CN110087685A - 用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供能够长期维持心力衰竭的治疗和/或预防效果的新的移植用心肌干细胞、制造该细胞的方法和包含该细胞的细胞制剂。本发明涉及用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法、利用该制造方法制造的细胞和包含该细胞的细胞制剂、以及用于制造该细胞的脂质体，该制造方法包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。根据本发明，可提供能够长期维持由细胞移植带来的治疗和/或预防效果的心肌干细胞。

Description

用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法
技术领域
本发明涉及用于治疗和/或预防心力衰竭的新的心肌干细胞的制造方法、包含线粒体被活化的心肌干细胞的细胞群、包含该心肌干细胞或细胞群的用于治疗和/或预防心力衰竭的细胞制剂、以及用于制造该心肌干细胞的脂质体。
背景技术
心力衰竭是指由心肌梗塞、心肌病或心绞痛等心脏相关疾病、或者高血压、肾脏疾病或针对恶性肿瘤的化学疗法的副作用等心脏以外的疾病导致的、心脏的功能降低而无法向肺和全身供给必要量的血液的症状。心力衰竭在日本是仅次于癌症的主要死因，作为其根本性的治疗方法，可以列举心脏移植。但是，心脏移植存在移植供体的慢性不足、移植器官的耐用年限、排斥反应、终生服用免疫抑制剂、频繁的入院导管检查等涉及多方面的问题。
自21世纪00年代后半期提出细胞移植作为针对心力衰竭的有希望的治疗方法以来，对使用包括iPS细胞的各种细胞的细胞移植疗法进行了研究。特别是心肌干细胞移植，由于是使用自体细胞的移植，因此具有能够使用在免疫学上安全、侵袭性低的方法进行等优点。心肌干细胞移植在临床试验中已被验证具有一定的效果(例如非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。
作为心肌干细胞移植的问题，可以列举例如在猪缺血再灌注模型中的心肌干细胞移植实验中移植细胞成活效果有限(非专利文献4)；在大鼠多柔比星心肌病模型中的心肌干细胞移植实验中存活率改善效果有限(非专利文献5)；等等。即，治疗效果的长期维持是今后心肌干细胞移植中的课题之一。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Bolli,R.et al.,Lancet 2011,378,pp.1847-1857
非专利文献2：Makkar,R.R.et al.,Lancet 2012,379,pp.895-904
非专利文献3：Ishigami,S.et al.,Circulation research 2015,116,pp.653-664
非专利文献4：Takehara,N.et al.,J.Am.Coll.Cardiol.2008,52,pp.1858-65
非专利文献5：De Angelis,A.et al.,Circulation 2010,121,pp.276-292
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供能够长期维持治疗和/或预防心力衰竭的效果的新的移植用心肌干细胞、制造该细胞的方法和包含该细胞的细胞制剂。
用于解决问题的方法
本发明人发现，通过将线粒体活化剂递送至心肌干细胞的线粒体，能够制造成活效果提高、可长期维持治疗效果的移植用细胞，从而完成了下述各发明。
(1)一种用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法，其包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。
(2)如(1)所述的制造方法，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。
(3)如(1)或(2)所述的制造方法，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂、含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质、并且在脂质膜表面上具有线粒体靶向分子的线粒体靶向脂质体。
(4)如(3)所述的制造方法，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。
(5)如(1)至(4)中任一项所述的制造方法，其中，线粒体活化剂为白藜芦醇。
(6)一种心肌干细胞，其通过将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中而制造。
(7)如(6)所述的心肌干细胞，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。
