CN108586580A - 细胞穿透肽dhyhpfs及作为细胞内运送载体的用途 - Google Patents
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Abstract
一种细胞穿透肽DHYHPFS，序列为DHYHPFS，在生理条件下净电荷为负值。分子量为901.9道尔顿，含有一个酸性氨基酸天冬氨酸Asp，含有一个疏水性氨基酸苯丙氨酸Phe，理论等电点为5.49，中性条件下带一个单位负电荷，无正电荷，具有弱疏水性。该细胞穿透肽DHYHPFS可作为细胞内运送载体，能够内化哺乳动物细胞。内化过程不依赖于其与细胞膜表面的静电作用，不受pH值的影响，携带大分子货物内化后在胞浆内形成弥散分布，而不进入内吞体中，代谢稳定。本发明的细胞穿透肽DHYHPFS可以作为一类新的哺乳动物胞内大分子研究工具和治疗药物转运载体在细胞生物学和医药领域得到应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种带有负电荷的细胞穿透肽的序列特征，内化的特点及其作为哺乳动物胞内运送载体在生物学和医药领域的应用。
技术背景
细胞膜是细胞与细胞外环境间的半透性屏障，具有选择性通透作用从而使细胞保持恒定的内环境。虽然这种磷脂双分子层对于细胞的存活和功能必不可少，它却给细胞内外货物分子的交换提出了挑战。由于蛋白、多肽、核苷酸等药物大分子物质和显影剂必须要达到细胞内部才能发挥相应的作用，因此实现这些物质的跨膜转运变得非常必要。
目前，能够向细胞内转运大分子的技术主要有电穿孔(electroporation)、显微注射(microinjection)、脂质体转染(transfection)和病毒载体(viral vector)等，但这些技术由于效率低下、安全性差等原因，难以应用于临床诊断和治疗药物的研发。近年来，有关细胞穿透肽(cell-penetrationpeptides，CPPs)的研究为解决上述问题提供了一个良好的机遇。关于CPPs的首次报道出现在1988年，Frankel等发现来源于人免疫缺陷病毒HIV-1转录激活因子的蛋白Tat具有穿透细胞膜和核膜，并锚定于特异基因调控区的能力(Cell,1988,55:1189-1193)。随后研究还发现，Tat蛋白中的一段长度为11个氨基酸残基的碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR发挥了蛋白转运的作用(J Biol Chem,1997,272:16010-16017)。经过二三十年的探索，人们逐渐认识到，CPPs是一类长约9～16个氨基酸的小分子多肽，富含碱性氨基酸。作为一种有效的运输载体，CPPs在体内外可以将多肽、蛋白、核酸、肽核酸、脂质体、显像剂、纳米大小颗粒等多种物质有效地运送入细胞，适用于几乎所有的真核细胞，并且具有蛋白转导发生迅速、操作简单，毒性、副作用较小等优点。
由于CPPs的发现为细胞膜的结构和功能提供了极佳的研究工具，因而对于其穿膜机制的研究也得到了大量的关注。以研究最多的Tat为例，目前普遍认为，CPPs穿透细胞膜的过程基本上可分为两个阶段：首先通过电荷作用与细胞表面结合；然后穿透细胞膜进入细胞，释放进入胞浆乃至胞核。在第一阶段中，Tat能通过精氨酸残基的胍基与细胞表面上带有阴离子的胺聚糖、膜磷脂头部等发生强烈的相互作用，从而在细胞膜表面聚集。因此，氨基酸序列中含有较多的正电荷是目前穿透肽的主要序列特征之一。肝素(Heparin)是硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)上硫酸肝素(heparin sulfate,HS)的结构类似物，当与HS同时存在时，起到竞争性与配体结合的作用，而肝素酶Ⅲ(Heparinase III)可以特异性降解细胞膜表面的HS链，这两种抑制剂通过不同的机制都可以阻断细胞膜上HSPG的HS链与配体的相互作用，进而阻断正电荷CPPs的内化过程。在第二阶段中，CPPs内化的机制主要涉及三条途径(Cell Mol Life Sci.2005,62:1839-1849)：一是CPPs通过细胞脂质双分子层直接进入细胞内；二是CPPs在细胞表面形成特定的跨膜结构实现转运，比如微团模式，打孔模式等；三是内吞介导的内化模式，其中又可能涉及网格蛋白、胞膜窖和巨胞饮介导等具体内吞方式。上述三种途径中，内吞介导的内化模式目前被认为是大多数CPPs进入细胞的主要途径，也是研究最深入的一条途径。但是对于某一条CPPs(例如研究最为透彻的Tat)的穿膜途径而言，由于实验方法和条件的不一致，不同的研究机构和组织往往得到了不同的结论。