DE60202356T2

DE60202356T2 - Tripeptide und deren derivate zur behandlung von postläsionalen krankheiten des nervensystems

Info

Publication number: DE60202356T2
Application number: DE60202356T
Authority: DE
Inventors: Jean Rapin; Klaus Hans WITZMANN; Jean-Marie Grumel; Jacques Gonella
Original assignee: NeuroTell AG
Current assignee: NeuroTell AG
Priority date: 2001-02-05
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2022-02-06
Also published as: EP1363656B1; JP2004526702A; JP4183507B2; WO2002062373A3; DE10105038B4; DE10105038A1; PT1363656E; ES2230480T3; ATE285244T1; US7122524B2; DE60202356D1; EP1363656A2; WO2002062373A2; US20050080016A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tripeptiden bzw. Tripeptidderivaten bei der Behandlung von postläsionalen Krankheiten des Nervensystems, insbesondere solchen nekrotischen Ursprungs, wie z. B. Ischämie, Trauma oder Intoxikation.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Ischämie von Nerven oder von Nervengewebe wird in der Regel durch Gefässkrankheiten hervorgerufen, z. B. aufgrund einer Embolie oder einer Thrombose. Die Nerven des zentralen Nervensystems können hiervon betroffen sein, z. B. nach einem Hirninfarkt. Die Ischämie führt letztlich zu einem nekrotischen Absterben des betroffenen Gewebes.
Auch eine traumatische Einwirkung kann zu einem solchen Absterben von Nerven führen. So sind beispielsweise Rückenmarksverletzungen oder mechanische Läsionen peripherer Nerven bekannt. Ebenso können Umwelteinflüsse durch toxische Substanzen, z. B. Schwermetalle, zu einer Nekrose der Nerven führen.
Neuere Therapieansätze für solche Nervenschädigungen sehen die Verabreichung neurotropher Faktoren bzw. von Neurotrophinen vor, denen eine massgebliche Rolle für das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung diskreter neuronaler Populationen zugeschrieben wird. Diese Neurotrophin-Familie schliesst den Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF), vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor, BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4) und die CNTF-Familie (ziliare neurotrophe Faktoren) ein. Neurotrophine sind kleine basische Proteine mit einem Molekulargewicht im Bereich von 26 bis 28 kDa. NGF ist das am besten charakterisierte Mitglied der Neurotrophin-Familie, und es hat sich herausgestellt, dass NGF eine Aktivität in vielen verschiedenen Geweben zeigt.
Im peripheren Nervensystem (PNS) ist NGF für die Entwicklung von sympathischen und bestimmten sensorischen Nerven massgeblich. Im zentralen Nervensystem (ZNS) nimmt NGF eine trophische Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung cholinerger Neuronen im basalen Vorderhirn ein. Es spielt zudem eine Rolle bei der neuronalen Regeneration im erwachsenen ZNS-Gewebe.
Die Verwendung von neurotrophen Faktoren zur Behandlung postläsionaler neuronaler Krankheiten, wie z. B. traumatischen, ischämischen oder toxischen Ursprungs, hat jedoch bislang nicht den erhofften Erfolg gebracht.
Insbesondere im Fall einer Behandlung von Nervenschädigungen im Gehirn sind jedoch neurotrophe Faktoren nicht geeignet, da sie die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden können und somit einer parenteralen oder enteralen Verabreichung nicht zugänglich sind.
WO 88/09604 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung einer traumatischen Verletzung des zentralen Nervensystems eines Patienten, der an einem Hirn- oder Rückenmarktrauma leidet, welches die Verabreichung an den Patienten einer wirksamen Menge eines Thyrotropin-freisetzenden Hormonanalogons ohne Änderung im terminalen Prolinamidrest umfasst, wie z. B. 6-Methyl-5-oxo-thiomorpholinyl-3-carbonyl-histidyl-prolinamid, 4-(2-Oxo-trimethylenimin)-carbonyl-histidyl-prolinamid oder 4-(2-Oxo-furan)-carbonyl-histidyl-prolinamid.
Faden et al., American Journal of Physiology (1999), 277 (CA 132: 31033) ist eine wissenschaftliche Publikation, die zeigt, dass TRH und bestimmte TRH-Analoga beachtliche neuroprotektive Wirkungen in experimentellen Hirn- und Rückenmarktraumata zeigen, aber auch andere physiologische Wirkungen, die für die Behandlung von Neurotraumata in Menschen unerwünscht sein können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, Substanzen bereitzustellen, die das Nervenwachstum stimulieren und somit für eine Behandlung postläsionaler neuronaler Krankheiten, wie z. B. ischämischen, traumatischen oder toxischen Ursprungs, geeignet sind.