(8)如(6)或(7)所述的心肌干细胞，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂、含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质、并且在脂质膜表面上具有线粒体靶向分子的线粒体靶向脂质体。
(9)如(8)所述的心肌干细胞，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。
(10)如(6)至(9)中任一项所述的心肌干细胞，其中，线粒体活化剂为白藜芦醇。
(11)一种包含心肌干细胞的细胞群，其在利用荧光染料JC-1染色时JC-1二聚体的荧光强度相对于JC-1单体的荧光强度之比的平均值为1～4。
(12)一种用于治疗和/或预防心力衰竭的细胞制剂，其包含(6)至(11)中任一项所述的心肌干细胞或细胞群。
(13)一种用于向心肌干细胞的线粒体中导入被包封物的脂质体，其含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质，并且在脂质膜表面具有线粒体靶向分子。
(14)如(13)所述的脂质体，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。
发明效果
根据本发明，可提供能够长期维持由细胞移植带来的治疗和/或预防效果的心肌干细胞。该心肌干细胞能够用于对心肌损伤的治疗和/或预防、心脏功能的恢复、保护或降低抑制、或者心力衰竭的治疗和/或预防等。
附图说明
图1是示出导入了包封有白藜芦醇并用NBD进行了荧光标记的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞的流式细胞术的直方图。横轴表示NBD的荧光量、纵轴表示细胞数。
图2是使用共聚焦激光扫描型显微镜(CLSM)对导入了包封有白藜芦醇并用NBD进行了荧光标记的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞进行观察的照片。图中，B照片表示用NBD(绿色)染色的RES-MITO-Porter、C照片表示用MTDR(红色)染色的线粒体、D照片表示用Hoechst 33342(蓝色)染色的细胞核、A照片表示将B～D照片重叠后得到的照片。各图的比例尺为20μm。
图3是示出将心肌成肌细胞与导入了包封有白藜芦醇的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞(MA-细胞)或未处理的心肌干细胞(CPC)共培养时，在由多柔比星(终浓度10μg/mL、50μg/mL)所致的细胞损伤下的细胞存活率的图。图中，“共培养”表示心肌成肌细胞与MA-细胞的共培养、“CPC单独”表示心肌成肌细胞与CPC的共培养、“对照”表示心肌成肌细胞的单独培养。
图4示出将心肌成肌细胞与导入了包封有白藜芦醇的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞(MA-细胞(+RES-MITO-Porter))、导入了空的MITO-Porter的心肌干细胞(CPC(+MITO-Porter))、用白藜芦醇直接处理后的心肌干细胞(CPC(+RES))或CPC共培养时，在由多柔比星(终浓度10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL)所致的细胞损伤下的细胞存活率。
图5示出将心肌成肌细胞与导入了包封有白藜芦醇的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞(CPC+RES-MITO-Porter)、用白藜芦醇直接处理后的心肌干细胞(CPC(+RES))或CPC共培养时，在由多柔比星(终浓度10μg/mL)所致的细胞损伤下经过48小时后的细胞存活率。
图6是示出将心肌成肌细胞与MA-细胞共培养时，白藜芦醇的各用量下的、在由多柔比星(终浓度10μg/mL)所致的细胞损伤下的细胞存活率的图。
图7是示出与移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠相关的Kaplan-Meier曲线的图。
图8是示出移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的平均体重的变化的图。
图9是示出移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的心脏组织中的二氢乙锭(DHE)阳性细胞率的图。
图10是示出移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的心脏组织中的凋亡诱导率的图。
图11是示出移植了MA-细胞的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的左室缩短率的图。
