CN101815522B - 诊断、预防或治疗与表达IL‑8或GRO‑α的细胞有关的疾病的组合物 - Google Patents

诊断、预防或治疗与表达IL‑8或GRO‑α的细胞有关的疾病的组合物 Download PDF

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Abstract

提供一种基因治疗组合物，其用于将治疗基因、标记基因或其混合物中之一转移到细胞，所述细胞表达白细胞介素‑8(IL‑8)或生长调节致癌基因α(GRO‑α)，且诱导从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(脐带血来源间质干细胞(UCB‑MSC))的趋向性，其中所述细胞治疗组合物包含UCB‑MSC。提供一种在基因疗法中通过使用UCB‑MSC来治疗与表达IL‑8或GRO‑α的细胞有关的疾病(即脑肿瘤)的组合物。提供一种通过使用UCB‑MSC来诊断脑肿瘤、预防脑肿瘤、治疗脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物或试剂盒。

Description

诊断、预防或治疗与表达IL-8或GRO-α的细胞有关的疾病的组 合物
技术领域
本发明涉及一种基因治疗组合物，其用于将治疗基因、标记基因或其产物转移到细胞，所述细胞表达白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)或生长调节致癌基因α(growth-regulated oncogene-α，GRO-α)，且诱导脐带血来源间质干细胞或从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(UCB-MSC)的趋向性(tropism)，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC。
本发明还涉及在基因疗法中使用包含UCB-MSC的组合物来治疗与表达IL-8或GRO-α的细胞有关的疾病或脑肿瘤。
本发明还涉及一种使用UCB-MSC来诊断脑肿瘤、预防脑肿瘤、治疗脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物或试剂盒。
背景技术
众所周知干细胞会向病变部位迁移。最近发现骨髓来源间质干细胞(bonemarrow-derived mesenchymal stem cell，BM-MSC)对多种肿瘤具有趋向性且会向肿瘤部位迁移。所述BM-MSC可迁移到特定肿瘤部位，可以证明是适用于基因疗法的工具。举例来说，对多种肿瘤具有趋向性的BM-MSC可用作将治疗性自杀基因转移到肿瘤部位的运载体(vehicle)[参见A.L.彭特(Ponte A.L.)等人，干细胞(Stem Cells)，25，1737-1745(2005)；C.M.凯勒(Kahler C.M.)等人，呼吸研究(Respir Res)8，50(2007)]。尽管发现这一有趣现象，但调控MSC运输(trafficking)到肿 瘤的分子机制并不清楚。
经数年研究，越来越多的证据表明BM-MSC迁移的诱导似乎是由数种可溶性因子所刺激。最近，已证实从乳癌细胞分泌来的单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)可刺激BM-MSC迁移[参见R.M.杜威(Dwyer R.M.)等人临床癌症研究(Clin Cancer Res)13，5020-5027(2007)]。此外，趋化因子配体2(chemokine ligand 2，CCL2)以及趋化因子配体10(chemokine ligand 10，CCL-10)可诱导神经祖细胞迁移到大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAo)中风模型中的受损部位[参见神经科学研究杂志(J Neurosci Res)85，2120-2125(2007)]。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growthfactor-1，IGF-1)可显著增加大鼠BM-MSC迁移应答[参见Y.李(Li Y.)等人，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)356，780-784(2007)]。因此，鉴定影响MSC迁移事件的可溶性因子对于了解MSC如何向肿瘤或受损组织迁移很重要。
被引入BM-MSC中的多种基因在体内(in vivo)过表达并显示生物活性。举例来说，引入有人血管生成素-1(hAng1)基因的BM-MSC可刺激急性心肌梗塞模型动物的梗塞部位中形成血管[参见L.孙(Sun L.)等人，生物化学与生物物理研究通讯(BiochemicalBiophysical ResearchCommunication)357(2007)779-784]，过表达Akt的BM-MSC意外地治疗心肌梗塞并改善心脏功能[参见N.尼古拉斯(Nicolas N.)等人，分子疗法(MolecularTherapy)14(6)，840-850，2006]，经Bcl-2基因修饰的BM-MSC防止细胞凋亡并改善心脏功能[参见干细胞(Stem Cells)25，2118-2127(2007)]，以及过表达内皮一氧化氮合成酶的BM-MSC可恢复由肺动脉高压所引起的右心室损伤[参见幸子(Sachiko)等人，循环(Circulation)，114[增刊I]：I-181-I-185]。这些结果表明引入有基因的MSC可用作基因疗法的工具。
同时，一般来说，中枢神经系统的细胞受到很好的调控，其中中枢神经系统由脑和脊髓组成。然而，当这种调控崩溃时，细胞连续分裂且形成肿瘤。肿瘤可分成良性肿瘤或恶性肿瘤。中枢神经系统内具有神经元，和支持与保护神经元的胶质细胞。在胶质细胞中形成的肿瘤被称为胶质瘤。胶质瘤占原发性脑肿瘤的50％且占原发性脊髓肿瘤的15％。另外，脑肿瘤包含神经肿瘤、血管肿瘤以及腺体肿瘤。也存在由身体其它部位中所形成的其它肿瘤引起的继发性脑肿瘤。继发性脑肿瘤是最常见类型的脑肿瘤。
脑肿瘤因肿瘤所处部位而难以治疗。可通过物理手术或化学疗法来治疗脑肿瘤。在物理手术中，当肿瘤部位被完全去除时，可能会出现并发症。在化学疗法中，由于脑血屏障(brain-blood barrier)而需要注射高浓度抗癌药，因此会严重损伤其它器官。最近，已使用基因疗法来治疗脑肿瘤。在基因疗法中，通过使用病毒载体来引入抑制癌细胞生长的基因。因为所述病毒载体不具有向癌症靶部位选择性迁移的能力，所以对病毒载体进行表面修饰来获得这种能力。然而，将病毒载体迁移到癌症靶部位的量是有限的。
有人已揭示关于寻家效应(homing effect)(干细胞向疾病部位迁移的一种现象)的研究结果，表明干细胞可适合作为治疗脑肿瘤的传递媒介物。然而，调控干细胞运输到肿瘤的机制并不清楚。众所周知神经干细胞对一类脑肿瘤(即恶性胶质瘤)具有趋向性。基于这一理论，正在研究一种通过使用神经干细胞充当运载体来将多种基因转移到脑肿瘤部位的方法(参见S叶(Yip S)等人，癌症杂志(The Cancer J)9(3)，189-204，2003；SK金(KimSK)等人，临床癌症研究(Clin Cancer Res)12(18)，5550-5556，2006)。叶(Yip)等人发现脑肿瘤可用携带有免疫调节基因、细胞凋亡促进基因、前药转化酶、溶瘤病毒等的神经干细胞来治疗。经布朗(Brown)等人鉴定，通过将含胞嘧啶脱氨酶基因的载体注入脑中，可有效治疗脑肿瘤，其中胞嘧啶脱氨酶基因将5-氟胞嘧啶 (5-fluorocytosine，5-FC)变为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，其中5-FU是抗癌药而5-FC是5-FU的前药(参见AB布朗(BrownAB)等人，人类基因疗法(Human Gene Ther.)14(18)，1777-1785，2003)。厄特山姆(Ehtesham)等人报道了通过注射被处理成传递白细胞介素-12或肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体的神经干细胞，来减缓脑肿瘤的生长(癌症研究(Cancer Res)62，5657-5663，2002；癌症研究(CancerRes)62，7170-7174，2002)。然而，在临床实验中使用神经干细胞引起与如何取得神经干细胞有关的伦理问题，以及由同种异体移植造成的免疫排斥反应。因此，需要寻找不引起这些问题且可轻易获得的其它类型干细胞。
秋田(Akira)等人揭示了BM-MSC对脑肿瘤具有趋向性(参见癌症研究(CancerRes)65(8)，3307-3316，2005)。BM-MSC可取自患者。当通过自体移植来注射BM-MSC时，不会出现免疫排斥反应，这对于临床上使用是个优点。研究中，通过颈动脉将人BM-MSC注入颅骨中移植了人胶质瘤细胞系的裸小鼠。结果，仅在胶质瘤中见到人BM-MSC而在脑中相邻于胶质瘤的正常部分中未见到。另外，即使当将人BM-MSC移植到颅骨中时，人BM-MSC也向胶质瘤迁移。当将人BM-MSC用含有IFN-β基因cDNA的腺病毒载体感染并接着通过颈动脉将所得载体注入裸小鼠移植了胶质瘤的颅骨中时，裸小鼠的寿命增加。WO07/037653A1揭示了一种治疗癌症的组合物，其包括表达胞嘧啶脱氨酶基因的BM-MSC。然而，在这种情况下，因为BM-MSC是通过多个复杂过程获得，所以被从中取得BM-MSC的个体遭受长时间的心理和身体压力。因此，需要寻找其它类型的干细胞。
与骨髓不同，具有许多MSC的脐带血(umbilical cord blood，UCB)可从分娩过程中丢弃的脐带轻松取得。而且UCB储存产业已完善建立，因此容易找到供体。即使当使用从其它人类诱导式UCB取得的MSC时，在移植后也不会出现免疫排斥反应。据此，可获得高免疫稳定性。因而，鉴定 疾病(诸如脑肿瘤)是否可根据UCB MSC的趋向性来治疗是极其重要的。然而，所述鉴定UCB-MSC可用性的尝试尚未有人进行。本说明书中所引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。而且本说明书中所揭示的所有信息都仅用于帮助理解本发明概念的背景而不可视为现有技术。
发明内容
技术难题
最近开发的靶基因疗法使用间质干细胞(MSC)的特定迁移特征，其中将治疗基因引入MSC中且接着所得MSC迁移到疾病部位而使疾病得到治疗。为开发使用MSC趋向性的基因疗法，应完全了解调控MSC向肿瘤迁移的分子机制。然而，所述分子机制尚未确定。因此，本发明的概念是要弄清楚UCB-MSC向肿瘤细胞迁移的分子机制并且在基因疗法中使用这种分子机制。
