CN111135312B - 一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂的制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于肿瘤泛代谢调控的促肿瘤血管正常化治疗混合纳米制剂及其应用。该混合纳米制剂是以基于静电作用与氢键作用的纳米自组装技术，将具有VEGF抑制活性的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子，或靶向血管内皮细胞的活性物质，与非病毒类基因载体与代谢调控相关基因药物组装构建性质稳定的分别靶向肿瘤细胞与肿瘤血管内皮细胞的纳米药物。所形成的两种三元组装纳米药物仅通过物理混合形成的混合纳米制剂以节拍给药的方式给药后，可获得显著的肿瘤细胞与肿瘤血管内皮细胞代谢调控作用、促肿瘤血管正常化治疗作用以及肿瘤增殖抑制的多重疗效，三者协同作用，相辅相成，相互增效。

Description

一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂的制备与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂的制备与应用。
背景技术
癌症是当今导致人类死亡的主要疾病之一，其中肿瘤血管在肿瘤的发生发展和转移中扮演了关键的促进角色。而临床最常用的抗肿瘤治疗手段如化疗和放疗等对肿瘤血管的调控强度薄弱，从而给临床抗肿瘤治疗带来巨大的困境。肿瘤微环境中促血管生成信号和抗血管生成信号失衡可导致实体肿瘤血管系统的结构和功能异常(Zhigang Liu,YifanWang,Yuhui Huang,Betty Y.S.Kim,Hong Shan,Depei Wu,Wen Jiang,TumorVasculatures:A New Target for Cancer Immunotherapy,Trends in PharmacologicalSciences,Volume 40,Issue 9,2019,Pages613-623.)，主要表现为内皮细胞排列紊乱，周细胞覆盖率低，基底膜缺失。肿瘤血管的结构和功能异常将进一步导致肿瘤灌注压增高，血流灌注和药物输送减少。此外，亦可致使肿瘤组织供氧困难并造成肿瘤局部的低氧和酸性环境，进而诱导产生免疫抑制性肿瘤微环境，以及部分循环肿瘤细胞通过渗漏的血管发生逃逸和转移而产生一系列的不利影响。促肿瘤血管正常化疗法可针对性修复肿瘤血管异常结构从而产生促进抗肿瘤药物的肿瘤递送、降低肿瘤内高间质压、增强肿瘤组织氧浸润以缓解乏氧带来的免疫抑制等广泛的有益治疗作用。综上，肿瘤血管正常化是对传统肿瘤抗血管治疗的全新阐述，可有效改善血管异常造成的化疗耐药和局部乏氧诱导的放化疗耐受，从而提高综合治疗效果。
目前促肿瘤正常化治疗的手段主要包括应用基于传统的抗血管生成疗法提出的合理使用抗血管生成药物和节拍化疗。临床常用的抗血管生成药物如VEGF抑制剂贝伐单抗、雷珠单抗和雷莫芦单抗等均可产生短时的促肿瘤血管正常化治疗作用。而节拍化疗是指采用持续、短间隙或无间隙、低剂量的化疗模式的给药方式，可将肿瘤血管结构与功能在短期内修复到“正常化”水平(Munoz R,Shaked Y,Bertolini F,et al.Anti-angiogenictreatment of breast cancer using metronomic low-dose chemotherapy[J].Breast,2005,14(6):466-479.)。
然而，研究显示肿瘤细胞本身以及肿瘤内皮细胞的异常代谢行为可通过促进血管新生以削弱甚至抵抗抗血管生成药物及节拍化疗的促肿瘤血管正常化治疗效果(Porporato P E,Valéry L.Payen,Christophe J.De Saedeleer.Lactate stimulatesangiogenesis and accelerates the healing of superficial and ischemic woundsin mice[J].Angiogenesis,2012,15(4):581-592.)。主要机制表现为：①肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞双重高度糖酵解造成肿瘤微环境中乳酸堆积，作为糖酵解的副产物，乳酸进而会诱导肿瘤细胞和肿瘤内皮细胞血管内皮生成因子(VEGF)的表达，随后乳酸可以被内皮细胞摄取，使之产生的VEGF和成纤维细胞生长因子EGF进一步上调，促进血管新生，抵抗抗血管生成药物及节拍化疗的促血管正常化作用；②异常代谢刺激缺氧诱导因子HIF-1α的产生，在缺氧时，HIF-1α结合VEGF 5’端的低氧反应活化其启动子，上调VEGF的表达，产生抵抗促血管正常化的不利影响。
肿瘤代谢的一个显著特征是葡萄糖摄取利用率及乳酸产出率的提高。肿瘤细胞为了满足自身能量与生物合成需求，主要通过增加糖酵解速率快速高效地产生能量(Warburg效应)(Tekade R K,Sun X.The Warburg effect and glucose-derived cancertheranostics[J].Drug Discovery Today,2017:S1359644617304166.)。除了肿瘤细胞，最近有研究指出血管出芽活动也与内皮细胞的能量代谢变化相关，一旦启动血管生成，血管内皮细胞即呈过度糖酵解状态。这说明肿瘤血管除了在肿瘤细胞的代谢活动中充当物质运输的媒介，血管内皮细胞活跃的能量代谢状态也显示出对病理性血管生成的促进作用，而应用糖酵解抑制剂可有效抑制血管内皮细胞的活性及其血管生成行为(Cantelmo A,Conradi L C,Brajic A,et al.Inhibition of the Glycolytic Activator PFKFB3 inEndothelium Induces Tumor Vessel Normalization,Impairs Metastasis,andImproves Chemotherapy[J].Cancer Cell,2016:S1535610816304937.)。综上，由于肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞同时存在的高度糖酵解代谢特征，可共同促使肿瘤微环境酸性程度加剧，使得肿瘤血管系统结构和功能异常情况进一步恶化。因此，为增强促肿瘤正常化治疗的效果，同时对肿瘤细胞和肿瘤内皮细胞进行靶向代谢干预，是十分必要的手段。
基因药物已经显示出针对细胞代谢调控的出色效果。然而，由于基因本身容易遭受体液及细胞环境中各种核酸酶的降解，并且难以克服细胞外和细胞内屏障，因此，亟需安全有效的载体将治疗基因运输和递送到靶细胞中发挥治疗作用。常用的基因载体包括病毒载体与非病毒载体。病毒载体通常表现出较高的转染效率，但是其制备复杂、靶向特异性差、基因携带能力差和难以克服免疫原性引起的安全性问题等极大地阻碍了它们在临床上的应用；相反的是，由于非病毒载体的结构可控且多样性，以及更高的安全性近年来受到更多关注。其中，非病毒载体-阳离子聚合物转染效率通常较高，并且由于其结构的可控性、多价官能化的表面氨基以及其优异的压缩核酸的能力已得到广泛研究；此外，由于阳离子脂质体具有制备简单、可重复转染和易降解的特点也被认为具有潜在的应用前景。但是，这类阳离子非病毒载体由于其表面正电荷引起的毒副作用风险高，因此其使用也受到限制。
综上，促肿瘤血管正常化治疗是本发明亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是制备一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂，该混合纳米制剂应用于促肿瘤血管正常化治疗的增强。
本发明的另一个目的是为肿瘤治疗领域提供一种针对整体微环境的泛代谢调控的方案，本发明提供了上述混合纳米制剂的制备方法与用途。
本发明的最后一个目的是为基因治疗方案提供一种更安全且稳定保护基因药物不被降解、同时具有高转染效率的载体，改善应用于肿瘤治疗的基因递送过程中存在的技术瓶颈。具体发明目的如下：
