CN118141790A - 一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物纳米制剂与肿瘤学应用技术领域，涉及一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物及其制备方法和应用。本发明所述纳米药物包括姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡，或所述纳米药物包括姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡。姜黄素载入上述细胞外囊泡联用，能够产生极强的协同效应，多肽修饰能够显著增强EV‑T的抗癌活性；将姜黄素载入上述细胞外囊泡获得的复合纳米药物，可解决姜黄素难溶性的问题，进一步提升抗癌效果。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米制剂与肿瘤学应用技术领域，具体涉及一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
多酚类化合物姜黄素(curcumin，简称CUR)是从姜黄中提取的多酚类化合物，具有良好的抗癌潜力。姜黄素可调节凋亡因子、生长因子以及炎症蛋白的表达，具有抗癌和消炎活性，可单独使用或与其他抗癌药物联合用于癌症治疗。然而，姜黄素的临床应用受限于其低抗肿瘤活性等显著的问题。因此，亟需开发其新的制剂来克服上述问题，以求获得更好的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物及其制备方法和应用。本发明所述纳米药物高效且安全，具有较高的抗肿瘤活性和良好的生物安全性，为攻克癌症这一重大疾病提供了新的思路和策略。
本发明提供了一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物，所述纳米药物包括姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡，或所述纳米药物包括姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡。
优选的是，所述肿瘤抗原结合多肽修饰包括RGD多肽修饰。
优选的是，所述RGD多肽修饰使用RGD-CP05融合肽进行，所述RGD-CP05融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的是，所述纳米药物中，姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡简单混合；或将姜黄素载入表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内；或姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡简单混合；或将姜黄素载入经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内。
优选的是，用于细胞外囊泡生产的细胞包括间充质干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞、诱导多能干细胞、肿瘤细胞、肿瘤干细胞、免疫细胞或成纤维细胞中的任一种。
优选的是，所述纳米药物的剂型包括纳米制剂；所述纳米制剂中，细胞外囊泡的粒径分布为60～120nm。
本发明还提供了经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡作为靶向递送抗癌药物的纳米递送平台，在制备抗肿瘤纳米药物中的应用；所述抗癌药物包括姜黄素。
优选的是，当将姜黄素载入表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内时，所述纳米药物的制备方法包括以下步骤：
将表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡与姜黄素混合，置于冰上进行超声处理，得到EV-T-CUR；
当将姜黄素载入经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内，所述纳米药物的制备方法包括以下步骤：
将经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡与姜黄素混合，置于冰上进行超声处理，得到RGD@EV-T-CUR。
优选的是，经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡的制备方法包括以下步骤：
