JPWO2018092839A1 - 心不全の治療及び/又は予防に用いるための心筋幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、(1)に記載の製造方法。
(3)前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び/又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、(1)又は(2)に記載の製造方法。
(4)ミトコンドリア指向性分子が配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、(3)に記載の製造方法。
(5)ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、(1)から(4)のいずれか一項に記載の製造方法。
(6)ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入することにより製造される、心筋幹細胞。
(7)前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、(6)に記載の心筋幹細胞。
(8)前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び/又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、(6)又は(7)に記載の心筋幹細胞。
(9)ミトコンドリア指向性分子が配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、(8)に記載の心筋幹細胞。
(10)ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、(6)から(9)のいずれか一項に記載の心筋幹細胞。
(11)心筋幹細胞を含む細胞集団であって、蛍光色素JC−1で染色したときのJC−1モノマーの蛍光強度に対するJC−1ダイマーの蛍光強度の比の平均値が1〜4である、前記細胞集団。
(12)(6)から(11)のいずれか一項に記載の心筋幹細胞又は細胞集団を含む、心不全の治療及び/又は予防に用いるための細胞製剤。
(13)ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び/又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有する、心筋幹細胞のミトコンドリアに被封入物を導入するためのリポソーム。
(14)ミトコンドリア指向性分子が配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、(13)に記載のリポソーム。
(1)マウスCPCの精製
マウスCPCを、Ohら(PNAS. 2003,100,pp.12313−12318)の方法に従い、下記のようにして単離・精製した。
S2ペプチドで表面修飾され、かつレスベラトロールを封入したミトコンドリア指向性リポソーム(RES−MITO−Porter)を下記のように調製した。
既報(Abe,J. et al.,J.Pharm.Sci. 2016,105,pp.734−740)の方法に従い、RES−MITO−Porterを緑色蛍光色素NBD(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole)で標識し、CPCへの導入を評価した。総脂質量として550μMのNBD蛍光標識RES−MITO−Porter(レスベラトロール濃度は100μM)を200μL準備し、1×106個のCPC/DMEM−F12培地10mLに添加して1時間インキュベーションすることで、CPCにRES−MITO−Porterを導入した。FACSを用いてCPCに取り込まれたNBD蛍光標識キャリアを検出することで、RES−MITO−PorterがCPCに導入されたことを確認した(図1)。
(1)CPCへのRES−MITO−Porterの導入
DMEM−F12培地に懸濁したCPCを1×106個/ウェルとなるように6ウェルプレートに播種し、37℃で24時間培養した。各ウェルに実施例1の(2)で調製したRES−MITO−Porterを添加して2時間インキュベーションすることでRES−MITO−PorterをCPCに導入し、以後の実験に用いた。このRES−MITO−Porterを導入したCPCをMA−Cellと表す。
ラット心筋芽細胞H9c2細胞(ATCCより購入)を3×104個/ウェルとなるように、及び(1)で調製したMA−Cellを1×104個/ウェルとなるようにDMEM−F12培地中で混合し、混合液を37℃で24時間共培養した。共培養液に終濃度10μg/mL(低用量)又は50μg/mL(高用量)となるようにドキソルビシンを添加して細胞傷害を誘起してさらに16時間培養した後、WST−1試薬(Takara Bio Inc.)を用いて細胞生存率を測定した。また、MA−Cellに代えて培地のみを添加したH9c2細胞(コントロール)、及びMA−Cellに代えてCPCを添加したH9c2細胞(CPC単独)についても、上記と同様にして細胞傷害を誘起して、細胞生存率を測定した。ドキソルビシン未処理のH9c2細胞の細胞生存率を100%としたときの結果を図3に示す。
上記(1)と同様の操作を行って、レスベラトロール濃度0〜10μМのRES−MITO−Porterを用いて、レスベラトロールの送達量を変化させたMA−Cellを調製した。各MA−Cell及び終濃度10μg/mLのドキソルビシンを用いて上記(2)と同様の実験を行い、レスベラトロールの各用量における細胞生存率を測定した。ドキソルビシン未処理のH9c2細胞の細胞生存率を100%としたときの結果を図6に示す。
(1)ドキソルビシン心筋傷害モデルマウスの作製及び各CPCの投与
健常マウス(6〜8週齢の雄C57/BL6マウス)の心臓にMA−Cell(1×106個)を細胞移植して、MA−Cell移植群(n=6)を用意した。移植から24時間後に、Zhangら(Nature Medicine 2012,18,pp.1639−1642)の方法を参考にして、200μLのドキソルビシン/PBSを25mg/kgとなるように1回のみ、マウスの腹腔内に投与して、心筋傷害を誘導した。細胞移植をしない群(未処置群)及びMA−Cellに代えてCPCを移植した群(CPC移植群)についても、上記と同様にして心筋傷害を誘導した。また、ドキソルビシンを投与しない群(健常群)を各群に対して用意した。
心筋傷害誘導後の各群の生存率に関するKaplan−Meier曲線を作成し、log−rank解析による統計処理を行った。その結果を図7に示す。MA−Cell移植群の生存率は、未処置群及びCPC移植群のそれと比較して大きく改善されることが確認された。
心筋傷害誘導から3日目及び7日目における各群のマウス平均体重を、図8に示す。ドキソルビシンを投与した全ての群で一時的に体重は減少するが、7日目にはMA−Cell移植群において体重の回復傾向が認められた。
