DE102010036261A1

DE102010036261A1 - Peptidgebundene α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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Publication number: DE102010036261A1
Application number: DE102010036261A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Henle Thomas; Michael Hellwig; Stefanie Geißler; Dr. habil. Brandsch Matthias
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Martin-Luther-Universitaet Halle-Wittenberg K De; Technische Universitaet Dresden; Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 2010-08-24
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2012-03-01

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft peptidgebundene α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone mit verbesserter Darmzellpermeabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, welche peptidgebundene α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone enthalten, zur Verwendung bei der Behandlung von Metallspeichererkrankungen, insbesondere Eisenspeichererkrankungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Peptide mit einer Länge von zwei bis fünf Monomeren, wobei mindestens eines der Monomere ein α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I ist, mit n = 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und mit R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, C1-6-Alkyl, C1-6-Alkoxy, -F, -Cl, -Br und -I.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft peptidgebundene α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone mit verbesserter Darmzellpermeabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, welche peptidgebundene α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone enthalten. Die erfindungsgemäßen peptidgebundenen α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone bzw. die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche diese enthalten, eignen sich insbesondere zur Behandlung von Metallspeichererkrankungen, insbesondere Eisenspeichererkrankungen.
Eisen wird als wichtiges Spurenelement im Körper vor allem für den Transport von Sauerstoff von der Lunge zu peripheren Geweben benötigt. Daneben besitzt es katalytische Funktion in einigen Enzymen. Die Homöostase des Eisens, d. h. die Einstellung seiner Konzentration in einem eng geregelten Bereich, wird beim gesunden Menschen vor allem durch die Zufuhr aus der Nahrung beeinflusst, da es keine nennenswerte gerichtete Eisenausscheidung gibt. Eisen kann daneben bei Verletzungen durch Blutverlust und bei gebärfähigen Frauen durch die Regelblutung verloren gehen (Hahn, A. (2009). Pharm. Unserer Zeit 38, 232–239. Sommer, E., Heimple, H. (2009). Pharm. Unserer Zeit 38, 242–250).
Unter dem Begriff Eisenspeicherkrankheit (Siderose) werden sowohl erbliche (primäre) als auch erworbene (sekundäre) Eisenspeicherkrankheiten zusammengefasst. Eine sekundäre Eisenspeicherkrankheit kann durch Vorerkrankungen wie Diabetes mellitus oder durch Alkoholmissbrauch entstehen. Die häufigste primäre Eisenspeicherkrankheit ist die primäre oder erbliche (hereditäre) Hämochromatose (primäre Siderose, Siderophilie), bei der es zu einer erhöhten Aufnahme von Eisen im oberen Dünndarm kommt. Der Gesamtkörpereisengehalt steigt dadurch von ca. 2–6 g (Normwert) auf bis zu 80 g. Bei der erblichen Thalassämie (griechisch für Mittelmeeranämie) dagegen wird durch einen Gendefekt das Hämoglobin nicht ausreichend gebildet bzw. gesteigert abgebaut. Patienten erhalten daher lebenslang alle 4–6 Wochen Bluttransfusionen. Dadurch wird jedoch die Eisenhomöostase erheblich gestört, da dem Körper mehr Eisen zugeführt wird als er ausscheiden kann.
Die Folgen von Eisenspeichererkrankungen sind zunächst die „Ablagerung” des Eisens vor allem in der Leber und daraus folgende Organerkrankungen (Zirrhosen, Karzinome). Diese Symptome treten auch bei anderen Siderosen auf, bei denen zu viel Eisen aus der Nahrung resorbiert wird (Bommer, E., Heimple, H. (2009) Pharm. Unserer Zeit 38, 242–250; Andrews, N. C. (1999) New England J. Med. 341, 1986–1995).
Um den Spätfolgen vorzubeugen, werden bei Siderosen Komplexbildner verabreicht (Chelattherapie), die überschüssiges Eisen binden sollen (Cappellini, M. D., Pattoneri, P. (2009) Annu. Rev. Med. 60, 25–38). Das komplex gebundene Eisen wird über den Urin oder über die Galle ausgeschieden.
Zentrale Anforderung an einen geeigneten Komplexbildner ist die Bildung eines möglichst stabilen Komplexes, was durch eine möglichst hohe „Komplexbildungskonstante” zum Ausdruck kommt. Beispiele für medikamentös genutzte Komplexbildner sind Deferipron, Deferoxamin und Deferasirox (Carlo, H. et al. (2007). Klin. Pädiatr. 219, 158–165).
Die bereits therapeutisch genutzte Verbindungsklasse der ringsubstituierten α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone zählt zu den geeigneten Komplexbildnern mit ausreichend hoher Komplexbildungskonstante (Santos, M. A. (2008). Coordination Chem. Rev. 252, 1213–1224). Hier ist der bekannteste Vertreter das Deferipron (siehe Tab. 1), welches im Gegensatz zu dem bereits seit ca. 50 Jahren genutzten Deferoxamin bei Eisenüberladung oral wirksam ist. Deferoxamin muss subkutan verabreicht werden, was die Akzeptanz der Therapie bei den Erkrankten entscheidend verschlechtert. Nachteilig an der Deferipron-Therapie ist im Gegensatz dazu die relativ schnelle Ausscheidung bzw. Metabolisierung des Wirkstoffs. Das Medikament muss in drei täglichen Dosen von insgesamt 75–100 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden, was einer täglichen Menge von über 5–7 g entspricht. Dies wiederum kann allein aufgrund der sehr hohen Menge zu Nebenwirkungen wie einem Zinkmangel führen (Crisponi und Remelli, 2008).
Insbesondere die Arbeitsgruppe um Santos et al. hat im Laufe der letzten Jahre zahlreiche Beiträge zu den Komplexbildungseigenschaften der α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone und deren möglicher medizinischer Bedeutung publiziert. (Santos, M. A., Gil, M., Marques, S. et al. (2002) J. Inorg. Biochem. 95, 43–54; Santos, M. A., Gil, M., Gano, L., Chaves, S. (2005) J. Biol. Inorg. Chem. 10, 564–580).
Verbindungen, bei denen die Pyridinonstruktur an eine Aminosäureseitenkette gebunden ist, wie z. B. H₂L⁹ und das 1-(5-Amino-5-carboxy)pentyl-3-hydroxy-2-methyl-4(1H)-pyridinon (Maltosin) (Seifert S, Dissertation TU Dresden 2008; Ledl, F., Osiander, H., Pachmayr, O., Severin, T. (1989) Z. Lebensm. Unters. Forsch. 188, 207–211) sind effiziente Komplexbildner für Eisen (siehe Tab. 1). Die Komplexbildungskonstante des H₂L⁹ liegt um 4 Zehnerpotenzen und die des Maltosins sogar um 5 Zehnerpotenzen höher als die des Deferiprons (Hahn, A. (2009). Pharm. Unserer Zeit 38, 232–239).