目的1：获得一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂及其制备方法。
目的2：提供上述混合纳米制剂在促血管正常化、肿瘤代谢调控、抗肿瘤药物中的应用。
目的3：拓宽抗血管生成药物血管正常化时间窗。
目的4：实现上述混合纳米制剂在肿瘤中的双重靶向分区递送，通过对肿瘤进行泛代谢调控对其他抗肿瘤治疗药物的肿瘤递送与抗肿瘤治疗学效果产生显著促进，克服目前仅针对肿瘤微环境的中某个特定环节进行代谢调控容易出现代偿变化而产生治疗局限性的困境。
目的5：提供高效低毒且性质结构稳定的混合纳米制剂用作基因药物的靶向递送。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂，该混合纳米制剂由两种自组装三元复合纳米体系直接物理混合而成；其中一种三元复合纳米体系由具有VEGF抑制活性的大分子与阳离子非病毒类基因载体、代谢调控相关基因药物自组装形成；另外一种三元复合纳米体系由具有内皮细胞靶向功能活性物质与阳离子非病毒类基因载体、代谢调控相关基因药物自组装形成。
作为一种优选技术方案，所述的具有VEGF抑制活性的大分子为具有VEGF抑制活性的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子；进一步优选的，所述的具有VEGF抑制活性的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子为低分子量肝素-全反式维甲酸(LMWH-ATRA)、低分子量肝素-牛磺胆酸酯(LHT7-ApoPep-1)、低分子量肝素-牛磺胆酸(LHTD4)、低分子量肝素-苏拉明(LHsura)、低分子量肝素-白杨素(LC)、低分子量肝素-槲皮素(PLQ)、低分子量肝素-熊果酸(sLHU)、RGD-低分子量肝素-藤黄酸(cRHG)、低分子量肝素-透明质酸(LH)、低分子量肝素-姜黄素(LCU)、低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、贝伐单抗、雷珠单抗和雷莫芦单抗中的至少一种。
作为一种优选技术方案，所述的非病毒类基因载体为阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)、聚氨基胺(PAAs)、聚氨基酯(PAEs)、壳聚糖、葡聚糖、阳离子脂质体(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DORI)、1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷(DODMA)、Liposome 2000和Liposome 3000中的至少一种。进一步优选的，支化和线性的聚乙烯亚胺分子量在0.8～25kDa之间。
作为一种优选技术方案，所述具有内皮细胞靶向功能活性物质为聚苯乙烯磺酸钠(PSS)、Arg-Gly-Asp三肽(RGD)、cyclo-[Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys]环五肽RGD(Tyr-RGD)、Cys-Ala-Gly三肽(CAG)和Arg-Glu-Asp-Val多肽(REDV)中的至少一种。
作为一种优选技术方案，所述的代谢调控相关基因药物为具有抑制糖酵解代谢作用的DNA、miRNA、IncRNA、siRNA中至少一种，以及过表达或沉默上述DNA或非编码RNA的质粒。
进一步优选的：其中一种三元复合纳米体系中具有VEGF抑制活性的大分子、阳离子非病毒类基因载体和代谢调控相关基因药物的质量比为5～200：2～20：1(优选为5～100：2～20：1)；另外一种三元复合纳米体系中具有内皮细胞靶向功能活性物质、阳离子非病毒类基因载体和代谢调控相关基因药物三者的质量比为1～200：2～20：1(优选为1～100：2～20：1；进一步优选为1～20：2～20：1)；两种三元复合纳米体系的混合摩尔比(按两种三元复合纳米体系中基因药物的摩尔量计)为1～10：10～1。
进一步优选的：两种所述的三元复合纳米体系的药物粒径为20nm～1000nm。
上述混合纳米制剂的制备方法为首先将阳离子非病毒类基因载体、带负电的代谢调控相关基因药物、具有VEGF抑制活性的大分子，或具有内皮细胞靶向功能活性物质在溶液环境中自组装形成两种不同靶向治疗功能的三元复合纳米药物，进而将两种三元复合纳米药物直接混合成为混合纳米制剂。
优选的，体系中阳离子非病毒类基因载体首先与带负电的代谢调控相关基因药物通过静电作用形成二元复合纳米体系预组装单元，进而与具有VEGF抑制活性的大分子，或具有内皮细胞靶向功能活性物质通过静电作用和氢键作用力各自形成两种三元复合纳米药物，经过直接混合后形成混合纳米制剂。
进一步优选的，该方法具体包括以下步骤：
(1)将阳离子非病毒类基因载体溶于超纯水、注射用水、葡萄糖注射液或氯化钠注射液溶液中，再滴入一定浓度的带负电的代谢调控相关基因药物，搅拌后静置形成二元复合纳米体系预组装单元；
(2)将具有VEGF抑制活性的大分子溶于超纯水、注射用水、葡萄糖注射液或氯化钠注射液溶液中，滴加此溶液至步骤(1)制备的二元复合纳米体系预组装单元中，搅拌后静置得到混合纳米制剂中的其中一种三元复合纳米体系；
(3)将具有内皮细胞靶向功能活性物质溶于超纯水、注射用水、葡萄糖注射液或氯化钠注射液溶液中，滴加此溶液至步骤(1)制备的二元复合纳米体系预组装单元中，搅拌后静置得到混合纳米制剂中的另外一种三元复合纳米体系；
(4)将步骤(2)和(3)制备的两种三元复合纳米体系按比例直接混合得到混合纳米制剂。
上述各步骤中搅拌和静置的条件可以为：用磁力搅拌器搅拌10～300s，之后室温静置20～120min，但不限于此。
上述的混合纳米制剂在制备抗血管生成、肿瘤代谢调控、抗肿瘤治疗药物中的应用。
导入外源基因用于恶性肿瘤，通过取代变异基因，填充丢失区域，沉默或过表达非正常的基因表达水平或者是引入新的功能等方式都具有从根源上治疗的重要意义。在正常生理条件下，基因药物是带负电荷的柔性大分子，在体内复杂的环境中十分容易被降解或者清除，同时在没有外力或载体协助的情况下不容易被细胞摄取。此外，在肿瘤微环境中，由于肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞同时存在的高度糖酵解代谢特征，肿瘤微环境酸性和缺氧程度加剧，肿瘤血管结构和功能异常情况进一步恶化。
本发明所述混合纳米药物能被稳定地递送至靶细胞调控其异常代谢过程并增强血管正常化治疗的原理在于：本发明利用阳离子非病毒载体通过静电作用压缩负电性的基因药物分子，形成具有一定粒径大小致密的预组装二元纳米粒，再在二元预组装单元表面包覆负电性的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子和靶向内皮细胞的靶头，是一种具有高选择性的靶向双单元混合纳米药物。纳米粒被细胞摄取后，通过内吞作用转运至内涵体中，从内涵体逃逸后将基因药物递送至细胞质或细胞核中实现转染。肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子包覆的三元复合纳米药物通过渗漏的肿瘤血管(EPR效应)在肿瘤组织周围富集，发挥抗VEGF及节拍化疗共同介导的血管正常化作用，并将携带的基因转染至肿瘤细胞下调其代谢过程，协助修复由于肿瘤细胞高度糖酵解的微环境。同时，另一种三元复合纳米药物依靠对内皮细胞的亲和力主动靶向至内皮细胞，下调在肿瘤微环境中被激活的内皮细胞高度糖酵解过程。本发明所设计的混合纳米药物可通过以下机制发挥高效低毒的基因药物靶向递送效果：①阳离子聚合物对细胞产生的毒性主要来源于表面阳离子，本发明所设计的混合纳米药物所基于的两种三元复合纳米药物通过静电作用在阳离子聚合物表面包被负电性聚合物，起到了屏蔽和中和正电荷的作用，从而降低正电荷引起的毒副作用；②混合纳米药物所基于的两种三元复合纳米药物是由具有抗VEGF作用的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子或具有内皮细胞靶向功能活性物质通过静电作用和氢键作用力与阳离子聚合物、基因药物组装而成，结构及性质极稳定，在血清存在下也能维持稳定组装，避免基因药物在血液环境中提前释放并被血清中蛋白吸附；③将各活性组分选择性靶向到肿瘤细胞与肿瘤内皮细胞，提高靶向分布，降低其非选择性全身分布，从而降低系统毒性。