图12是示出移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的心脏组织中的、PGC1α、ESRRa、SDHA、Cox1和ATP1a各基因的相对表达量的图。
图13是示出移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的心脏组织中的线粒体呼吸链复合物的形成率的图。
图14是示出移植后的小鼠心脏中的MA-细胞的定植的照片。图中，左下的照片表示用Alexa Flour 488(绿色)染色的心肌辅肌动蛋白、右上的照片表示用Hoechst 33342(蓝色)染色的细胞核、右下的照片表示用CellVue Claret(红色)染色的MA-细胞、左上的照片表示将这些照片重叠后得到的照片。
图15是示出使用荧光染料JC-1对MA-细胞和CPC的线粒体膜电位进行检测的结果的照片。图中，左列的照片为CPC、中央列的照片为MA-细胞、右列的照片为添加有FCCP的CPC，中段的照片示出与表示去极化的线粒体的JC-1单体对应的波长529nm的绿色荧光、下段的照片示出与表示极化的线粒体的JC-1二聚体对应的波长590nm的红色荧光、上段的照片表示中段照片与下段照片重叠而得到的照片。
图16是示出基于使用荧光染料JC-1对MA-细胞和CPC的线粒体膜电位进行检测而得到的图像，算出表示去极化的线粒体的JC-1单体(绿色)与表示极化的线粒体的JC-1二聚体(红色)的荧光强度之比(二聚体/单体)的结果的图。图中，○表示各个细胞中的值、━表示平均值(n＝19)。
具体实施方式
本发明的第一方式涉及用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法，其包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。
心肌干细胞(也称为心肌祖细胞(Cardiac progenitor cells)；以下表示为CPC)是具有自我复制能力和向心肌、血管内皮/平滑肌、脂肪、骨、软骨等的分化能力的干细胞。本发明中使用的CPC可以利用本领域技术人员公知的方法从心脏组织中分离。该CPC的一例例如为利用Oh等(PNAS.,2003,100,pp.12313-12318)的方法、Ishigami等(Circ Res.,2015,116,pp.653-664)的方法等从心脏组织中分离的细胞。另外，由iPS细胞分化诱导的CPC(Funakoshi S.et al,Scientific Reports 6,2016、19111)、以及通过成纤维细胞或心肌细胞的重编程得到的CPC(Ieda M.et al,Cell,2010,142,pp.375-386)也可以在本发明中使用。上述各文献以参考的方式并入本说明书中。
CPC可以来源于任何动物，但在用于治疗或预防人的心力衰竭的目的中，优选使用人的CPC。本发明中，特别优选使用从患有心力衰竭的人或有可能发生心力衰竭的人的心脏组织中以使用自体细胞的移植为前提而分离的CPC。
另外，CPC可以是基于Sca-1等CPC特异性标志物的表达而分离纯化的CPC，或者也可以是包含在细胞群、例如通过由心脏分离的细胞的球状体培养得到的异质的细胞群中的状态的CPC。后者的情况下，将各细胞群供于后述的导入线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物的步骤，由此制造包含线粒体被活化的CPC的细胞群。
为了确保之后的细胞移植所需要的细胞数，只要维持CPC的干细胞性，也可以将CPC在体外传代培养使其增殖后进行使用。
本发明包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到CPC中的步骤。
线粒体靶向载体是指该载体被导入到细胞内时具有选择性地到达作为细胞内细胞器之一的线粒体的功能的载体。作为线粒体靶向载体的示例，可以列举亲脂性三苯基阳离子(TPP)或罗丹明123等脂溶性阳离子物质、线粒体靶向序列(MTS)肽(Kong,BW.etal.,Biochimica et Biophysica Acta 2003,1625,pp.98-108)或S2肽(Szeto,H.H.etal.,Pharm.Res.2011,28,pp.2669-2679)等多肽、或DQAsome(Weissig,V.et al.,J.Control.Release 2001,75,pp.401-408)、MITO-Porter(Yamada,Y.et al.,BiochimBiophys Acta.2008,1778,pp.423-432)、DF-MITO-Porter(Yamada,Y.et al.,Mol.Ther.2011,19,pp.1449-1456)、用S2肽修饰的改造型DF-MITO-Porter(Kawamura,E.etal.,Mitochondrion 2013,13,pp.610-614)等线粒体靶向脂质体。上述各文献涉及本发明中的各载体的制造和利用，以参考的方式并入本说明书中。
