CN114533696B - 一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体的制备方法和应用。本发明借助血液来源的外泌体为载体共同搭载sicPLA2和二甲双胍，该工程化外泌体可从磷脂代谢和线粒体代谢两个方面抑制GBM能量代谢和增殖，为治疗GBM提供新的治疗靶点和治疗策略，同时也进一步为转化医学奠定了理论基础。

Description

一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种脑靶向递送sicPLA2 和二甲双胍用工程化外泌体的制备方法和应用。

背景技术

胶质母细胞瘤(GBM)是恶性程度最高的原发性脑肿瘤。尽管有包括手术和放化疗结合的多种治疗方案，但GBM仍不可避免复发且五年生存率不足10％，迫切需要确定新的靶点以开发有效的治疗方法。代谢重构作为GBM的标志性特征之一，为肿瘤细胞的快速生长和增殖提供能量，可作为探索GBM治疗的新方向。因此，通过阻断多种代谢途径剥夺GBM的能量供应有望成为新的治疗策略。

磷脂代谢在肿瘤中扮演着重要的角色，也是支持肿瘤能量需求的重要途径。磷脂酶活性与GBM能量代谢有关，以胞质型磷脂酶A2 (cPLA2)为代表，该酶水解磷脂形成脂肪酸，然后通过β-氧化作用进入三羧酸(TCA)循环产生能量。前期研究证明cPLA2在GBM 中被聚合酶1和转录释放因子(PTRF)激活并调控，从而促进肿瘤细胞能量代谢，抑制cPLA2可以阻断GBM细胞的ATP产生和增殖。因此，通过小干扰RNA特异性抑制cPLA2是一种有潜力的GBM靶向方法。除了磷脂代谢为能量产生提供原料，线粒体代谢是能量代谢的直接驱动因素。线粒体电子传递链(ETC)支持TCA循环并直接产生GBM细胞所需的大部分ATP。我们发现二甲双胍作为ETC复合物I的抑制剂在临床前试验中与cPLA2抑制剂联合使用可以抑制肿瘤细胞能量代谢和增殖。因此，cPLA2小干扰RNA(sicPLA2) 和二甲双胍的组合可以通过同时靶向两种代谢途径来抑制能量代谢。然而，稳定性差和血脑屏障(BBB)是siRNA和二甲双胍联合治疗 GBM的障碍。这种GBM治疗策略的主要挑战是如何有效地将 sicPLA2和二甲双胍跨越血脑屏障共同递送到GBM进行治疗，合适的纳米药物载体系统需要进一步研究。

构建单一载体穿过BBB以实现sicPLA2和二甲双胍的共同递送是最优的方式。据报道，多种载体可以共同递送RNA和药物，但如果用于治疗GBM，则需要额外的修饰才能使BBB渗透。这不可避免地带来了载体的系统复杂性和批次间差异等一系列问题，这些都给临床转化带来了很大的困难。相比之下，天然衍生的外泌体提供了更好的选择。外泌体由围绕水性核心的两亲脂质双层组成，这为共装载具有不同物理和化学特性的治疗剂(如RNA和小分子药物)提供了可能性。血液是安全且丰富的外泌体的来源，常规输血证明了同种异体血液外泌体的临床转化能力。更重要的是，在其膜上表达的转铁蛋白受体使血液外泌体能够穿透BBB。因此，血液来源的外泌体可以成为siPLA2和二甲双胍联合治疗GBM的潜在载体。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体。

本发明一方面提供了一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体，所述工程化外泌体以离心后的健康动物血清的外泌体为载体，将二甲双胍以电穿孔的方式载入所述载体内得到Exos-Met，再将sicPLA2(双链RNA，其核苷酸序列为5'-CCUGGUAUAUGUCAACCUUTT-3'；5'-AAGGUUGACAUAUACCAGGTT-3')以孵化的方式再入Exos-Met中得到Exos-Met/sicPLA2，所述外泌体的平均粒径为100-150nm。

优选的，所述二甲双胍经过5'-四甘醇和胆固醇修饰。

本发明还提供一种上述工程化外泌体的制备方法，包括如下步骤：

(1)取健康动物的血清，采用超速离心方法制备外泌体；

(2)通过电穿孔方法将二甲双胍负载至外泌体中；

(3)通过孵化方法将sicPLA2负载至步骤(2)得到的外泌体中后即得工程化外泌体。

优选的，所述步骤(1)超速离心方法为：放入超速离心机中依次进行离心条件如下的离心操作：300～500g离心10～20min、2000～ 3000g离心10～20min、10000～12000g离心30～40min、100000～ 110000g离心70～90min、PBS重悬沉淀后100000～110000g离心70～90min后收集血清外泌体。