Dieses erfindungsgemässe Ziel wird gelöst durch die Verwendung der Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei X NH₂, NH-C_1-3-Alkyl oder N(C_1-3-Alkyl)₂ darstellt;
R₁ ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, die wahlweise mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sein kann, oder Ile ableitet;
R₂ ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Gly oder Ile ableitet;
Y₁ und Y₂ unabhängig voneinander H oder C_1-3-Alkyl darstellen;
R₃, R₄ und R₅ H darstellen; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon;
zur Behandlung von postläsionalen neuronalen Krankheiten ischämischen, traumatischen oder toxischen Ursprungs.
FIGUREN
1 zeigt die Korrelation zwischen experimentellen und errechneten Werten der Blut-Hirn-Verteilung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Sofern nicht anders angegeben, können die Aminosäurereste sowohl in der D- als auch in der L-Form vorliegen, wobei die L-Form bevorzugt ist.
In der Formel (I) ist R₁ ein Rest, der sich von Phe ableitet, die wahlweise durch eine oder mehrere Methoxygruppen oder ein oder mehrere Halogenatome substituiert sein kann, oder der sich von der Aminosäure Ile ableitet, R₂ ist ein Rest, der sich von der Aminosäure Gly oder Ile ableitet, R₃, R₄ und R₅ sind ein Wasserstoffatom, X ist NH₂, NH-(C_1-3)-Alkyl oder N-(C_1-3-Alkyl)₂, und Y₁ und Y₂ sind unabhängig voneinander H oder (C_1-3)-Alkyl.
Besonders bevorzugt als Verbindung der Formel (I) ist Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-phenylalanyl-L-prolinethylamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-isoleucyl-prolinamid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Die verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren (Phe für Phenylalanin usw. wie auch die teilweise unten verwendeten Einbuchstabenabkürzungen, wie F für Phenylalanin) sind dem Fachmann geläufig (siehe z. B. Beyer und Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1988). So bedeutet Phe Phenylalanin, Gly Glycin usw. Der Ausdruck "ein Rest, der sich von der Aminosäure Phe ableitet", bezeichnet somit einen Benzyl (-CH₂-C₆H₅)-Rest. Entsprechend bezeichnet "ein Rest, der sich von der Aminosäure Gly ableitet", ein Wasserstoffatom, "ein Rest, der sich von der Aminosäure Ala ableitet", eine Methylgruppe usw.
Die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen der Formel (I) sind wasserlösliche Substanzen und somit für eine enterale oder parenterale Verabreichung geeignet.
Die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen sind jedoch nicht gleichermassen für die orale/enterale oder parenterale Verabreichung geeignet. Während z. B. HCl-Gly-Phe-ProNH₂ in erster Linie für die parenterale Verabreichung in Betracht kommt, sind N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH₂ und N,N-Diethyl-Ile-Phe-ProNHEt für die parenterale und insbesondere orale Verabreichung geeignet. Die Eignung der erfindungsgemäss zu verwendenden Verbindungen für die orale Verabreichung kann unter Verwendung des sogenannten "Parallel Artificial Membrane Permeation Assay" abgeschätzt werden, der unten detaillierter beschrieben wird. Für die orale Verabreichung werden solche Verbindungen mit Werten von mehr als 10, vorzugsweise mehr als 30, noch bevorzugter mehr als 45, wie gemäss diesem Assay bestimmt, bevorzugt.
Eine wesentliche Voraussetzung für die Wirksamkeit der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide und Tripeptidderivate ist ihre Konzentration im ZNS. Neben anderen Faktoren wird dies durch das Mass des Durchlasses der Blut-Hirn-Schranke bestimmt, die durch aktiven oder passiven Transport stattfinden kann. Ein sogenannter erleichterter Transport oder Transport über Lipidtransporter (lipid rafts) kommen als Mechanismen in Betracht. Das Gleichgewicht des Transports wird unabhängig von der Art oder dem Mechanismus durch den Blut-Hirn-Verteilungskoeffizienten (log HB) ausgedrückt. Je höher dieser Koeffizient, desto höher ist die Konzentration im ZNS.
Die Definition und Bestimmung des Blut-Hirn-Verteilungskoeffizienten durch molekulares Modellieren in Verbindung mit QSAR (quantitative structure activity relationships) wird unten detaillierter beschrieben. Der Blut-Hirn-Verteilungskoeffizient der erfindungsgemäss zu verwendenden Verbindungen liegt vorzugsweise bei –3,5 oder höher, insbesondere bevorzugt im Bereich von –3,0 und höher.
