胶质瘤细胞强烈降低BrdU在这两种检验的系中的并入（F98细胞的78.2％±3.0的抑制，和9L细胞的34.8％±2.6）（图7A），表明更低的增殖细胞的数目。强烈的对比，大鼠星形胶质细胞的相似处理没有影响其增殖。此外，NFL-SCR肽对所有这些细胞没有作用。
当测试源自人和小鼠的细胞时，获得相似的结果（分别图7B和7C）。
总括来说，这些结果显示NFL-TBS40-63肽特异性降低来自人、大鼠或小鼠来源的神经胶质瘤细胞的活力。相反，它不影响在脑中也存在的非肿瘤细胞的活力，例如星形胶质细胞。
3.1.4 恶性神经胶质瘤细胞中凋亡的特异性诱导
BrdU染色分析表明NFL-TBS.40-63肽对神经胶质瘤细胞的抑制细胞生长的作用。已知微管结合药物阻滞增殖并通过凋亡诱导细胞死亡。为了检验用MTS分析和台盼蓝测试观察到活神经胶质瘤细胞的减少的数目是否还与细胞死亡（细胞毒作用）有关，用100μM肽对F98、9L神经胶质瘤细胞或星形胶质细胞孵育72小时，然后收获并用碘化丙啶（PI）和膜联蛋白V染色。然后通过FACS分析评价凋亡定量。具有完整膜的活细胞排斥PI，而死亡的和受损的细胞的膜对PI是可渗透的。此外，膜磷脂磷脂酰丝氨酸（PS）从凋亡的细胞中外部细胞环境的内层易位到外层，并且因此膜联蛋白V蛋白染色（其对PS具有高亲和力并结合具有暴露的PS的细胞）可用于检测凋亡的细胞。
如图8A中所示，NFL-TBS40-63处理后，凋亡阶段早期或晚期的F98细胞百分比（被认为是死细胞）分别比阴性对照高233.5％±43.3和347.7％±32.6。同样，9L细胞表现出这种处理之后早期凋亡（712.1％±581.3）和晚期凋亡（233.6％±82.3）的增加的数目。与阴性对照比较，在F98（-37.6％±5.0）和9L（-32.6％±7.4）神经胶质瘤中对NFL-TBS40-63肽的凋亡反应与显著下降的活细胞数目相关。相比之下，原代星形胶质细胞对NFL-TBS40-63肽不敏感。在相同浓度下，NFL-SCR肽对这些不同细胞类型没有作用。
当测试源自人或小鼠的细胞时，获得相似的结果（图8B）。
总括来说，这些结果显示NFL-TBS40-63肽对神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用是通过活性凋亡机制介导的，该机制为当用抗有丝分裂药物处理时各种癌细胞尤其是胶质母细胞瘤细胞共有的细胞死亡机制（Wang等人，2000）。换言之，NFL-TBS40-63肽因此能够通过凋亡诱导神经胶质瘤细胞的死亡，但对正常健康的脑细胞没有作用。
3.2 NFL-TBS40-63在神经胶质瘤细胞中的体内渗透的特异性
体外实验显示当和星形胶质细胞或神经元相比时，神经胶质瘤细胞选择性吸收NFL-TBS40-63肽。使用携带有F98神经胶质瘤的大鼠进一步测试肽是否也可以仅体内靶向肿瘤细胞并选择性抑制其增殖。
通过立体定位将F98神经胶质瘤注入纹状体（第0天），6天后通过脑内注射60μL的5mMNFL-TBS40-63肽（或载体）处理动物。在第16、24或30天，大鼠安乐死并分析脑的连续冠状切片，来用抗GFAP检测NFL-TBS40-63肽和神经胶质瘤细胞。还用DAPI复染细胞核。
如图9中所示，在各时间点在神经胶质瘤细胞中检测到NFL-TBS40-63肽（绿色荧光）而在健康的周围细胞中没有检测到（与GFAP染色对肽进行共定位）。
重要的是，当按照相同的程序处理非携带有肿瘤（对照）大鼠时，NFL-TBS40-63肽被迅速清除，在这些时间点不可检测到。此外，当在正常脑中注射时，没有能检测到的或与肽存在相关的大的细胞缺陷。从生理角度来看，当用NFL-TBS40-63肽处理这些非携带肿瘤的（对照）大鼠时，没有发现痛苦的临床迹象，比如体重减轻或驼背的姿势。
所有这些数据共同表明NFL-TBS40-63肽特异性体内渗透神经胶质瘤细胞但避开健康细胞。特别感兴趣的是，因为这导致这样的结论：NFL-TBS40-63肽具有远低于其它靶向微管的药物（如紫杉醇，Cavaletti等人，1997）的毒副作用。为了强调这一点，已显示当它注入正常脑时NFL-TBS40-63肽确实被迅速清除，有利于低的毒性。这就解释了为什么与其它靶向微管的药物相反当注入非携带肿瘤（对照）的大鼠中时靶向微管的NFL-TBS40-63肽不诱导任何明显的作用。
3.3 NFL-TBS40-63的脑内施用体内降低肿瘤生长
为了进一步测试NFL-TBS40-63肽是否还可以抑制植入大鼠的神经胶质瘤的生长，用HE对连续切片进行染色并使用ImageJ通过形态测量学评价肿瘤的大小（见图10A上冠状切片的实例）。
用NFL-TBS40-63肽单次注射处理的动物表现出比未处理的动物中观察到的那些显著更小的肿瘤。事实上，肽处理的动物在第16天表现出肿瘤体积71.7％±18.9的减少（与载体处理的动物相比），在第24天72.0％±21.2的减少以及在第30天42.8％±11.3的减少（图10B）。