另外，有研究发现，CPPs乃至货物分子的长度、电荷等都会对其具体的穿膜机制产生影响。由于上述因素的存在，加之研究手段的落后和实验条件的差异，使得对于CPPs的穿膜机制这一问题尚未取得统一的认识。另一方面，关于CPPs内吞进入细胞后的运输问题逐渐得到越多越多的关注和研究。有数据显示，目前已知的以正电荷为主的CPPs中，有相当数量的成员内化后会被包裹在内体中，直接导致其携带的药物分子无法得到有效的释放。该现象随着货物分子量的增加而更为明显。有学者提出CPPs转运药物的限速步骤就在于其逃离胞吞囊泡的过程(Nat Med,2004,10(3):310-315)。他们发现，大多数的Tat(48-57)-Cre通过脂筏发生胞吞后，可滞留在胞吞中长达24小时，同时这一逃离过程的效率是非常低下的。
尽管目前对于CPPs如何作用于细胞脂膜，穿透脂膜的机理目前尚不完全清楚，细胞内药物转运释放效率尚不尽如人意，但其在生物和医药领域的诱人应用前景却是毋庸置疑的。由于CPPs能够显著提高货物分子的通透性，因而能够携带显影剂和放射性同位素标记的抗体分子穿透如血脑屏障等特殊生理结构，达到细胞的内部，从而为中枢系统疾病部位的可视化提供了途径。S.Santra等用微导管将和Tat共轭结合的量子点通过颈动脉导入大鼠体内(Chem.Commun.(Camb.),2005,144-3146)后，发现Tat能够成功和迅速地将量子点运送到脑部实质，通过手持式的紫外灯照射就能够达到脑部组织的荧光可视化，而无需破坏血脑屏障的完整结构。此外，在肿瘤治疗方面，CPPs也成为了重要的工具，用于运输化疗药物和促凋亡蛋白至肿瘤细胞内部。为了达到靶向性治疗的目的，研究者设计将Tat与抗Her-2/neu的模拟肽AHNP相连接(Cancer Res.2006,66:3764-3772.)。该模拟肽能够特异性与表皮生长因子受体ErB2相结合，而在30％的乳腺癌患者中受体ErB2都出现过表达。经过改造后，癌细胞特异性药物转运体系能够大大提高肿瘤细胞内部药物的浓度，从而达到改善肿瘤治疗效果的目的。
凋亡素就是近来诱导肿瘤细胞凋亡的研究热点分子之一，也是未来结合CPPs达到肿瘤治疗目的的重要货物分子。凋亡素(apoptin，Vp3)是来源于鸡贫血病毒的基因片段，它由121个氨基酸残基组成，含有2个脯氨酸富含区和2个碱性区。它能诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡，但对人正常的二倍体细胞无凋亡诱导作用。其诱导的凋亡是不依赖p53途径的，不会被bcl-2的过表达所抑制，反而bcl-2的高表达还能促进凋亡素诱导的凋亡。研究发现，Vp3在诱导细胞凋亡的过程中发生了108位苏氨酸的磷酸化，激活下游capases级联反应，线粒体跨膜电位破坏。进而细胞色素c从线粒体释放，最终导致细胞的凋亡。
综上所述，目前已知的CPPs分子序列中大都含有较多的碱性氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)，尚未见带有负电荷的CPPs分子的报道。前者的内化强烈依赖于生理条件下带正电荷的碱性氨基酸与细胞膜外带负电硫酸肝素的相互作用，同时多数内化后会被限制在内吞囊泡中，胞内释放过程效率低下。考虑到对于经典的CPPs而言，序列中的正电荷为其发生内化所必须具备的条件，带有负电荷CPPs可能代表着一类尚未被人们所认识的新家族。对新的CPPs分子内化特点，及其以及与凋亡肽融合蛋白的制备方法进行研究，将为其作为大分子研究工具和治疗药物的转运载体在细胞生物学和医药领域的应用奠定基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种新的带有负电荷的细胞穿透肽序列DHYHPFS(简称DHY)及其同源物、类似物和衍生物。
本发明的第二个目的在于提供该穿透肽内化的特点，并作为大分子研究工具和治疗药物的转运载体在细胞生物学和医药领域的应用。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现：
提供一种细胞穿透肽DHYHPFS，氨基酸序列为DHYHPFS，在生理条件下净电荷为负值。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS，在生理条件下净电荷为-1。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS，分子量为901.9道尔顿，含有一个酸性氨基酸天冬氨酸(Aspartate，D)，含有一个疏水性氨基酸苯丙氨酸(Phenylalanine，F)，含有一个疏水性氨基酸酪氨酸(Tyrosine，Y)，理论等电点为5.49，中性条件下带一个单位负电荷，无正电荷，具有弱疏水性。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS，作为细胞内运送载体。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS，能够内化哺乳动物细胞。