Weiterhin zeigen die erfindungsgemäss verwendeten Substanzen der Formel (I) eine hohe Affinität für Tyrosinkinase-Rezeptoren (TrkA, TrkB und TrkC). Da es bekannt ist, dass die neurotrophe Substanz NGF über Anlagerung an diese Rezeptoren wirkt, ist eine hohe Affinität für diese Rezeptoren ein starkes Indiz für die neurotrophe Wirkung der erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen. Die Bindekonstante (pKD) kann durch molekulares Modellieren bestimmt werden, und ein entsprechendes Verfahren wird unten im Detail be schrieben. Die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen weisen vorzugsweise pKD-Werte von 5,5 oder mehr, noch bevorzugter pKD-Werte von 7 oder mehr, auf.
Die Synthese der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate ist nicht besonders beschränkt und kann gemäss bekannten Verfahren, vorzugsweise stereospezifischen Verfahren der Peptidchemie, durchgeführt werden, bei denen die L- bzw. D-Konfiguration der jeweiligen Aminosäuren bzw. ihrer Derivate beibehalten wird. Verschiedene Peptidsynthesen sind in Beyer und Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1988, Seiten 829 bis 834, beschrieben. Erfindungsgemäss bevorzugt sind insbesondere die N-Carbonsäureanhydrid-Methode (NCA-Methode) und die Methode unter Verwendung von gemischten Carbonsäureanhydriden, wie durch die folgenden Reaktionsgleichungen veranschaulicht:
NCA-Methode

1. Boc-AA1-NCA + H-L-Pro-NH₂ → BOC-AA1-L-Pro-NH₂
2. Boc-AA1-L-Pro-NH₂ + TFA → TFA-H-AA1-L-Pro-NH₂
3. Boc-AA2-NCA + TFA-H-AA1-L-Pro-NH₂ → HCl-H-AA2-L-AA1-Pro-NH₂
4. Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH₂ + HCl → HCl-H-AA2-AA1-L-Pro-NH₂

Gemischte Carbonsäureanhydridsynthese

1. Boc-AA1OH + Cl-COOCH₂(CH₃)₂ → Boc-AA1-OCOO-CH₂CH(CH₃)₂
2. Boc-AA1-OCOOCH₂CH(CH₃)₂ → Boc-AA1-L-Pro-NH₂ 3. Boc-AA2-OH + Cl-COOCH₂CH(CH₃)₂ → Boc-AA2-OCOOCH₂CH)CH₃)₂
4. Boc-AA2-OCOOCH₂CH(CH₃)₂ + TFA-H-AA1-L-Pro-NH₂ → Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH₂
5. Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH₂ + HCl → HCl-H-AA2-AA1-L-Pro-NH₂ wobei AA1 bzw. AA2 die mittlere bzw. endständige Aminosäure (abgeleitet von R₁ bzw. R₂) bezeichnen, Boc einen tert-Butyloxycarbonylrest bezeichnet, NCA N-Carbonsäureanhydrid bezeichnet, und TFA Trifluoressigsäure bezeichnet. Die Ausgangsstoffe sind jeweils im Handel erhältlich.

Bei Verwendung von Aminosäuren, die weitere funktionelle Gruppen aufweisen, wie z. B. Serin, können diese in dem Fachmann geläufiger Weise geschützt werden.
Zudem können die erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate in einer gegebenenfalls modifizierten Merryfield-Synthese an der Festphase synthetisiert werden, vorzugsweise unter Verwendung von Fluoren-9-yl-methoxy-carbonyl-Schutzgruppen (Fmoc-Reste) bzw. Fmoc/tert-Butyl (tBu)-geschützten Aminosäuren.
Die oben beschriebenen Reaktionen weisen in der Regel Ausbeuten in der Grössenordnung von über 90%, bezogen auf den einzelnen Reaktionsschritt, und eine Gesamtausbeute von mehr als 60% auf. Die Reinheit der so synthetisierten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate betrug im allgemeinen über 98% und war daher ausreichend für die Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen. Die Strukturen der Tripeptide bzw. Tripeptidderivate können durch Massenspektroskopie (MS), Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), automatisierte Aminosäureanalyse (AAA), optische Drehung (OR), Infrarot- und Ultraviolettspektroskopie (IR, UV) bestätigt werden.
Regelmässig wirksam ist eine Verabreichung in einer Dosis von mehr als 5 mg pro Kilogramm Körpergewicht, gegebenenfalls bei mehrfacher parenteraler Verabreichung.