应用表面包被阴离子活性物质以屏蔽部分正电荷，将阳离子非病毒载体组装制备用于基因药物递送的纳米药物，是本发明针对性解决基因递送中存在的基因转染效率和载体安全性之间矛盾点的有效手段。
为了实现对肿瘤细胞与肿瘤内皮细胞的靶向代谢干预以促进肿瘤血管正常化治疗，本专利设计发明了两种用于靶向糖酵解代谢调控基因输送的纳米药物。其一，是由具有促血管正常化治疗作用的肝素衍生物或活性生物大分子、非病毒类基因载体和糖酵解代谢调控基因药物组装的复合纳米药物，用于肿瘤细胞靶向代谢调控与促血管正常化治疗；其二，是由具有内皮细胞高亲和力的靶向配体、非病毒类基因载体和糖酵解代谢调控基因药物组装的复合纳米药物，用于肿瘤内皮细胞靶向代谢调控与促血管正常化治疗。
本发明创新性地提出纳米混合制剂的精准分区递送策略，设计制备并利用具有精准肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞靶向代谢干预功能的混合纳米制剂，抑制肿瘤细胞与肿瘤内皮细胞高强度糖酵解代谢所介导的对促肿瘤血管正常化治疗的抗性。通过对肿瘤代谢微环境的广泛重塑以增强传统VEGF抑制剂及节拍化疗所介导的促肿瘤血管正常化治疗效果，以延长肿瘤血管正常化时间窗。目前基于利用VEGF抑制剂贝伐单抗介导的促血管正常化治疗(Zhang L,Takara K,Yamakawa D,et al.Apelin as a marker for monitoring thetumor vessel normalization window during antiangiogenic therapy[J].CancerScience,2016,107(1):36-44.)效果有限，其肿瘤血管正常化时间窗仅可维持3天；另外有研究表明，利用抗肿瘤药物节拍给药诱导血管正常化，仅能获得5天正常化时间窗(IshidaT,Shiraga E,Kiwada H.Synergistic antitumor activity of metronomic dosing ofcyclophosphamide in combination with doxorubicin-containing PEGylatedliposomes in a murine solid tumor model[J].Journal of Controlled Release,2009,134(3):194-200.)，而本发明所制备的混合纳米制剂可有效延长肿瘤血管正常化时间窗至10天左右。此外，仅利用针对肿瘤细胞或内皮细胞进行局部代谢调控治疗介导的促肿瘤血管正常化的疗法(Cantelmo A,Conradi L C,Brajic A,et al.Inhibition of theGlycolytic Activator PFKFB3 in Endothelium Induces Tumor VesselNormalization,Impairs Metastasis,and Improves Chemotherapy[J].Cancer Cell,2016:S1535610816304937.)血管正常化治疗后，周细胞覆盖率仅达20％左右，而本发明所制备的混合纳米制剂治疗后可提高周细胞覆盖率至40％～60％。可见，本发明在基于肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞代谢的全面调控的基础上，巧妙地联合了经典的基于VEGF抑制剂及节拍化疗介导的促肿瘤血管正常化治疗，实现了与单纯代谢干预相比和传统经典促血管正常化治疗相比更强效和长效的促肿瘤血管正常化治疗效果，突破了该领域先前的治疗局限。
该治疗体系还具有以下突出优势：
将上述两种异靶纳米复合药物混合给药，以实现对不同靶点进行不同机制的精确干预调控，该混合纳米制剂的突出优势在于：
(1)精准分区递送实现对肿瘤细胞与肿瘤内皮细胞的针对性干预。通过具有内皮细胞高亲和力的靶向配体精准靶向肿瘤血管内皮细胞以及纳米粒子尺寸效应与EPR效应介导的肿瘤细胞靶向递送，分别实现针对肿瘤血管内皮细胞的特异性代谢干预与促血管正常化治疗和针对肿瘤细胞的抗血管生成、节拍化疗和代谢稳态重塑联合调控。
(2)全面的肿瘤代谢微环境重塑增强抗血管生成和节拍化疗介导的肿瘤血管正常化。在抗VEGF治疗和节拍化疗诱导肿瘤血管正常化的基础上，通过对肿瘤代谢微环境稳态的重塑，抑制肿瘤细胞本身以及肿瘤内皮细胞的异常代谢行为对促肿瘤血管正常化治疗效果的抵抗，协同增强促血管正常化治疗效果。
(3)混合纳米制剂复合比例可调性，可通过制定灵活的治疗方案实现精准高效的治疗管理。肿瘤疾病具有复杂的病理学变化特征，因此，在肿瘤血管正常化治疗的不同阶段，抗VEGF、节拍化疗、代谢调控所产生的治疗效果也必会不同。本发明设计的混合纳米药物，可通过灵活调整复合比例，便捷地实现基于不同干预机制治疗方案的灵活调整，为制定最佳联合治疗方案提供了实际操作性较强的解决途径。
本发明的有益效果：
(1)所形成的两种三元组装纳米药物性质稳定地分别靶向肿瘤细胞与肿瘤血管内皮细胞，仅通过物理混合形成的混合纳米制剂以节拍给药的方式给药治疗后，可获得显著的肿瘤细胞与血管内皮细胞代谢调控作用、促肿瘤血管正常化治疗作用以及肿瘤增殖抑制的多重疗效。这种在肿瘤组织中的多靶点泛代谢调控治疗能便携高效地实现促血管正常化、肿瘤细胞与肿瘤内皮同步代谢调控多位一体联合治疗，治疗功能性高度协同。克服目前仅针对肿瘤微环境的中某个特定环节进行代谢调控容易出现代谢代偿变化的局限。
(2)全面的肿瘤代谢微环境重塑能协同增强抗血管生成和节拍化疗介导的肿瘤血管正常化。
(3)混合纳米制剂复合比例可调性，可通过制定灵活的治疗方案实现精准高效的治疗管理。
(4)本发明构建的混合纳米制剂能拓宽抗血管生成药物血管正常化时间窗。
(5)本发明构建的混合纳米制剂制备方法简单，制备条件温和，避免复杂制备方法造成的质量均一性差等问题，重现性好，产业转化技术简单。
(6)本发明构建的混合纳米制剂相对于传统的阳离子非病毒载体更安全、细胞毒性更小。首先混合纳米药物表面包覆的具有VEGF抑制活性的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子或靶向血管内皮细胞的活性物质屏蔽和中和了带来细胞毒性的表面正电荷。降低了纳米粒的毒副作用，具有更高的安全性；其次本发明所述的混合纳米药物可选择性地被肿瘤细胞和肿瘤内皮细胞摄取，同时具有被动靶向和主动靶向效应，这种更倾向于靶细胞的分布降低了在其他正常器官的分布情况，改善了系统毒性，最大程度地增加富集于靶细胞的药物分布，达到减毒增效的目的。
(7)本发明构建的混合纳米药物相对于传统的阳离子聚合物基因载体更加能保持在体液中的稳定性。阳离子聚合物与核酸形成的二元预组装单元通常容易发生相互聚集而沉淀，而表面负电性的包覆与正电性的二元预组装单元的静电作用与氢键作用进一步提高了纳米药物的稳定性和在血液循环中的稳定性，避免了纳米粒在复杂的血液环境中解体，保持核酸的完整性。提供了一种优越的选择性靶向双单元混合纳米药物。
(8)本发明构建的混合纳米药物相对于传统的阳离子聚合物基因载体具有转染效率高的特点。血清中含有大量的负电性蛋白，这些蛋白能和正电性的载体发生相互作用而载体的聚沉，进而影响了随后的细胞摄取、基因转染与表达。本发明所述的混合纳米药物负电性的表面修饰对这种现象有极大的缓解，混合纳米药物在血清存在下也能保持结构与功能的稳定性，很大程度上保证了基因的转染效率，缓解了由于载体表面正电性减少带来的不利影响如细胞对纳米粒的摄取减少。负电荷聚合物与二元预组装单元纳米粒的静电作用和氢键作用，使三元纳米药物分子内压缩更紧密，粒径进一步缩小，纳米粒更多地富集在靶细胞和更多地被细胞摄取，从而转染效率更高。
附图说明