进一步的，能够内化人前列腺癌细胞株PC-3、人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y、人肾上皮细胞系HEK-293A、小鼠胚胎成纤维细胞系3T3、人脐静脉内皮细胞系ECV304和大鼠心肌细胞。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS，内化过程不依赖于其与细胞膜表面的静电作用，不受pH值的影响，携带大分子货物内化后在胞浆内形成弥散分布，而不进入内吞体中，代谢稳定。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS，内化不对细胞产生毒性。
本发明提供细胞穿透肽DHYHPFS作为细胞内运送载体的用途。
本发明提供细胞穿透肽DHYHPFS作为在细胞内运送治疗药物的载体的医药用途。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS作为在细胞内运送治疗药物的载体的医药用途，包括作为运送治疗中枢退行性疾病、脑缺血、药物成瘾、心肌梗死、恶性肿瘤、肾损伤和肾功能衰竭、尿毒症、糖尿病性肾病、肾小管损伤、肝脏损伤和肝功能衰竭、感染和炎症性疾病的药物进入动物细胞方面的医药用途。
优选的，上述的细胞穿透肽DHYHPFS作为作为造影剂在细胞内的运送载体的医学成像技术的用途。
本发明提供上述的细胞穿透肽DHYHPFS的同源物；
所述同源物为包含带负电荷细胞穿透肽DHYHPFS的任意多肽或蛋白；或者所述同源物为包含带负电荷细胞穿透肽DHYHPFS的同源物的任意多肽或蛋白；细胞穿透肽DHYHPFS的同源物作为细胞内运送载体及作为在细胞内运送治疗药物的载体及作为造影剂在细胞内的运送载体的医学成像技术的用途。
本发明通过噬菌体展示肽库对人宫颈腺癌Hela细胞采用全细胞筛选的方法，得到的丰度最高的细胞穿透肽基因序列，得到序列为DHYHPFS，在生理条件下净电荷为负值的细胞穿透肽DHYHPFS。本发明的细胞穿透肽DHYHPFS与经典正电荷穿透肽相比较，具有不被内吞体包裹、代谢稳定好，不受pH值及电荷影响，同时对细胞毒性低，携带货物分子转运更加有效的优点，可以作为一类新的哺乳动物胞内大分子研究工具和治疗药物转运载体在细胞生物学和医药领域得到应用。
附图说明
结合附图对本发明作进一步说明，但附图中的内容不构成对本发明的限制。
图1为FITC-DHYHPFS内化不同哺乳动物细胞的实验结果。5μmol/L的FITC-DHYHPFS与人前列腺癌细胞株PC-3、人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y、人肾上皮细胞系HEK-293A、小鼠胚胎成纤维细胞系3T3、人脐静脉内皮细胞系ECV304在内的多种哺乳动物细胞系和新生大鼠心肌细胞孵育1小时后的荧光图像；相同浓度的FITC-Tat作为对照。
图2为DHYHPFS携带不同大小的荧光分子内化Hela细胞的实验结果。5μmol/L的FITC标记穿透肽或EGFP标记穿透肽与Hela细胞孵育1小时后的荧光图像；相同浓度的FITC-Tat或His-EGFP-Tat作为对照。其中FITC分子量为389.4道尔顿，EGFP分子量为27千道尔顿。
图3为抑制剂EGTA、肝素(Heparin)和肝素酶Ⅲ(Heparinase III)对DHYHPFS内化作用的影响；FITC-Tat作为对照。
图4为DHYHPFS携带EGFP在Hela细胞中代谢的过程；相同浓度的His-EGFP-Tat作为对照。
图5为不同浓度DHYHPFS对Hela细胞存活率的影响；相同浓度的FITC-Tat作为对照。
图6为结果对比表，是以1μmol/L的His-DHYHPFS-Vp3处理后MTT法检测Hela细胞增殖率(n＝3)、与相同浓度的His-DHYHPFS、His-Vp3和His-Tat-Vp3作为对照，在同一处理时间不同分组之间比较采用One-wayANOVA法，与正常组相比的结果，若P<0.05，用*表示，若P≤0.001，用**表示。
图7为1μmol/L的1μmol/L的His-DHYHPFS-Vp3处理后MTT法检测Hela细胞相对增殖率(n＝3)。相同浓度的His-DHY、His-Vp3和His-Tat-Vp3作为对照。与正常组相比，若P<0.05，用*表示，若P≤0.001，用**表示。