合成肿瘤抗原结合多肽，将肿瘤抗原结合多肽和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡混和，孵育，超速离心，取沉淀，得到RGD@EV-T。
优选的是，所述超声处理的条件包括：超声10～60s，暂停10～60s，循环次数5～12次；温度15～30℃，超声功率设置为10～30％。
本发明提供了一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物。本发明所述纳米药物包括姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡，或所述纳米药物包括姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡。药物组分可以简单混合联用，也可以制备成复合载入药物。通过联用姜黄素增敏癌细胞的TRAIL响应，可克服普遍的癌细胞TRAIL抵抗性。具体的，CUR与EV-T或RGD@EV-T联用，能够产生极强的协同效应，获得显著高于单药的抗癌活性。且与CUR联用时，RGD@EV-T显示出比EV-T更高的癌细胞生长抑制率，表明RGD修饰显著增强了EV-T的抗癌活性。并且，CUR与EV-T或RGD@EV-T联用对正常细胞无影响，本发明复合药物联用的方案具有良好的安全性。
当姜黄素以载入的方式存在于表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡或经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡中时，本发明获得的是一种新型的复合纳米药物。纳米粒子来自于细胞，具体为细胞外囊泡，CUR有较高的EV包封率，可解决姜黄素难溶性的问题。本发明先制备表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡EV-T，再通过CP05锚定肽介导将肿瘤靶向多肽RGD结合到EV-T膜表面，获得RGD修饰的EV-T，即RGD@EV-T(在本发明对EV-T进行工程化修饰，使其携带膜表面结合的RGD，获得肿瘤靶向修饰的EV-T，即RGD@EV-T，能够显著增强EV-T的肿瘤靶向性)，然后载入CUR，制备靶向修饰的、复合载送TRAIL和CUR的新型靶向的姜黄素纳米药物RGD@EV-T-CUR。省略肿瘤靶向多肽RGD修饰的过程，获得复合载送TRAIL和CUR的新型靶向的姜黄素纳米药物EV-T-CUR。经由EV共载递送的CUR和TRAIL具有高度的协同作用，能高效特异性地广谱杀死各种癌细胞，RGD修饰进一步显著增强了EV-T-CUR的肿瘤靶向性，在细胞模型和动物肿瘤模型中均显示了高效的抗肿瘤活性，并且具备良好的安全性。本发明创造了一种高效安全的新型的肿瘤靶向的姜黄素纳米制剂，具有开发为广谱靶向抗癌纳米药物的良好潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为EV-T透射电子显微镜照片；
图2为使用ELISA试剂盒定量检测EV、EV-T和RGD@EV-T的TRAIL含量结果图；
图3为使用肾癌细胞Caki-1进行DiR荧光标记的EV-T和RGD@EV-T细胞摄入试验结果图；其中，a为DiR标记制剂的细胞摄入图，b为细胞摄入定量分析图，c为DiR标记制剂的生物分布图，d为制剂生物分布的定量分析图；
图4为以免疫印迹(WB)检测EV、EV-T和RGD@EV-T中TRAIL的表达水平结果图；
图5为以HPLC检测姜黄素CUR的检出峰和标准曲线结果图；其中，a为CUR的检出峰图，b为检测标准曲线图，c为CUR的载入率图；
图6为EV-T、RGD@EV-T及RGD@EV对于癌细胞系和正常细胞系的细胞毒性测试结果图；其中，a为EV-T影响细胞增殖效应的剂量实验图，b为RGD@EV-T影响细胞增殖效应的剂量实验图，c为RGD@EV影响细胞增殖效应的剂量实验图；
图7为不同浓度的CUR与EV-T或RGD@EV-T联合治疗对癌细胞系和正常细胞系的细胞毒性测试结果图；其中，a为姜黄素CUR对4种癌细胞和2种正常细胞的细胞毒性剂量试验结果图；b-g为CUR单独处理或与EV-T或RGD@EV-T联用对A549(b)，M231(c)，Hela(d),Caki-1(e),HK-2(f)和MSC(g)细胞的增殖影响图；
图8为各种试剂(CUR、EV-T、RGD@EV-T、EV-T-CUR和RGD@EV-T-CUR)对Caki-1癌细胞的生长抑制(CCK-8检测)和凋亡诱导效应(AnnexinV/PI染色和流式分析)以及细胞骨架影响(F-actin荧光标记)观测图；其中，a为细胞增殖和活性试验图，b为细胞凋亡检测图，c为各种制剂处理24小时后细胞骨架变化比较图；