尽管正在进行脑肿瘤是否可用神经干细胞或骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)治疗的研究，但收集神经干细胞和BM-MSC可能会产生伦理问题、免疫排斥反应以及被从中取得BM-MSC的个体的心理和身体压力。因此，本发明的概念还提供可在不发生上述这些问题的情况下获得且对脑肿瘤具有较好趋向性的干细胞。
技术解决方案
为解决这些问题，本发明的发明人进行了研究，并发现从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(UCB-MSC)对脑肿瘤细胞具有趋向性，并且UCB-MSC的迁移能力比从骨髓分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(BM-MSC)强。本发明人提供了使用UCB-MSC治疗脑肿瘤的治疗性应用。
本发明的发明人还发现UCB-MSC的趋向性受白细胞介素-8(IL-8)或GRO-α所影响。根据这一发现，本发明的发明人提供一种将治疗基因或其 产物传递到表达IL-8或GRO-α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞的方法，以及其治疗性应用。
有益效果
本发明组合物中的脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)对表达IL-8或GRO-α且因此诱导UCB-MSC趋向性的细胞或对脑肿瘤细胞具有选择性趋向性。UCB-MSC的趋向能力优于其它干细胞且因此治疗基因或其产物会比使用其它常规干细胞时得到更有效传递。因此，本发明的包括UCB-MSC的医药组合物或试剂盒可用于诊断、预防以及治疗与表达白细胞介素(IL)-8或GRO-α的细胞有关的疾病或脑肿瘤。
发明模式
本发明的发明人研究了对肿瘤具有有效趋向性的多种干细胞，且意外地发现脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)对脑肿瘤具有强趋向性，特别是对脑肿瘤的趋向性比骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)强，这是以前从不知道的。本发明人还发现白细胞介素(IL)-8或GRO-α与UCB-MSC的趋向性有关。
本发明人将UCB-MSC与代表性肿瘤细胞系共培养以鉴定UCB-MSC的趋向性特征以及与那些肿瘤细胞系有关的细胞因子。具体来说，将UCB-MSC与选自以下的一种细胞系在穿膜(transwell)小室中共培养以测量UCB-MSC的迁移率(mobility)：人脑肿瘤细胞系，诸如U-87MG、LN18、U138或U251细胞；人直肠癌细胞系，诸如LS-174T；人B淋巴细胞，诸如NC37；小鼠纤维母细胞(NIH3T3)；胃癌细胞系，诸如KATO III；肺癌细胞系，诸如A549；以及肝癌细胞系，诸如PLC/PRF5。结果发现，UCB-MSC对脑肿瘤细胞U-87 MG、LN18、U138以及U251细胞具有强趋向性(参见图3A、图3B和图4A至图4D)。对于不包含U-87MG细胞且是通过培养U-87MG所获得的条件培养基，UCB-MSC也具有趋向性(参见图4A至图4D)。
还将UCB-MSC对一种脑肿瘤细胞系的趋向性与目前用作干细胞源的 BM-MSC作比较。结果发现UCB-MSC对这种脑肿瘤细胞系的趋向性比BM-MSC强(图5)。而且在多种癌细胞系中，UCB-MSC对于脑肿瘤细胞系的趋化指数最大(图6)。UCB-MSC除了比BM-MSC可更易获得且免疫稳定性更高外，所述对脑肿瘤细胞的高趋化指数是UCB-MSC的另一个优点，这证明UCB-MSC是极适合于脑肿瘤基因疗法的媒介物，因为治疗基因可被有效地转移到脑肿瘤的内部或相邻部分。
在穿膜(transwell)小室中UCB-MSC的趋向性可能通过产生后分泌在两种细胞共培养物中的细胞因子来驱动。由此，将两种细胞在穿膜(transwell)小室中共培养以制备培养基且接着使用细胞因子阵列分析这种培养基。结果经鉴定，在UCB-MSC与U87 MG被共培养过的培养基中分泌出高含量的细胞因子(诸如IL-8或GRO-α)(参见图7)。因此，很有可能这些细胞因子可驱动UCB-MSC的趋向性。
本发明的发明人单独培养UCB-MSC，单独培养U-87 MG，且共培养UCB-MSC与U-87MG，并接着使用RT-PCR分析这些细胞的IL-8 mRNA含量。结果，UCB-MSC在U-87 MG细胞存在或不存在下都不表达IL-8。然而，U-87MG在UCB-MSC存在和不存在下都组成性表达IL-8(参见图8)。用IL-8处理UCB-MSC与未经处理的细胞相比，显著增强其迁移(参见图9A)。然而，当将UCB-MSC与抗CXC趋化因子受体1(CXC chemokine receptor 1，CXCR1)抗体(针对IL-8受体的抗体)一起预培育且对UCB-MSC施用重组IL-8时，通过抗CXCR1处理，UCB-MSC的IL-8介导性迁移以剂量依赖性方式减少(图9B)。抗CXC趋化因子受体2(CXC chemokine receptor2，CXCR2)处理也显示相同作用。类似地，与未经处理的UCB-MSC相比，GRO-α处理也增强UCB-MSC迁移(图9C)。相比之下，在用MCP-1处理的培养物中UCB-MSC迁移无显著差异(图9D)。这一数据表明IL-8和GRO-α参与UCB-MSC向U-87 MG细胞的迁移。
测量了由各种癌细胞分泌的IL-8浓度与UCB-MSC迁移之间的关系。 结果，迁移最高浓度UCB-MSC的U-87 MG显示最高的IL-8产量(图10A)。本发明人还测量了多种胶质瘤细胞的IL-8分泌水平。作为UCB-MSC趋向性靶细胞的所有受测试的胶质瘤细胞系也都显示IL-8高分泌水平(图10B)。这一数据表明UCB-MSC对分泌IL-8的细胞具有强迁移吸引力。为了对此进行鉴定，人为地使IL-8在A549(是低IL-8表达水平的人肺癌细胞)中过表达且接着将过表达IL-8的A549与UCB-MSC共培养。结果发现尽管UCB-MSC对A549具有弱迁移吸引力，但UCB-MSC对过表达IL-8的A549具有强迁移吸引力。因而，IL-8可能是UCB-MSC的强诱导剂(参见图10C)。
本发明的发明人比较了BM-MSC与UCB-MSC关于U-87MG细胞或IL-8的迁移特征。结果发现UCB-MSC向U-87MG细胞或IL-8的迁移比BM-MSC强。UCB-MSC迁移回应IL-8处理而急剧增强，但BM-MSC迁移回应IL-8处理而较弱(参见图11A及图11B)。
通过测量mRNA和蛋白质比较了CXC趋化因子受体1(CXCR1)与CXC趋化因子受体2(CXCR2)在UCB-MSC和BM-MSC中的表达水平(参见图12A至图12D)。使用从UCB-MSC和BM-MSC分离来的总RNA的RT-PCR分析揭露，CXCR1与CXCR2的PCR产物在UCB-MSC中的强度都高于在BM-MSC中。关于CXCR1和CXCR2的蛋白质表达，CXCR1与CXCR2在UCB-MSC和BM-MSC中都高度表达。因为IL-8对CXCR1和CXCR2具有高亲和力，所以UCB-MSC向U-87 MG的迁移增加可能归因于CXCR1和CXCR2的表达上调。
本发明的发明人进行了将编码绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的基因引入UCB-MSC中的实验。结果发现GFP被成功引入并表达(参见图13)。还发现过表达GFP编码基因的UCB-MSC也对U87 MG具有趋向性(参见图14)。所述结果表明引入了基因或其产物的UCB-MSC可被转移到分泌IL-8或GRO-α的细胞。
根据上述结果，本发明涉及一种通过使用UCB-MSC将基因或其产物转 移到表达IL-8或GRO-α的细胞的方法。本发明还涉及含有UCB-MSC的治疗组合物，其用于将治疗或标记基因或其产物转移到表达IL-8或GRO-α且驱动UCB-MSC趋向性的细胞。本发明还涉及使用UCB-MSC的治疗性医药组合物、试剂盒、预防或治疗脑肿瘤的用途，以及脑肿瘤治疗方法。本发明还涉及使用UCB-MSC的组合物、诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的试剂盒，以及脑肿瘤的诊断方法或脑肿瘤治疗进展的监测方法。
具体来说，本发明的概念涉及：
[1]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC；
[2]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中所述UCB-MSC充当脑肿瘤基因疗法的载体；
[3]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中；
[4]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因；
[5]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述肿瘤抑制基因可选自由以下组成的群组：磷酸酶以及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)的基因、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(marray serine proteinase inhibitor，Maspin)的基因、RUNX3的基因、小窝蛋白-1(Caveolin-1)的基因、nm23的基因、Rb蛋白的基因、Brush-1的基因、肿瘤生长抑制剂(ING-4)的基因、存活素的基因、X染色体连锁细胞凋亡抑制蛋白(X chromosome linked inhibitor apoptosis protein，XIAP)的基因、神经细胞凋亡抑制蛋白(neural apoptosis inhibitory protein，NAIP)的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；