图1.低分子量肝素-全反式维甲酸/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)-PSS/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)混合纳米药物对肿瘤细胞HepG2和肿瘤血管内皮细胞HUVEC选择性摄取。
图2.低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物/Liposome 2000/miR-143-RGD/Liposome 2000/miR-143混合纳米药物促肿瘤血管结构正常化评价。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/PEI(10kDa)/miR-206(代谢调控基因)与PSS/PEI(10kDa)/miR-206混合纳米制剂的制备
按照质量比为20：5：1取低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、PEI(10kDa)、miR-206，将低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、PEI(10kDa)分别溶于超纯水。将PEI水溶液与miR-206混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物水溶液，搅拌30s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为5：3：1取PSS、PEI(10kDa)、miR-206，将PSS、PEI(10kDa)分别溶于超纯水。将PEI水溶液与miR206混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌30s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比2:1(按两种三元复合纳米体系中基因药物的摩尔量计，实施例2～15也以此为标准计量)直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例2：低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-206与PSS/壳聚糖/miR-206混合纳米制剂的制备
按照质量比为100：5：1取低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、壳聚糖、miR-206，将低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、壳聚糖分别溶于氯化钠注射液。将壳聚糖溶液与miR-206混合搅拌10s后静置40min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物溶液，搅拌30s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为10：5：1取PSS、壳聚糖、miR-206，将PSS、壳聚糖分别溶于氯化钠注射液。将壳聚糖溶液与miR206混合搅拌10s后静置40min，再在搅拌条件下注入PSS溶液，搅拌30s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比3:1直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例3：低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-9(代谢调控基因)与PSS/壳聚糖/miR-9混合纳米药物体系的制备
按照质量比为100：8：1取低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、壳聚糖、miR-9，将低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、壳聚糖分别溶于超纯水。将壳聚糖水溶液与miR-9混合搅拌30s后静置60min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物水溶液，搅拌30s后静置60min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为20：6：1取PSS、壳聚糖、miR-9，将PSS、壳聚糖分别溶于超纯水。将壳聚糖水溶液与miR-9混合搅拌30s后静置60min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌30s后静置60min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:1直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例4：低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/DOTAP/miR-143(代谢调控基因沉默质粒)与PSS/DOTAP/miR-143(基因沉默质粒)混合纳米药物体系的制备
按照质量比为50：7：1取低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、DOTAP、miR-143质粒，将低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、DOTAP分别溶于超纯水。将DOTAP水溶液与miR-143质粒混合搅拌20s后静置45min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物水溶液，搅拌20s后静置45min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为10：5：1取PSS、DOTAP、miR-143质粒，将PSS、DOTAP分别溶于超纯水。将DOTAP水溶液与miR-143质粒混合搅拌20s后静置45min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌20s后静置45min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:2直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例5：低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/DODMA/miR-16(代谢调控基因沉默质粒)与PSS/DODMA/miR-16(基因沉默质粒)混合纳米药物体系的制备
按照质量比为35：10：1取低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、DODMA、miR-16质粒，将低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物、DODMA分别溶于葡萄糖注射液。将DODMA溶液与miR-16质粒混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物溶液，搅拌30s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为8：8：1取PSS、DODMA、miR-16质粒，将PSS、DODMA分别溶于葡萄糖注射液。将DODMA溶液与miR-16质粒混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入PSS溶液，搅拌30s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比3:2直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例6：低分子量肝素-全反式维甲酸/PEI(25kDa)/miR-26a(代谢调控基因过表达质粒)与PSS/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)混合纳米药物体系的制备