本发明中优选的线粒体靶向载体为线粒体靶向脂质体，特别优选MITO-Porter、DF-MITO-Porter或改造型DF-MITO-Porter。
线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物是指下述形态的物质：无论借助化学性键合或是物理性包封等方式，线粒体靶向载体与线粒体活化剂整体性行动。例如，在脂溶性阳离子脂质或多肽为线粒体靶向载体时，依据例如关于脂溶性阳离子脂质的Murphy等的方法(G.F.Kelso et al,J.Biol.Chem.,2001,276,pp.4588-4596)、关于Szeto肽的日本特表2007-503461中记载的方法等，利用共价键或离子键等化学方法使线粒体靶向载体与线粒体活化剂键合，由此能够形成线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物。
另外，在线粒体靶向载体为脂质体时，可以通过使线粒体活化剂以化学方式键合在脂质体的脂质膜表面，或者将线粒体活化剂物理性地包封到脂质体的内部、即被脂质膜封闭的内部空间中，形成线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物。
上述复合物向CPC中的导入可以利用关于各线粒体靶向载体所已知的向细胞中导入的方法来进行。例如，可以通过将CPC在含有复合物的适当培养基中进行培养而导入到细胞内，另外也可以通过在Lipofectamine、聚乙二醇等能够促进物质向细胞中摄入的公知物质的存在下将复合物和CPC进行温育而导入到细胞内。
本发明的第一方式中的将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到CPC中的步骤的优选例为下述步骤：将作为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体的复合物、特别是作为用MTS肽或S2肽进行了表面修饰的包封有线粒体活化剂的MITO-Porter或DF-MITO-Porter的复合物与CPC进行温育，由此将复合物导入到CPC中。
线粒体活化剂是指能够使线粒体的呼吸链复合物(电子传递系统)活化、特别是能够使线粒体的膜电位成为极化状态的物质，特别优选使用能够使线粒体成为超极化状态的物质。作为这样的线粒体活化剂的示例，可以列举白藜芦醇(resveratrol、3,5,4’-三羟基反式二苯乙烯)、辅酶Q10、维生素C、维生素E、N-乙酰基半胱氨酸、TEMPO、SOD、谷胱甘肽等抗氧化剂，特别优选白藜芦醇。
本发明中优选使用的白藜芦醇可以是利用公知的方法从植物中提取的白藜芦醇，另外也可以是利用例如Andrus等(Tetrahedron Lett.2003,44,pp.4819-4822)等公知的方法化学合成的白藜芦醇。
利用本发明的第一方式的方法制造的CPC为本发明的另外的方式之一，如后述实施例所示，能够大幅提高进行了多柔比星给药的小鼠的存活率。另外，还适当地参与进行了多柔比星给药的小鼠的心脏组织中的氧化应激的降低、凋亡的抑制或线粒体功能的维持。
临床上已知，通过作为蒽环类药剂之一的多柔比星的给药可引起重度的心肌损伤，进行了多柔比星给药的小鼠被用作心力衰竭模型小鼠。因此，利用本发明的第一方式的方法制造的CPC能够用于针对心肌损伤、特别是重度心肌损伤的治疗和/或预防、心脏功能的恢复、保护或降低抑制、或者心力衰竭的治疗和/或预防等。
本发明的另一方式涉及一种包含心肌干细胞的细胞群，其在用荧光染料JC-1染色时JC-1二聚体的荧光强度相对于JC-1单体的荧光强度之比(JC-1二聚体的荧光强度/JC-1单体的荧光强度)的平均值为1～4。
线粒体通过存在于其内部的呼吸链复合物的作用在膜内外产生质子浓度梯度，成为具有膜电位的极化状态。极化的线粒体在受到凋亡或代谢应激等时，会陷入膜电位降低的去极化状态。这种线粒体的极化状态是表示线粒体的代谢活性的参数，认为大量具有极化线粒体的细胞是线粒体被活化的细胞。
已知作为线粒体膜电位探针的荧光染料JC-1(5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物，5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)是在去极化的线粒体内发出绿色荧光的单体，但其在极化的线粒体内形成发出红色荧光的二聚体。因此，JC-1单体与二聚体的荧光强度之比成为表示线粒体的极化状态的指标。荧光强度之比例如可以通过使用由ThermoFisher Scientific、COSMO BIO等销售的JC-1按照制造商的操作说明进行荧光比率检测来测定。