[6]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述细胞凋亡诱导因子基因可选自由以下组成的群组：细胞因子的基因、白细胞介素的基因、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)的基因、干扰素(INF-α、INF-β、INF-γ)的基因、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)的基因、p53的基因、细胞凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)的基因、肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)的基因、卡斯蛋白酶(Caspase)的基因、Bax的基因、Bad的基因、Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associateddeath domain protein，FADD)的基因、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的基因、p38激酶的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；
[7]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述细胞周期调节基因可选自由以下组成的群组：cdc2的基因、细胞周期蛋白(Cyclin)(细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E)的基因、cdc25C的基因、p21WAF的基因、p16INK4的基因、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin depent kinase，CDK)(CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)的基因、Rb蛋白的基因、E2F的基因、其反义物或SiRNA以及调控这些基因的蛋白质的基因；
[8]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述血管生成抑制剂基因可选自由以下组成的群组：凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1)的基因、内皮抑素(endostatin)的基因、肿瘤抑素(tumstatin)的基因、血管能抑素(canstatin)的基因、内皮生长抑制蛋白(vastatin)的基因、细胞静息因子(restin)的基因、血管内皮生长抑制剂的基因、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)的基因、血管生成素的基因、16-kd促乳素片段的基因以及基底膜蛋白多糖片段(endorepellin)的基因；
[9]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将前药转化酶基因引入所述UCB-MSC中；
[10]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将前药转化酶基因引入所述UCB-MSC中，其中所述前药转化酶基因是选自胞嘧啶脱氨酶以及CYP2B1基因；
[11]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将与脑肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中；
[12]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将与脑肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中，其中所述与脑肿瘤有关的基因可选自由以下组成的群组：Ras家族的基因、c-myc的基因、abl的基因、erbB-1的基因、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor-Receptor，EGF-R)的基因、Bax的基因、Apaf-1相互作用蛋白(Apaf-1 interacting protein，APIP)的基因、Wnt-1诱导分泌蛋白1(Wnt-1-induced secreted protein 1，WISP-1)的基因、Wnt的基因、Raf-1的基因、Src的基因、Akt的基因、Erk-1，2的基因以 及BcL-2的基因；
[13]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中；
[14]一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中，其中所述溶瘤病毒是选自单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus)以及呼肠孤病毒3型(Reovirustype 3)；
[15]上述预防或治疗脑肿瘤的医药组合物中的任一种，其中所述脑肿瘤是选自由以下组成的群组：星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症；
[16]一种诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC；
[17]一种诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记；
[18]一种诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记，其中所述可检测标记是选自含荧光素酶的酶基荧光检测剂以及Tat肽衍生的磁性纳米粒子；
[19]诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物中的任一种，其中所述脑肿瘤是选自由以下组成的群组：星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、 室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症；
[20]一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含：具有前药转化酶基因的表达载体；UCB-MSC；以及抗癌药的前药；
[21]一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含：具有前药转化酶基因的表达载体；UCB-MSC；以及抗癌药的前药，其中所述前药转化酶基因是选自胞嘧啶脱氨酶基因以及CYP2B1基因；
[22]一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含：具有前药转化酶基因的表达载体；UCB-MSC；以及抗癌药的前药，其中所述前药转化酶基因是选自胞嘧啶脱氨酶基因以及CYP2B1基因，其中所述UCB-MSC经所述具有前药转化酶基因的表达载体转染；
[23]上述套组中的任一种，其中所述脑肿瘤是选自由以下组成的群组：星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症；
[24]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性；
[25]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且 诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中所述UCB-MSC充当基因疗法的载体；
[26]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中；
[27]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组；
[28]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述肿瘤抑制基因可选自由以下组成的群组：磷酸酶以及张力蛋白同源物(PTEN)的基因、Maspin的基因、RUNX3的基因、小窝蛋白-1的基因、nm23的基因、Rb蛋白的基因、Brush-1的基因、肿瘤生长抑制剂(ING-4)的基因、存活素的基因、X染色体连锁细胞凋亡抑制蛋白(XIAP)的基因、神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；
[29]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述细胞凋亡诱导因子基因可选自由以下组成的群组：细胞因子的基因、白细胞介素的基因、肿瘤坏死因子(TNF)的基因、干扰素(INF-α、INF-β、INF-γ) 的基因、集落刺激因子(CSF)的基因、p53的基因、Apaf-1的基因、TRAIL的基因、卡斯蛋白酶的基因、Bax的基因、Bad的基因、FADD的基因、JNK的基因、p38激酶的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；
[30]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述细胞周期调节基因可选自由以下组成的群组：cdc2的基因、细胞周期蛋白(细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E)的基因、cdc25C的基因、p21WAF的基因、p16INK4的基因、CDK(CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)的基因、Rb蛋白的基因、E2F的基因、其反义物或SiRNA以及调控这些基因的蛋白质的基因；
[31]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述血管生成抑制剂基因可选自由以下组成的群组：凝血栓蛋白-1的基因、内皮抑素的基因、肿瘤抑素的基因、血管能抑素的基因、内皮生长抑制蛋白的基因、细胞静息因子的基因、血管内皮生长抑制剂的基因、maspin的基因、血管生成素的基因、16-kd促乳素片段的基因以及endorepellin的基因；
[32]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将前药转化酶基因引入所述UCB-MSC中；
[33]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中 所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将前药转化酶基因引入所述UCB-MSC中，其中所述前药转化酶基因是选自由胞嘧啶脱氨酶基因以及CYP2B1基因组成的群组；
[34]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将与肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中；