Untersuchungen der Erfinder zeigen, dass Maltosin zwar ein wesentlich besserer Komplexbildner als das Medikament Deferipron ist (Tab. 1), als freie Aminosäure jedoch vermutlich ebenso wie das Deferipron nur schlecht oral verfügbar sein wird, da es nicht aktiv von Darmepithelzellen transportiert wird. Tab. 1. Strukturen und Trivialnamen der diskutierten Substanzen. Lg β₁₃₀, Bruttokomplexbildungskonstante
M. A. Santos (2008, Coordination Chem. Rev. 252, 1213–1224) beschreibt verschiedene bifunktionelle Mono-(3-hydroxy-4-pyridinon)-Derivate, von denen einige an Stickstoff-haltige molekulare Vektoren gebunden sind. Darunter finden sich auch Mono-3-hydroxy-4-pyridinone, welche an bioaktive Tripeptide mit der Sequenz RGD bzw. RYD gebunden sind. Dies sind peptidische Liganden, welche durch die Rezeptoren von α_vβ₃-Integrinen (das sind Adhäsionsmoleküle an extrazellulären Membranen, die bei der Angiogenese von schnellwachsenden Tumoren überexprimiert werden) erkannt werden. Die an diese Peptide gebundenen Mono-3-hydroxy-4-pyridinone könnten den Autoren zufolge beispielsweise in der bildgebenden Diagnostik eine Rolle spielen (z. B. für die „Sichtbarmachung” der Tumoren durch intravenöse Applikation von mit einem z. B. radioaktiven Metallion „beladenen” Liganden). Dabei ist das Mono-3-hydroxy-4-pyridinon jeweils über eine Carboxylgruppe an den N-Terminus des Tripeptids gebunden, das Peptid verfügt also über keinen freien N-Terminus.
Diese von Santos beschriebenen Liganden sind jedoch nicht für die orale Verabreichung mit dem Ziel einer therapeutischen Verwendung geeignet, da eine Voraussetzung für die aktive Aufnahme über den Peptid-Transporter der Darmwandzellen ein intakter N-Terminus ist. Die minimalen Anforderungen an ein Substrat für den intestinalen Peptidtransporter PEPT1 wurden von Knütter (2003, Dissertation, Universität Halle-Wittenberg, Mathematischnaturwissenschaftlich-technische Fakultät) beschrieben. Essentiell ist vor allem ein freier N-Terminus des Peptides, der zwar durch andere funktionelle Gruppen ersetzt werden kann, aber nicht durch raumfüllende modifizierende Gruppen maskiert sein darf. So zeigt z. B. das Dipeptid Gly-Lys eine mittlere Affinität zum Peptidtransporter (Knütter, I., 2003), während das am N-Terminus modifizierte Derivat Bz-Gly-Lys (Hippuryllysin) nur noch in sehr hoher Konzentration eine schwache Wechselwirkung auszuüben vermag (Grunwald, S. et al., 2006, Br. J. Nutr., 95, 1221–1228).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, peptidgebundene α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivate mit verbesserter Darmzellpermeabilität und dadurch mit erhöhter Bioverfügbarkeit zur Verfügung zu stellen. Weiterhin hat die Erfindung die Aufgabe, Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivate bereit zu stellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Peptid mit einer Länge von zwei bis fünf, bevorzugt zwei oder drei, Monomeren, wobei
mindestens eines der Monomere ein α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I ist,
mit n = 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und
mit R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, C1-6-Alkyl, C1-6-Alkoxy, -F, -Cl, -Br und -I.
Im Gegensatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verbindungen ist in der vorliegenden Erfindung die komplexierende Pyridinongruppe Bestandteil der Seitenkette mindestens einer Aminosäure in Peptiden, deren N- und C-Termini frei vorliegen. Modifizierungen in Aminosäureseitenketten werden vom Peptidtransporter wesentlich stärker toleriert als solche am N- oder C-Terminus. Vorteilhaft eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide daher besonders gut für die orale Verabreichung und die Aufnahme in den systemischen Blutkreislauf.
Wird die Seitenkette des Lysins in Peptiden durch Einführung auch raumfüllender modifizierender Gruppen, wie die Pyridinongruppe sie darstellt, hydrophobisiert, kann dies vorteilhaft sogar zu einer Erhöhung der Affinität gegenüber dem Peptidtransporter PEPT1 führen (Knütter, I. et al., 2004, Eur. J. Pharm. Sci., 21, 61–67).
Bevorzugt ist für die in den erfindungsgemäßen Peptiden enthaltenen α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivate n = 1 bis 5, besonders bevorzugt n = 3 oder 4, ganz besonders bevorzugt n = 4.
Vorzugsweise sind R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt aus -H, Methyl, Ethyl, Methoxy, -F, -Cl, -Br und -I. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat ringsubstituiert, d. h. mindestens ein Rest aus R₁, R₂ und R₃ ist nicht -H. Besonders bevorzugt ist darüber hinaus unter den Resten R₁, R₂ und R₃ genau eine Methylgruppe, während die übrigen Reste -H sind. Ganz besonders bevorzugt ist R₁ = Methyl und R₂ = R₃ = -H oder R₃ = Methyl und R₁ = R₂ = -H, am meisten bevorzugt ist R₁ = Methyl und R₂ = R₃ = -H.
Als in dem erfindungsgemäßen Peptid enthaltene Monomere sind besonders die folgenden beiden α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivate der allgemeinen Formel I bevorzugt, nämlich das α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I mit n = 4, R₁ = Methyl, R₂ = H und R₃ = H, welches im Folgenden mit seinem Trivialnamen Maltosin bezeichnet wird, und das α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I mit n = 1 und R₁ = R₂ = R₃ = H, welches im folgenden auch mit seinem Trivialnamen Mimosin bezeichnet wird. Ganz besonders bevorzugt ist das α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat Maltosin.
Ein Peptid im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Oligomer, das aus Aminosäureeinheiten als Monomeren zusammengesetzt ist. Aminosäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind organische Verbindungen, welche über mindestens eine Aminogruppe und mindestens eine Carboxylgruppe verfügen. Bevorzugt handelt es sich dabei um α-Aminosäuren, d. h. Aminosäuren, welche zum einen über eine endständige Carboxylgruppe und zum anderen an dem der Carboxylgruppe benachbarten C-Atom, dem sogenannten α-C-Atom, über eine Aminogruppe verfügen. Das α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I zählt daher im Sinne der vorliegenden Erfindung ebenfalls zu der Gruppe der Aminosäuren.