图8为1μmol/L的His-DHYHPFS-Vp3处理后诱导Hela细胞凋亡DAPI染色结果(×630油镜，相差)。未处理细胞、相同浓度的His-DHYHPFS或His-Vp3处理的细胞作为对照。
图9为结果对比表，是1μmol/L的His-DHYHPFS-Vp3处理后流式细胞术检测Hela细胞凋亡率(n＝3)，与相同浓度的His-DHYHPFS、His-Vp3和His-Tat-Vp3作为对照，同一处理时间不同分组之间比较采用One-wayANOVA法，与正常组相比的结果对比表，若P≤0.001，用**表示。
图10为1μmol/L的His-DHYHPFS-Vp3处理后流式细胞术检测Hela细胞凋亡率(n＝3)。相同浓度的His-DHYHPFS、His-Vp3和His-Tat-Vp3作为对照。与正常组相比若P≤0.001，用**表示。
具体实施方案
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：噬菌体总DNA的提取
经测序后将编码DHYHPFS的噬菌体离心，取100μl上清转入一个新鲜EP管中，加40μl PEG/NaCl，混匀后冰上放置1小时。于4℃，10000rpm，离心10分钟，弃上清；短暂离心，小心吸去残余上清。将沉淀彻底重悬于1ml碘化物缓冲液中，加2.5ml无水乙醇，室温温育10分钟。于4℃，10000rpm，离心10分钟，弃上清。用70％乙醇洗涤沉淀，短暂干燥。沉淀重悬于30μl TBS中。
该方法可以获得编码DHYHPFS的噬菌体的DNA序列。DHYHPFS对应的多肽名称、氨基酸序列和核酸编码序列如表一所示。
表一序列表
注：简并碱基符号对应表：
| 简并碱基 | 正常碱基 |
| Y | C/T |
| S | G/C |
| W | A/T |
| N | A/T/C/G |
实施例2：DHY内化不同的哺乳动物细胞系的实验
将人宫颈癌腺癌细胞系Hela、人肺腺癌上皮细胞系A549、人脐静脉内皮细胞HUVEC和小鼠单核巨噬细胞系Raw264.7培养在含10％小牛血清的DMEM完全培养基中，加入含0.1％链青霉素于37℃，5％CO2培养。将人前列腺癌细胞系PC-3、人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y和小鼠胚胎成纤维细胞系3T3培养在含10％小牛血清的1640完全培养基中，加入含0.1％链青霉素于37℃，5％CO2培养。根据细胞不同生长速度，选择融合度达80％-90％时进行常规传代。准备新生1天内的SD大鼠乳鼠，分离心脏，胶原消化液消化，加入血清终止消化。离心沉淀心肌细胞，充分悬浮后置于37℃细胞培养箱内，孵育60min。离心1,000rpm，5min，上清细胞数计数，使细胞在含10％小牛血清的DMEM中平衡生长24小时后用于实验。于实验前12h，在petri皿中以7×103细胞/孔密度分别铺入上述细胞。待细胞融合度达到50％～60％，撤去原培养基，用无血清DMEM洗细胞表面3次。将终浓度为5μmol/L的FITC-DHY与上述细胞分别共孵育1小时后利用激光共聚焦显微镜进行荧光观察，阴性对照为不含血清的培养基。结果显示，上述细胞内部均可以检测到荧光信号，提示穿透肽DHY能够有效内化上述多种哺乳动物细胞，内化具有普遍性，如图1所示。
实施例3：DHY与Tat携带货物分子内化细胞的行为比较
于实验前12小时，在petri皿中以7×103细胞/孔密度分别铺入人宫颈癌腺癌细胞系Hela。待细胞融合度达到50％～60％，撤去原培养基，用无血清DMEM洗细胞表面3次。将终浓度为5μmol/L的FITC-DHY或His-EGFP-DHY与上述细胞分别共孵育1小时后利用激光共聚焦显微镜进行荧光观察，相同浓度的FITC-Tat或His-EGFP-Tat作为对照，观察两类穿透肽内化行为差异。结果显示，当携带FITC(分子量为389.4道尔顿)时，DHY和Tat都是以胞浆分布为主，Tat甚至出现细胞核区的信号聚集。但是当携带大分子货物EGFP(分子量为27千道尔顿)时，Tat产生的荧光信号呈现颗粒状，存在于内吞体中，而DHY产生的荧光信号始终呈现胞浆均匀弥散状分布，如图2所示。提示，Tat在携带大分子货物时，被内吞体包裹的现象明显，不利于货物分子的释放和稳定存在，而DHY携带的大分子货物具有更好的细胞浆分布，能够更好地、更快地释放，更有效发挥作用。
需要说明的是，DHY除了能够携带EGPF这种大分子物质，还可以携带其它大分子物质，且内化后具有良好的释放效果。如，已经证实DHY可以携带凋亡素Vp3分子进入细胞内部，同时引起的细胞增殖率的抑制效应要强于单纯使用Vp3。此外，DHY还可以将超氧化物歧化酶1(SOD1)带入细胞，提高细胞抗氧化损伤的能力。在此不一一列举。