本方式的细胞群为包含线粒体被活化的CPC的细胞群，该群中所含的CPC的线粒体活化的程度可以利用将细胞群用JC-1染色时JC-1二聚体的荧光强度相对于JC-1单体的荧光强度之比(JC-1二聚体的荧光强度/JC-1单体的荧光强度)的平均值来表示。
荧光强度之比的平均值可以如下计算出：对细胞群中所含的任意个数、优选为十几个到几十个的CPC分别测定JC-1二聚体的荧光强度相对于JC-1单体的荧光强度之比(JC-1二聚体的荧光强度/JC-1单体的荧光强度)，以它们的平均值的形式算出。包含线粒体被活化的CPC的细胞群中的JC-1二聚体的荧光强度相对于JC-1单体的荧光强度之比的平均值大于1、优选为1～4。
需要说明的是，本方式的细胞群为主要包含CPC的细胞群，优选为实质上不含CPC以外的细胞的细胞群。该细胞群典型地可以利用上述本发明的第一方式的方法来制造。
上述CPC和包含CPC的细胞群均可以用于针对心肌损伤的治疗和/或预防、心脏功能的恢复、保护或降低抑制、或者心力衰竭的治疗和/或预防等。因此，作为本发明的另外的方式，提供一种治疗和/或预防心肌损伤或心力衰竭的方法，其包括对需要处置的对象给药有效量的上述CPC或细胞群的步骤。此外，作为本发明的另外的方式，还提供一种恢复心脏功能的方法、保护心脏功能的方法或抑制心脏功能降低的方法，其包括对需要处置的对象给药有效量的上述CPC或细胞群的步骤。
此外，作为本发明的不同的方式，还提供以上述CPC或包含CPC的细胞群作为有效成分的细胞制剂、特别是用于心肌损伤或心力衰竭的治疗和/或预防的细胞制剂、用于心脏功能的恢复和/或保护的细胞制剂、用于抑制心脏功能降低的细胞制剂等。
本领域技术人员可以利用公知的方法制备作为本发明的一个方式的细胞制剂。例如，可以根据需要将细胞悬浮在水或除此以外的药学上可接受的缓冲液等中，以悬浮液的形态制备。细胞制剂可以包含药学上可接受的载体或介质、例如植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、防腐剂等添加剂。
作为本发明的一个方式的细胞制剂包含有效量的上述CPC或包含CPC的细胞群。本说明书中使用的“有效量”是指为了发挥出针对心肌损伤的治疗和/或预防、心脏功能的恢复、保护或降低抑制、或者心力衰竭的治疗和/或预防等效果所需的CPC的量。有效量取决于需要处置的对象的状况，相对于每个对象个体，例如为1×103细胞～1×109细胞、优选为1×106细胞～1×109细胞、更优选为1×107细胞～1×109细胞，可以将该量一次给药或隔开适当间隔多次给药。
对于细胞制剂的给药方法没有特别限制，可以列举通常使用的给药方法、例如血管内给药(优选静脉内给药)、腹腔内给药、局部给药等。优选静脉内给药或对心脏局部给药。
本发明的另外的方式还提供一种用于将被包封物导入到CPC的线粒体中的脂质体，其含有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以及磷脂酸(PA)和/或鞘磷脂(SM)作为脂质膜的构成脂质，并且在脂质膜表面上具有线粒体靶向分子。线粒体靶向分子为由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽、即S2肽的脂质体可以利用上述kawamura等记载的方法来制造。本方式的脂质体在脂质膜表面除了具有S2肽以外还可以进一步具有由序列号2所示的氨基酸序列构成的肽、即八精氨酸肽，该脂质体可以利用日本专利第5067733号中记载的方法来制造。优选被包封物为本发明的第一的方式中说明的线粒体活化剂。
利用以下的实施例进一步详细地对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
实施例1.将白藜芦醇递送到了线粒体的CPC的制备
(1)小鼠CPC的纯化
按照Oh等(PNAS.2003,100,pp.12313-12318)的方法，如下分离、纯化小鼠CPC。
从8周龄的c57BL6/J雄性小鼠中摘除心脏，进行胶原酶处理和Percoll密度梯度处理，由此提取出包含CPC的细胞群。将所得到的细胞群进行原代培养后，利用MACS系统进行分选，对选择性地提取出的Sca-1阳性CPC进行传代培养，由此分离出小鼠CPC。对于分离的CPC，利用流式细胞术(FACS)对表面标志蛋白质量进行定量，利用PCR法对心肌转录因子和结构蛋白质的基因表达量进行定量，确认到这些值与已经报道的值一致(未显示数据)。
(2)用S2肽修饰的RES-MITO-Porter的制备
如下制备用S2肽进行表面修饰、并且包封有白藜芦醇的线粒体靶向脂质体(RES-MITO-Porter)。
对1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和鞘磷脂(SM)的1mM脂质乙醇溶液(DOPE/SM＝9:2)137.5μL与三氯甲烷112.5μL的混合液进行减压干燥处理，由此制备脂质膜。将含有2.3mg/mL白藜芦醇的10mM HEPES缓冲液250μL添加到脂质膜中进行水合(室温、15分钟)后，使用水浴型超声仪(AU-25C；AIWA医科工业)进行超声波处理，由此制备脂质体。在该脂质体中添加Stearyl S2溶液使其达到总脂质量的10％，在室温下温育30分钟，由此制备RES-MITO-Porter。