使用MRI分析在相同的动物组上观察到相似的肿瘤抑制。当与未处理的动物相比时，在NFL-TBS40-63肽处理的动物中，这种肿瘤的体积降低（未显示）。
也密切监测大鼠的体重减轻，一种反映注射制剂治疗性作用的肿瘤生长间接指标。动物的每天称重显示NFL-TBS40-63处理的动物的体重减轻显著低于未经处理的动物（图11）。
总之，上述结果强调了NFL-TBS40-63肽的显著能力：
a）当瘤内注射时，体内渗透神经胶质瘤细胞，
b）在它渗透的神经胶质瘤细胞中诱导凋亡，
c）避免影响脑的其它非肿瘤区域，
d）只通过一次注射，体内抑制神经胶质瘤的进展。
3.4 NFL-TBS2肽用于将纳米胶囊靶向神经胶质瘤细胞的用途
获得含有亲脂性荧光团的脂质纳米胶囊并偶联有或不偶联NFL-TBS2肽。用偶联有或不偶联NFL-TBS2肽的不同稀释的含亲脂性荧光团（DiD）的LNC对三种神经胶质瘤细胞系（GL261、T98G和U87-MG细胞）处理1或6个小时。通过FACS（图14A）、以及通过共聚焦显微镜对活细胞（图14B）或固定细胞（图14C）观察到用NFL-TBS2偶联的LNC改善的神经胶质瘤细胞系的靶向。
也在携带有GL261肿瘤的C57Bl/6小鼠中进行体内实验。为了检测肿瘤，用DAPI或使用抗GFAP（神经胶质纤维酸性蛋白Glial Fibrillary Acid Protein）抗体标记脑的连续切片，神经胶质肿瘤如胶质母细胞瘤中高度表达中间丝。重要的是，当通过立体定位注射在携带肿瘤的小鼠中脑内施用LNC（DiD）-NFL-TBS2时，LNC能够达到神经胶质瘤细胞（见图14D上的图像右侧），它们仍然滞留在肿瘤组织中（在健康组织中未观察到它们）。
因此，这些结果允许考虑将NFL-TBS40-63肽用作在动物或人类中治疗神经胶质瘤肿瘤的非常有前途的工具。除了其在降低肿瘤大小上的治疗效率，NFL-TBS40-63肽不显示这种药物（靶向微管的）通常伴有的强烈的神经毒性。因此，它体现了作为治疗患有神经胶质瘤的患者的未来治疗制剂。
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Claims (34)

1.一种由NFL-TBS40-63肽组成的分离的氨基酸序列在制备用于治疗恶性神经胶质瘤的药物中的用途，其中NFL-TBS40-63肽如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述恶性神经胶质瘤是脑恶性神经胶质瘤。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述脑恶性神经胶质瘤选自：间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、间变性少突神经胶质瘤和间变性少突星形细胞瘤。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述脑恶性神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述氨基酸序列以包括在0.07和0.7毫摩尔之间的剂量向人类施用。
6.由NFL-TBS40-63肽组成的氨基酸序列在制备用于检测神经胶质瘤细胞的试剂盒中的用途，其中NFL-TBS40-63肽如SEQ ID NO 1所示。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述氨基酸序列标记有染料或标签。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述标记是荧光染料。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述荧光染料是荧光素或荧光素衍生物。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述荧光素衍生物选自：六氯-荧光素、四氯-荧光素、羧基荧光素TAMRA、或羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述是从BIOSEARCHTECHNOLOGIES可获得的CAL绿色荧光素520、CAL金色荧光素540、CAL橙色荧光素560、CAL红色荧光素590、或CAL红色荧光素635。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯是6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素的琥珀酰亚胺酯或6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’二甲氧基荧光素的琥珀酰亚胺酯。