更优选的，离心条件为：300g离心10min、2000g离心10min、10000g离心30min、100000g离心70min、PBS重悬沉淀后100000g 离心70min后收集血清外泌体。

优选的，所述步骤(2)电穿孔方法为：将纯化的外泌体与二甲双胍在电穿孔缓冲液中混合得到混合物，然后使用Bio-Rad Gene Pulser Xcell电穿孔系统在电穿孔比色皿中以350V和150μF的电压进行电穿孔，之后将混合物在37℃下孵育30min以恢复外泌体膜。

优选的，所述步骤(3)孵化方法为：所述步骤(3)孵化方法为：在室温下将负载了二甲双胍的外泌体和sicPLA2在PBS缓冲液中混合，缓慢摇动1-2h使sicPLA2加载至负载有二甲双胍的外泌体中，然后通过超速离心用PBS洗涤血清外泌体以去除未结合的sicPLA2。

优选的，所述血清外泌体、sicPLA2和二甲双胍的质量比为1:1:1。

优选的，所述sicPLA2经过5'-四甘醇和胆固醇修饰。

本发明还提供了上述工程化外泌体在抑制GBM细胞能量代谢和增殖方面的应用。

本发明还提供了上述工程化外泌体在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明研究和分析了工程化外泌体与BBB的相互作用及其与脑靶向投递效率的关系，同时搭载sicPLA2和二甲双胍从磷脂代谢和线粒体代谢两个方面抑制肿瘤能量代谢，为GBM治疗探索新的理论和技术路线，也为进一步转化医学奠定了基础。

附图说明

图1为sicPLA2和二甲双胍共投递工程化外泌体的构建及表征图；

图2为sicPLA2和二甲双胍共投递抑制GBM细胞能量代谢和增殖图；

图3为工程化外泌体脑靶向能力的体内和体外验证图；

图4为动物实验验证sicPLA2和二甲双胍共投递对GBM增殖的抑制图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例1sicPLA2和二甲双胍共投递工程化外泌体的构建

(1)血液外泌体的分离纯化：

应用梯度超速离心技术，使用超速离心机从健康动物(BALB/C 裸鼠，动物来源为北京维通利华实验动物技术有限公司)的血清中分离和纯化外泌体，具体步骤为：①300g离心10分钟、②2000g离心 10分钟、③10000g离心30分钟、④100000g离心70分钟、⑤PBS 重悬沉淀后100000g离心70分钟收集外泌体，使用纳米颗粒跟踪分析和电子显微镜对提取的外泌体进行粒径测量。

(2)血液外泌体制备sicPLA2和二甲双胍工的具体制备过程：

如图1a所示，将100μg纯化的外泌体与100μg二甲双胍在200 μL电穿孔缓冲液中轻轻混合。然后使用Bio-Rad Gene Pulser Xcell 电穿孔系统在电穿孔比色皿中以350V和150μF的电压进行电穿孔。之后，将混合物在37℃下孵育30min以恢复外泌体膜。然后将缓冲液替换为不含RNase的PBS缓冲液，以准备加载sicPLA2。然后，在室温下将负载了二甲双胍的外泌体(Exos-Met)和100μg浓度为20uM的有5'-四甘醇和胆固醇修饰的sicPLA2(chol-sicPLA2)(购自苏州吉玛基因股份有限公司)混合，缓慢摇动1h以形成 Exos-Met/sicPLA2，然后通过超速离心用PBS洗涤外泌体以去除未结合的sicPLA2分子。

(2)外泌体对sicPLA2和二甲双胍的负载及对负载后形成的工程化外泌体进行表征：

通过①纳米颗粒跟踪分析、②透射电子显微镜、③Western blot 分析、④荧光显微镜对共载sicPLA2和二甲双胍的工程化外泌体进行表征，包括粒径、形态、特征蛋白以及RNA与外泌体的共定位基本特性，以确定工程化外泌体的特征。