确认到，所制备的RES-MITO-Porter为平均粒径：121±7nm、ζ电位：49±1mV、白藜芦醇包封率：87±4％、具有正电荷的纳米粒子，在4℃下保存一个月后也维持粒子物性。
(3)RES-MITO-Porter向CPC中的导入
按照已经报道(Abe,J.et al.,J.Pharm.Sci.2016,105,pp.734-740)的方法，将RES-MITO-Porter用绿色荧光染料NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑，7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole)进行标记，评价向CPC中的导入。准备以总脂质量计为550μM的NBD荧光标记RES-MITO-Porter(白藜芦醇浓度为100μM)200μL，添加到1×106个CPC/DMEM-F12培养基10mL中，温育1小时，由此向CPC中导入RES-MITO-Porter。使用FACS检测摄取到CPC中的NBD荧光标记载体，由此确认RES-MITO-Porte被导入到CPC中(图1)。
按照已经报道(Abe,J.et al.,J.Pharm.Sci.2016,105,pp.734-740)的方法，将导入有NBD荧光标记RES-MITO-Porter的CPC的线粒体用MTDR染色后，使用共聚焦激光扫描型显微镜(CLSM)进行观察，结果观察到NBD的绿色与MTDR的红色重叠而形成的黄色的点。由此确认RES-MITO-Porter聚集在CPC的线粒体中(图2)。
实施例2.将白藜芦醇递送到线粒体中的CPC的心肌成肌细胞保护效果(体外实验)
(1)RES-MITO-Porter向CPC中的导入
将悬浮在DMEM-F12培养基中的CPC以1×106个/孔接种到6孔板中，在37℃下培养24小时。在各孔中添加实施例1的(2)中制备的RES-MITO-Porter，温育2小时，由此将RES-MITO-Porter导入到CPC中，用于之后的实验。将该导入有RES-MITO-Porter的CPC表示为MA-细胞。
(2)在由多柔比星所致的细胞损伤下的细胞存活率
将大鼠心肌成肌细胞H9c2细胞(从ATCC购入)和(1)中制备的MA-细胞在DMEM-F12培养基中混合，使H9c2细胞为3×104个/孔、MA-细胞为1×104个/孔，将混合液在37℃下共培养24小时。在共培养液中添加多柔比星使终浓度为10μg/mL(低用量)或50μg/mL(高用量)，诱发细胞损伤，进一步培养16小时后，使用WST-1试剂(Takara Bio Inc.)测定细胞存活率。另外，对于仅添加培养基来代替MA-细胞的H9c2细胞(对照)和添加CPC来代替MA-细胞的H9c2细胞(CPC单独)，也与上述同样地诱发细胞损伤，测定细胞存活率。将设未进行多柔比星处理的H9c2细胞的细胞存活率为100％时的结果示于图3。
确认到，MA-细胞抑制由多柔比星的细胞损伤作用所致的细胞存活率的减少。另外，在将共培养中的H9c2细胞与MA-细胞的混合比率设为6:1时也确认到同样的结果(图4的MA-细胞)。另一方面，向H9c2细胞中添加用白藜芦醇直接处理的CPC来代替MA-细胞时的细胞存活率(图4的CPC(+RES))的减少与CPC单独时的细胞存活率的减少(图4的CPC)为同等程度，未确认到由白藜芦醇的添加带来的改善。
另外，将培养基从DMEM-F12变更为高糖DMEM(Thermo)，将H9c2细胞与MA-细胞、用白藜芦醇直接处理的CPC或CPC的混合比率设为6:1在37℃下共培养24小时后，添加终浓度10μg/mL的多柔比星，诱发细胞损伤，进一步培养48小时后，测定细胞存活率。将设未进行多柔比星处理的H9c2细胞的细胞存活率为100％时的结果示于图5。确认到，MA-细胞对于由多柔比星的细胞损伤作用所致的细胞存活率的减少的抑制在诱发细胞损伤后48小时后仍得以保持。
(3)白藜芦醇用量依赖性的细胞存活率的变化
进行与上述(1)同样的操作，使用白藜芦醇浓度为0～10μМ的RES-MITO-Porter，制备改变了白藜芦醇的递送量的MA-细胞。使用各MA-细胞和终浓度10μg/mL的多柔比星，进行与上述(2)同样的实验，测定白藜芦醇的各用量下的细胞存活率。将设未进行多柔比星处理的H9c2细胞的细胞存活率为100％时的结果示于图6。
确认到，由多柔比星的细胞损伤作用所致的细胞存活率的减少以依赖于白藜芦醇的用量的方式得到改善。
实施例3.将白藜芦醇递送到线粒体的CPC对心肌损伤的保护效果(体内实验)
(1)多柔比星心肌损伤模型小鼠的制作和各CPC的给药