实施例4：DHY内化与抑制剂之间的关系
抑制剂肝素、肝素酶Ⅲ、EGTA分别与5μM的FITC-DHY或FITC-Tat共孵育Hela细胞1小时，利用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光分布。
肝素是硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)上硫酸肝素(heparin sulfate,HS)的结构类似物，当与HS同时存在时，起到竞争性与配体结合的作用，而肝素酶Ⅲ可以特异性降解细胞膜表面的HS链，这两种抑制剂通过不同的机制都可以阻断细胞膜上HSPG的HS链与配体的相互作用。结果显示，在肝素和肝素酶Ⅲ处理组，Tat的内化几乎被完全阻断，提示其内化强烈依赖与细胞膜外硫酸肝素的相互作用。而DHY在与肝素和肝素酶Ⅲ共孵育的情况下，仍然能发生内化，提示DHY的内化作用不依赖其与细胞膜表面的静电作用。另外，当培养液中二价阳离子被EGTA螯合之后，两种穿透肽都可以发生明显内化，提示二者的内化均不需要Ca2+等二价阳离子的存在。实验结果如图3所示，从实验结果可以看出，DHY的内化不依赖于电荷之间的作用，不会受到pH值的影响，适合于偏酸或偏碱性生理环境下的货物运输。
实施例5：DHY与Tat携带绿色荧光蛋白内化后的代谢比较
于实验前12小时，在petri皿中以7×103细胞/孔密度分别铺入人宫颈癌腺癌细胞系Hela。待细胞融合度达到50％～60％，撤去原培养基，用无血清DMEM洗细胞表面3次。将终浓度为5μmol/L的His-EGFP-DHY或His-EGFP-Tat与上述细胞分别共孵育2小时达到内化平衡，然后将细胞更换至正常的细胞培养液，分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时利用激光共聚焦显微镜进行荧光观察。由于大多数CPPs内化细胞后，会大量进入囊泡包裹的内吞体结构中，这一性质在携带大分子货物分子或是细胞外货物分子浓度较高时尤其明显。而CPPs一旦进入内吞体，将会妨碍其携带的分子到达胞浆或是其他细胞器部位发挥原有的功能。同时，进入内吞体结构的分子一部分会通过与溶酶体融合进而发生降解，另一部分可能通过细胞“内吞体循环”的机制被释放到细胞外，从而导致细胞内药物分子迅速的减少。本实验目的在于考察和比较DHY与Tat携带大分子EGFP(分子量27kDa)内化后在细胞内的代谢情况。结果显示，当更换培养基继续培养2小时左右时，His-Tat-EGFP在细胞内的荧光信号已显著减弱，而当培养时间延长至8小时时，细胞内已无法观察到明显荧光信号，提示此时His-Tat-EGFP已在细胞内代谢完全。对于His-DHY-EGFP处理组的细胞而言，随着继续培养的延长，荧光信号逐渐向细胞膜集中，同时细胞内的荧光信号逐渐减弱。然而当培养时间延长至8小时时，仍有部分细胞内存在较弱荧光信号，提示His-DHY-EGFP此时仍未完全被降解，如图4所示。通过测定不同时间点细胞悬液中的荧光强度进行定量，结果显示His-Tat-EGFP在细胞内的半衰期大概在2-3小时，而His-DHY-EGFP在细胞内的半衰期可以达到近6小时。提示，在相同条件下，DHY携带大分子内化后其稳定性较Tat强。
实施例6：DHY内化对Hela细胞的生长的影响
于实验前12小时，在12孔板中以1×105个细胞/孔密度铺入Hela细胞。待细胞完全贴壁后，撤去原培养基，用无血清DMEM洗涤细胞表面，分别将一定浓度的FITC-DHY或FITC-Tat与细胞共孵育2小时。PBS洗涤细胞细胞后，用胰酶处理适当时间至细胞变圆将从皿底脱落，加血清终止消化，4,000×g离心10min，制备单细胞悬液，并作适当稀释。将细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1比例混合均匀，滴至细胞计数板，置于显微镜下观察，计数细胞总数以及被染成明显蓝色的死细胞数量，统计细胞活力。计算公式：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。实验数据均采用均数±标准差表示，统计学分析采用SPSS 13.0软件，多样本均数比较采用One-WayANOVA。统计结果显示，在上述浓度范围的穿透肽处理下，浓度梯度对存活率无显著影响(F＝0.171,P＞0.05,n＝5)，90％以上的哺乳动物细胞仍然能保持细胞膜的完整性，如图5所示。提示，在高于最低内化浓度100倍的情况下，DHY的内化不会对细胞产生毒性，DHY具有与Tat类似低细胞毒性。