[35]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将与肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中，其中所述与肿瘤有关的基因可选自由以下组成的群组：Ras家族的基因、c-myc的基因、abl的基因、erbB-1的基因、EGF-R的基因、Bax的基因、APIP的基因、WISP-1的基因、Wnt的基因、Raf-1的基因、Src的基因、Akt的基因、Erk-1，2的基因以及BcL-2的基因；
[36]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中；
[37]一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中，其中所述溶瘤病毒是选自由单纯疱疹病毒以及呼肠孤病毒3型组成的群组；
[38]一种诊断在包含细胞的某部位发生的疾病或监测所述疾病的治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性；
[39]一种诊断在包含细胞的某部位发生的疾病或监测所述疾病的治 疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记；以及
[40]一种诊断在包含细胞的某部位发生的疾病或监测所述疾病的治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记，其中所述可检测标记可选自由含荧光素酶的酶基荧光检测剂以及Tat肽衍生的磁性纳米粒子组成的群组。
附图说明
图1是说明收集间质干细胞(MSC)的方法的图。
图2是用于共培养脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)以及本发明各种细胞系的穿膜(transwell)小室的示意图。
图3A及图3B是当将置于穿膜(transwell)小室的上室中的标记PKH的UCB-MSC与各置于穿膜(transwell)小室的下室中的U87-MG、LS174-T、NC-37以及NIH3T3细胞共培养时，向穿膜(transwell)小室的下室迁移的UCB-MSC数目的图，其中：在图3A中，左柱表示穿膜(transwell)小室的下室中细胞系的细胞数目是1×105个细胞的情况而右柱表示穿膜(transwell)小室的下室中细胞系的细胞数目是5×105个细胞的情况，且在两种情况下，UCB-MSC的数目都是1×105个细胞，且在图3B中，左荧光显微图像显示当仅使用无人细胞系的培养基(对照组)时，标记PKH26的UCB-MSC向穿膜(transwell)小室的下室的迁移，而右荧光显微图像显示当将UCB-MSC与U87-MG细胞共培养时，标记PKH26的UCB-MSC向穿膜(transwell)小室的下室的迁移。
图4A至图4D是当将置于穿膜(transwell)小室的上室中的标记PKH的UCB-MSC与各置于穿膜(transwell)小室的下室中的U87-MG、KATO III、 A549、PLC/PRF5、LN18、U138以及U251细胞共培养时，向穿膜(transwell)小室的下室迁移的UCB-MSC数目的图(图4A和图4C)，其中图4B是标记PKH26的UCB-MSC向下室迁移的荧光显微图像，而图4D是当将UCB-MSC与U-87 MG细胞或与无U87 MG细胞培养的条件培养基共培养时，所迁移的UCB-MSC数目的图，所述条件培养基是通过在培养基中培养U87 MG细胞并接着从培养基去除U87 MG细胞而制得。
图5是比较BM-MSC和UCB-MSC对于U-87MG细胞的趋向性的图，其中将各置于穿膜(transwell)小室的上室中的标记PKH的UCB-MSC和标记PKH的BM-MSC与置于穿膜(transwell)小室的下室中的U-87MG细胞共培养且将向下室迁移的标记PKH的UCB-MSC数目与标记PKH的BM-MSC数目作比较，其中左柱表示不存在U-87MG细胞的情况而右柱表示存在U-87MG细胞的情况(U-87MG细胞的数目是5×105个，且在两种情况下，MSC的数目都是1×105个)。
图6是当将UCB-MSC与癌细胞系(A549、海拉(HeLa)以及U-87MG细胞)共培养时，UCB-MSC趋化指数的图。
图7绘示在将NC37、LS174-T以及U-87MG细胞各与UCB-MSC共培养后用细胞因子阵列分析细胞溶解液和细胞培养物上清液所获得的结果。
图8绘示通过收集单独培养UCB-MSC、单独培养U-87 MG细胞以及共培养UCB-MSC与U-87 MG细胞两者的条件培养基，在阵列膜上培育所述条件培养基，并接着用ECL试剂观察培育结果所获得的分析结果，其中A绘示使用UCB-MSC的条件培养基和培养基对照组的细胞因子抗体阵列分析结果，B绘示使用仅培养U-87 MG的条件培养基时以及使用共培养UCB-MSC与U-87 MG的培养基时的分析结果，且C绘示在U-87 MG细胞存在或不存在下培养的UCB-MSC(左)以及在UCB-MSC存在或不存在下培养的U-87 MG细胞的mRNA分离结果，其中用IL-8特异性引物进行RP-PCT且使用GAPDH作为对照。
图9A至图9D是鉴定在参考图8所分析的细胞因子之中IL-8和GRO- α对MSC迁移的作用的图，其中图9A是当用0、1、10以及100纳克的重组IL-8蛋白处理MSC 24小时时细胞向下室迁移的图，图9B是当用0.02、0.2以及2微克CXC趋化因子受体1(CXCR1)抗体(称为细胞中IL-8的受体)预处理UCB-MSC并接着用50纳克IL-8处理以促进MSC迁移时细胞向下室迁移的图。(*，p＝0.007；**，p＜0.001)，图9C是当用GRO-α(*，p＜0.005)处理UCB-MSC时细胞向下室迁移的图，且图9D是当用单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)处理MSC时细胞迁移的图。
图10A至图10D由图10A、图10B、图10C以及图10D组成，其中图10A和图10B是通过ELISA所测量，使用U-87MG、KATO III、A549、PLC/PRF5、LN18、U138以及U251细胞的培养后培养基中所分泌的IL-8量的图，图10C是当将IL-8基因引入分泌低含量IL-8的A549细胞中并过表达时细胞迁移的图，且图10D是通过ELISA所测量，处于图10C条件下的培养基中所分泌的IL-8量的图。
图11A及图11B是比较UCB-MSC和BM-MSC对于U-87 MG细胞的趋向性的图，其中图11A是就U-87 MG细胞来比较UCB-MSC和BM-MSC向下室移动的趋向性的图，且图11B是当用IL-8处理UCB-MSC和BM-MSC 14小时时比较UCB-MSC和BM-MSC的趋向性的图。
图12A至图12D绘示通过测量mRNA和蛋白质来比较CXC趋化因子受体1与CXC趋化因子受体2(CXCR1与CXCR2)(称为IL-8受体)在UCB-MSC和BM-MSC中的表达水平的分析结果，其中图12A绘示当从UCB-MSC和BM-MSC各分离mRNA且在UCB-MSC和BM-MSC中用CXCR1和CXCR2引物进行RT-PCR时的分析结果，其中参考与各样品反应的GAPDH来定量所分离的RNA，图12B是通过用光密度计测量从图12A获得的各凝胶的mRNA条带密度所得的CKCR1和CXCR2表达水平的图(*和**，p＜0.001；n＝4)，图12C绘示通过抗CXCR1和抗CXR2抗体执行免疫染色法(×400)所得的CXCR1和CKCR2在UCB-MSC和BM-MSC中的蛋白质表达水平的分析结果，且图12D绘示通过仅用二次抗体来代替抗CXCR1和抗CXCR2抗体对UCB-MSC和BM-MSC进行免疫染色以鉴定抗CXCR1和抗CXCR2抗体的抗原特异性所获得的分析结果。
图13是被引入且过表达编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因的UCB-MSC的荧光显微图像。
图14绘示编码GFP的基因和空基因各在UCB-MSC中过表达的实验结果。将所述UCB-MSC置于穿膜(transwell)的上室中而将U-87MG细胞置于穿膜(transwell)的下室中且共培养24小时，并接着鉴定向下室迁移的UCB-MSC。
图15绘示本发明实例中所使用的引物序列。
具体实施方式
下文将详细描述本发明。
在本说明书中，术语“脐血”是指取自所有哺乳动物(包含人类)中连接胎盘与胎儿的脐静脉的血液。
在本说明书中，术语“脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)”是指从哺乳动物(优选为人类)的脐血分离并培养的MSC。
在本说明书中，术语“治疗”是指：预防尚未诊断出疾病但易患疾病的动物(优选为哺乳动物且更优选为人类)的疾病或病症形成；抑制疾病进展；以及减轻疾病。
在本说明书中，术语“脑肿瘤”是指在脑和脊髓中形成的恶性或良性肿瘤以及在胶质细胞和非胶质细胞中形成的各种肿瘤。在此，脑肿瘤可为原发性脑肿瘤或继发性脑肿瘤。
同时，本说明书中未定义的术语可具有业界通常所定义的含义。
为从UCB分离包含MSC的单核细胞，可使用任何已知方法，诸如由本申请的申请人所申请并登记过的韩国登记专利第489248号中所揭示的方法。举例来说，分离方法可为葡聚糖-泛影葡胺密度梯度法 (ficoll-Hypaque density gradient method)，但不限于此。具体来说，将在分娩后且在分离胎盘前取自脐静脉的UCB以葡聚糖-泛影葡胺梯度离心来获得单核细胞，且接着洗涤单核细胞数次去除其中的杂质。所得单核细胞可直接用于MSC分离或培养，或长时间低温保存。
可从UCB分离MSC并使用任何已知方法培养(参见MF皮滕杰(Pittinger MF)等人，科学(Science)，284：143-7，1999；以及HM拉扎罗丝(Lazarus HM)等人，骨髓移植(BoneMarrow Transplant)，16：557-64，1995)，诸如韩国公开专利第2003-0069115号中所揭示的方法。
首先，例如以葡聚糖-泛影葡胺梯度离心所分离的UCB，以分离包含造血细胞和MSC的单核细胞，且接着洗涤单核细胞数次去除其中的杂质。接着，将单核细胞以适当浓度接种于培养皿中，使细胞以单层形式生长。用相差显微镜鉴定这些细胞。在相差显微图像中，一群具有均匀纺锤形的细胞就是MSC。接着，在培养细胞和生长时，进行细胞传代培养随后繁殖直到细胞数目达到所需数目。