Die Aminosäuren sind in einem Peptid über sogenannte Peptidbindungen miteinander verknüpft. Die Peptidbindung ist dabei eine Amidbindung zwischen der Carboxylgruppe der einen Aminosäure mit der Aminogruppe der darauffolgenden Aminosäure: Aufgrund der Asymmetrie der Amidbindung ist die Abfolge der Aminosäuren innerhalb des Peptids gerichtet, d. h. das Peptid verfügt über einen freien Amino- oder N-Terminus an seinem einem Ende und einen freien Carboxy- oder C-Terminus am seinem anderen Ende. Im Inneren des Peptids wiederum verfügt jedes Monomer über einen N-terminalen und einen C-terminalen Bindungspartner.
Vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Peptide, welche α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivate der allgemeinen Formel I enthalten, im Gegensatz zu freien α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivaten von den Darmzellen aktiv aufgenommen. In den Darmzellen erfolgt eine Spaltung der Peptide und anschließende Abgabe der freien Aminosäuren sowie des eigentlichen Wirkstoffs (nämlich des α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivats) in den Blutkreislauf.
Da sich in den meisten Aminosäuren an dem C-Atom, welches mit der Amino- und der Carboxylgruppe verbunden ist, vier verschiedene Substituenten befinden, existiert von der entsprechenden Aminosäure jeweils ein L- und ein D-Enantiomer (eine Ausnahme hiervon ist die natürlich vorkommende Aminosäure Glycin). Es wurde gezeigt, dass Peptide, die aus L-Aminosäuren bestehen, beim aktiven Transport in die Darmzellen bevorzugt werden. Aber auch gemischte DL-Dipeptide haben zufriedenstellende Affinitäten zum Peptidtransporter. In den erfindungsgemäßen Peptiden sind daher sowohl D- oder L-Aminosäuren einsetzbar. Allerdings steigt die enzymatische Stabilität in Anwesenheit von D-Aminosäuren, d. h. die Peptide werden intrazellulär nicht oder nur schlecht gespalten. Die Freisetzung des eigentlichen Wirkstoffs, also des α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivats wäre somit weniger effizient. Dies wird jedoch nicht unbedingt als Nachteil angesehen, da davon ausgegangen wird, dass sich die komplexbildenden Eigenschaften der Peptide nicht wesentlich von z. B. denen des Maltosins unterscheiden. Dennoch ist der Einsatz von L-Aminosäuren in den erfindungsgemäßen Peptiden bevorzugt. Besonders bevorzugt haben alle im Peptid enthaltenen Aminosäuren die L-Konfiguration.
Natürlich vorkommende Proteine oder Peptide sind vollständig aus 22 genetisch kodierten Aminosäuren bzw. aus daraus durch posttranslationale Modifikationen gebildeten Aminosäuren aufgebaut. Bevorzugt sind daher die neben dem α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat in dem erfindungsgemäßen Peptid vorhandenen Monomere ausgewählt aus der Gruppe dieser proteinogenen Aminosäuren Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, Selenocystein und/oder Pyrrolysin und aus diesen Aminosäuren posttranslational gebildeten Aminosäuren wie z. B. Hydroxyprolin, Hydroxylysin, Ornithin, Methylhistidin, Cystin, Phosphoserin oder Glucosylserin.
Peptide sind über die Abfolge der enthaltenen Aminosäuren, die sogenannte Aminosäuresequenz, charakterisiert. Bei Peptiden, die aus natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen, wird diese üblicherweise durch einen Ein- oder einen Dreibuchstabencode dargestellt, wobei man übereingekommen ist, die Sequenzen vom N-Terminus (d. h. der freien Aminogruppe an einem Ende des Peptids) beginnend in Richtung des C-Terminus (d. h. der freien Carboxylgruppe am entgegengesetzten Ende des Peptids) darzustellen.
Bevorzugt sind in dem erfindungsgemäßen Peptid vor allem hydrophobe Aminosäuren enthalten, wie z. B. die Aminosäuren Valin, Alanin, Leucin, Phenylalanin und Isoleucin. Besonders bevorzugt sind die Aminosäuren Valin, Alanin und Leucin.
In dem erfindungsgemäßen Peptid sind auch andere Aminosäuren einsetzbar, die natürlich vorkommen können, aber nicht zu den genetisch kodierten Aminosäuren zählen, wie z. B. Ornithin, Hydroxyprolin, oder Selenomethionin.
Daneben können in dem erfindungsgemäßen Peptid auch synthetisch hergestellte Aminosäuren enthalten sein, wie z. B. D-Phenylglycin, Methylvalin und L-Amino-5-phosphovaleriansäure.
Die Aminosäuren können glykosyliert oder anderweitig modifiziert sein, wie beispielsweise durch die Phosphorylierung einer Hydroxygruppe, wie z. B. bei O-Phosphoserin oder O-Phosphotyrosin.
Die Erfinder konnten in Zellkulturstudien, in denen der Transport von Aminosäuren und Peptiden an Darmzellmembranen untersucht wurde, für freies Maltosin nur eine sehr geringe Transportrate messen (2). Im Gegensatz dazu werden erfindungsgemäße Dipeptide mit C-terminalem oder N-terminalem Maltosin von einem Transportprotein aktiv in Darmzellen aufgenommen (3, hier gezeigt für die Dipeptide Ala-Mal und Mal-Ala). Dipeptide mit C-terminalem oder N-terminalem Maltosin werden in den Darmzellen schnell proteolytisch gespalten und das freie Maltosin dann zur Blutseite abgegeben (2). Auf diese Weise kann ein Transport des an sich schlecht verfügbaren Komplexbildners durch die Darmzellen ins Blut erreicht werden.
Dabei können die Darmzellen als „Depot” fungieren, denn die Maltosinpeptide werden zwar schnell hineintransportiert, das daraus gespaltene Maltosin aber nur langsam abgegeben (3). Das Problem der hohen Dosierung (vgl: Deferipron) kann somit vorteilhaft umgangen werden.
Als Transporter, der das peptidgebundene Maltosin in die Darmzellen transportiert, konnten die Erfinder den Peptidtransporter PEPT1 identifizieren, der eine Vielzahl von pharmazeutisch aktiven Stoffen transportiert.
Die erfindungsgemäßen peptidgebundenen α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivate stellen somit vorteilhaft effiziente „Prodrugs” dar, aus denen die pharmazeutisch relevante Verbindung nach Aufnahme durch den körpereigenen Stoffwechsel freigesetzt wird und dann im Körper wirken kann.
Bestandteil der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide mit einer Länge von drei bis fünf Monomeren, bevorzugt zwei oder drei Monomeren, durch die Umsetzung einer Diaminocarbonsäure mit einem O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranon und die anschließende Nutzung des dadurch erhaltenen Zwischenprodukts als Baustein („building block”) für die Peptidsynthese in bekannter Weise.