按照质量比为20：4：1取低分子量肝素-全反式维甲酸、PEI(25kDa)、miR-26a质粒，将低分子量肝素-全反式维甲酸、PEI(25kDa)分别溶于超纯水。将PEI水溶液与miR-26a质粒混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-全反式维甲酸水溶液，搅拌30s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为15：6：1取PSS、PEI(25kDa)、miR-26a质粒，将PSS、PEI(25kDa)分别溶于超纯水。将PEI水溶液与miR-26a质粒混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌30s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比5:2直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例7：低分子量肝素-全反式维甲酸/PAEs/miR-26a(基因过表达质粒)与PSS/PAEs/miR-26a(基因过表达质粒)混合纳米药物体系的制备
按照质量比为20：4：1取低分子量肝素-全反式维甲酸、PAEs、miR-26a质粒，将低分子量肝素-全反式维甲酸、PAEs分别溶于注射用水。将PAEs水溶液与miR-26a质粒混合搅拌30s后静置45min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-全反式维甲酸水溶液，搅拌30s后静置45min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为15：6：1取PSS、PAEs、miR-26a质粒，将PSS、PAEs分别溶于注射用水。将PAEs水溶液与miR-26a质粒混合搅拌30s后静置45min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌30s后静置45min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比5:2直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例8：低分子量肝素-牛磺胆酸酯/PEI(5kDa)/let-7(代谢调控基因)与PSS/PEI(5kDa)/let-7混合纳米药物体系的制备
按照质量比为5：8：1取低分子量肝素-牛磺胆酸酯、PEI(5kDa)、let-7，将低分子量肝素-牛磺胆酸酯、PEI(5kDa)分别溶于超纯水。将PEI水溶液与let-7混合搅拌60s后静置40min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-牛磺胆酸酯水溶液，搅拌60s后静置40min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为10：12：1取PSS、PEI(5kDa)、let-7，将PSS、PEI(5kDa)分别溶于超纯水。将PEI水溶液与let-7混合搅拌60s后静置40min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌60s后静置40min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比3:1直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例9：低分子量肝素-牛磺胆酸酯/PAAs/miR-210(代谢调控基因沉默质粒)与PSS/PAAs/miR-210(基因沉默质粒)混合纳米药物体系的制备
按照质量比为10：7：1取低分子量肝素-牛磺胆酸酯、PAAs、miR-210质粒，将低分子量肝素-牛磺胆酸酯、PAAs分别溶于注射用水。将PAAs水溶液与miR-210质粒混合搅拌10s后静置20min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-牛磺胆酸酯水溶液，搅拌10s后静置20min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为18：4：1取PSS、PAAs、miR-210质粒，将PSS、PAAs分别溶于注射用水。将PAAs水溶液与miR-210质粒混合搅拌10s后静置20min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌10s后静置20min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:3直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例10：低分子量肝素-牛磺胆酸酯/Liposome 2000/Linc 00092(代谢调控LincRNA)与PSS/Liposome 2000/Linc 00092混合纳米药物体系的制备
按照质量比为20：8：1取低分子量肝素-牛磺胆酸酯、Liposome 2000、Linc 00092，将低分子量肝素-牛磺胆酸酯、Liposome 2000分别溶于葡萄糖注射液。将Liposome 2000溶液与Linc 00092混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-牛磺胆酸酯溶液，搅拌30s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为18：4：1取PSS、Liposome 2000、Linc 00092，将PSS、Liposome 2000分别溶于葡萄糖注射液。将Liposome2000溶液与Linc 00092混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入PSS溶液，搅拌30s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:1直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例11：低分子量肝素-牛磺胆酸/Liposome 3000/Linc UCA1(代谢调控LincRNA过表达质粒)与PSS/Liposome 3000/Linc UCA1(过表达质粒)混合纳米药物体系的制备
按照质量比为80：4：1取低分子量肝素-牛磺胆酸、Liposome 3000、Linc UCA1质粒，将低分子量肝素-牛磺胆酸、Liposome 3000分别溶于超纯水。将Liposome 3000水溶液与Linc UCA1质粒混合搅拌20s后静置15min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-牛磺胆酸水溶液，搅拌20s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为16：4：1取PSS、Liposome 3000、Linc UCA1质粒，将PSS、Liposome 3000分别溶于超纯水。将Liposome 3000水溶液与Linc UCA1质粒混合搅拌20s后静置15min，再在搅拌条件下注入PSS水溶液，搅拌20s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:3直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例12：低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物/Liposome 2000/miR-143与RGD/Liposome 2000/miR-143混合纳米药物体系的制备