本发明组合物中所包含的UCB-MSC可以使用已知方法低温保存(参见坎波斯(Campos)等人，低温生物学(Cryobiology)35：921-924，1995)。用于低温保存法的培养基可包含10～20％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)以及10％二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。将细胞悬浮于所述培养基中直到细胞浓度为每1毫升培养基约1×106到5×106个细胞。
将细胞悬浮液分份并将每一份加载于用于低温保存的玻璃或塑料安瓿中，接着密封样品并装载于控制温度的程序冷冻器中。可使用提供-1℃/分钟的温度变化的冷冻程序冷冻细胞，以致当解冻冷冻的细胞时可减少对细胞的损伤。当样品温度达到-90℃或更低时，将样品移到温度为-150℃或更低的液氮贮槽中。
当解冻冷冻的细胞时，将样品从所述液氮贮槽快速移到温度控制在37℃的水浴中。安瓿中解冻的内容物立即移到含有处于稳定条件下的培养基 的培养皿中。
根据本发明，用于分离和培养MSC的培养基可为含有10％到30％FBS的细胞培养基。所述细胞培养基可为业界通常所用的任何细胞培养基。细胞培养基的实例包含杜尔贝可改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modifiedEagle′s medium，DMEM)培养基、最低必需培养基(Minimum EssentialMedium，MEM)培养基、α-MEM培养基、McCoys 5A培养基、伊格尔氏基础培养基(eagle′s basal medium)、化学定性基础培养基(ChemicallyDefined BasalMedium，CMRL)培养基、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgowminimum necessarily medium)、(汉姆氏(Ham′s))F-12培养基、伊思考夫改良杜尔贝可培养基(iscove′s modifiedDulbecco′s medium，IMDM)、(莱博维茨氏(Liebovitz′))L-15培养基以及RPMI 1640培养基。举例来说，细胞培养基可为DMEM培养基。在培养期间，可将细胞悬浮以致细胞浓度为每1毫升培养基约5×103到2×104个细胞。
需要时，细胞培养基也可进一步包含一种或多种添加剂。添加剂可包含至少一种选自由以下组成的群组的物质：胎牛、胎马或人类胎儿的血清；防止微生物污染的青霉素G(penicillin G)；抗生素，诸如硫酸链霉素(streptomycin sulfate)或庆大霉素(gentamycin)；抗真菌剂，诸如两性霉素B(amphotericin B)或制霉菌素(nystatin)；以及至少两种选自上述的物质的混合物。
根据本发明，UCB-MSC可经遗传工程改造以转移实质上抑制脑肿瘤细胞生长的治疗性药物。又根据本发明，UCB-MSC可经遗传工程改造以将治疗基因或其产物转移到分泌IL-8或GRO-α的细胞。在此，术语“抑制”是指抑制细胞增殖和生长，而且包括坏死和凋亡。所述治疗基因可例如为抗肿瘤基因、使前药转化为药物的酶的基因、与肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA，或溶瘤病毒(参见S叶(Yip S)等人，癌症杂志(The CancerJ.)9(3)，189-204，2003)。所述抗肿瘤基因可为肿瘤抑制基因、细胞 凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因或血管生成抑制剂基因。具体来说，肿瘤抑制基因可选自由以下组成的群组：磷酸酶以及张力蛋白同源物(PTEN)的基因、Maspin的基因、RUNX3的基因、小窝蛋白-1的基因、nm23的基因、Rb蛋白的基因、Brush-1的基因、肿瘤生长抑制剂(ING-4)的基因、存活素的基因、X染色体连锁细胞凋亡抑制蛋白(XIAP)的基因、神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因。肿瘤抑制基因并不限于上述那些基因。细胞凋亡诱导因子基因可选自由以下组成的群组：细胞因子的基因、白细胞介素的基因、肿瘤坏死因子(TNF)的基因、干扰素(INF-α、INF-β、INF-γ)的基因、集落刺激因子(CSF)的基因、p53的基因、Apaf-1的基因、TRAIL的基因、卡斯蛋白酶的基因、Bax的基因、Bad的基因、FADD的基因、JNK的基因、p38激酶的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因。细胞凋亡诱导因子基因并不限于上述那些基因。细胞周期调节基因可选自由以下组成的群组：cdc2的基因、细胞周期蛋白(细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E)的基因、cdc25C的基因、p21WAF的基因、p16INK4的基因、CDK(CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)的基因、Rb蛋白的基因、E2F的基因。细胞周期调节基因并不限于上述那些基因。血管生成抑制剂基因可选自由以下组成的群组：凝血栓蛋白-1的基因、内皮抑素的基因、肿瘤抑素的基因、血管能抑素的基因、内皮生长抑制蛋白的基因、细胞静息因子的基因、血管内皮生长抑制剂的基因、maspin的基因、血管生成素的基因、16-kd促乳素片段的基因以及Endorepellin的基因。血管生成抑制剂基因并不限于上述那些基因。使前药转化为药物的酶的基因可为使5-FC转化为5-FU(是抗癌药)的胞嘧啶脱氨酶，或参与生物活化环磷酰胺和异环磷酰胺(ifosfamide)(是抗癌药)的CYP2B1基因，其中5-FC是5-FU的前药。使前药转化为药物的酶的基因并不限于上述这些物质。与肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA可为(但不限于)Ras家族的基因、c-myc的基因、abl的基因、erbB-1的基因、 EGF-R的基因、Bax的基因、APIP的基因、WISP-1的基因、Wnt的基因、Raf-1的基因、Src的基因、Akt的基因、Erk-1，2的基因以及BcL-2的基因的反义物或SiRNA。
可由UCB-MSC运载的溶瘤病毒可为单纯疱疹病毒或呼肠孤病毒3型，但不限于此。
在可表达状态下引入所需基因的UCB-MSC可适当地使用业界已知的技术来制造。举例来说，制备包含待引入基因的载体(参见H德里(DehariH)等人，癌症基因疗法(CancerGene Ther.)，10，75-85，2003；WO07/037653)且接着可离体(ex vivo)将载体转导于原代培养MSC中。在此，载体的实例包含腺病毒载体、反转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、SV40载体、多瘤病毒载体、乳头状瘤病毒载体、微小核糖核酸病毒载体、牛痘病毒载体以及慢病毒载体。举例来说，可使用由H津田(Tsuda H)等人开发的方法(分子疗法(MolTher)2003，7，354-365)。具体来说，可在感染腺病毒基因前一天，将MSC(5×105个细胞)接种于培养皿中。接着将MSC和包含引入有腺病毒基因的腺病毒载体的溶液于37℃在5％CO2恒温箱中培育1小时，以致MSC感染上腺病毒基因。接着用磷酸缓冲溶液洗涤被感染的MSC，随后对其施用常规培养基。或者，不使用病毒载体，可通过使用裸DNA和选自磷酸钙法、阳离子脂质体法以及电穿孔法的任何方法将所需基因引入UCB-MSC中。或者，可使用包含蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)与抗肿瘤蛋白的融合蛋白基因的载体将所述融合蛋白基因引入UCB-MSC中(参见SP吴(WuSP)等人生物化学与生物物理研究通讯(BiochemBiophys Res Commun.)346(1)，1-6，2006)。
载体可进一步包含用于其它历史检查的基因标记。所述基因标记可例如为编码发色或荧光蛋白(诸如lacZ或绿色荧光蛋白(GFP))的基因，但不限于此(参见S叶(Yip S)等人，癌症杂志(The Cancer J.)9(3)， 189-204，2003)。
可使用本发明医药组合物诊断、预防以及治疗的脑肿瘤可为原发性脑肿瘤或继发性脑肿瘤。可使用本发明组合物诊断、预防以及治疗的脑肿瘤实例包含星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症。然而，可使用本发明组合物诊断、预防以及治疗的脑肿瘤并不限于上述这些肿瘤。
本发明医药组合物可与任何已知抗癌药一起投药。
因为UCB-MSC不表达人白细胞抗原DR(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)(II型主要组织相容性复合体，Major HistocompatibilityComplex class II)(这是移植组织或器官时产生免疫排斥反应的主要原因)(参见KC勒布朗(Le Blanc，KC)，实验血液学(ExpHematol)，31：890-896，2003；以及WT谢(Tse WT)等人，移植(Transplantation)，75：389-397，2003)，所以不发生免疫反应(诸如排斥反应)(这是主要移植问题)或可减到最少。因此，本发明医药组合物中所包含的UCB-MSC除自身来源的UCB外，也可取自来源于另一个体的UCB。根据本发明，UCB-MSC可在低温保存后使用。
本发明的用于基因疗法或用于预防或治疗疾病的含UCB-MSC医药组合物除有效组分外，还可进一步包含医药学上可接受的添加剂。含UCB-MSC的医药组合物可成形为适合于身体投药的剂型。所述适合的剂型可为非口服剂型，诸如可注射剂型或可局部投药剂型。举例来说，包含水或医药学上可接受的溶剂的已灭菌溶液或悬浮液可以可注射形式非口服投药。具体来说，将水或医药学上可接受的溶剂与医药学上可接受的载剂或介质适当 组合，从而形成呈通常可接受的单位剂量的可注射剂型。医药学上可接受的载剂或介质的实例可包含无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、媒剂、防腐剂、粘合剂等。
上述可注射剂型可通过使用常规方法来非口服投药，具体来说直接投药到疾病部位。或者，上述可注射剂型可经由向疾病部位供血的脑脊髓液、静脉或动脉来投药，优选直接投药到脑或脊髓中疾病部位的相邻部分或其相对部分。举例来说，所述可注射剂型可使用由匹兹堡(Pittsburgh)的道格拉斯·孔德兹卡(Douglas Kondziolka)(1998)开发的临床方法来投药。即，将待投药的个体颅骨切开直径约1厘米的豌豆大小，且接着向其中注入与汉可氏平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS))混合的MSC溶液。在此，使用包含长针的注射器和将MSC溶液精确注入脑中的立体定位架(stereotactic frame)来注射MSC溶液。