Aufgrund ihrer molekularen Struktur weisen diese Substanzen eine sehr geringe Toxizität sowohl in akuten wie auch in chronischen Toxizitätsuntersuchungen auf. Die geringste letale Dosis (i. v.) in Ratten betrug 250 bis 350 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Daher zeigen die getesteten Substanzen ein komfortables therapeutisches Verhältnis, das eine Voraussetzung für eine therapeutische Anwendung im Menschen darstellt.
Die Tripeptide bzw. Tripeptidderivate können für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die für die Verabreichung über verschiedene Wege geeignet sind, z. B. parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan), über den Atemwegstrakt (bukkal, sublingual, nasal, bronchial), den transdermalen Weg (perkutan) und die enterale Route (peroral). Im letzteren Fall ist eine geeignete Dosierung notwendig, um einen eventuellen "First Pass Effect" zu überwinden.
Die erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel oder Adjuvantien. Zur Formulierung können Standardtechniken verwendet werden, wie z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Williams & Wilkins, Pa., USA, 20. Auflage, offenbart.
Die Verabreichungsform wird in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg gewählt und umfasst unter anderem Tabletten, Kapseln, Pulver und Lösungen.
Für die orale Verabreichung werden vorzugsweise Tabletten und Kapseln verwendet, die ein geeignetes Bindemittel, z. B. Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, einen geeigneten Füllstoff, wie z. B. Lactose oder Stärke, ein geeignetes Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat, und wahlweise weitere Zusatzstoffe enthalten.
Eine besonders bevorzugte Formulierung für die orale Verabreichung ist eine beschichtete Tablette, enthaltend 100 mg oder 200 mg N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH₂, Siliciumdioxid, Magnesiumstearat, Macrogol 400/600, Hypromellose (E404)-titandioxid und Croscarmellose-Na.
Für die parenterale Verabreichung sind sterile wässrige Lösungen bevorzugt. Geeignete wässrige Lösungsmittel schliessen Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Hank-Lösung und Ringer-Lösung ein. Bevorzugt ist unter anderem eine physiologische Kochsalzlösung enthaltend 20 g/l des Tripeptids bzw. Tripeptidderivats, z. B. Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid.
Eine besonders bevorzugte Formulierung für die parenterale Verabreichung ist eine Ampulle für die Injektion, enthaltend 5 oder 10 ml einer Injektionslösung für die Infusion, umfassend 100 mg oder 200 mg lyophilisiertes HCl-Gly-Phe-ProNH₂, Essigsäure, Natriumacetat und Wasser für die Injektion.
Besonders für die Behandlung von Rückenmarkverletzungen und mechanischen Läsionen peripherer Nerven ist die Implantierung eines Materials, an dem die erfindungsgemäss zu verwendenden Verbindungen immobilisiert worden sind, eine geeignete Methode zur Sicherstellung eines geführten Nervenwachstums. Verschiedene Verfahren zur Immobilisierung von Peptiden an eine Vielzahl von Materialien sind bekannt (für Referenzen siehe US 6 156 572 ). Erfindungsgemäss ist es besonders bevorzugt, die Verbindungen der Formel (I) an ein biokompatibles und möglicherweise bioabbaubares Material, wie z. B. Hydrogele, vorzugsweise Polysaccharidhydrogele, wie z. B. Agarose, Alginat oder Chitosan, oder Poly(lactid), Polyethylenoxid und Hyaluronat, zu immobilisieren. Die Immobilisierungsverfahren der Peptide an diese Materialien sind dem Fachmann bekannt und umfassen typische Aktivierungsschritte von Hydroxylgruppen zur Bildung von Amidbindungen, wie z. B. Carbodiimid, wie z. B. EDC-Aktivierung oder die Verwendung eines bifunktionellen Imidazol-Kupplungsagenses, z. B. 1,1'-Carbonyldiimidazol. Besonders geeignete Immobilisierungsmatrixen sind in US 6 156 572 offenbart.
Zudem können die erfindungsgemäss zu verwendenden Tripeptide in eine periphere Nervenbrücke eingeführt werden, die wiederum in die Transektionsläsionslücke implantiert wird (siehe S. Varon, J. M. Conner, Nerve Growth Factor in CNS Repair, Journal of Neurotrauma, Bd. 11, Nr. 5, 1994).