具体步骤：取100μL的外泌体溶液，采用NanoSight纳米粒度分析仪进行纳米粒径分析测试，表征外泌体的粒径；外泌体的形貌使用透射电子显微镜进行表征。滴加10μL的外泌体溶液到铜网上，静置10分钟，然后用滤纸吸去多余的样品，以2％磷钨酸溶液染色2 分钟后，用去离子水清洗染色剂，晾干后进行电镜观察；将RIPA裂解液与外泌体混合，离心得到蛋白质，加入到SDS-PAGE凝胶电泳中，电泳结束后将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，并分别用 CD63、CD81、Tsg101、TfR的抗体孵育过夜，然后用相应的二抗进行孵育1小时，最后漂洗干净，在凝胶成像系统中采集图像；将外泌体用Cy5荧光分子标记，sicPLA2用FAM标记，所构建的工程化外泌体溶液至于共聚焦小皿中，在荧光显微镜下观察。

结果见图1b-e，可见如TEM图像(图1b)所示，工程化外泌体的粒径为128.1±7.7nm，呈现出典型的“碟状”纳米形态(图1b)。蛋白质印迹分析(图1c)显示典型的外泌体标志物以及血液来源的外泌体的典型生物标志物TfR在工程化外泌体中表达。荧光图像半定量分析(图1d)显示外泌体的红色荧光点和sicPLA2的绿色荧光点重叠，表明siRNA的有效负载。这些结果证明，在不改变Exos的结构和理化性质的情况下，利用血液外泌体共同负载二甲双胍和 sicPLA2以获得工程化外泌体纳米制剂是可行的。

(3)工程化外泌体的肿瘤细胞摄取：

用Cy5荧光分子标记制备得到的外泌体，N9和TBD0220细胞接种到共聚焦培养皿中，然后与Cy5-Exos一起孵育4小时，孵育后将细胞用PBS洗涤。对于共聚焦分析，用4％多聚甲醛固定细胞，并用 Alexa Fluor^TM 488Phalloidin和DAPI进一步染色细胞骨架和细胞核，使用共聚焦荧光显微镜观察图像。对于流式分析，用胰蛋白酶分离细胞，然后重悬于PBS中进行测量。通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞仪观察并定量外泌体在GBM细胞中的摄取。

结果见图1f，可见外泌体的红色荧光信号定位于细胞之中，表明外泌体可以被GBM细胞有效地摄取。

实施例2工程化外泌体脑靶向能力的体内和体外验证

(1)体外验证工程化外泌体跨域血脑屏障效率：

建立Transwell体系体外BBB模型，将bEnd.3内皮铺于小室上层，形成致密单层，使用电阻仪评价BBB致密程度，将TBD细胞铺于小室下腔(图3a)。将荧光标记的工程化外泌体加入小室上腔，在37℃避光条件下共孵育一定时间，通过共聚焦荧光显微镜观察外泌体在Transwell小室上bEnd.3细胞单层以及下腔室肿瘤细胞中的分布，通过流式细胞仪观察并定量评价外泌体穿透BBB的速率。

结果见图3a-c，可见外泌体在bEnd.3和TBD0220细胞中的荧光信号在不同时间点(4、8和12小时)有显着差异。随着时间的推移，在TBD02220细胞中观察到荧光强度逐渐增加，表明外泌体可以有效地穿透单层内皮细胞并在内化到GBM细胞中(图3b)。此外，bEnd.3细胞中Exos荧光强度的连续降低也证明Exos被转运出bEnd.3细胞并迁移到GBM细胞中。流式细胞仪进一步证实了这一现象。此外，外泌体也可将二甲双胍和sicPLA2递送穿透内皮细胞单层(图3c)。这些结果表明，外泌体在体外模型中具有很强的穿透内皮细胞屏障的能力。

(3)体内验证工程化外泌体脑靶向能力：

①将Cy5.5荧光标记的工程化外泌体通过尾静脉注射到荷瘤裸鼠中，并在接种后使用活体成像系统进行观察。注射24小时后，将荷瘤裸鼠安乐死解剖获取肿瘤组织并制备冰冻切片，通过荧光显微镜观察外泌体在肿瘤中的富集，分析其肿瘤靶向能力。

结果见图3d-g，可见外泌体进入到脑瘤部位，并显示与肿瘤的生物发光信号共定位(图3d-e)。冰冻切片的荧光分析显示外泌体在肿瘤侧的富集多于正常脑组织，并且从血管中穿透出来进入肿瘤细胞。

②使用Cy5.5荧光分子标记sicPLA2并制备工程化外泌体，经尾静脉注射至小鼠中，以高效液相色谱-质谱联用检测二甲双胍在各个组织中的富集，以小动物活体成像观察sicPLA2在脑部的富集。