Im Gegensatz zu direkten einstufigen Verfahren, bei welchen die Lysinseitenkette innerhalb eines Peptids modifiziert wird, führt das erfindungsgemäße Mehrstufen-Verfahren unter Verwendung von Peptid-Kopplungsreagenzien vorteilhaft zu höheren Ausbeuten an gewünschtem Produkt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide geht aus von der Synthese des O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranons der allgemeinen Formel II
mit R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, C1-6-Alkyl, C1-6-Alkoxy, -F, -Cl, -Br und -I und
mit R4 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Benzyloxymethylether- (BOM), Benzylether-, 2-Naphthylmethylether-, p-Methoxybenzylether- und p-Nitrobenzyletherschutzgruppe.
Vorzugsweise sind R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt aus -H, Methyl, Ethyl, Methoxy, -F, -Cl, -Br und -I. Bevorzugt ist das O-veretherte α-Hydroxy-4(1H)-pyranon ringsubstituiert, d. h. mindestens ein Rest aus R₁, R₂ und R₃ ist nicht -H. Besonders bevorzugt ist darüber hinaus unter den Resten R₁, R₂ und R₃ genau eine Methylgruppe, während die übrigen Reste -H sind. Ganz besonders bevorzugt ist R₁ = Methyl und R₂ = R₃ = -H oder R₃ = Methyl und R₁ = R₂ = -H, am meisten bevorzugt ist R₁ = Methyl und R₂ = R₃ = -H.
Bevorzugt ist desweiteren die Verwendung der Benzyletherschutzgruppe als R₄ (Struktur II a).
Die Synthese von O-verethertem α-Hydroxy-4(1H)-pyranon der allgemeinen Formel II erfolgt dabei in bekannter Weise mit einem geeigneten Reagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Benzyloxymethylchlorid, Benzyloxymethylbromid, Benzylchlorid, Benzylbromid, 2-Naphthylmethylchlorid, 2-Naphthylmethylbromid, p-Methoxybenzylchlorid, p-Methoxybenzylbromid, p-Nitrobenzylchlorid und p-Nitrobenzylbromid. Bevorzugt ist die Umsetzung des α-Hydroxy-4(1H)-pyranons mit Benzylbromid in Gegenwart einer Base bei erhöhter Temperatur (vgl. Dobbin et al., 1993; Liu et al., 2002).
Bei der zur Herstellung der Verbindung der allgemeinen Formel I eingesetzten Diaminocarbonsäure handelt es sich vorzugsweise um eine Diaminocarbonsäure der allgemeinen Formel III. Dabei handelt es sich um eine α-Aminosäure, also um eine Alkylcarbonsäure mit einer Aminogruppe am α-C-Atom, welche über eine weitere Aminogruppe am ω-C-Atom, d. h. am endständigen C-Atom, der Alkylkette verfügt.
Dabei ist n = 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, bevorzugt n = 1 bis 5, besonders bevorzugt n = 3 oder 4. Ganz besonders bevorzugt ist der Einsatz der natürlich vorkommenden Aminosäure Lysin, d. h. n = 4.
R₅ ist = -H oder vorzugsweise eine geeignete Schutzgruppe. Die Schutzgruppe R₅, die verhindert, dass gleichzeitig mit der endständigen Aminogruppe auch die α-Aminogruppe zur Reaktion gebracht wird, ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der tert-Butoxycarbonyl-(Boc), Benzyloxycarbonyl-(Cbz oder Z), Triphenylmethyl-(Trt) und Nitrobenzolsulfenyl-(Nps)Gruppe. Besonders bevorzugt wird die Schutzgruppe tert-Butoxycarbonyl-(Boc) zum Schutz der α-Aminogruppe eingesetzt.
R₆ ist = -H oder eine geeignete Schutzgruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Alkylester-, der Benzylester-, Diphenylmethylester- und t-Butylester-Schutzgruppen. Ein vergleichbarer Schutzeffekt kann aber auch ohne kovalent gebundene Schutzgruppe durch die Verwendung eines Lysin-Kupfer-Komplexes erreicht werden. Bevorzugt wird keine C-terminale Schutzgruppe verwendet, d. h. R₆ ist = -H (allgemeine Formel III a).
Die Diaminocarbonsäure wird mit dem O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranon der allgemeinen Formel II zur Reaktion gebracht.
Als Lösungsmittel für die Durchführung der Reaktion wird vorzugsweise eine Mischung von Ethanol/Wasser, bevorzugt in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:20, besonders bevorzugt 1:1 bis 1:5, eingesetzt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes beträgt vorzugsweise pH 10 bis 14, bevorzugt pH 11 bis 13, besonders bevorzugt pH 12 bis 13. Vorzugsweise wird dabei die Verbindung II im Überschuss, bevorzugt in einem 3 bis 10fachen, besonders bevorzugt 4 bis 6fachen Überschuss, gegenüber der geeignet geschützten Diaminocarbonsäure der allgemeinen Formel III, eingesetzt. Die Reaktion wird vorzugsweise 1 h bis 36 h, bevorzugt 10 bis 30 h, besonders bevorzugt 18 h bis 24 h lang durchgeführt, wobei der Ansatz bevorzugt unter Rückfluss auf eine Temperatur zwischen 60°C und 80°C erhitzt wird.
Das Zwischenprodukt I a entspricht einem an der α-Aminogruppe mit einer Schutzgruppe R₅ versehenen und an der Hydroxygruppe mit einer Schutzgruppe R₄ veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I und wird vorzugsweise durch fraktionierende Extraktion erhalten und durch Säulenchromatographie gereinigt. Als Säulenmaterial wird vorzugsweise Kieselgel eingesetzt. Als Fließmittel wird bevorzugt Methanol verwendet.
Aus dem Zwischenprodukt I a mit R₅ = Boc wird gegebenenfalls durch essigsaure Hydrolyse die Verbindung der allgemeinen Formel I b hergestellt. Durch die essigsaure Hydrolyse wird die Schutzgruppe Boc abgespalten, so dass man die freie Aminosäure-Form des α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivats der allgemeinen Formel I b erhält. Das Zwischenprodukt I a mit R₅ = Boc wird dazu vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1–0,3 mg/mL in 10%iger Essigsäure gelöst und 4 h bei 70°C erhitzt. Nach Entfernung der Essigsäure wird das Produkt I b durch Säulenchromatographie gereinigt. Als Säulenmaterial wird vorzugsweise Kieselgel eingesetzt. Als Fließmittel wird bevorzugt Methanol verwendet.
Aus dem α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I b kann gegebenenfalls durch Umsetzung mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (Fmoc-Cl) die Verbindung I c hergestellt werden. Die Umsetzung erfolgt in einem Gemisch aus Dioxan und Wasser in Gegenwart einer Base. Vorzugsweise wird hierzu Natriumcarbonat verwendet. Das Produkt I c wird vorzugsweise durch fraktionierende Extraktion erhalten und mittels Säulenchromatographie oder semipräparativer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt.