UCB-MSC的每日剂量可为每千克体重1×104到1×107个细胞，优选为每千克体重5×105到5×106个细胞。每日剂量可一次性投药或分次投药进行数次治疗。然而，根据本发明，UCB-MSC的投药剂量可根据待治疗疾病的种类、待治疗疾病的严重程度、投药途径以及患者的体重、年龄和性别而变化。因此，上述投药剂量不限制本发明的范围。
本发明还提供治疗与产生IL-8或GRO-α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞有关的疾病或脑肿瘤的方法，其中所述方法包含向患者投与治疗有效量的本发明医药组合物。在此，医药组合物中所包含的UCB-MSC可取自患者自身或用于医学目的的其它人或动物的UCB。在此，UCB-MSC可在低温保存后使用。所述使用UCB-MSC的方法并不限于人类，且可应用于其它哺乳动物。
本发明还提供诊断与产生IL-8或GRO-α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞有关的疾病或脑肿瘤的方法，以及用于进行所述方法的试剂盒，其中所述方法使用UCB-MSC。在这种方法中，UCB-MSC可标记有可检测标记。标 记有可检测标记的UCB-MSC可通过现有技术观察，且可在活动物体内实时追踪。所述可检测标记可为含荧光素酶的酶基荧光检测剂或Tat肽衍生的磁性纳米粒子(S叶(Yip S)等人，癌症杂志(The Cancer J.)9(3)，189-204，2003)。如果使用表达荧光素酶的干细胞，那么所投与干细胞向疾病部位的迁移可通过实时鉴定生物发光来追踪，且因此可诊断出疾病并可鉴定疾病部位(参见R维斯勒德尔(Weissleder R)等人，自然·医学(Nat Med)9，123-128，2003)。使用由卢因(Lewin)等人开发的方法(参见自然·生物技术(Nat Biotech)18，410-414，2000)将Tat肽衍生的磁性纳米粒子与UCB-MSC连接且接着体内投药。所投与的UCB-MSC可通过磁共振成像(magnetic resonanceimaging，MRI)来追踪。因此，标记有标记的UCB-MSC可体内投药且接着可通过鉴定UCB-MSC聚集的位置来鉴定肿瘤以及肿瘤部位。另外，标记有标记的UCB-MSC还可在脑肿瘤治疗期间或在脑肿瘤治疗之后投药，以鉴定所投与UCB-MSC的分布位置与尺寸。即，还可监测脑肿瘤治疗的进展。因此，本发明还提供监测脑肿瘤治疗进展的方法和用于进行所述方法的试剂盒，其中所述方法使用UCB-MSC。所述监测方法和用于进行所述方法的所述试剂盒还可应用于与产生IL-8或GRO-α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞有关的疾病。
应注意本说明书中所提及的现有技术都以全文引用的方式并入本文中。
将参考以下实例来更详细地描述本发明。这些实例仅用于说明目的而不欲限制本发明概念的范围。
实例
从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)购得U-87MG、A549、KATO III、PLC/PRF5、LN18、U138以及U251细胞系并用于本发明实验中。在37℃下在5％CO2恒温箱中将A549、KATOIII以及PLC/PRF5细胞培养于含有10-20％(v/v)FBS(美国犹他州洛根市的 海克隆公司(HyClone，Logan，UT，US))和庆大霉素的RPMI中。使U-87MG细胞、LN18、U138以及U251细胞生长于含有10-20％(v/v)FBS的伊格尔最低必需培养基(MEM)中。骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)购自龙沙公司(LONZA)。将BM-MSC和所建立的UCB-MSC培养于含有10-20％FBS的α-MEM培养基中。
<实例1>制备脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)
在得到母亲同意后，从分娩的脐静脉收集UCB样品。具体来说，将含有44毫升CPDA-1抗凝剂的UCB收集袋(韩国京畿道龙仁市的绿十字公司(Greencross Co.，Yongin，Kyungki-do，Korea)的16号针插入脐静脉中且自流收集UCB。所有情况下，在收集48小时内处理UCB收集物，成活率(viability)是90％或更多。
<实例2>分离和扩增UCB-MSC
以葡聚糖-泛影葡胺梯度(由西格马公司(Sigma Co.)制造，密度：1.077克/毫升)离心根据实例1制备的UCB-MSC，且接着洗涤数次去除杂质。向所得产物加入含有10到20％FBS(海克隆公司(HyClone Co.))的基础培养基(α-MEM，吉布科BRL公司(Gibco BRL Co.))使UCB-MSC悬浮。使UCB-MSC以适合的浓度分配于各含有10到20％FBS的基础培养基中，且接着在37℃下在5％CO2恒温箱中培养，同时一周内更换培养基两次(图1)。当培养的细胞形成单层时，用相差显微镜鉴定以纺锤形扩增的MSC。接着，重复进行传代培养直到MSC充分扩增。
<实例3>制备标记有PKH-26的UCB-MSC
使用参考文献中所揭示的方法，用PKH-26(西格马公司(Sigma Co.))使根据实例2培养的UCB-MSC染色[DA巴雷达(Barreda DA)等人，发育与比较免疫学(Developmental andComparative Immunology)，24：395-406，2000]。首先，通过使用胰蛋白酶从细胞培养皿分离UCB-MSC，且接着用无FBS培养基洗涤2×107个细胞。使用离心机收集经洗涤的细胞 且接着悬浮于制造商所提供试剂盒中的1毫升稀释剂C中。接着将所得细胞悬浮溶液(2×)与1毫升PKH荧光染料溶液(2×)混合，随后使混合物在25℃反应5分钟。为终止标记反应，向反应产物中加入含有等体积胎牛血清(FBS)的培养基且接着使其静置1分钟。通过离心收集标记有PKH26的细胞，且接着用含有10到20％FBS的培养基洗涤三次并用于实验中。
<实例4>在穿膜(transwell)小室中共培养MSC与其它细胞系
用PKH-26(由西格马公司(Sigma)制造)使人UCB-MSC(hUCB-MSC)染色。将经染色的hUCB-MSC与其它肿瘤细胞系在培养条件下共培养于穿膜(transwell)小室(猎鹰公司(FALCON))中(MSC∶癌细胞系＝1∶5))。对照组是在如上文所述的相同条件下培养无癌细胞系的MSC。如图2中所示，用于共培养的穿膜(transwell)小室包含下室和上室，其中下室与上室靠微孔膜(8微米尺寸)分开。在上室中，培养标记PKH26的hUCB-MSC；而在下室中，培养人脑肿瘤细胞系U87-MG、人直肠癌细胞系LS174-T、人B淋巴细胞NC-37以及小鼠纤维母细胞NIH3T3中的每一个。各共培养一天、两天以及三天后，使用相差显微镜(×100)鉴定标记PKH26的UCB-MSC的迁移且对所迁移的标记PKH26的UCB-MSC进行计数(图3A及图3B)。使用肿瘤细胞系KATO III、A549、PLC/PRF5、LN18、U138以及U251进行相同实验且鉴定标记PKH26的UCB-MSC的迁移。在将通过U-87 MG细胞条件化的培养基置于下室中的情况下进行相同实验(图4A至图4D)。
即，在穿膜(transwell)小室中将标记PKH26的UCB-MSC与各种肿瘤细胞系共培养且接着对迁移到下室中的标记PKH的间质干细胞进行计数。结果发现，UCB-MSC对脑肿瘤细胞系U87-MG、LN18、U138以及U251具有强趋向性，而对其它肿瘤细胞具有弱趋向性(图3A、图3B和图4A至图4D)。在图3B中，左图像绘示添加无人细胞系的培养基来代替肿瘤细胞的对照组情况，而右图像绘示将UCB-MSC与U87-MG细胞共培养的情况。参看图3A及图3B，鉴定了许多标记PKH26的UCB-MSC的迁移。当使用无人细胞系的培养基 来代替肿瘤细胞并培养时，标记PKH26的UCB-MSC的迁移可忽略不计(参见图3B的左图像)。然而，标记PKH26的UCB-MSC对不含U-87 MG细胞、但曾在其中培养U-87 MG细胞的条件培养基具有趋向性(参见图4D)。所述结果表明条件培养基含有可将UCB-MSC吸引向U-87 MG细胞的可溶性因子。
<实例5>比较BM-MSC对U87-MG的趋向性与UCB-MSC对U87-MG的趋向性
使用穿膜(transwell)小室，将BM-MSC对U87-MG的趋向性与UCB-MSC对U87-MG的趋向性作比较。将U87-MG癌细胞或培养基置于下室中，而将BM-MSC和UCB-MSC各置于上室中。所有情况下，进行培养两天。结果发现，UCB-MSC对U87-MG的趋向性比BM-MSC强(图5)。
<实例6>比较MSC的迁移
将上室中由四位捐献者捐献的UCB-MSC与各处于下室中的A549(肺癌细胞)、海拉(HeLa)(子宫颈癌细胞)以及U87-MG(脑癌-胶质瘤细胞)共培养于穿膜(transwell)小室中。接着比较在各种情况下UCB-MSC的趋化指数(图6)。
A549、海拉以及U87-MG细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)。将A549和U87MG细胞各培养于含有10-20％牛血清的RPMI1640中，而将海拉培养于DMEM中。在各种情况下，通过将向U87MG迁移的UCB-MSC数目除以对照实验中所迁移的UCB-MSC数目来计算趋化指数。分析UCB-MSC对那些癌细胞的趋向性。结果，发现UCB-MSC对U87MG(脑肿瘤细胞系)的趋向性最强。
<实例7>细胞因子阵列
将MSC与三种人类细胞(包含U87-MG肿瘤细胞)各进行共培养，并收集培养后的培养基。使用细胞因子抗体阵列来检查培养后培养基的细胞因子概况。
从购自R&D系统公司(R&D System Co.)的细胞因子阵列试剂盒取得上面附有各种细胞因子的抗体的膜，并使其与阻断溶液反应1小时。分别将通过共培养UCB-MSC与三种人类细胞(包含U87-MG肿瘤细胞)中每一种所制得的培养基的量调节到1.5毫升或更少，并将各培养基与试剂盒中所含的细胞因子的混合抗体混合且诱导抗原-抗体反应1小时。使所供应的细胞因子抗体与所分泌的细胞因子于其中组合的培养基与经受4℃阻断12小时的所述膜反应。反应后，将膜置于洗涤液中洗涤，并接着用三重蒸馏水洗涤。接着在室温下干燥膜。重复洗涤与干燥过程两次或三次后，使膜在含有链亲合素-辣根过氧化物酶(streptavidin-HorseradishPeroxidase/HRP)的溶液中反应30分钟。接着用洗涤液洗涤膜三次，与染色剂反应，且接着在暗室中暴露于X射线胶片。