图9为以裸鼠皮下肾癌模型测试比较各种治疗试剂的治疗效应结果图；其中，a为肿瘤生长曲线图，b为实验结束时代表性肿瘤图，c为实验结束时肿瘤重量比较图，d为动物器官组织的TUNEL凋亡染色图，e为TUNEL染色定量分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物，所述纳米药物包括姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL))的细胞外囊泡(细胞可分泌释放表达了膜结合TRAIL的EV，命名为EV-T)，或所述纳米药物包括姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的(即肿瘤靶向)表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡。本发明首次发现姜黄素与EV-T有高度的凋亡诱导协同效应，特别是可特异性高效杀死多种癌细胞，具有广谱抗癌活性，而对正常细胞无影响。并且，发现可将姜黄素载入EV-T，完美解决其难溶于水的问题。对EV-T进行肿瘤靶向修饰，使其携带膜表面结合的肿瘤靶向多肽，能够获得肿瘤靶向修饰的，显著增强EV-T的肿瘤靶向性。本发明对表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡(EV-T)的制备方法没有特殊限定，采用常规方法进行制备即可，如参考文献(Cytotherapy 2015,17(7):885-896；Journal ofExtracellularVesicles,2017,6(1),1265291)。载入细胞外囊泡EV的姜黄素与表达在EV表面的抗癌因子TRAIL协同，具有高效的、广谱的和特异性的抗癌活性。在本发明中，所述肿瘤抗原结合多肽修饰优选包括RGD多肽修饰。在本发明中，所述RGD多肽修饰优选使用RGD-CP05融合肽进行，所述RGD-CP05融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：RGDCRHSQMTVTSRL。本发明对RGD-CP05融合肽的来源没有特殊限定，公司合成即可。本发明所述RGD-CP05融合肽优选经合肥森尔生物科技有限公司合成。
在本发明中，所述纳米药物中，姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡简单混合(即混合联用)；或将姜黄素载入表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内；或姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡简单混合(即混合联用)；或将姜黄素载入经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内。在本发明中，姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡或经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡联用，能够产生极强的协同效应，获得显著高于单药的抗癌活性。且经肿瘤抗原结合多肽修饰后，显示出更高的癌细胞生长抑制率，表明肿瘤抗原结合多肽修饰显著增强了抗癌活性。并且，药物联用对正常细胞无影响，本发明混合联用的方案具有良好的安全性。经由EV共载递送的CUR和TRAIL具有高度的协同作用，能高效特异性地广谱杀死各种癌细胞，RGD修饰进一步显著增强了EV-T-CUR的肿瘤靶向性。最优选的，本发明将姜黄素(CUR)载入RGD@EV-T，制备了复合共载递送CUR和TRAIL的新型靶向纳米制剂RGD@EV-T-CUR，在细胞模型和动物肿瘤模型中均显示了高效的抗肿瘤活性，并且具备良好的安全性。这一新型制剂可潜在地开发成为一种治疗癌症的靶向纳米药物，具有很好的应用前景。
在本发明中，用于细胞外囊泡生产的细胞优选包括间充质干细胞(MSC)、骨髓干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞、诱导多能干细胞、肿瘤细胞、肿瘤干细胞、免疫细胞或成纤维细胞中的任一种。最优选为人脐带来源的间充质干细胞。
在本发明中，所述纳米药物的剂型优选包括纳米制剂；所述纳米制剂中，细胞外囊泡的粒径分布优选为60～120nm，平均粒径优选为72.77nm。
本发明还提供了经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡作为靶向递送抗癌药物的纳米递送平台，在制备抗肿瘤纳米药物中的应用；所述抗癌药物优选包括姜黄素。载入细胞外囊泡EV的姜黄素与表达在经肿瘤抗原结合多肽修饰的EV表面的抗癌因子TRAIL协同，具有高效的、肿瘤靶向的、广谱的和特异性的抗癌活性。