在正常小鼠(6～8周龄的雄性C57/BL6小鼠)的心脏中进行MA-细胞(1×106个)的细胞移植，准备MA-细胞移植组(n＝6)。移植起24小时后，参考Zhang等(Nature Medicine2012,18,pp.1639-1642)的方法，将200μL的多柔比星/PBS以25mg/kg仅一次给药到小鼠的腹腔内，诱导心肌损伤。对于未进行细胞移植的组(未处置组)和移植CPC来代替MA-细胞的组(CPC移植组)，也与上述同样地诱导心肌损伤。另外，对于各组准备未给药多柔比星的组(正常组)。
(2)心肌损伤诱导后的存活率
制作关于心肌损伤诱导后的各组的存活率的Kaplan-Meier曲线，利用对数秩(log-rank)分析进行统计处理。将该结果示于图7。确认到，MA-细胞移植组的存活率与未处置组和CPC移植组的存活率相比大幅改善。
(3)平均体重
将心肌损伤诱导起第3天和第7天的各组的小鼠平均体重示于图8。在进行了多柔比星给药的全部组中体重均暂时减少，但在第7天在MA-细胞移植组中确认到体重恢复的倾向。
(4)心脏组织中的氧化应激状态
在心肌损伤诱导起第3天摘除心脏，参考Zhang等(前述)的方法迅速对心脏组织进行二氢乙锭(DHE)染色，计数心脏组织中的红色细胞(DHE阳性细胞)，以DHE阳性细胞率对心脏组织的氧化应激状态进行定量。将其结果示于图9。DHE为与活细胞中的活性氧反应而发出红色荧光的荧光探针。与正常组的DHE阳性细胞率相比，在未处置组和CPC移植组中显示出显著高的DHE阳性细胞率。另一方面，在MA-细胞移植组中确认到DHE阳性细胞的增加受到抑制的倾向。
(5)心脏组织中的凋亡诱导
将(4)中摘除的心脏进行组织固定后。使用TUNNEL原位细胞死亡检测试剂盒荧光素试剂盒(Sigma公司)进行TUNEL法，计数心脏组织中的凋亡阳性细胞，算出凋亡诱导率。将其结果示于图10。确认到，在未处置组和CPC移植组中观察到大量凋亡诱导细胞，但在MA-细胞移植组中凋亡诱导被抑制到与正常组同等程度的水平。
(6)心功能(左室缩短率)
通过进行二维超声心动法测定心肌损伤诱导5周后的正常组和MA-细胞移植组的各小鼠的心功能(左室缩短率)。将其结果示于图11。关于左室缩短率，在MA-细胞移植组与正常组之间未确认到显著差异。
(7)线粒体功能
从(4)中摘除的心脏组织中提取、纯化总RNA，进行反转录反应后，设定GAPDH为内标进行实时PCR法，由此对与线粒体新生相关的PGC1α和ESRRa、与线粒体呼吸链复合物相关的SDHA、Cox1和ATP1a各基因的表达量进行定量。将设正常组中的各基因的表达量为1时的各组中的相对表达量示于图12。确认到，在未处置组和CPC移植组中各基因的表达水平大幅减少，但在MA-细胞移植组中表达水平的减少受到抑制。由该结果确认，在MA-细胞移植组的心脏组织中，在心肌损伤诱导后也显著维持了线粒体新生和线粒体氧化的磷氧化基因群的表达。
(8)线粒体呼吸链复合物的结构保持
从(4)中摘除的心脏组织中提取蛋白质，进行蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue-Native PAGE)。电泳后，使用线粒体复合物I抗体(Abcam)和线粒体复合物II抗体(Abcam)进行蛋白免疫印迹，对电子传递系统超级复合物带(1000kDa)的条带进行定量。利用由复合物II抗体得到的条带定量值进行校正，将由此算出的超级复合物的形成率示于图13。确认到，与未处置组相比，在CPC移植组和MA-细胞移植组中线粒体呼吸链复合物结构得到保持。特别是在MA-细胞移植组中，确认到在与正常组同等程度的水平上保持了线粒体呼吸链复合物的高级结构。
实施例4.MA-细胞在心肌组织内的成活
按照制造商的操作说明使用CellVue Claret Far Red(Sigma)，制备将细胞膜表面染成了红色的MA-细胞和CPC。使用这些细胞进行与实施例3同样的细胞移植和心肌损伤诱导，在损伤诱导起第7天摘除心脏。对于摘除的心脏，使用心肌辅肌动蛋白抗体(小鼠抗α横纹肌辅肌动蛋白单克隆抗体(Sigma))作为一次抗体、使用抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor488山羊F(ab’)2(Life Technologies)作为二次抗体，将心肌染成绿色，另外使用Hoechst33342将细胞核染成蓝色，进行显微镜观察。将与移植了MA-细胞的小鼠相关的显微镜照片示于图14。
确认到，在移植了MA-细胞的小鼠的心脏组织中，在绿色的心肌组织上存在红色的移植细胞(图14左上的重叠、白色箭头的位置)。另一方面，在CPC移植组中未观察到红色的荧光(未显示数据)。
实施例5.MA-细胞的线粒体膜电位
对于MA-细胞和实施例1中制备的CPC，按照制造商的操作说明，使用荧光染料JC-1(Invitrogen公司)考察线粒体的膜电位。JC-1在极化的线粒体中聚集时发出波长590nm的红色荧光，在线粒体去极化(膜电位消失)时扩散到细胞质中并发出波长529nm的绿色荧光。将结果示于图15。