Bei allen Verfahrensschritten ist wegen der metallkompiexierenden Eigenschaften des α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivats streng darauf zu achten, daß Wasser benutzt wird, das über einen Ionenaustauscher gereinigt wurde („Reinstwasser”).
Die Zwischenprodukte I a, I b und I c eignen sich nun zur Verwendung als Bausteine („building blocks”) in der chemischen Peptidsynthese in bekannter Weise.
In der chemischen Peptidsynthese werden zwei Aminosäuren bzw. Peptide durch Schließung einer Amidbindung miteinander verknüpft, wobei sowohl der N-Terminus des später N-terminalen Peptidteils als auch der C-Terminus des später C-terminalen Anteils durch geeignete funktionale Gruppen, sog. Schutzgruppen, blockiert werden. Dadurch reagiert nur jeweils die freie der beiden funktionellen Gruppen der Aminosäure und die Knüpfung der Amidbindung führt ausschließlich zu dem gewünschten Endprodukt.
Bei der Synthese des erfindungsgemäßen Peptids kommen vorzugsweise Verfahren zum schrittweisen Kettenaufbau der Zielsequenz zum Einsatz, die in Lösung durchgeführt werden und auf jeder Stufe eine Reinigung und Charakterisierung der Zwischenprodukte beinhalten.
Die Schutzgruppe für die Aminogruppe ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der tert-Butoxycarbonyl- (Boc), [(Fluoren-9-yl)methoxycarbonyl]-(Fmoc), Benzyloxycarbonyl)-(Cbz oder Z), Triphenylmethyl-(Trt) und Nitrophenylsulfenyl-(Nps)Gruppe. Besonders bevorzugt wird die Schutzgruppe tert-Butoxycarbonyl-(Boc) zum Schutz der α-Aminogruppe eingesetzt.
Gegebenenfalls ist die Carboxylgruppe des späteren C-terminalen Teils ebenfalls durch eine geeignete Schutzgruppe blockiert. Vorzugsweise ist die Schutzgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, Nitrobenzyl-, tert-Butyl-(tBu-) und (Fluoren-9-yl)methyl-. Bevorzugt wird zum Schutz der Carboxylgruppe eine tert-Butyl-Schutzgruppe eingesetzt.
Da die Carboxylgruppe resonanzstabilisiert und daher wenig reaktiv ist, wird derjenige Reaktionspartner, der später den N-terminalen Teil des Produkts bilden soll, vorzugsweise an seiner Carboxylgruppe mit einer geeigneten Abgangsgruppe aktiviert, um eine Peptidbindung eingehen zu können. Die Carboxylgruppe wird in diesem Fall zunächst in eine reaktive Verbindung überführt. Verbindungen, welche für die Aktivierung der Carboxylfunktion eingesetzt werden, werden dabei häufig auch als Abgangsgruppe bezeichnet, weil sie in der nachfolgenden Reaktion das Molekül verlassen.
Bevorzugte Abgangsgruppen sind N-Succinimidyl-(Su), Pentafluorphenyl-(Pfp) und Benzotriazol-1-ylester. Besonders bevorzugt werden N-Succinimidylaktivester verwendet.
In der Peptidchemie wird die Carboxylgruppe meist direkt in situ vor der Kupplung aktiviert. Vorzugsweise wird hier ein Gemisch aus DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid) oder DIC (N,N'-Diisopropylcarbodiimid) oder EDC (1-Ethyl-3-(3'dimethylamino)carbodiimid-Hydrochlorid) mit HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) eingesetzt.
DCC (bzw. DIC oder EDC) aktiviert die Carbonsäure unter Bildung eines sehr reaktiven Acylisoharnstoffs. Dieser kann dann mit der freien Aminogruppe einer zweiten Aminosäure unter Bildung einer Peptidbindung reagieren. HOBt beschleunigt die Reaktion und unterdrückt die Razemisierung.
Weitere bevorzugte Wege der Aktivierung sind die Kupplung mit CDI (1,1'-Carbonyldiimidazol), HBTU (O-(benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat), BroP (Bromotris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat), Carbonsäurechloriden, -fluoriden und -bromiden, PyBroP (Bromo-trispyrrolidino-phosphoniumhexafluorphosphat), HATU (O-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat), TBTU (O-[(1H)-Benzotriazol-1-yl]-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat), TSTU (O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluoroborat) oder mit einem Gemisch aus HBTU und HOBt (Hydroxybenzotriazol), BOP (Benzotriazol-1-yloxytris[dimethylamino]-phosphoniumhexafluorphosphat) oder PyBop ((Benzotriazol-1-yl-oxy)tris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat).
Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Methoden zur Synthese von Peptiden in Lösung oder an fester Phase bekannt. Übersichtsartikel hierzu finden sich beispielsweise bei Montalbetti & Falque (Tetrahedron, 2005, 61, 10827–852) und bei Han & Kim (Tetrahedron, 2004, 60, 2447–2467). Für die chemische Peptidsynthese eignen sich insbesondere die Verbindungen I a und I c. Es ist auch der Einsatz von Verfahren zur Festphasensynthese möglich, bei welchen die wachsende Peptidkette mit einem unlöslichen polymeren Träger kovalent verknüpft ist und das Peptid vom C- zum N-Terminus mittels aufeinanderfolgender Kupplungs- und Abspaltzyklen schrittweise aufgebaut wird.
Die Verbindung I a ist dabei insbesondere geeignet zur direkten Verwendung bei der klassischen Merrifield-Synthese („Boc-Strategie”), die Verbindung I c insbesondere zur direkten Verwendung bei der milderen Variante der Festphasensynthese („Fmoc-Strategie”).
Um zu einem Peptid zu gelangen, in dem die Verbindung der allgemeinen Formel I N-terminal vorliegt, wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung folgendermaßen vorgegangen:
Eine an der α-Aminogruppe mit einer geeigneten Schutzgruppe R₅ geschützte Diaminocarbonsäure der allgemeinen Formel III wird wie oben beschrieben mit einem O-benzylierten 3-Hydroxy-2-methyl-4(1H)-pyranon der allgemeinen Formel II a umgesetzt.
Anschließend wird das dadurch erhaltene 3-Hydroxy-2-methyl-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I a an der Carboxylgruppe durch eine geeignete Abgangsgruppe aktiviert. Bevorzugt ist dies ein Succinimid-Aktivester. Diese Aktivierung geschieht vorzugsweise in Gegenwart einer Base, bevorzugt DIPEA (Diisopropylethylamin). Die Reaktion wird vorzugsweise in Dichlormethan als Lösungsmittel durchgeführt. Anschließend wird das aktivierte 3-Hydroxy-2-methyl-4(1H)-pyridinon-Derivat in bekannter Weise mit einer beliebigen weiteren Aminosäure gekoppelt.