实施例7：DHY携带Vp3对Hela细胞相对增殖率的影响
于96孔培养板中铺入5×103个/孔的Hela细胞，加入含10％小牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中。待细胞融合度达到50％～60％时，弃去上清，分别加入含有1μmol/L的His-DHY-Vp3和His-Tat-Vp3的DMEM培养基100μl，同时设定对照组，分别加入1μmol/L的His-DHY和His-Vp3的DMEM培养基。根据计算公式需要，还设立了空白细胞对照组(孔底铺有细胞，上清为DMEM培养基)和空白培养基对照组(孔底无细胞，上清为DMEM培养基)。每组实验分别设立5个平行复孔，置入37℃，5％CO2培养箱中分别继续培养24小时和48小时测定细胞存活率。具体为，于实验终止前4小时加入5mg/mL MTT 10μL/孔孵育后，加入150μL/孔DMSO溶解紫色结晶，37℃孵育1小时，于连续光谱多功能微孔板阅读仪495nm处测量吸光度值。利用公式将吸光度值转化为细胞增殖率，该实验重复三次。细胞相对增殖率＝(实验或对照蛋白组平均值-空白培养基组平均值)/(空白细胞平均值-空白培养基组平均值))x 100％。
结果显示，处理24小时后，His-DHY-Vp3组细胞增殖率即出现下降，与正常组间差异具有统计学意义(P<0.001)；处理48小时后，His-Vp3和His-Tat-Vp3对照组细胞增殖率开始下降，His-Tat-Vp3组与正常组间差异具有统计学意义(P<0.001)。此时His-DHY-Vp3组细胞增殖率继续下降，与正常组间差异具有统计学意义(P<0.001)，与His-Vp3处理组细胞增殖率差异具有统计学意义(P<0.001)，与His-Tat-Vp3处理组细胞的增殖率差异不具有统计学意义(P＝1.000)。上述结果提示，His-DHY-Vp3处理组较His-Vp3和His-Tat-Vp3对照组细胞增殖率更早出现下降，48小时后His-DHY-Vp3引起的细胞增殖率大于His-Vp3处理组，但是和His-Tat-Vp3引起细胞增殖率的下降程度相差不大，如图6的结果对比表和图7所示。提示，由于Vp3分子难以在细胞内产生足够的浓度，DHY携带Vp3分子进入细胞引起的细胞增殖率的抑制效应要强于单纯使用Vp3，同时这种增殖率的下降要早于Tat，其原因可能在于DHY内化后主要弥散分布与胞浆中，更加有助于药物分子更快地发挥作用。
实施例8：Hela细胞核凋亡的形态观察
于Petri皿中铺入7×103个/孔的Hela细胞，加入含10％小牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中。待细胞融合度达到50％～60％时，弃去上清，加入含有1μmol/L的His-DHY-Vp3的DMEM培养基，同时设定对照组，分别为无血清DMEM、含1μmol/L的His-DHY和His-Vp3的无血清DMEM。置入37℃，5％CO2培养箱中48小时后，弃去细胞上清，4％多聚甲醛室温固定细胞10min，0.1％NaBH4处理细胞5min，再以100ng/ml的DAPI细胞核染色试剂避光处理5min。细胞经PBS洗涤后置于激光共聚焦显微镜下观察，激发波长364nm，发射波长454nm，采集蓝色通道荧光信号。结果显示，与对照组相比，1μmol/L的His-DHY-Vp3处理48小时后，绝大部分Hela细胞体积变小，细胞膜出现皱缩，细胞核出现固缩且凝聚趋边呈月牙状，如图8所示，上述现象均为细胞凋亡的典型特征。
实施例9：Hela细胞凋亡的流式细胞仪检测
于6孔板中铺入2×105个/孔的Hela细胞，加入含10％小牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中。待细胞贴壁后，弃去上清，加入含有1μmol/L的His-DHY-Vp3的DMEM培养基，同时设定正常细胞对照组和实验对照组(分别含1μmol/L的His-DHY和His-Vp3)，测定孵育24小时和48小时后的细胞凋亡率。即：弃去上清，PBS洗涤细胞后，用不含EDTA的胰酶消化收集，用含有2％BSA的PBS洗涤细胞二次，2000rpm离心5min收集细胞至EP管中。每管加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞，先后加入5μlAnnexin V-FITC和5μlPropidium Iodide，弹匀后室温避光处理15min。使用宽口吸管混匀细胞后加入流式细胞仪样品管中，于1小时内进行测定。激发波长488nm，发射波长530nm，Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。