在CPC中，观察到局限于线粒体的红色荧光，同时也观察到绿色荧光(图15左、CPC)。另外，在利用线粒体膜电位的解偶联剂FCCP对CPC进行处理时，红色荧光几乎消失，仅观察到绿色荧光(图15右、FCCP)。另一方面，在MA-细胞中，观察到比CPC多的红色荧光(图15中、MA-细胞)。
此外，对于MA-细胞和CPC，分别以19个细胞为对象，算出极化的线粒体(红色、二聚体)的荧光强度相对于去极化的线粒体(绿色、单体)的荧光强度之比(二聚体/单体比率)(图16)。其结果确认到，在MA-细胞中，比率处于0.5～4.5倍的范围、其平均值为1.9，另一方面，在CPC中，比率处于0～1的范围、其平均值为0.4。
序列表
<110> 国立大学法人北海道大学（National Corporation University HokkaidoUniversity）
<120> 用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法（Method forproducing cardiac progenitor cells for use in treatment and/or prevention ofcardiac failure）
<130> P16HU04WO
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的线粒体靶向肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> Xaa表示D-Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> Xaa表示二甲基酪氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> Xaa表示D-Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> Xaa表示二甲基酪氨酸
<400> 1
Xaa Xaa Lys Phe Xaa Xaa Lys Phe
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 八精氨酸
<400> 1
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5

Claims (14)

1.一种用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法，其包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述复合物为包封有线粒体活化剂、含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质、并且在脂质膜表面具有线粒体靶向分子的线粒体靶向脂质体。
4.如权利要求3所述的制造方法，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。
5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，线粒体活化剂为白藜芦醇。
6.一种心肌干细胞，其通过将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中而制造。
7.如权利要求6所述的心肌干细胞，其中，所述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。
8.如权利要求6或7所述的心肌干细胞，其中，所述复合物为包封有线粒体活化剂、含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质、并且在脂质膜表面具有线粒体靶向分子的线粒体靶向脂质体。
9.如权利要求8所述的心肌干细胞，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。
10.如权利要求6～9中任一项所述的心肌干细胞，其中，线粒体活化剂为白藜芦醇。
11.一种包含心肌干细胞的细胞群，其在利用荧光染料JC-1染色时JC-1二聚体的荧光强度相对于JC-1单体的荧光强度之比的平均值为1～4。
12.一种用于治疗和/或预防心力衰竭的细胞制剂，其包含权利要求6～11中任一项所述的心肌干细胞或细胞群。
13.一种用于向心肌干细胞的线粒体中导入被包封物的脂质体，其含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质，并且在脂质膜表面具有线粒体靶向分子。
14.如权利要求13所述的脂质体，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。
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