结果见图3h-j，可见经外泌体搭载后，二甲双胍在脑组织尤其是肿瘤组织中的富集增强。siRNA经外泌体搭载后，可以进入到脑瘤组织中，并且荧光切片显示可从血管中穿透出来进入肿瘤细胞。

实施例3sicPLA2和二甲双胍共投递抑制GBM细胞能量代谢和增殖

(1)线粒体压力测试：

将GBM细胞计数后按最佳接种密度，一般在2万至3万之间，铺在XF24细胞培养板中。将工程化外泌体和对照外泌体加入肿瘤细胞培养板中共同孵育24小时，配置Oligomycin、FCCP、Rot/AA和检测液，并加入检测板中。将细胞培养板放入Seahorse细胞分析仪中进行线粒体压力测试，对数据进行归一化处理后，进一步使用定量方法计算基础呼吸和ATP产生指标分析实验结果。

结果见图2a-2b，可见，经过天然外泌体处理的两种GBM细胞的OCR与未经处理的细胞没有显著差异，表明血液外泌体自身不会影响线粒体代谢。在N9细胞中，单药治疗组(Exos/sicPLA2和 Exos-Met)线粒体功能下降，表明Exos可以有效地将sicPLA2或二甲双胍传递给GBM细胞，发挥其对线粒体氧化呼吸的调节功能。进一步证明联合治疗(Exos-Met/sicPLA2)比单药治疗更有效地降低基础氧化呼吸能力。我们在TBD0220细胞中重复了这个实验，结果表明 Exos-Met/sicPLA2处理可以最大限度地抑制OCR，与N9细胞的结果一致。

(2)ATP检测：

将肿瘤细胞铺在6孔培养板中，加入工程化外泌体及对照共同孵育24小时，利用ATP检测试剂盒将细胞裂解提取样本。在检测孔中加入20μL样品和100μL ATP检测工作液迅速混匀，使用酶标仪测量荧光素酶信号强度，根据标准曲线计算样品中对应的ATP浓度。

结果见图2c和2f，ATP检测更能直观反应线粒体能量代谢可见单药治疗组(Exos/sicPLA2和Exos-Met)使细胞ATP产生降低，联合治疗组(Exos-Met/sicPLA2)更使N9和TBD0220细胞ATP水平分别下降了47.3％和52.7％。

(3)细胞平板克隆形成实验：

将300个肿瘤细胞悬液接种到六孔板中，待细胞贴壁24小时后，加入sicPLA2和二甲双胍共载外泌体，置于37℃恒温细胞培养箱中培养2-3周。当培养板中出现肉眼可见的克隆(数目大于50个)，终止培养，使用4％多聚甲醛固定细胞。加入2.5％结晶紫染色液进行染色，计数克隆数目并统计。

结果见图2d和2g，可见与Exos/sicPLA2和Exos-Met组的细胞相比，用Exos-Met/sicPLA2处理的N9细胞的平板克隆菌落数量更少。TBD0220细胞中结果也一样。

(4)肿瘤细胞增殖实验：

CCK-8试剂盒检测sicPLA2和二甲双胍共投递外泌体对GBM细胞增殖的作用，在96孔板中接种细胞，加入sicPLA2和二甲双胍共载外泌体培养一定时间后，配制CCK-8检测液，每孔加入100μL 检测液，然后将细胞培养板在培养箱内孵育2小时，待充分反应后，使用自动酶标仪测定吸光度并进行统计分析。

结果见图2e和2h，可见，在N9细胞的增殖实验中，与对照组相比，联合治疗组在48小时内的增殖率降低了约60％，而单独使用 Exos/sicPLA2和Exos-Met组的增殖率分别降低了27％和40％。

实施例4体内动物实验验证sicPLA2和二甲双胍共投递对GBM 增殖的抑制

(1)建立原位人源性GBM异种移植模型：

使用已经建立的GBM原代细胞系，取BALB/C裸鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)的前后囟门中线中点偏右1-2mm 处使用针头钻穿颅骨，计数细胞后利用立体定位仪将肿瘤细胞种植在裸鼠颅内，待细胞种植完成后使用缝线将切口缝合整齐，消毒皮肤后将小鼠放回SPF级动物饲养室，待颅内接种手术七天后进行后续治疗实验。动物实验技术路线示意图如图4a所示。

(2)小动物活体成像和绘制生存曲线观察肿瘤生长体积情况：

将实验小鼠按照颅内肿瘤荧光数值随机分组，然后将工程化外泌体尾静脉注射到荷瘤裸鼠中进行治疗，隔天进行一次注射，持续时间为两周，每七天进行一次成像观察，对小动物成像结果进行统计分析。详细记录动物实验过程中实验小鼠的死亡日期用于分析每组实验动物的生存期并绘制Kaplan-Meier生存曲线。