按照质量比为50：7：1取低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物、Liposome 2000、miR-143，将低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物、Liposome 2000分别溶于超纯水。将Liposome 2000水溶液与miR-143混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物水溶液，搅拌30s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为10：5：1取RGD、Liposome 2000、miR-143，将RGD、Liposome 2000分别溶于超纯水。将Liposome 2000水溶液与miR-143混合搅拌30s后静置30min，再在搅拌条件下注入RGD水溶液，搅拌30s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:4直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例13：低分子量肝素-牛磺胆酸/Liposome 2000/Linc NBR2(代谢调控LincRNA)与Tyr-RGD/Liposome 2000/Linc NBR2混合纳米药物体系的制备
按照质量比为75：15：1取低分子量肝素-牛磺胆酸、Liposome 2000、Linc NBR2，将低分子量肝素-牛磺胆酸、Liposome 2000分别溶于超纯水。将Liposome 2000水溶液与LincNBR2混合搅拌60s后静置45min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-牛磺胆酸水溶液，搅拌30s后静置30min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为4：2：1取Tyr-RGD、Liposome2000、Linc NBR2，将Tyr-RGD、Liposome 2000分别溶于超纯水。将Liposome 2000水溶液与Linc NBR2混合搅拌60s后静置45min，再在搅拌条件下注入Tyr-RGD水溶液，搅拌30s后静置30min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:2直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例14：低分子量肝素-苏拉明/DOTMA/Linc NBR2与CAG/DOTMA/Linc NBR2混合纳米药物体系的制备
按照质量比为25：18：1取低分子量肝素-苏拉明、DOTMA、Linc NBR2，将低分子量肝素-苏拉明、DOTMA分别溶于超纯水。将DOTMA水溶液与Linc NBR2混合搅拌10s后静置30min，再在搅拌条件下注入低分子量肝素-苏拉明水溶液，搅拌30s后静置45min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为7：5：1取CAG、DOTMA、Linc NBR2，将CAG、DOTMA分别溶于超纯水。将DOTMA水溶液与Linc NBR2混合搅拌10s后静置30min，再在搅拌条件下注入CAG水溶液，搅拌30s后静置45min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比3:1直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例15：低分子量肝素-苏拉明/DORI/Linc HULC(代谢调控LincRNA基因沉默质粒)与REDV/DORI/Linc HULC(基因沉默质粒)混合纳米药物体系的制备
按照质量比为80：20：1取低分子量肝素-苏拉明、DORI、Linc HULC质粒，将低分子量肝素-苏拉明、DORI分别溶于超纯水。将DORI水溶液与Linc HULC质粒混合搅拌30s后静置45min，再在搅拌条件下注入低低分子量肝素-苏拉明水溶液，搅拌60s后静置60min，得到一种三元复合纳米药物。按照质量比为15：8：1取REDV、DORI、Linc HULC质粒，将REDV、DORI分别溶于超纯水。将DORI水溶液与Linc HULC质粒混合搅拌30s后静置45min，再在搅拌条件下注入REDV水溶液，搅拌60s后静置60min，得到另一种三元复合纳米药物。将两种三元纳米复合体系按摩尔比1:1直接混合，得到一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂。
实施例16：肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的粒径测定
取实施例1-15制备得到的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物分别用双蒸水稀释到2mL，用粒径测定仪(Malvem Instruments，Malvern，UK)分别对粒径以及在50％血清存在条件下24h后体系粒径进行测定，结果见表1。由表可知，制备得到的三元复合纳米药物，纳米体系粒径均达到纳米级，且粒径分布均匀。
表1肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的粒径表征与血清稳定性
Figure BDA0002362254870000161
Figure BDA0002362254870000171
实施例17：具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的粒径表征
取实施例1-15制备得到的具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒载体/基因药物三元复合纳米药物用双蒸水稀释到2mL，用粒径测定仪(Malvem Instruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表2。由表可知，制备得到的三元复合纳米药物，纳米体系粒径均达到纳米级，且粒径分布均匀。
表2具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的粒径表征
Figure BDA0002362254870000172
实施例18：肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的血清稳定性评价
取实施例1-15制备得到的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物用50％血清稀释到2mL，24h后用粒径测定仪(MalvemInstruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表3。由表可知，制备得到的三元复合纳米药物在血清存在条件下能保持稳定，纳米药物不会对血清中的蛋白质有吸附作用从而影响血液循环中的稳定性。
表3肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的血清稳定性评价
Figure BDA0002362254870000181
Figure BDA0002362254870000191
实施例19：具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的血清稳定性评价