Dieser Schritt wird gegebenenfalls mit weiteren Aminosäuren wiederholt. Sobald das Peptid die gewünschte Länge bzw. Aminosäuresequenz hat, werden die noch vorhandenen Schutzgruppen abgespalten. Dies geschieht vorzugsweise durch Hydrierung bzw. saure Hydrolyse. Bevorzugt wird das Produkt durch Ionenaustauschchromatographie abschließend gereinigt. Vorzugsweise wird dabei als Säulenmaterial ein stark saurer Ionenaustauscher in Na⁺-Form eingesetzt. Als Fließmittel wird 0,3 N Natriumcitratpuffer, pH 5,25 bevorzugt.
Um zu einem Peptid zu gelangen, in dem die Verbindung der allgemeinen Formel I C-terminal vorliegt, wird folgendermaßen vorgegangen:
Eine an der α-Aminogruppe mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützte ω-Diaminocarbonsäure der allgemeinen Formel III wird wie oben beschrieben mit einem O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranon der allgemeinen Formel II mit R4 = Benzyl umgesetzt. Anschließend wird die Schutzgruppe an der α-Aminogruppe des erhaltenen Produkts (I a) abgespalten. Dies wird bevorzugt durch essigsaure Hydrolyse erreicht. Bevorzugt wird die Verbindung dazu in 10%iger Essigsäure erhitzt. Anschließend wird die Essigsäure entfernt. Der Rückstand wird anschließend durch Säulenchromatographie, vorzugsweise an Kieselgel und mit dem Fließmittel Methanol, gereinigt.
Anschließend wird das erhaltene α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I b mit der gewünschten Aminosäure bzw. dem gewünschten Peptid, das am N-Terminus mit einer geeigneten Schutzgruppe blockiert und am C-Terminus durch eine geeignete Abgangsgruppe aktiviert ist, gekoppelt. Dies geschieht vorzugsweise in Gegenwart einer Base, bevorzugt Diisopropylethylamin (DIPEA). Die Reaktion wird vorzugsweise in Dichlormethan oder einem noch polareren Lösungsmittel wie zum Beispiel N,N-Dimethylformamid (DMF) durchgeführt. Anschließend werden die Schutzgruppen abgespalten, vorzugsweise durch Hydrierung bzw. saure Hydrolyse. Zuletzt wird das Produkt bevorzugt durch Ionenaustauschchromatographie abschließend gereinigt.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die beschriebenen Verfahren durch geeignete Kombination der Schritte zur Herstellung von Peptiden mit einer Länge auch von drei bis fünf Monomeren und beliebiger Sequenz eingesetzt werden kann, in denen die Verbindung der allgemeinen Formel (I) an beliebigen Stellen der Aminosäuresequenz vorliegt.
In Anbetracht der Tatsache, dass beispielsweise Maltosin ein um Größenordnungen effizienterer Komplexbildner für Eisen ist als bislang pharmakologisch genutzte Verbindungen, eröffnen sich für die erfindungsgemäßen Peptide vielversprechende pharmazeutische Anwendungen als neue Klasse von Medikamenten zur Behandlung von Eisenspeichererkrankungen. Dabei ist auch die Verwendung zur Behandlung von Krankheiten denkbar, deren Pathogenese auch auf örtlich begrenzter ausreichend hoher Eisenverfügbarkeit beruht, wie z. B. bestimme Krebsarten oder Malaria.
Therapien mit Komplexbildnern werden aber nicht nur bei Siderosen, sondern auch bei verschiedenen anderen Krankheiten wie M. Alzheimer, Malaria und koronarer Herzkrankheit und auch für andere potentiell toxische Metalle wie Aluminium und Kupfer (Wilson's Disease) diskutiert. Da α-Hydroxy-4(1H)-pyridinone nicht nur Eisen, sondern auch andere Metalle wie zum Beispiel Aluminium hervorragend binden können und daneben relativ stabile Kupferkomplexe eingehen (Seifert, S., 2008, Dissertation, TU Dresden, Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften; Santos, M. A. et al., 2005, J. Inorg. Chem., 10, 564–580), sind die erfindungsgemäßen Peptide nicht nur zur Behandlung von Eisenspeicherkrankheiten, sondern auch von Metallspeicherkrankheiten im allgemeinen geeignet, bei denen bestimmte Metalle nicht in ausreichender Menge aus dem Körper ausgeschieden werden.
Bestandteil der Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Behandlung von Metallspeicherkrankheiten, insbesondere Kupfer-, Aluminium- und Eisenspeicherkrankheiten (Siderosen), sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche die erfindungsgemäßen Peptide enthalten.
Anhand nachfolgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.
Dabei zeigt
1 die schematische Darstellung der Synthese von Alanylmaltosin (Ala-Mal). (i, EtOH/H₂O 1/1, pH 13, 18 h, RF; ii, 10% HOAc, 4 h, 70°C; iii, DCM, DIPEA, 18 h, RT; iv, H₂/Pd, 18 h, RT; v, THF/6 N HCl 1/1, RT, 60 min),
2 den transepithelialen Transport von Maltosin und dessen Dipeptidderivaten Ala-Mal und Mal-Ala über einen Caco-2-Zellmonolayer und
3 die Aufnahme von Maltosin und dessen Dipeptidderivaten Ala-Mal und Mal-Ala in die Caco-2-Zellen nach 2 h (Angaben als Mittelwert ± Standardfehler, n = 3). Ausführungsbeispiel 1: Herstellung von Alanyl-Maltosin (Ala-Mal)
Die Synthese von O-benzyliertem 3-Hydroxy-2-methyl-4(1H)-pyranon erfolgte mit einem geeigneten Benzylierungsreagenz (Benzylbromid) in Gegenwart von Kaliumcarbonat in Aceton bei erhöhter Temperatur (vgl. Dobbin et al., 1993; Liu et al., 2002). Bei allen Verfahrensschritten wurde Wasser benutzt, das über einen ionenaustauscher gereinigt wurde („Reinstwasser”, Leitfähigkeit 0,055 μS/cm). Die Synthese ist schematisch in 1 dargestellt.
Es wurde von der Aminosäure Lysin ausgegangen, die an der α-Aminogruppe Boc als Schutzgruppe trägt. Boc-Lysin wurde mit dem benzylierten 3-Hydroxy-2-methyl-4(1H)-pyranon im Überschuss (4–6fach) in basischer Lösung (Ethanol/Wasser 50/50, pH 13) 18 h lang unter Rückfluss erhitzt (siehe 1, Reaktion i).