Die neuroregenerative Wirkung der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate, ist überraschend, da Peptide regelmässig einer proteolytischen Spaltung durch Endo- oder Exopeptidasen und weiterer Metabolisierung unterliegen, so dass ein Erreichen der Blut-Hirn-Schranke und sogar deren Überwindung nicht erwartet werden konnte. Das Ausmass und die Geschwindigkeit einer solchen Spaltung wird durch die Halbwertszeit des Tripeptids bzw. Tripeptidderivats im Plasma angezeigt. Es ist bekannt, dass die Halbwertszeit von Tripeptiden, wie z. B. Thyroliberin, sehr kurz ist. Daher war es überraschend, dass die erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate unerwartet lange Halbwertszeiten (≥ 24 std) aufweisen. Diese lange Halbwertszeit ist eine weitere Voraussetzung für eine ausreichende neuroregenerative Wirkung.
Zudem konnte an Hepatozyten experimentell gezeigt werden, dass die erfindungsgemässen Tripeptide bzw. Tripeptidderivate nur langsam in der Leber metabolisiert werden. Dieses Ergebnis wurde durch Analyse des Plasmas und der Hepatozyten bestätigt, in dem mehr als 4 Stunden nach Exposition nur das unveränderte Tripeptid gefunden wurde.
Die hervorragenden therapeutischen Eigenschaften der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate werden im folgenden anhand eines Neuritenwachstums-Assays (sprouting assay) dargelegt. Bevor diese Versuche im Detail beschrieben werden, werden jedoch zuvor die Bestimmung des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten, der PAMPA-Assay, die Bestimmung der TrK-Bindekonstanten, die Bestimmung der Halbwertszeit und ausgewählte Synthesen des Tripeptidderivats beschrieben, die in den darauffolgenden Versuchsreihen verwendet wurden.
EXPERIMENTELLER TEIL
(1) Bestimmung des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten
Wie bereits oben dargelegt, stellt die Blut-Hirn-Schranke für wasserlösliche Stoffe in der Regel ein Hindernis dar, das die Anwendung vieler wasserlöslicher Stoffe für die Behandlung des ZNS bei herkömmlicher Verabreichung verhindert. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate diese Blut-Hirn-Schranke zu überwinden vermögen. Dieses Ausmass der Blut-Hirn-Verteilung der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate kann wie folgt quantifiziert werden.
Als Technik zur Quantifizierung bestimmter physikochemischer oder pharmakologischer Eigenschaften chemischer Verbindungen hat sich die sogenannte QSAR (quantitative structure activity relationship)-Technik etabliert. Hierbei wird eine in der Regel lineare Korrelation zwischen einer bestimmten experimentellen Eigenschaft der Verbindungen (wie z. B. des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten (HB)) mit berechneten strukturellen Parametern A, B, C usw. durch Anpassung der sogenannten Deskriptoren (X1, X2 usw.) gefunden, wobei die Gleichung prinzipiell die folgende Form aufweist: Log HB = (X1 Λ A) + (X2 × B) + (X3 × C) + ... + Konstante.
Mit den so bestimmten Deskriptoren ist es dann möglich, die jeweilige experimentelle Eigenschaft, wie z. B. den Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten von Verbindungen, für die diese experimentellen Daten nicht vorliegen, zu berechnen. Entsprechend wird erfindungsgemäss die Hirn-Blut-Verteilung wie folgt bestimmt.
Auf Grundlage von experimentellen Daten von 75 Verbindungen (siehe Luco, J. M., J. Chem. Inf. Comput. Sci. (1999), 39, 396–404) und bestimmten Parametern, wie im folgenden dargelegt, konnte eine lineare Korrelation zwischen berechneten und experimentellen Werten erhalten werden.
Die Verbindungen wurden hierbei unter Verwendung des Molecular Modelling-Programmpakets SYBYL konstruiert (Tripos Associates Inc., 1699 S. Henley Road, Suite 303, St. Louis, MO63144, USA). Um Konformationen niedriger Energie der Verbindungen eines ausgewählten Satzes (A-F-P, A-dF-P, A-F-dP, A-dF-dP) zu bestimmen, wurde eine Zufallssuche ausgeführt. Alle Torsionswinkel, mit Ausnahme der der Peptidbindung, wurden als flexibel betrachtet. Die Grundgerüstkonformationen der Strukturen mit der geringsten Energie wurden dann als Ausgangskonformation für alle Verbindungen verwendet.
Alle manuell konstruierten Verbindungen wurden unter Verwendung des Tripos-Kraftfeldes (siehe Clark, M., Kramer, III, R. D. und van Optenbosch, N. (1989), J. Comp. Chem. 10, 982–991) mit Gasteiger (PEOE)-Partialladungen (Gasteiger, J., Marsili, M. (1980; Tetrahedron 36, 3219–3238)) und einer distanzabhängigen dielektrischen Konstante von 4 energetisch minimiert.