使用未经凋亡诱导处理的正常细胞分别进行单染，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。该实验重复三次，实验数据均采用均数±标准差表示。结果显示，处理24小时后，His-DHY-Vp3组细胞凋亡率出现提高，与正常组间差异具有统计学意义(P<0.001)；处理48小时后，His-Tat-Vp3对照组细胞凋亡率出现提高，与正常组间差异具有统计学意义(P<0.001)。此时His-DHY-Vp3组细胞凋亡率继续提高，与正常组间差异具有统计学意义(P<0.001)，与His-Vp3处理组间差异具有统计学意义(P<0.001)，与His-Tat-Vp3处理组细胞的凋亡率差异不具有统计学意义(P＝1.000)。提示，由于Vp3分子难以在细胞内产生足够的浓度，DHY携带Vp3分子进入细胞引起的细胞凋亡效应要强于单纯使用Vp3，同时这种凋亡率的上升要早于Tat，其原因可能在于DHY内化后主要弥散分布与胞浆中，更加有助于药物分子更快地发挥作用，如图9的对比结果表和图10所示。
实施例10:细胞穿透肽DHYHPFS的用途
本发明提供上述的细胞穿透肽DHYHPFS,其内化过程不依赖于其与细胞膜表面的静电作用，不受pH值的影响，携带货物内化后在胞浆内形成弥散分布，胞内释放性能良好，且不进入内吞体中，代谢稳定。能够携带的货物包括从小分子药物到蛋白大分子、以及到纳米颗粒物质。可以作为细胞内运送载体的用途，也可以作为在细胞内运送治疗药物的载体的医药用途。
实验发现，该细胞穿透肽DHYHPFS可以作为哺乳动物细胞内运送载体的用途。由于其具有良好的细胞内化性能，可以作为用于在细胞内运送治疗药物载体的医药用途，包括作为运送治疗中枢退行性疾病、脑缺血、心肌梗死、恶性肿瘤、肾损伤和肾功能衰竭、尿毒症、糖尿病性肾病、肾小管损伤、肝脏损伤和肝功能衰竭、抗菌、抗炎性疾病的药物进入动物细胞方面的医药用途。此外，该细胞穿透肽DHYHPFS还可作为造影剂在细胞内的运送载体的医学成像技术的用途。
可用于中枢退行性疾病如老年性痴呆和帕金森氏症、脑缺血如中风、药物成瘾、心肌梗死、恶性肿瘤、感染和炎症性疾病等的治疗以及医学成像技术的开发上。
①中枢神经系统疾病：实验发现，此类细胞穿透肽DHYHPFS可能具有透过生理屏障(包括血脑屏障)的能力，可以提高药物从血液运送到中枢神经系统的效率，更可进入神经细胞内发挥作用。此类负电荷细胞穿透肽可用于老年性痴呆和帕金森氏症等中枢退行性疾病、脑缺血(中风)、药物成瘾等的治疗。
②心血管系统疾病：由于心肌缺血和脑缺血机制具有相似性，此类负电荷细胞穿透肽亦可携带抗凋亡或激酶等活性分子进入心肌细胞和血管内皮细胞中，发挥保护作用，用于抑制由缺血或再灌注引起的心肌损伤，组织微细血管破坏和微血栓的形成。此类负电荷细胞穿透肽可用于心肌梗死等心血管系统疾病的治疗。
③肿瘤治疗：实验发现，此类细胞穿透肽DHYHPFS可能与表皮生长因子受体或肿瘤归巢结构域等特异性识别分子相连接，实现癌症的靶向治疗，并有效提高细胞内治疗药物浓度；可通过引导放射免疫试剂，提高抗体其在肿瘤的吸收和保留能力；可以与化疗药物设计形成复合物，以主动方式进入肿瘤细胞内，减小化疗药物耐药性。此外，它们中的一些还可能具备肿瘤细胞毒性，穿透细胞膜的同时可直接抑制肿瘤细胞的增殖。此类负电荷细胞穿透肽可用于恶性肿瘤疾病的治疗。
④炎症相关疾病：实验发现，此类细胞穿透肽DHYHPFS可能提高抗炎药物对皮肤的穿透效率，帮助抗炎药物有效抵达真皮T淋巴细胞，提高抗炎药物局部给药的疗效；可能对屏障功能发生障碍的炎症上皮细胞具有更高的内化能力。此类负电荷穿透肽可用于抗炎药物的载体开发。
⑤医学成像技术：实验发现，此类细胞穿透肽DHYHPFS可能提高造影剂对器官和组织的渗透性，提高造影剂对血脑屏障的通透性，实现中枢神经系统的可视化；提高量子点和抗体等大分子在细胞内的浓度，用于肿瘤光学成像和放射免疫治疗技术的开发。此类负电荷穿透肽可用于医学成像技术的发展。
可见，本发明的细胞穿透肽DHYHPFS可以突破现有技术中的正性电荷细胞穿透肽的局限，作为一种新的使用用途。
实施例11：细胞穿透肽DHYHPFS的同源物
本实施例提供细胞穿透肽DHYHPFS的同源物。同源物为氨基酸序列同源性大于60％的任意七肽；或者同源物为包含细胞穿透肽DHYHPFS的任意多肽或蛋白；或者同源物为包含细胞穿透肽DHYHPFS的同源物的任意多肽或蛋白；或者同源物为以细胞穿透肽DHYHPFS为功能骨架的多肽。