Das Zwischenprodukt Boc-Mal(Bzl)-OH wurde fraktionierend extrahiert und dann durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit dem Fließmittel Methanol gereinigt. Anschließend wurde durch Erhitzung in 10%iger Essigsäure (4 h, c = 0,3 mg/ml) die Boc-Schutzgruppe abgespalten (siehe 1, Reaktion ii) und der zur Trockne gebrachte Ansatz durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit dem Fließmittel Methanol gereinigt.
Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und in Gegenwart einer Base (Diisopropylethylamin, DIPEA) mit der an der α-Aminogruppe geschützten und an der Carboxylgruppe mit einem Succinimid-Aktivester (Su) aktivierten „Partneraminosäure” Boc-Ala-OSu versetzt (siehe 1, Reaktion iii). Die Mischung wurde 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Rückstand wurde nach Entfernung des Lösungsmittels in Ethylacetat aufgenommen und mit 1 N HCl extrahiert. Die organische Phase wurde zur Trockne gebracht. Das Zwischenprodukt Boc-Ala-Mal(Bzl)-OH wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit dem Fließmittelsystem Ethylacetat/Methanol (1/1, v/v) gereinigt.
Das Isolat wurde in Ethylacetat gelöst und in Gegenwart eines Palladiumkatalysators unter Wasserstoffatmosphäre zur Abspaltung der Benzylschutzgruppe hydriert (siehe 1, Reaktion iv). Anschließend wurde vom Katalysator abfiltriert und die Lösung zur Trockne gebracht. Sie wurde in einer Mischung aus Tetrahydrofuran und 6 N Salzsäure (50/50, v/v) gelöst und 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt, um die Boc- und Esterschutzgruppen zu entfernen (siehe 1, Reaktion v). Die abschließende Reinigung erfolgte wie unter Ausführungsbeispiel 3 angegeben. Ausführungsbeispiel 2: Herstellung von Maltosinyl-Alanin (Mal-Ala)
Zur Herstellung von Mal-Ala wurde Boc-Mal(Bzl)-OH wie in Ausführungsbeispiel 1 angegeben synthetisiert. Die Verbindung wurde dann in Dichlormethan in Gegenwart von Diisopropylethylamin (Hünig-Base, DIPEA) mit O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat (TSTU) als Aktivierungsreagenz aktiviert (30 min rühren) (Reaktion i) und anschließend mit der methanolischen Lösung der „Partneraminosäure” H-Ala, die an der Carboxylgruppe mit tBu (tert-Butyl) geschützt war, versetzt und 30 min bei Raumtemperatur gerührt (Reaktion ii). Der zur Trockne gebrachte Rückstand wurde in Ether aufgenommen und mit sauren, basischen und neutralen Lösungen extrahiert. Das Zwischenprodukt Boc-Mal(Bzl)-Ala-OtBu wurde nach dem Einengen der etherischen Phase durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit dem Fließmittelsystem Ethylacetat/Methanol (9/1 v/v) gereinigt. Benzyl- und Boc-Schutzgruppen wurden in gleicher Weise entfernt wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben (Reaktion iii, iv).
Schematische Darstellung der Synthese von Mal-Ala. (i, DCM, TSTU, DIPEA, RT, 30 min; ii, H-Ala-OtBu, DIPEA, RT, 30 min; iii, H₂/Pd, 18 h, RT; iv, THF/6 N HCl, RT, 60 min)
Ausführungsbeispiel 3: Abschließende Reinigung der erhaltenen Peptide
Zur abschließenden Reinigung der in den Ausführungsbeispielen 1 und 2 erhaltenen Peptide wurde die Lösung nach Abspaltung der Schutzgruppen zur Trockne gebracht und in 0,1 N Natriumcitratpuffer, pH 3,00 aufgenommen. Die Lösung wurde auf einen stark sauren Kationenaustauscher (z. B. DOWEX 50 WX-8, Siebgröße (mesh size) 200–400) in der Na⁺-Form gegeben, der anschließend mit 0,3 N Natriumcitratpuffer, pH 5,25 gespült wurde. Fraktionen, die das Zielprodukt enthielten, wurden vereinigt. Die angesäuerte Lösung wurde auf einen stark sauren Kationenaustauscher in der H⁺-Form aufgetragen, der dann zunächst mit Reinstwasser und mit 1 N Salzsäure gespült wurde. Anschließend wurde der Ionenaustauscher mit 4 N Salzsäure gespült, das Eluat aufgefangen, zur Trockne gebracht und gefriergetrocknet.
Ausführungsbeispiel 4: Transportstudien
Der totale transepitheliale Nettoflux von Maltosin und seinen Dipeptid-Derivaten Ala-Mal und Mal-Ala über Darmepithelzellen wurde gemessen (2). Dazu wurden Caco-2-Zellen auf permeablen Polycarbonat-Transwell^® Zellkultur-Einsätzen (Durchmesser 24 mm, Porengröße 3 μm, Costar GmbH, Bodenheim, Deutschland) mit einer Zelldichte von ca. 0,2 × 10⁶ Zellen/Filter ausgesät und 21 Tage kultiviert. Während der Kultivierung polarisieren sich die Zellen, d. h. dort, wo sie sich anheften können, bilden sie die funktionelle Unterseite aus (basolaterale Seite, „Blutseite”); die andere Seite wird die funktionelle Außenseite (apikale Seite, „Darmseite”). Zur Messung des Fluxes wurden die Zellkultur-Einsätze in eine Transwell-Kammer gehängt, die es erlaubt, durch die Zellschicht zwei Flüssigkeitskompartimente voneinander zu trennen: Die untere Kammer („Akzeptorkompartiment”) enthielt 2,6 mL Akzeptorpuffer (25 mM Hepes/Tris (pH 7,5), 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgSO₄, 5 mM Glucose) und die obere Kammer („Donorkompartiment”) 1,5 mL Donorpuffer (25 mM Mes/Tris (pH 6,0), 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgSO₄, 5 mM Glucose). Der transepitheliale elektrische Widerstand wurde am Tag 21 mittels einer Millicell ERS (Millipore Intertech, Redford, USA) bestimmt. Hierbei konnte durch Überschreiten des kritischen Wertes jeweils bestätigt werden, daß die Zellen eine vollkommen zusammenhängende Schicht gebildet hatten.
Der transepitheliale Flux von Maltosin, Ala-Mal, Mal-Ala und [¹⁴C]Mannitol durch Caco-2-Zell-Monolayer wurde in bekannter Weise bestimmt (siehe z. B. Grunwald S. et al., Br. J. Nutr. 95 (2006) 1221–1228).