Das Molecular Graphics-Programm MOE (Chemical Computing Group Inc., Montreal, Canada, http://www.chemcomp.com) ermöglicht dann die Berechnung von einem anwendbaren Satz von Deskriptoren, die nur von der Verknüpfung der Verbindungen und der Atomtypen (Typen im Sinne der Kraftfeldparameter) abhängen (siehe Labute auf der oben erwähnten Home Page). Die hier verwendeten Deskriptoren schliessen eine einfache Annäherung der van der Waals-Oberfläche der Verbindungen ein. Für die Testserie von 1947 organischen Verbindungen konnte eine hohe Korrelation (r² = 0,9666) zwischen der exakten van der Waals-Oberfläche und der 2D-Annäherung erhalten werden. Der erste Satz der 14 Parameter (PEOE-VSA) zieht die Ladungsverteilung (PEOE) des Moleküls unter Verwendung gleichförmiger Intervallgrenzen in Betracht. Ein zweiter Satz von 10 Deskriptoren (SlogP-VSA) beschreibt das Log (P) der Verbindungen und ein dritter Satz von 8 Deskriptoren (SMR-VSA) hängt von der molekularen Polarisierbarkeit ab.
Die Werte für die oben beschriebenen 32 Deskriptoren wurden jeweils für die 75 Verbindungen berechnet (siehe Lucco, J. M., J. Chem. Inf. Comput. SCI. (1999), 39, 396–404), um eine Korrelation zu der experimentellen Hirn-Blut-Verteilung zu finden. Eine Regression der Hauptkomponenten wurde durchgeführt, um ein lineares Modell für Log (HB) als eine Funktion der Deskriptoren abzuschätzen. In einer ersten Berechnung ergab sich, dass 8 Deskriptoren aufgrund sehr geringen Beitrages vernachlässigt werden konnten. Nach dem zweiten Durchlauf ohne diese 8 Deskriptoren erschienen 9 Deskriptoren mit Beiträgen von weniger als 0,1. Letztendlich ergab sich auf Grundlage der Berechnungen von 70 Verbindungen (5 stark abweichende Verbindungen wurden weggelassen) unter Verwendung der verbleibenden 15 Deskriptoren eine relativ lineare Korrelation. Diese Korrelation ist graphisch in 1 gezeigt (in der Graphik: verwendete Komponenten: 15; condition number 663.7658; root mean square error (RMSE): 0.20126; correlation coefficient (R2): 0.93240; cross-validated R2: 0.88321).
Wobei Log(HB) wie folgt definiert ist: Log (HB) = Log (Konzentration im Gehirn)/(Konzentration im Blut)).
Die durch diese Korrelation erhaltenen Deskriptoren können dann für die Berechnung der Hirn-Blut-Verteilung von den erfindungsgemässen Tripeptiden bzw. Tripeptidderivaten verwendet werden.
Unter anderem wurden folgende Werte erhalten, die sich auf die bei physiologischem pH-Wert vorliegenden Formen beziehen:

A₁: aliphatische Aminosäuren einschliesslich Substitution an der Aminogruppe, gemäss Formel (I) Y₁Y₂N-CR₂H-CO-.
A₂: aromatische Aminosäuren einschliesslich Substitution am Phenylring, sowie aliphatische Aminosäuren, gemäss Formel (I) -NH-CHR₁-CO-.
A₃: Prolin und Derivate Aus diesen Berechnungen können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
D: rechtsdrehend

(a) Die Verwendung des Prolinamids, des Prolin(diethyl)amids oder des Prolinmethylesters anstelle der freien Säure des Prolins ist im Hinblick auf die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke vorteilhaft.
(b) Unter den verwendeten Bausteinen von A₂ (entsprechend R₁) sind die aliphatische Aminosäure Ile sowie die aromatische Aminosäure F und deren Alkylderivate vorteilhaft.
(c) Unter den verwendeten Bausteinen von A₁ (entsprechend R₁) ist die aliphatische Aminosäure I sowie die Substitution der Aminogruppe von G und I durch 2 Ethylgruppen besonders vorteilhaft.
(d) Die optische Chiralität der Aminosäurebausteine spielt zumindest bei der passiven Überwindung der Blut-Hirn-Schranke offenbar keine Rolle.