诱导UCB-MSC强趋向性的U87-MG分泌有生长相关致癌基因(GRO-α)、IL-8、MCP-1、G-CSF、GM-DSF、IL-6、IL-1β、迁移抑制因子(migrationinhibitory factor，MIF)以及丝氨酸蛋白酶抑制剂E1(serine proteaseinhibitor E1，Serpin E1)。具体来说，GRO-α和IL-8的量高于MCP-1、G-CSF、GM-DSF、IL-6、IL-1β、MIF以及Serpin E1的量。图7绘示使用细胞因子阵列分析细胞溶解液和细胞培养物上清液所获得的结果。图1绘示阵列结果和有关与对照组相比所改变斑点的信息。表1中，括号内的细胞因子是通过与肿瘤细胞共培养所产生的细胞因子。很有可能这些细胞因子可诱导UCB-MSC的趋向性。
[表1]
制备仅从UCB-MSC培养物、仅从U-87 MG细胞培养物以及两种细胞的共培养物收集的条件培养基。将各条件培养基在阵列膜上培育，且接着通过电化学发光(electrochemical luminescence，ECL)试剂观察。接着相互比较所观察的条件培养基(参见图8)。图8的A绘示通过仅培养UCS-MSC所制得的培养基和对照培养基的细胞因子抗体阵列分析结果。图8的B绘示通过仅培养U-87 MG所制得的培养基和通过共培养UCB-MSC和U-87MG所制得的培养基的细胞因子抗体阵列分析结果。
图8的C绘示通过从在有或无U-87 MG的情况下培养的UCB-MSC(左)或者从在有或无UCB-MSC的情况下培养的U-87 MG(右)分离mRNA所鉴定的结果。使用IL-8特异性引物进行RT-PCR且使用GAPDH作为对照。当通过RT-PCR测量IL-8 mRNA的含量时，发现在有或无UCB-MSC时培养US-87MG的两种情况下U-87 MG都表达IL-8。
<实例8>细胞因子对UCB-MSC迁移的作用
使用穿膜(transwell)迁移测定来测量IL-8、GRO-α、MCP-1(美国明尼苏达州的RND系统公司(RND Systems，MN，USA))对UCB-MSC迁移的作用。将标记PHK-26的UCB-MSC置于上室中而下室中不放细胞。将UCB-MSC培养于无IL-8培养基或含有不同浓度重组人类IL-8的培养基中24小时。结果，可见当用IL-8处理时比不用IL-8处理时，UCB-MSC迁移更多(图9A)。
UCB-MSC上的IL-8受体可有效地被抗人CXC趋化因子受体1(CXCR1)抗体阻断。将UCB-MSC与抗CXCR1抗体一起预培育后，再次对UCB-MSC施用重组IL-8。通过抗CXCR1处理，UCB-MSC的IL-8介导性迁移以剂量依赖性方式减少(图9B)。抗CXCR2处理也显示相同作用。
类似地，与未经处理的细胞相比，GRO-α处理也增强UCB-MSC迁移(图9C)。GRO-α也属于CC亚族且可与CXCR2受体相互作用[参见A.伍兹(WuytsA.)等人，欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)255，67-73(1998)]。相比之下，在用MCP-1处理的培养物中未发现UCB-MSC迁移的显著差异(图9D)。这些数据有力地表明IL-8和GRO-α参与了UCB-MSC向U-87MG细胞的迁移。
<实例9>UCB-MSC向过表达IL-8的A549细胞迁移
鉴定从数种癌细胞分泌的IL-8浓度与UCB-MSC向各癌细胞迁移之间的关系。图10A绘示酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)结果，其显示培养U87MG(脑肿瘤)、KATOIII(胃癌)、A549(肺癌)以及PLC/PRF5(肝癌)细胞的培养基中所分泌的IL-8的浓度。在此，测量每1×105个细胞的IL-8浓度。在所测的癌细胞系之中，U-87MG显示最高的IL-8产量。这一数据表明UCB-MSC对产生IL-8的细胞具有强迁移吸引力。另外，其它人脑肿瘤细胞，即LN18、U138以及U251细胞，也显示与U-87MG类似的IL-8浓度水平(参见图10B)。因此，可见UCB-MSC对脑肿瘤细胞所分泌的IL-8具有趋向性。
为了弄清向表达较低水平IL-8的细胞中加入IL-8是否诱导UCB-MSC迁移，使IL-8在人肺癌细胞A549中过表达。图10C绘示使用lipofectamine试剂将IL-8基因引入分泌低含量IL-8的A549细胞中且接着使IL-8过表达后UCB-MSC的迁移结果。参看图10C，在过表达IL-8的A549细胞中比在A549细胞中迁移了更多的UCB-MSC。因此，可见IL-8可 能是UCB-MSC迁移的强诱导剂。图10D绘示通过ELISA所测量，处于C条件下的培养基中所分泌的IL-8浓度。
<实例10>比较BM-MSC和UCB-MSC对于IL-8的反应
因为已知BM-MSC可在体外(in vitro)和体内(in vivo)向U-87 MG细胞迁移，所以将BM-MSC和UCB-MSC对于U-87 MG细胞的迁移特征与对于IL-8的迁移特征作比较(图11A及图11B)。图11A绘示向下室B(即向U87MG)迁移的BM-MSC和UCB-MSC的趋向性特征。图11B绘示当用IL-8处理14小时时向下室B迁移的BM-MSC和UCB-MSC的趋向性特征。参看图11A及图11B，与BM-MSC相比，迁移了更多的UCB-MSC。因此，可见UCB-MSC与IL-8强烈对应且迁移更多，但BM-MSC与IL-8的对应性相对较弱。
<实例11>IL-8受体CXCR1和CXCR2在UCB-MSC中的表达水平
通过测量IL-8受体CXCR1和CXCR2各自中的mRNA和蛋白质，来比较CXCR1和CXCR2在UCB-MSC和BM-MSC中的表达水平。图12A绘示在CXCR1和CXCR2各自中分离mRNA后使用CXCR1和CXCR2引物进行的RT-PCR的结果。各样品中包含GAPDH以评估所分离RNA的数量。图12B绘示通过使用光密度计测量从图12A获得的凝胶的各mRNA条带密度所获得的CXCR1和CXCR2表达水平结果(*和**，p＜0.001；n＝4)。从UCB-MSC和BM-MSC分离的所有RNA的RT-PCR分析结果显示，CXCR1和CXCR2的PCR产物的条带密度在UCB-MSC中比在BM-MSC中高。图12C绘示通过使用抗CXCR1和抗CXCR2抗体对UCB-MSC和BM-MSC进行免疫染色以鉴定CXCR1和CXCR2的表达水平所获得的分析结果(×400)。参看图12C，UCB-MSC和BM-MSC显示CXCR1和CXCR2的高表达水平。因为IL-8对CXCR1和CXCR2具有高亲和力，所以UCB-MSC向U-87 MG的迁移增加可能归因于CXCR1和CXCR2的表达上调。图12D绘示通过仅使用二次抗体而不使用抗CXCR1和抗CXCR2抗体对UCB-MSC和BM-MSC进行免疫染色以鉴定抗CXCR1和CXCR2抗体的抗原特异性所获得的分析结果。
<实例12>将基因引入脐带血间质干细胞中
以将基因引入UCB-MSC中的实验举例来说，使用电穿孔方法以及用由阿曼科萨生物系统公司(amaxa biosystem Co.)制造的人MSCnucleofector，使绿色荧光蛋白(GFP)过表达。将4×105个UCB-MSC细胞培养两天且接着置于5毫克GFP编码基因与100毫升人MSCnucelofector的混合物中15分钟并在电穿孔仪中引入所述基因。将所得UCB-MSC移到培养板上且24小时后用荧光显微镜鉴定GFP的表达水平。可在各MSC的细胞质中鉴定到GFP(参见图13)。
为测试被引入GFP编码基因的UCB-MSC的趋向性，使GFP编码基因和空基因各在UCB-MSC中过表达且接着鉴定所得UCB-MSC对U-87MG的趋向性。如上文所述引入基因后，将表达GFP的UCB-MSC置于穿膜(transwell)小室的上室中而将U-87 MG置于所述穿膜(transwell)小室的下室中，且接着将表达GFP的UCB-MSC与U-87 MG共培养24小时。在向下室迁移的细胞之中，鉴定到GFP阳性细胞。结果，可见由于引入GFP基因而过表达GFP的UCB-MSC对U87 MG具有强趋向性(图14)。

Claims (9)

1.一种医药组合物作为制备治疗表达白细胞介素-8的脑肿瘤细胞的药物的应用，其特征在于所述医药组合物包括从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞，其中所述从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞对白细胞介素-8具有趋向性，且其中将肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体的基因引入从脐带血分离来的所述间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的所述间质干细胞中。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于从脐带血分离来的所述间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的所述间质干细胞充当用于治疗脑肿瘤的基因疗法的载体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将前药转化酶基因引入从脐带血分离来的所述间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的所述间质干细胞中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述前药转化酶基因是选自胞嘧啶脱氨酶基因以及CYP2B1基因。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将与脑肿瘤有关的基因的反义物或siRNA引入从脐带血分离来的所述间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的所述间质干细胞中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述与脑肿瘤有关的基因是选自由以下组成的群组：Ras家族的基因、c-myc的基因、abl的基因、erbB-1的基因、表皮生长因子受体的基因、Bax的基因、Apaf-1相互作用蛋白的基因、Wnt-1诱导分泌蛋白1的基因、Wnt的基因、Raf-1的基因、Src的基因、Akt的基因、Erk-1,2的基因以及BcL-2的基因。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将溶瘤病毒引入从脐带血分离来的所述间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的所述间质干细胞中。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述溶瘤病毒是选自单纯疱疹病毒以及呼肠孤病毒3型。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的应用，其特征在于所述脑肿瘤是选自由以下组成的群组：节细胞神经瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101039235B1 (ko) 2007-08-29 2011-06-07 메디포스트(주) 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는치료용 조성물