在本发明中，当将姜黄素载入表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内时，所述纳米药物的制备方法包括以下步骤：将表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡与姜黄素混合，置于冰上进行超声处理，得到EV-T-CUR。本发明对表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡(EV-T)的制备方法没有特殊限定，采用常规方法进行制备即可，如参考文献(Cytotherapy 2015,17(7):885-896；Journal ofExtracellular Vesicles,2017,6(1),1265291)。具体的，本发明优选先构建表达TRAIL的慢病毒载体，制备基因工程修饰病毒，通过慢病毒转染建立高表达TRAIL的细胞株，培养细胞获得含有EV-T的培养上清，通过超速离心分离纯化EV-T。本发明工程修饰病毒的制备不限于慢病毒，优选还可以使用逆转录病毒或腺病毒进行制备。在本发明中，所述超声处理的条件优选包括：超声10～60s，暂停10～60s，循环次数5～12次；温度15～30℃，超声功率设置为10～30％，更优选为优选包括：超声35s，暂停35s，循环次数6次；温度25℃，超声功率设置为25％。
当将姜黄素载入经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内，所述纳米药物的制备方法包括以下步骤：将经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡(RGD@EV-T)与姜黄素混合，置于冰上进行超声处理，得到RGD@EV-T-CUR(靶向多肽修饰的复合共载送姜黄素和抗癌因子TRAIL的细胞外囊泡纳米粒子)。本发明先进行经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡的制备，包括以下步骤：合成肿瘤抗原结合多肽，将肿瘤抗原结合多肽和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡混和，孵育，超速离心，取沉淀，得到RGD@EV-T。本发明对所述肿瘤抗原结合多肽的来源没有特殊限定，采用公司合成的多肽产品即可。在本发明中，肿瘤抗原结合多肽和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡的混合质量比优选为(0.8～1.1):(0.95～1.05)，更优选为1:1。混合后，本发明优选在4℃下摇动孵育6h，以促进多肽与EV-T的结合，具体通过CP05锚定肽插入EV-T膜完成表面修饰。在本发明中，所述超速离心的条件优选为110000～120000g，1.5h，4℃，去除游离的未结合多肽，取沉淀物即为RGD靶向修饰的EV-T，即RGD@EV-T。得到经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡后，本发明优选将其重悬并与姜黄素溶液(溶解在DMSO，10mM母液)混合，置于冰上进行超声处理以载入姜黄素，得到RGD@EV-T-CUR。本发明所述超声处理优选使用超声波细胞破碎仪，超声波细胞破碎仪的型号优选：Sonics VC505。在本发明中，所述超声处理的条件优选包括：超声10～60s，暂停10～60s，循环次数5～12次；温度15～30℃，超声功率设置为10～30％，更优选为优选包括：超声35s，暂停35s，循环次数6次；温度25℃，超声功率设置为25％。超声后，本发明优选进行孵育，恢复EV膜完整性，得到复合载送姜黄素和抗癌因子TRAIL的靶向修饰的纳米制剂RGD@EV-T-CUR。在本发明中，所述孵育的条件优选为30～40℃孵育0.5～2.5h，更优选37℃摇床孵育1h。
本发明经过基因工程修饰了EV源细胞，然后分离提纯了表达TRAIL的EV(EV-T)，通过RGD多肽修饰提高EV-T的肿瘤靶向性，以EV为纳米载体，复合载送姜黄素和TRAIL，充分发挥两者的协同效应，克服癌细胞的TRAIL耐受性，结果表明靶向修饰后的复合载药的EV-T(RGD@EV-T-CUR)具有特异的广谱的癌细胞杀死活性，在动物肿瘤模型中也有高效的治疗效应，并且有良好的安全性。
本发明利用肿瘤靶向多肽RGD修饰EV-T并载入姜黄素，制备靶向的复合载药纳米制剂RGD@EV-T-CUR，能够显著增加姜黄素和TRAIL向肿瘤趋向递送的富集效应，并具有联用药物的极为显著的协同增效效应；本发明可解决姜黄素水溶性低，缺乏靶向性和生物利用度低的问题；通过联用姜黄素致敏癌细胞，可克服普遍的癌细胞TRAIL抵抗性；本发明靶向复合载药纳米制剂通过静脉给药进入血液后，能够高度地趋向富集于肿瘤组织，并且诱导癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长，同时具备良好的治疗安全性。本发明靶向复合载药纳米制剂，可实现基于细胞外囊泡共载递送生物分子和化学药物对耐药性癌症的多靶点联合精准治疗，为癌症治疗提供潜在的更高效和更安全的创新靶向纳米药物。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