(2) Absorption im Magen-Darm-Trakt
Die Absorption eines oral verabreichten Arzneimittels wird durch seine Fähigkeit bestimmt, die Magen-Darm-Schranke zu überwinden. Das "Parallel Artificial Membrane Permeation Assay-System (PAMPA) ist ein einfaches und schnelles Verfahren zum Vorhersagen der Arzneimittelabsorption im Magen-Darm-Trakt. Die Arzneimittelpermeation von biologischen Zellschichten wird hauptsächlich bestimmt durch passive Diffusionsprozesse. Das PAMPA-Verfahren misst die Permeation von potentiellen neuen Arzneimitteln durch eine künstliche Membran durch passive Diffusion und erlaubt eine Klassifizierung in geringe, mittlere und hohe Absorber.
Die Vorgehensweise gemäss dem Parallel Artificial Membrane Permeation Assay, beschrieben von Kansy et al., wurde verwendet (M. Kansy, F. Senner, K. Gobernator, Physicochemical Hight Throughout Screening: Parallel Artificial Membrane Permeation Assay in the Description of Passive Absorption Processes, J. Med. Chem., 1998, 41(7), 1007–1010). Die künstliche Membran wurde aufgebaut durch Pipettieren einer Lösung von Lecithin in einem organischen Lösungsmittel auf einem stützenden Filtermaterial in einer 96er-Titerplatte. Für alle Testverbindungen wurden Stammlösungen von 5 mM in Ethanol hergestellt. Diese wurde dann in Tris-Puffer (0,05 M, pH 7,4) auf eine Endkonzentration von 500 μM verdünnt. Die Permeationsraten aller Testverbindungen wurden dreimal oder viermal gemessen. Die Diffusionszeit durch die künstliche Membran betrug 16 Stunden. Für alle Verbindungen wurden Referenzwerte ohne Phospholipidschicht einzeln bestimmt. Konzentrationen in den Akzeptorkompartimenten wurden durch UV-Differenzspektroskopie unter Verwendung eines Mikrotiterplattenreaders Spectramax Plus³⁸⁴ von Molecular Devices gemessen. Für jede Verwendung wurden λmax-Werte in einem vorhergehenden Durchlauf bestimmt, und die Messungen wurden bei dieser Wellenlänge durchgeführt. Die Permeationsraten wurden als Flussraten ausgedrückt, die gemäss der folgenden Formel berechnet werden: Fluss (%) = OD (Testvertiefung)/OD (Kontrollvertiefung) × 100. Als interner Standard wurden drei Arzneimittel mit bekannten Flussraten für niedrige, mittlere und hohe Permeation in der Testplatte einbezogen: Bretylium, Hydrocortison und Cumarin. Nach dem Permeationsexperiment wurde die Intaktheit der Membran geprüft, um zu untersuchen, ob die Testverbindungen die künstliche Membran durch einen toxischen oder unspezifischen Effekt geschädigt und daher ein falsches positives Ergebnis geliefert haben. Lucifer Yellow, ein nicht-permeierender Farbstoff, ist jeder Vertiefung nach dem Experiment zugefügt worden, und die Konzentration des Markers wurde in einem Wallac Victor² 1420 Multilabel Counter gemessen. Vertiefungen, in denen die Konzentration von Lucifer Yellow 1% der in den Kontrollvertiefungen (ohne künstliche Membran) überstiegen, wurden ausser Acht gelassen. In dem vorliegenden Experiment überstieg nur eine Vertiefung (für die Referenzverbindung Bretylium) diese Grenze und wurde daher nicht berücksichtigt.
Die Tabelle 1 zeigt die Flussraten der 7 Testverbindungen und der 3 Referenzverbindungen
Die interne Kontrolle durch die 3 Referenzverbindungen, deren Flussraten mehrfach von uns und anderen gemessen worden sind (siehe Kansy et al. oben), zeigten keine Anomalien und bestätigen die guten Bedingungen, unter denen das Experiment durchgeführt wurde. Bretylium, eine aktiv transportierte Verbindung, die eine geringe Bioverfügbarkeit in Menschen zeigt, zeigte eine Flussrate von 0% auch in diesem Experiment. Die Flussraten für Hydrocortison und Cumarin, veröffentlicht von Kansy et al. (siehe oben) betrugen jeweils 52 bzw. 66%. Diese Daten stimmen sehr gut mit den in unserem Experiment erhaltenen Ergebnissen überein (Tabelle 1).