该细胞穿透肽DHYHPFS可以作为哺乳动物细胞内运送载体的用途。由于其具有良好的细胞内化性能，可以作为用于在细胞内运送治疗药物载体的医药用途，包括作为运送治疗中枢退行性疾病、脑缺血、药物成瘾、心肌梗死、恶性肿瘤、感染和炎症性疾病的药物进入动物细胞方面的医药用途。此外，该细胞穿透肽DHYHPFS还可作为造影剂在细胞内的运送载体的医学成像技术的用途。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 细胞穿透肽DHYHPFS及作为细胞内运送载体的用途
<130> GZZRH0504-18-1-402
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial)
<400> 1
Asp His Tyr His Pro Phe Ser
1 5
Claims (10)
1.一种细胞穿透肽DHYHPFS，其特征在于：氨基酸序列为DHYHPFS，在生理条件下净电荷为-1。
2.根据权利要求1所述的细胞穿透肽DHYHPFS，其特征在于：分子量为901.9道尔顿，含有一个酸性氨基酸天冬氨酸，含有一个疏水性氨基酸苯丙氨酸，含有一个疏水性氨基酸酪氨酸，理论等电点为5.49，中性条件下带一个单位负电荷，无正电荷，具有弱疏水性。
3.根据权利要求2所述的细胞穿透肽DHYHPFS，其特征在于：作为细胞内运送载体。
4.根据权利要求3所述的细胞穿透肽DHYHPFS，其特征在于：用于内化哺乳动物前列腺癌细胞株PC-3、人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y、人肾上皮细胞系HEK-293A、小鼠胚胎成纤维细胞系3T3、人脐静脉内皮细胞系ECV304和大鼠心肌细胞。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的细胞穿透肽DHYHPFS，其特征在于：内化过程不依赖于其与细胞膜表面的静电作用，不受pH值的影响，携带大分子货物内化后在胞浆内形成弥散分布，且不进入内吞体中，代谢稳定；内化不对细胞产生毒性。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的细胞穿透肽DHYHPFS作为细胞内运送载体的用途。
7.根据权利要求1至5任意一项所述的细胞穿透肽DHYHPFS作为在细胞内运送治疗药物的载体的医药用途。
8.根据权利要求7所述的细胞穿透肽DHYHPFS作为在细胞内运送治疗药物的载体的医药用途，包括作为运送治疗中枢退行性疾病、脑缺血、药物成瘾、心肌梗死、恶性肿瘤、肾损伤和肾功能衰竭、尿毒症、糖尿病性肾病、肾小管损伤、肝脏损伤和肝功能衰竭、感染和炎症性疾病的药物进入动物细胞方面的医药用途。
9.根据权利要求1至5任意一项所述的细胞穿透肽DHYHPFS作为造影剂在细胞内的运送载体的医学成像技术的用途。
10.如权利要求1至5任意一项所述的细胞穿透肽DHYHPFS的同源物，
所述同源物为包含带负电荷细胞穿透肽DHYHPFS的任意多肽或蛋白；或者
所述同源物为包含带负电荷细胞穿透肽DHYHPFS的同源物的任意多肽或蛋白；
细胞穿透肽DHYHPFS的同源物作为细胞内运送载体及作为在细胞内运送治疗药物的载体及作为造影剂在细胞内的运送载体的医学成像技术的用途。
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|---|---|---|---|---|
| WO2024018865A1 (ja) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN1733806A (zh) * | 2005-09-01 | 2006-02-15 | 南方医科大学 | 一种多肽随机文库及其构建方法和从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法 |
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| CN1733806A (zh) * | 2005-09-01 | 2006-02-15 | 南方医科大学 | 一种多肽随机文库及其构建方法和从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吴向玲: "Hela细胞穿透肽的筛选和初步鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024018865A1 (ja) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 |
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