结果见图4b-d，可见Exos组与PBS组相似的恶性肿瘤，随着时间的推移，GBM显著增殖。我们发现，与PBS组相比，Exos/sicPLA2 和Exos-Met处理组的生物发光强度显著降低。与单药治疗组相比，联合治疗组的生物发光面积和强度明显减小，定量显示Exos-17 Met/sicPLA2组第21天的肿瘤发光强度比PBS组低约67倍。这些结果表明，Exos介导的sicPLA2和二甲双胍联合给药对GBM进展具有最显著的抑制作用。此外，Exos-Met/sicPLA2处理的小鼠中位生存期最好，可延长至40天。

(3)HE和免疫组织化学染色：

将荷瘤裸鼠的肿瘤样本制作城石蜡切片，经过脱蜡水化、抗原修复、抗原抗体反应、DAB显色和封片实验步骤，使用光学显微镜对 Ki-67增殖指标进行观察和统计分析。使用苏木素-伊红染色对小鼠全脑切片进行染色测量肿瘤体积大小，用于观察sicPLA2和二甲双胍共投递治疗对肿瘤增殖的抑制作用。

结果见图4e-g，可见H&E结果显示PBS组和Exos组均为典型的GBM恶性肿瘤，GBM细胞密度高。Exos-Met/sicPLA2治疗组肿瘤体积明显小于其他治疗组，进一步证实联合治疗可显著抑制肿瘤的进展，这与生物发光成像结果一致。免疫组化检测肿瘤组织中cPLA2 和Ki67的抗肿瘤作用，Exos-Met/sicPLA2组在GBM组织中cPLA2 的表达水平显著降低。同样，Ki67阳性细胞的百分比在 Exos-Met/sicPLA2组治疗下降到20.7％。这些结果证实了Exos-Met/sicPLA2可以阻断GBM细胞的增殖。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体，其特征在于：所述工程化外泌体以离心后的健康动物血清的外泌体为载体，将二甲双胍以电穿孔的方式载入所述载体内得到Exos-Met，再将sicPLA2以孵化的方式再入Exos-Met中得到Exos-Met/sicPLA2，所述外泌体的平均粒径为100-150nm；所述sicPLA2的核苷酸序列为5'-CCUGGUAUAUGUCAACCUUTT-3'，5'-AAGGUUGACAUAUA CCAGGTT-3'。

2.根据权利要求1所述的脑靶向递送sicPLA2和二甲双胍用工程化外泌体，其特征在于：所述sicPLA2经过四甘醇和胆固醇修饰。

3.一种权利要求1或2所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取健康动物的血清，采用超速离心方法制备外泌体；

(2)通过电穿孔方法将二甲双胍负载至外泌体中；

(3)通过孵化方法将sicPLA2负载至步骤(2)得到的外泌体中后即得工程化外泌体。

4.根据权利要求3所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)超速离心方法为：放入超速离心机中依次进行离心条件如下的离心操作：300～500g离心10～20min、2000～3000g离心10～20min、10000～12000g离心30～40min、100000～110000g离心70～90min、PBS重悬沉淀后100000～110000g离心70～90min后收集血清外泌体。

5.根据权利要求3所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：离心条件为：300g离心10min、2000g离心10min、10000g离心30min、100000g离心70min、PBS重悬沉淀后100000g离心70min后收集血清外泌体。

6.根据权利要求3所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)电穿孔方法为：

将纯化的外泌体与二甲双胍在电穿孔缓冲液中混合得到混合物，然后使用Bio-RadGene Pulser Xcell电穿孔系统在电穿孔比色皿中以350V和150μF的电压进行电穿孔，之后将混合物在37℃下孵育30min以恢复外泌体膜。

7.根据权利要求3所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)孵化方法为：在室温下将负载了二甲双胍的外泌体和sicPLA2在PBS缓冲液中混合，缓慢摇动1-2h使sicPLA2加载至负载有二甲双胍的外泌体中，然后通过超速离心用PBS洗涤血清外泌体以去除未结合的sicPLA2。

8.根据权利要求3所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：血清外泌体、二甲双胍和sicPLA2的质量比为1:1:1。

9.根据权利要求3所述的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述sicPLA2经过四甘醇和胆固醇修饰。

10.权利要求1或2所述的工程化外泌体在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。

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