对表达TRAIL的细胞外囊泡(EV-T)进行RGD表面修饰。
按文献报道(Cytotherapy 2015,17(7):885-896；Journal of ExtracellularVesicles,2017,6(1),1265291)，使用表达TRAIL的慢病毒转染P3代的人脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)，建立TRAIL基因工程化修饰的细胞系MSCTRAIL。培养亲本MSC细胞及MSCTRAIL细胞，收集培养上清，根据文献报道，采用超速离心法分别分离纯化EV和EV-T。简言之，先以低速离心培养上清，去除细胞及细胞碎片，澄清上清；然后使用0.22μm滤膜过滤，除去大于220nm的EV，再用100kDa超滤柱离心(4℃，30min，3000g)浓缩含有EV的上清5～10倍，最后在4℃进行超速离心(1.5h，120000g)将EV和EV-T沉淀下来，然后以PBS溶液重悬EV和EV-T沉淀，定量其蛋白含量，分装、冻存于-80℃备用。
以透射电子显微镜观察所制备EV和EV-T的形态及粒径(图1)，检测到双层膜囊泡结构，粒径分布为60～120nm，为典型的细胞来源的外泌体纳米颗粒；使用一种TRAIL特异性的ELISA试剂盒测量了EV、EV-T和RGD@EV-T(制备方法见下文)所携带的TRAIL含量(图2)，可见EV-T和RGD@EV-T都显著表达TRAIL蛋白，其表达水平为98.5±2.1pg TRAIL/μg EVs，说明RGD修饰没有显著影响EV-T对TRAIL蛋白的携带水平，同时可以EV没有明显的TRAIL表达。
EV-Ts的表面RGD修饰通过锚定肽CP05与EV表面蛋白CD63的结合来实现。首先在市场上合成了RGD与CP05的融合肽RGD-CP05，序列为RGDCRHSQMTVTSRL(SEQ ID NO.1)，纯度≥95％。为了进行EV-T的表面修饰，将EV-Ts(10μg)与RGD-CP05肽(10μg)在4℃下摇动孵育6h，以促进多肽与EV-T的结合，所制备的RGD修饰纳米制剂命名为RGD@EV-T，通过超速离心(120000g，1.5h，4℃)去除未结合的多肽，纯化的RGD@EV-T沉淀最后重悬于PBS中，分装，储存于-80℃备用。
为检测RGD-CP05肽对EV-T的修饰，使用罗丹明B(RhoB)标记的RGD-CP05肽，即RGDRhoB-CP05与EV-T进行结合修饰，所制备的RGDRhoB@EV-T先进行DiR荧光标记，然后加到Caki-1肾癌细胞作EV的细胞摄入观察。结果见图3，图3显示了使用肾癌细胞Caki-1进行DiR荧光标记的EV-T和RGD@EV-T细胞摄入试验结果，以评估RGD靶向修饰增强EV-T肿瘤靶向性的效应。如图3中的a所示，RhoB和DiR标记共同定位于被细胞摄入的EV-T，表明RGD对EV-T的成功修饰。为验证RGD修饰对EV-T的肿瘤靶向性的增强效应，对PBS对照，EV-T和RGD@EV-T分别进行了DiR荧光标记，然后经过超速离心去除未标记的染料，再分别以Caki-1细胞摄入结合共聚焦显微镜观察，以及动物肿瘤模型/静脉输注/活体成像观察制剂的肿瘤靶向性。如图3中的b和图3中的c和d分别所示，RGD修饰显著增强了EV-T的肿瘤细胞靶向性和肿瘤组织靶向性。
进一步对所制备的EV、EV-T和RGD@EV-T进行蛋白免疫印迹(WB)实验，检测细胞外囊泡标志蛋白TSG101和TRAIL的表达。结果如图4所示，三种制剂都表达TSG101，具有明确的细胞外囊泡特征；来源于亲本MSC细胞的EV不表达TRAIL，但是EV-T和RGD@EV-T都表达TRAIL蛋白，表明RGD表面修饰不影响EV-T对抗癌蛋白TRAIL的携带。
实施例2
将姜黄素(CUR)载入实施例1制备得到的EV-T和RGD@EV-T。
将市场上购买的CUR(HY-N0005，MedChemExpress，上海)溶解于DMSO，制备浓度为10mM的母液。采用高效液相色谱(HPLC)法定量溶液中的CUR浓度，使用C18色谱柱，检测波长420nm。建立CUR标准曲线，测试系列浓度为0.0μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL和100μg/mL。