心筋傷害誘導から3日目に心臓を摘出し、Zhangら(前出)の方法を参考にして心臓組織を速やかにジヒドロエチジウム(DHE)染色し、心臓組織中の赤色細胞(DHE陽性細胞)をカウントして、心臓組織の酸化ストレス状態をDHE陽性細胞率として定量した。その結果を図9に示す。DHEは、生細胞中の活性酸素種と反応して赤色蛍光を発する蛍光プローブである。健常群のDHE陽性細胞率と比較して、未処置群群及びCPC移植群では有意に高いDHE陽性細胞率を示した。一方、MA−Cell移植群ではDHE陽性細胞の増加が抑制される傾向が確認された。
(4)で摘出した心臓を組織固定した後に、TUNNEL In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein kit(Sigma社)を用いたTUNEL法を行い、心臓組織中のアポトーシス陽性細胞をカウントして、アポトーシス誘導率を算出した。その結果を図10に示す。未処置群及びCPC移植群ではアポトーシス誘導細胞が多数観察されたが、MA−Cell移植群では健常群と同程度のレベルまでアポトーシス誘導が抑制されている事が確認された。
心筋傷害誘導した5週間後の健常群及びMA−Cell移植群の各マウスの心機能(左室短縮率)を断層心エコー法を行うことで測定した。その結果を図11に示す。左室短縮率については、MA−Cell移植群と健常群との間には有意な差は認めらなかった。
(4)で摘出した心臓組織から全RNAを抽出・精製し、逆転写反応後、内標準にGAPDHを設定したリアルタイムPCR法を行うことで、ミトコンドリア新生に関連するPGC1α及びESRRa、ミトコンドリア呼吸鎖複合体に関連するSDHA、Cox1及びATP1aの各遺伝子の発現量を定量した。健常群における各遺伝子の発現量を1としたときの各群における相対的発現量を、図12に示す。未処置群及びCPC移植群では各遺伝子の発現レベルが大きく減少していたが、MA−Cell移植群では発現レベルの減少が抑制されている事が確認された。この結果から、MA−Cell移植群の心臓組織では、心筋傷害誘導後も、ミトコンドリア新生及びミトコンドリア酸化的リン酸化遺伝子群の発現が有意に維持されていることが確認された。
(4)で摘出した心臓組織からタンパク質を抽出し、Blue−Native PAGEを行った。電気泳動後、ミトコンドリアComplexI抗体(Abcam)及びミトコンドリアComplexII抗体(Abcam)を用いたWestern−blottingを行い、電子伝達系Super−complex帯(1,000kDa)のバンドを定量した。ComplexII抗体によるバンド定量値で補正することで算出したSuper−complexの形成率を、図13に示す。未処置群と比較すると、CPC移植群及びMA−Cell移植群ではミトコンドリア呼吸鎖複合体構造が保持されることが確認された。特に、MA−Cell移植群では、健常群と同程度のレベルでミトコンドリア呼吸鎖複合体の高次構造が保持される事が確認された。
CellVue Claret Far Red(Sigma)を製造者のプロトコルに従って用いて、細胞膜表面を赤色に染色したMA−Cell及びCPCを調製した。これらの細胞を用いて実施例3と同様の細胞移植及び心筋傷害誘導を行い、傷害誘導から7日目に心臓を摘出した。摘出された心臓について、1次抗体に心筋アクチニン抗体(Ms monoclonal anti−sarcomeric α actinin Ab(Sigma))、2次抗体にAlexa Fluor 488 Goat F(ab’)2 anti−Ms IgG(H+L)(Life Technologies)を用いて心筋を緑色に、またHoechst 33342を用いて細胞核を青色にそれぞれ染色し、顕微鏡観察を行った。MA−Cellを移植したマウスに関する顕微鏡写真を図14に示す。
MA−Cell及び実施例1で調製したCPCについて、蛍光色素JC−1(Invitrogen社)を製造者のプロトコルに従って用いてミトコンドリアの膜電位を調べた。JC−1は、分極したミトコンドリアに集積すると波長590nmの赤色蛍光を発し、ミトコンドリアが脱分極する(膜電位が消失する)と細胞質中に拡散して波長529nmの緑色の蛍光を発する。結果を図15に示す。
Claims (14)
- ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入する工程を含む、心不全の治療及び/又は予防に用いるための心筋幹細胞の製造方法。
- 前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、請求項1に記載の製造方法。
- 前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び/又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、請求項1又は2に記載の製造方法。
- ミトコンドリア指向性分子が配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項3に記載の製造方法。
- ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- ミトコンドリア指向性キャリアとミトコンドリア活性化剤との複合体を心筋幹細胞に導入することにより製造される、心筋幹細胞。
- 前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入されたミトコンドリア指向性リポソームである、請求項6に記載の心筋幹細胞。
- 前記複合体が、ミトコンドリア活性化剤が封入された、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び/又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有するミトコンドリア指向性リポソームである、請求項6又は7に記載の心筋幹細胞。
- ミトコンドリア指向性分子が配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項8に記載の心筋幹細胞。
- ミトコンドリア活性化剤がレスベラトロールである、請求項6〜9のいずれか一項に記載の心筋幹細胞。
- 心筋幹細胞を含む細胞集団であって、蛍光色素JC−1で染色したときのJC−1モノマーの蛍光強度に対するJC−1ダイマーの蛍光強度の比の平均値が1〜4である、前記細胞集団。
- 請求項6〜11のいずれか一項に記載の心筋幹細胞又は細胞集団を含む、心不全の治療及び/又は予防に用いるための細胞製剤。
- ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び/又はスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつミトコンドリア指向性分子を脂質膜表面に有する、心筋幹細胞のミトコンドリアに被封入物を導入するためのリポソーム。
- ミトコンドリア指向性分子が配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項13に記載のリポソーム。
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