EP3539380A3 (en) 2008-08-20 2019-12-18 Celularity, Inc. Improved cell composition and methods of making the same
EP2658557A1 (en) 2010-12-31 2013-11-06 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules
WO2012106281A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 The General Hospital Corporation Multimodal trail molecules and uses in cellular therapies
WO2012121577A2 (ko) * 2011-03-10 2012-09-13 이화여자대학교 산학협력단 Ｐｔｅｎ을 포함하는 줄기세포의 조직 재생능 강화용 조성물
CN113559126A (zh) 2011-06-01 2021-10-29 人类起源公司 利用胎盘干细胞治疗疼痛
CA2857545A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Advanced Cell Technology, Inc. Mesenchymal stromal cells and uses related thereto
US20130171115A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Gang Li Cell-mediated gene therapy for cancer using mesenchymal stem cells expressing a suicide gene
CN104160027B (zh) * 2012-02-01 2016-06-22 浦项工科大学校产学协力团 同时表达十二聚体trail及hsv-tk自杀基因的载体及利用其的抗癌干细胞治疗剂
CN102731658B (zh) * 2012-05-15 2014-07-30 山东大学 一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用
EP3473708B1 (en) 2012-07-24 2021-01-27 The General Hospital Corporation Oncolytic virus therapy for resistant tumors
US9605074B2 (en) 2012-08-30 2017-03-28 The General Hospital Corporation Multifunctional nanobodies for treating cancer
GB201220573D0 (en) * 2012-11-15 2013-01-02 Univ Central Lancashire Methods of diagnosing proliferative disorders
CN103602625B (zh) * 2013-08-16 2015-09-30 苏州大学 含有重组腺病毒质粒的大肠杆菌及重组腺病毒的应用
WO2015089280A1 (en) * 2013-12-11 2015-06-18 The General Hospital Corporation Stem cell delivered oncolytic herpes simplex virus and methods for treating brain tumors
JP6519727B2 (ja) * 2014-09-17 2019-05-29 国立大学法人山口大学 間葉系幹細胞の培養方法、および肝機能障害用治療剤の製造方法
NZ735160A (en) * 2015-03-06 2019-05-31 Univ Ajou Ind Academic Coop Found Cell therapeutic agent for cancer treatment and combination therapy with same
CN104726411B (zh) * 2015-03-27 2017-06-23 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抑制肿瘤生长的重组间充质干细胞及其制备方法与应用
US20180112006A1 (en) * 2015-04-17 2018-04-26 The General Hospital Corporation Agents, systems and methods for treating cancer
CA3045228C (en) * 2016-12-28 2024-01-02 Transgene Sa Oncolytic viruses and therapeutic molecules
CN108018287A (zh) * 2018-01-10 2018-05-11 扬州大学 一种抑制山羊卵泡颗粒细胞增殖的特异siRNA及方法
CN108553478B (zh) * 2018-04-02 2020-03-20 杭州师范大学 一种septin基因shRNA在制备septin基因活性抑制剂中的应用
US10835558B2 (en) * 2018-04-16 2020-11-17 Brahm Holdings, Inc. Mammalian birth tissue composition for tumor treatment
US20220275337A1 (en) * 2019-08-05 2022-09-01 Mesoblast International Sárl Cellular compositions comprising viral vectors and methods of treatment

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003070922A1 (en) 2002-02-19 2003-08-28 Medipost Co., Ltd. Isolation and culture-expansion methods of mesenchymal stem/progenitor cells from umbilical cord blood, and differentiation method of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem/progenitor cells into various mesenchymal tissues
KR20040022134A (ko) * 2002-09-06 2004-03-11 송준석 인간 간엽줄기 세포와 p53 분비 아데노바이러스를 이용한항암치료방법
US20060019256A1 (en) * 2003-06-09 2006-01-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
JPWO2005007176A1 (ja) 2003-06-27 2006-08-31 株式会社レノメディクス研究所 間葉系細胞を有効成分とする体内投与用脳神経疾患治療薬
AU2005245399A1 (en) * 2004-05-12 2005-12-01 Schering Corporation CXCR1 and CXCR2 chemokine antagonists
EP2597149A1 (en) * 2004-08-16 2013-05-29 CellResearch Corporation Pte Ltd Isolation, cultivation and uses of stem/progenitor cells
JP2006345726A (ja) * 2005-06-14 2006-12-28 Hamamatsu Univ School Of Medicine 脳腫瘍治療用発現ベクター
WO2007011693A2 (en) 2005-07-14 2007-01-25 Medistem Laboratories, Inc. Compositions of placentally-derived stem cells for the treatment of cancer
KR101022401B1 (ko) * 2005-09-29 2011-03-15 아주대학교산학협력단 자살유전자를 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 암치료용 조성물
KR101039235B1 (ko) 2007-08-29 2011-06-07 메디포스트(주) 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는치료용 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Akira Nakamizo 等.《Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells in the treatment of Gliomas》.《Cancer Research》.2005,第65卷(第8期),3307-3318. *

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