采用低频超声介导载入法，将CUR分别封装到EV-T和RGD@EV-T中，制备复合纳米药物EV-T-CUR和RGD@EV-T-CUR。具体步骤为：在1mL浓度为20μg/mL的EV-T或RGD@EV-T溶液(含有2.0ng/mLTRAIL)中加入2μl CUR溶液(10mM)，混匀，使用超声或共孵育处理将CUR载入。使用超声仪(Sonics VC505)载入药物的设置参数为：超声35s，暂停35s，功率25％，温度25℃，循环次数6次。在超声处理结束后放置样品在37℃的摇床，孵育1h，帮助EV-T恢复膜结构；最后对样品进行超速离心处理(120000g，1.5h，4℃)去除溶液中游离的未载入的CUR(取沉淀)，得到纯化的EV-T-CUR和RGD@EV-T-CUR沉淀，再悬浮溶解于PBS溶液中，按实施例1所述进行透射电镜观察，确证超声载入CUR后EV-T纳米囊泡的完整性没有被破坏。共孵育载入法：将CUR与EV-T/RGD@EV-T的混合溶液在4℃孵育1小时，然后同样超速离心纯化制备的EV-T-CUR和RGD@EV-T-CUR。为了测量药物载入率，将载药并纯化后的纳米制剂加入RIPA裂解液，裂解释放包入EV的CUR，再利用HPLC检测CUR含量，计算对应的CUR载入率。结果表明，CUR的检出峰时间为5.91min(图5中的a),其标准回归曲线为y＝0.1515x-1.034(R2＝0.9958)(图5中的b)，超声载药法对CUR的载药率为53.4±1.02％，显著优于混和载入法的载入率31.5％(图5中的c)。
实施例3
以CCK-8试验检测纳米制剂的体外抗癌活性。
为了测试EV-T、RGD@EV-T和RGD@EV单独使用或与CUR联合使用的抗癌活性，本发明选取了6个细胞系进行CCK-8试验，测试它们对细胞增殖和活性的影响。所用细胞系包括1个肾癌细胞系(Caki-1)，1个肺癌细胞系(A549)、1个乳腺癌细胞系(M231)，1个宫颈癌细胞系(Hela)和2个正常细胞系(人间充质干细胞MSC和人肾小管上皮细胞HK-2)。
结果如图6所示，EV-T和RGD@EV-T都对癌细胞有显著的生长抑制效应，其作用呈现剂量效应，与之形成对照的是，RGD@EV没有显著的抗癌活性，表明活性主要是EV携带的TRAIL赋予的，而不是来自EV本身或RGD修饰。如图7所示，与对照PBS(Ctrl))相比，CUR单独使用对肿瘤细胞有一定的生长抑制作用，当其与EV-T或RGD@EV-T(携带2ng/mL TRAIL)联用时，产生极强的协同效应，获得显著高于单药处理的抗癌活性；当与CUR联用时，RGD@EV-T显示出比EV-T更高的癌细胞生长抑制率，表明RGD修饰显著增强了EV-T的抗癌活性；值得注意的是，CUR和EV-T或RGD@EV-T的协同细胞毒性是对癌细胞特异性的，对正常细胞无影响，揭示了这一联合治疗的良好安全性。
实施例4
纳米制剂的特异性癌细胞凋亡诱导效应检测。
在确定CUR与EV-T协同抑制癌细胞增殖后，本发明接下来研究了CUR包封EV-T和RGD@EV-T(EV-T-CUR和RGD@EV-T-CUR，分别含有20μM CUR和2.0ng/mLTRAIL)对癌细胞增殖、细胞凋亡及细胞骨架的影响，所用检测方法为CCK-8试验，FITC-Annexin-V/PI染色结合流式细胞仪技术分析以及肌动蛋白纤维(F-actin)的FITC-鬼笔环肽标记。
结果如图8中的a和b所示，单独使用20μM CUR和2.0ng/mLEV-T携带的TRAIL对抑制Caki-1细胞增殖和诱导凋亡的作用十分有限，相比之下，EV-T-CUR和RGD@EV-T-CUR处理均产生了显著的协同增效效应，而且RGD@EV-T和RGD@EV-T-CUR的作用分别优于EV-T和EV-T-CUR。细胞骨架标记观察(图8中的c)进一步确证了无论是EV-T-CUR还是RGD@EV-T-CUR的处理，均诱导癌细胞显著的细胞骨架破坏，表明发生了明显的细胞凋亡，而后者的效果尤为显著。
实施例5
复合纳米制剂联合递送CUR和TRAIL对动物肿瘤模型的靶向杀伤效应观察。
从市场购入4～5周龄的BALB/c雌性裸鼠，在SPF级饲养环境下饲养至其体重达到20g左右；选取状态良好的小鼠用于皮下肿瘤模型造模。按照300万/只的细胞数量接种Caki-1细胞造模。Caki-1植入两周后，当肿瘤生长到～200mm3时，分别通过瘤内注射对照(PBS)、RGD@EV-T、CUR和RGD@EV-T-CUR开始治疗。选择极低剂量的CUR(1.0mg/kg，相对于小鼠的剂量)包封到RGD@EV-T中以制备复合的RGD@EV-T-CUR制剂，共进行三次瘤内注射治疗，注射间隔为48h。
RGD@EV-T-CUR的每次注射剂量为60μg/只(3.0mg/kg，含0.2μg/kg TRAIL和1.0mg/kg CUR)，RGD@EV-T为40μg/只(2.0mg/kg，含0.2μg/kg TRAIL)，CUR每次注射剂量为20μg(1.0mg/kg)。定期监测动物状况和测量肿瘤生长。结果如图9中的a-图9中的c所示，从肿瘤生长曲线，试验结束后肿瘤形态和重量三个观测指标来看，与对照相比，使用RGD@EV-T-CUR的联合治疗几乎完全抑制了肿瘤生长；而相比之下，无论是RGD@EV-T还是CUR，其单独治疗仅显示出有限的抑制作用。此外，采用组织细胞凋亡检测技术TUNEL对RGD@EV-T-CUR联合治疗的安全性作了评估。结果如图9中的d～图9中的e图所示，与对照小鼠相比，联合治疗在动物的心脏、肺、肝、肾脏和脾组织中均未显著诱导细胞凋亡，揭示了此治疗的良好安全性。