取实施例1-15制备得到的具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物用50％血清稀释到2mL，24h后用粒径测定仪(MalvemInstruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表4。由表可知，制备得到的三元复合纳米药物在血清存在条件下能保持稳定，纳米药物不会对血清中的蛋白质有吸附作用从而影响血液循环中的稳定性。
表4具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物的血清稳定性评价
Figure BDA0002362254870000192
实施例20：肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物对HepG2细胞乳酸代谢水平的调控
将对数生长期的HepG2细胞以3×104个/孔的密度接种于24孔板，37℃、5％CO2条件下孵育24h，吸弃培养液。分别加入含1μg/mL无血清培养基和无血清培养基稀释的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒载体/基因药物三元复合纳米药物1mL，其中无血清培养基组为对照组。于37℃、5％CO2条件下培养4小时后，弃去培养基，更换新鲜的完全培养基，继续培养48h使其转染并表达。取培养基上清，使用Lactate(乳酸)Elisa试剂盒检测乳酸相对含量。表5结果显示，纳米药物组乳酸含量相对对照组明显降低，表明肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物对肿瘤细胞具有显著的抑制代谢效果。
表5肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物对HepG2细胞乳酸水平的调控
Figure BDA0002362254870000201
注：与对照组组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例21：具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物对HUVEC细胞乳酸代谢水平的调控
将对数生长期的HUVEC细胞以3×104个/孔的密度接种于24孔板，37℃、5％CO2条件下孵育24h，吸弃培养液。分别加入含1μg/mL无血清培养基和无血清培养基稀释的具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物1mL，其中无血清培养基组为对照组。于37℃、5％CO2条件下培养4小时后，弃去培养基，更换新鲜的完全培养基，继续培养48h使其转染并表达。取培养基上清，使用Lactate(乳酸)Elisa试剂盒检测乳酸相对含量。表6结果显示，纳米药物组乳酸含量相对对照组明显降低，表明具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒载体/基因药物三元复合纳米药物对肿瘤血管内皮细胞具有显著的抑制代谢效果。
表6具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物对HUVEC细胞乳酸水平的调控
Figure BDA0002362254870000211
注：与对照组组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例21：MTT法测定肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物对L02细胞(正常肝细胞)的细胞毒性
取L02细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，5％CO2浓度，37℃条件下孵育。12h后吸去培养液，分别加入浓度梯度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μg/mL(以基因药物浓度计)的肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物，每孔200μL，每组设置六复孔。5％CO2浓度，37℃条件下孵育48h后每孔加入40μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，相同条件下继续孵育4h后每孔加入150μLDMSO，并在水平摇床上振荡10min，以充分溶解紫色结晶。使用酶标仪在490nm处检测吸光度A，细胞生存率按公式(1)计算，并使用SPSS计算各组IC50值。由表7可知，三元复合纳米药物IC50值都小于基因转染的“金标准”PEI(10kDa)，三元复合纳米粒能有效降低阳离子基因载体对正常体细胞的毒性。
Figure BDA0002362254870000221
表7肝素类多糖大分子及其衍生物和活性生物大分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物对L02细胞(正常肝细胞)的细胞毒性
Figure BDA0002362254870000222
Figure BDA0002362254870000231
实施例22：MTT法测定具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物对L02细胞(正常肝细胞)的细胞毒性
取L02细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，5％CO2浓度，37℃条件下孵育。12h后吸去培养液，分别加入浓度梯度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μg/mL的具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒载体/基因药物三元复合纳米药物，每孔200μL，每组设置六复孔。5％CO2浓度，37℃条件下孵育48h后每孔加入40μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，相同条件下继续孵育4h后每孔加入150μL DMSO，并在水平摇床上振荡10min，以充分溶解紫色结晶。使用酶标仪在490nm处检测吸光度A，细胞生存率按上述公式(1)计算，并使用SPSS计算各组IC50值。由表8可知，三元复合纳米药物IC50值都PEI(10kDa)，三元复合纳米粒能有效降低阳离子基因载体对正常体细胞的毒性。
表8具内皮细胞靶向活性分子/阳离子非病毒类基因载体/基因药物三元复合纳米药物对L02细胞(正常肝细胞)的细胞毒性
Figure BDA0002362254870000232
Figure BDA0002362254870000241
实施例23：低分子量肝素-全反式维甲酸/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)+PSS/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)混合纳米药物对肿瘤细胞HepG2和肿瘤血管内皮细胞HUVEC选择性摄取的评价