13.根据权利要求8所述的用途，其中所述荧光染料是罗丹明或罗丹明衍生物。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述罗丹明衍生物选自：5-羧基-X-罗丹明、6-羧基-X-罗丹明、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明。
15.根据权利要求8所述的用途，其中所述荧光染料是花菁或花菁衍生物。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述花菁衍生物选自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5。
17.根据权利要求8所述的用途，其中所述荧光染料是发色团。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述发色团选自4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚-3-丙酸、4,4-二氟-5,p-甲氧基苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚-3-丙酸、4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼烷-3a,4-二氮杂-a-S-茚-丙酸、4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚-3-丙酸、4,4-二氟-5,p-乙氧基苯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-s-茚3-丙酸和4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼烷-3a,4a-二氮杂-S-茚-丙酸。
19.根据权利要求8所述的用途，其中所述荧光染料是Texas或其衍生物。
20.根据权利要求8所述的用途，其中所述荧光染料是芘三磺酸。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述芘三磺酸是APTS或HPTS。
22.根据权利要求8所述的用途，其中所述荧光染料是曙红或曙红衍生物。
23.根据权利要求7所述的用途，其中所述标记选自：六氯-荧光素、四氯-荧光素、羧基荧光素TAMRA、和羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述是从BIOSEARCHTECHNOLOGIES可获得的CAL绿色荧光素520、CAL金色荧光素540、CAL橙色荧光素560、CAL红色荧光素590、或CAL红色荧光素635。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯是6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素的琥珀酰亚胺酯、或6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’二甲氧基荧光素的琥珀酰亚胺酯。
26.根据权利要求6所述的用途，其中神经胶质瘤细胞是胶质母细胞瘤细胞。
27.根据权利要求6所述的用途，其中所述氨基酸序列偶联有羧基荧光素染料或生物素标签。
28.由NFL-TBS40-63组成的氨基酸序列在制备用于体内或体外向神经胶质瘤细胞递送化学化合物或将化学化合物靶向至神经胶质瘤细胞的药物中的用途，其中NFL-TBS40-63肽如SEQ ID NO 1所示。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述化学化合物是药物化合物或标记标志物。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述的药物化合物是细胞毒性药物。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述细胞毒性药物是抗有丝分裂药物。
32.根据权利要求29所述的用途，其中所述的标记标志物是荧光分子。
33.根据权利要求28或29所述的用途，其中所述化学化合物包囊在偶联所述肽的纳米胶囊中。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述纳米胶囊是脂质纳米胶囊。
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