Mannitol wurde in den vorliegenden Transportstudien als Kontrolle („space marker”) eingesetzt. Es wird parazellulär transportiert, d. h. es gelangt von der apikalen Seite durch die Zellzwischenräume hindurch auf die basolaterale Seite und wird nicht durch die „Zellinnenräume” geleitet. Wird bei einer Testsubstanz ein Transport gemessen, der unter dem des Mannitols liegt, so kann man prinzipiell nicht davon ausgehen, dass dieser Transport aktiv und unter Passage der Zellen erfolgt.
Der Transport wurde in Anwesenheit von 1 mM der jeweiligen Substanz bzw. 10 μM [¹⁴C]Mannitol bei pH 6 (apikal) und pH 7,5 (basolateral) über 2 h bestimmt. Alle Experimente wurden an Tag 21 nach der Aussaat der Zellen bei 37°C auf einem Schüttelinkubator durchgeführt. Nach dem Spülen der Einsätze mit Akzeptorpuffer wurde die Aufnahme durch die Zugabe von 1,5 ml Donorpuffer mit 1 mM der zu transportierenden Substanz (Maltosin, Ala-Mal, Mal-Ala) in das Donorkompartiment gestartet.
Nach jeweils 10, 30, 60 und 120 min wurden 200 μL-Aliquote aus dem Akzeptorkompartiment entnommen und durch frischen Puffer (pH 7,5) ersetzt. Die Aliquote wurden bis zur HPLC-Analyse bei –20°C aufbewahrt. Nach 2 h wurden die Filter viermal rasch mit eiskaltem Akzeptorpuffer gespült, aus dem Plastikeinsatz herausgeschnitten und in 1 ml 10% TCA-Lösung eingefroren und aufbewahrt.
Nach der Zugabe von freiem Maltosin zu der apikalen Seite konnten nur geringer Mengen der Substanz in den Zellen und auf der basolateralen Seite detektiert werden. Die Fluxrate lag deutlich unter der des „space markers” [¹⁴C]Mannitol (0,02 ± 0,01%/cm² × h vs. 0,13 ± 0,03%/cm² × h) (2). Innerhalb der Zellen wurde nach 2 h nur 0,07% des gesamten freien Maltosins gefunden (3).
Nach der Zugabe von Ala-Mal bzw. Mal-Ala zu der apikalen Seite der Zellen konnte keines der beiden Derivate in den intrazellulären und basolateralen Bereichen detektiert werden. Nachdem die Proben jedoch auf Maltosin hin überprüft worden waren, wurden viel höhere Maltosinwerte in beiden Bereichen festgestellt als in dem Experiment, in welchem freies Maltosin zu den Zellen gegeben wurde. Für Ala-Mal wurde eine Maltosin-Flussrate von 0,27 ± 0,08%/cm² × h ermittelt und im Fall von Mal-Ala betrug die errechnete Maltosin-Flussrate 0,16 ± 0,06%/cm² × h. Beide Flussraten übertreffen die Flussrate von [¹⁴C]Mannitol und liegen um ein Vielfaches höher als die Flußrate des freien Maltosins. intrazellulär wurde nach 2 h ausschließlich freies Maltosin, jedoch kein Ala-Mal oder Mal-Ala gefunden (15,9% bzw. 2,7%, siehe 3). Das bedeutet, dass während der zweistündigen Fluxmessung insgesamt 18,4% des Ala-Mal und 4,2% des Mal-Ala in die Zellen aufgenommen wurden, dagegen jedoch nur ca. 0,3% des applizierten freien Maltosins.
Der transepitheliale Maltosin-Flux während 2 h Versuchsdauer ist also bei Gabe in Form von Ala-Mal bzw. Mal-Ala im Vergleich zur Gabe von freiem Maltosin um das 8- bzw. 14-fache erhöht. Sowohl Ala-Mal als auch Mal-Ala werden im Inneren der Zellen durch intrazelluläre Dipeptidasen zu Maltosin und Alanin hydrolysiert. Das freigesetzte Maltosin erreicht dann entweder durch einfache Diffusion oder möglicherweise vermittelt durch basolaterale Aminosäure-Transporter die basolaterale Zellseite. Die relativ starke Retention des aus Peptiden freigesetzten Maltosins in den Zellen (vgl. 3) lässt erwarten, dass Maltosin von den Zellen über relativ lange Zeit kontinuierlich abgegeben werden kann.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Peptid mit einer Länge von zwei bis fünf Monomeren, wobei mindestens eines der Monomere ein α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I
mit n = 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und mit R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, C1-6-Alkyl, C1-6-Alkoxy, -F, -Cl, -Br und -I ist.
Peptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Länge von zwei oder drei Monomeren aufweist.
Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass n = 1 oder 4 ist.
Verwendung eines durch die Umsetzung einer Diaminocarbonsäure mit einem O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranon erhaltenen O-veretherten alpha-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivats der allgemeinen Formel I, I a, I b und/oder I c

mit n = 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und mit R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, C1-6-Alkyl, C1-6-Alkoxy, -F, -Cl, -Br und -I, mit R₄ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Benzyloxymethylether-(BOM), Benzylether-, 2-Naphthylmethylether-, p-Methoxybenzylether- und p-Nitrobenzyletherschutzgruppe und mit R₅ = -H oder eine geeignete Schutzgruppe als Baustein in der chemischen Peptidsynthese.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 durch die Umsetzung einer Diaminocarbonsäure mit einem O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranon und die anschließende Nutzung des erhaltenen Zwischenprodukts als Baustein für die chemische Peptidsynthese in bekannter Weise.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I in dem Peptid N-terminal vorliegt, mit den Schritten: a) Umsetzung einer am α-N-Atom geschützten Diaminocarbonsäure mit einem O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranon b) Aktivierung der Carboxylgruppe des in Schritt a erhaltenen α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivats der allgemeinen Formel I, c) Kopplung mit einer weiteren Aminosäure d) ggf. Wiederholung des Schrittes b) mit weiteren Aminosäuren und e) Abspaltung der Schutzgruppen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivat der allgemeinen Formel I in dem Peptid C-terminal vorliegt, mit den Schritten a) Umsetzung einer am α-N-Atom geschützten Diaminocarbonsäure mit einem O-veretherten α-Hydroxy-4(1H)-pyranon, b) essigsaure Hydrolyse des in Schritt a erhaltenen α-Hydroxy-4(1H)-pyridinon-Derivats der allgemeinen Formel I, c) Kopplung mit einer N-terminal geschützten und C-terminal aktivierten Aminosäure oder Peptid und d) Abspaltung der Schutzgruppen.
Pharmazeutische Zubereitung enthaltend ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Verwendung zur Behandlung von Metallspeichererkrankungen.
Peptid nach Anspruch 9 für die Verwendung zur Behandlung von Eisenspeicher-, Kupfer- oder Aluminiumspeichererkrankungen.
Peptid nach Anspruch 9 oder 10 für die Verwendung zur Behandlung von Eisenspeichererkrankungen.