用接枝了异硫氰酸荧光素异构体(FITC)的PEI(25kDa)制备低分子量肝素-全反式维甲酸/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)和PSS/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)三元复合纳米药物，用倒置荧光显微镜观察FITC的荧光表征纳米粒的摄取。在六孔板上铺适宜大小的细胞爬片，在细胞爬片上分别以6×105个/孔的与3×105个/孔的密度种HepG2与HUVEC，待细胞在爬片上长满后，取出爬片。将一片HepG2爬片与一片HUVEC爬片放在同一个塑料培养皿中，给予低分子量肝素-全反式维甲酸/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)三元复合纳米药物与PSS/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)三元复合纳米药物药物干预4h。将爬片取出，用37℃PBS洗3次；在4％多聚甲醛中固定15min，用37℃PBS洗3次；加入适量Hoechst 33342染色稀释液染核10min，用37℃PBS洗5次，用滤纸尽量吸干爬片边缘的水分，用甘油明胶将爬片固定在载玻片上，待甘油明胶干了后用倒置荧光显微镜观察细胞选择性摄取药物结果，每组设置三个复孔。用Image J计相对平均荧光强度(MFI)。结果如图1所示，低分子量肝素-全反式维甲酸/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)三元复合纳米药物选择性优先被肿瘤细胞摄取，其纳米粒子尺寸效应与EPR效应介导了肿瘤细胞靶向递送，利于纳米药物在肿瘤部位的富集，实现针对肿瘤细胞的抗血管生成、节拍化疗和代谢稳态重塑联合调控。相反的是，PSS/PEI(25kDa)/miR-26a(基因过表达质粒)三元复合纳米药物选择性优先被肿瘤血管内皮细胞所摄取，主要是由于其具有内皮细胞高亲和力的靶向配体精准靶向肿瘤血管内皮细胞，有利于实现针对肿瘤血管内皮细胞的特异性代谢干预与促血管正常化治疗。
实施例24：低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-206+PSS/壳聚糖/miR-206混合纳米药物对拓宽肿瘤血管正常化时间窗能力的考察
将HepG2细胞接种于Balb/c裸鼠皮下，建立肝癌动物模型。随机将荷瘤小鼠分为五个实验组(每组11只小鼠)：(1)生理盐水(对照组)；(2)游离吉西他滨组；(3)低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-206单纳米药物干预组；(4)PSS/壳聚糖/miR-206单纳米药物干预组；(5)低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-206-PSS/壳聚糖/miR-206混合纳米药物组。给药剂量为2mg/kg/天(以吉西他滨给药量计算)。隔天静脉注射给药，分别在第3，4，6，8，10，12，13天处每组处死两只小鼠，剥离肿瘤，制备蜡块。对各组样品进行CD31和α-SMA免疫荧光染色，使用image pro plus软件计算微血管密度和周细胞覆盖率，判断正常化时间窗的范围。表9为各组正常化时间窗范围，低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-206单纳米药物干预组相对游离吉西他滨延长了3天正常化时间窗，而低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-206-PSS/壳聚糖/miR-206混合纳米药物组由于靶向血管内皮细胞的代谢调控，协同增强了吉西他滨节拍化疗以及低分子量肝素的抗VEGF作用诱导的血管正常化，相对游离吉西他滨组延长了8天正常化时间窗，表明基于肿瘤泛代谢调控的促肿瘤血管正常化治疗混合纳米制剂对于拓展血管正常化时间窗有重要意义。
表9低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物/壳聚糖/miR-206+PSS/壳聚糖/miR-206混合纳米药物对拓宽肿瘤血管正常化时间窗能力的考察
Figure BDA0002362254870000251
实施例25：低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物/Liposome 2000/miR-143+RGD/Liposome 2000/miR-143混合纳米药物促肿瘤血管结构正常化评价将HepG2细胞接种于Balb/c裸鼠皮下，建立肝癌动物模型。随机将荷瘤小鼠分为五个实验组(每组11只小鼠)：(1)生理盐水(对照组)；(2)游离吉西他滨组；(3)低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物/Liposome 2000/miR-143单纳米药物干预组；(4)RGD/Liposome 2000/miR-143单纳米药物组；(5)低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物/Liposome 2000/miR-143-RGD/Liposome2000/miR-143混合纳米药物组。给药剂量为2mg/kg/天(以吉西他滨给药量计算)。隔天静脉注射给药，分别在第3，4，6，8，10，12，13天处每组处死两只小鼠，剥离肿瘤，制备蜡块。对各组样品进行CD31和α-SMA免疫荧光染色，使用image pro plus软件计算周细胞覆盖率。图2为测得的各组周细胞覆盖率。结果表明，在第3天至第12天，混合纳米药物组的周细胞覆盖率显著高于对照组，初步确定混合纳米药物诱导的血管正常化时间窗为第3天至第12天。此外，单纳米药物组在第6天至第10天周细胞覆盖率也显著高于对照组，但这种作用比混合纳米药物组更弱且持续时间更短。这些结果表明，混合纳米药物在对肿瘤进行泛代谢调控的基础上，巧妙地联合经典地基于抗VEGF及节拍化疗诱导的促肿瘤血管正常化治疗，实现了强效及长效的促肿瘤血管正常化治疗效果。

Claims (5)

1.一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂，其特征在于，该混合纳米制剂由两种自组装三元复合纳米体系直接物理混合而成；其中一种三元复合纳米体系由具有VEGF抑制活性的大分子与非病毒类基因载体、代谢调控相关基因药物自组装形成；另外一种三元复合纳米体系由具有内皮细胞靶向功能活性物质与非病毒类基因载体、代谢调控相关基因药物自组装形成；
所述的具有VEGF抑制活性的大分子为低分子量肝素-吉西他滨-胆固醇偶联物或低分子量肝素-吉西他滨两亲性偶联物；
所述的非病毒类基因载体为聚乙烯亚胺、聚氨基胺、聚氨基酯、壳聚糖、葡聚糖、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷、Liposome 2000和Liposome 3000中的至少一种；
所述具有内皮细胞靶向功能活性物质为RGD或PSS；
所述的代谢调控相关基因为miR-206或miR-143。
2.根据权利要求1所述的混合纳米制剂，其特征在于：其中一种三元复合纳米体系中具有VEGF抑制活性的大分子、非病毒类基因载体和代谢调控相关基因药物的质量比为5~200：2~20：1；另外一种三元复合纳米体系中具有内皮细胞靶向功能活性物质、非病毒类基因载体和代谢调控相关基因药物三者的质量比为1~200：2~20：1；两种三元复合纳米体系的混合摩尔比为1~10：10~1。
3.根据权利要求1所述的混合纳米制剂，其特征在于：两种所述的三元复合纳米体系的药物粒径为20 nm~1000 nm。
4.根据权利要求1~3中任一所述混合纳米制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将非病毒类基因载体溶于超纯水、注射用水、葡萄糖注射液或氯化钠注射液溶液中，再滴入所述的代谢调控相关基因药物，搅拌后静置形成二元复合纳米体系预组装单元；
（2）将具有VEGF抑制活性的大分子溶于超纯水、注射用水、葡萄糖注射液或氯化钠注射液溶液中，滴加此溶液至步骤（1）制备的二元复合纳米体系预组装单元中，搅拌后静置得到混合纳米制剂中的其中一种三元复合纳米体系；
（3）将具有内皮细胞靶向功能活性物质溶于超纯水、注射用水、葡萄糖注射液或氯化钠注射液溶液中，滴加此溶液至步骤（1）制备的二元复合纳米体系预组装单元中，搅拌后静置得到混合纳米制剂中的另外一种三元复合纳米体系；
（4）将步骤（2）和（3）制备的两种三元复合纳米体系按比例直接混合得到混合纳米制剂。
5.权利要求1-3中任一所述的混合纳米制剂在制备抗血管生成、肿瘤代谢调控、抗肿瘤治疗药物中的应用。
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