综上所述，先经过基因工程修饰间充质干细胞，使其分泌表达了抗癌因子TRAIL的细胞外囊泡EV-T；分离纯化此EV-T后，以肿瘤靶向多肽RGD修饰EV-T，再复合载入协同治疗药物CUR，实现了基于靶向修饰复合纳米制剂的共载递送CUR和TRAIL。与单独EV-T及CUR治疗相比，采用RGD修饰的EV-T载送CUR能极为显著地提高对肿瘤生长的抑制作用，高效地协同杀死多种癌细胞(乳腺癌、肺癌、宫颈癌和肾癌)，并且具有良好的癌症特异性和治疗安全性。可见，以靶向修饰的EV复合载送姜黄素和TRAIL，可实现基于EV纳米载体递送系统对多种癌症的联合靶向治疗，同时具备治疗的高效性和良好安全性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性劳动的前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种含姜黄素的治疗癌症的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物包括姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡，或所述纳米药物包括姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述肿瘤抗原结合多肽修饰包括RGD多肽修饰。
3.根据权利要求2所述的纳米药物，其特征在于，所述RGD多肽修饰使用RGD-CP05融合肽进行，所述RGD-CP05融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物中，姜黄素和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡简单混合；或将姜黄素载入表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内；或姜黄素和经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡简单混合；或将姜黄素载入经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内。
5.根据权利要求1、2或4所述的纳米药物，其特征在于，用于细胞外囊泡生产的细胞包括间充质干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞、诱导多能干细胞、肿瘤细胞、肿瘤干细胞、免疫细胞或成纤维细胞中的任一种。
6.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物中，细胞外囊泡的粒径分布为60～120nm。
7.经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡作为靶向递送抗癌药物的纳米递送平台，在制备抗肿瘤纳米药物中的应用；所述抗癌药物包括姜黄素。
8.权利要求1～6任一项所述纳米药物的制备方法，其特征在于，当将姜黄素载入表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内时，所述纳米药物的制备方法包括以下步骤：
将表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡与姜黄素混合，置于冰上进行超声处理，得到EV-T-CUR；
当将姜黄素载入经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡内，所述纳米药物的制备方法包括以下步骤：
将经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡与姜黄素混合，置于冰上进行超声处理，得到RGD@EV-T-CUR。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，经肿瘤抗原结合多肽修饰的表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡的制备方法包括以下步骤：
合成肿瘤抗原结合多肽，将肿瘤抗原结合多肽和表达抗癌蛋白TRAIL的细胞外囊泡混和，孵育，超速离心，取沉淀，得到RGD@EV-T。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的条件包括：超声10～60s，暂停10～60s，循环次数5～12次；温度15～30℃，超声功率设置为10～30％。
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