Das PAMPA-Verfahren erlaubt eine Klassifizierung von Verbindungen in 3 Gruppen.:
Geringe (Flussrate < 20%), mittlere (20% < Flussrate < 50%) und hohe (Flussrate > 50%) Permeatoren. Gemäss dieser Klassifizierung sind HCl-Gly-Phe-ProNH₂, wie auch TRH und H-Gly-Phe-Pro-OH schwach absorbierende Verbindungen, und für N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH₂, N-Isopropyl-Ile-Ile-ProNH₂, N,N-Diethyl-Gly-Ile-ProNH₂ und N,N-Diethyl-Ile-Phe-ProNHEt wird vorhergesagt, dass sie mittlere bis hoch absorbierende Verbindungen nach peroraler Verabreichung sind.
Auf Grundlage der in dieser Studie erhaltenen Ergebnisse kann die folgende Rangordnung der Testverbindungen bezüglich der Permeabilität von biologischen Membranen vorgenommen werden:
HCl-Gly-Phe-ProNH₂, H-Gly-Phe-Pro-OH < TRH, N,N-Diethyl-Gly-Ile-ProNH₂ < N-Isopropyl-Ile-Ile-ProNH₂ < N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH₂ < N,N-Diethyl-Ile-Phe-ProNEt.
Eine Beschränkung des PAMPA-Permeationstestsystems, wie es hier beschrieben wird, ist die Tatsache, dass es nur Verbindungen detektieren kann, die über den transzellulären Weg transportiert werden. Verbindungen, die den parazellulären oder aktiven weg bevorzugen, können trotz einer guten Absorption im Menschen nach peroraler Verabreichung geringe Flussraten zeigen.
(3) Bestimmung der Bindekonstanten
Auf Grundlage von Röntgenstrukturen oder Modellen von Dimerfragmenten von TrkA, TrkB und TrkC wurden Bindungsstudien von mehreren Verbindungen der Formel (I) durchgeführt. Für alle Anordnungen der Liganden zwischen beiden Monomeren sollten die Affinitätskonstanten (pKd = pKi) mittels theoretischer Modelle berechnet werden (siehe R. Wang, L. Liu, L. Lai, Y. Tang, J. Mol. Model., 1998, 4, 379–394).
(a) Modellierung der Dimeranordnung der Rezeptoren
Die Grundlage für alle folgenden Untersuchungen ist die Röntgenstruktur (pdb = 1www) eines TrkA-Fragments, das NGF bindet (siehe C. Wiesmann, M. H. Ultsch, S. H. Bass, A. M. De Vos, Nature 1999, 401, 184).
Wir nehmen an, dass die Liganden in einer ähnlichen Weise wie NGF an zwei Monomere von TrkA, TrkB oder TrkC binden können. Je höher die Affinität der Liganden, desto näher werden beide Monomere zusammengehalten, was als Hauptfunktion für die Aktivität in Betracht gezogen wird. Da NGF viel grösser ist als die Tripeptidderivate, müssen Modelle gebildet werden, die das Binden von ziemlich kleinen Molekülen erlauben. Zu diesem Zweck wurden die Koordinaten von NGF aus der Röntgenstruktur entfernt, und ein Monomer wurde manuell nahe an den van der Walls-Kontakt des anderen Monomers bewegt (unter Verwendung des Molecular Modelling Package SYBYL; TRIPOS Associates Inc.). Um eine relevante Anordnung beider nicht-belegter Monomere zusammen zu finden, wurden molekulare Dynamiksimulationen (MD) unter Verwendung des AMBER-ALL-ATOM-Kraftfelds (siehe S. J. Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc. 1984, 106, 765–784) bei 150 K für 20.000 fs durchgeführt. Die resultierende Struktur nach dieser Simulation wurde an einen Energiegradienten von 0,1 kcal/mol Å2 optimiert. Diese Struktur wurde als ein Templat zur Modellierung der Strukturen von TrkB und TrkC wie auch für die Bindungsstudien verwendet.
Modelle für die Dimeranordnung von TrkB und TrkC wurden unter Verwendung des Homologiemodellierwerkzeugs COMPOSER (siehe T. L. Blundell, D. Carney, S. Gardner, F. Hayes, B. Howlin, T. Hubhard, Eur. J. Biochem. 1988, 172-513-20) von SYBYL und anschliessend MD und Energieminimierungen generiert. Die resultierenden Strukturen wurden bezüglich der Qualität unter Verwendung von PROCHECK überprüft (siehe R. A. Laskowski, M. W. MacArthur, D. S. Moss, J. M. Thornton, J. Appl. Cryst., 1993, 26, 283–291).
(b) Bindungsstudien der Liganden
Das Programm GOLD (siehe D. T. Jones, J. Mol. Biol., 1999, 292(2), 195–202; D. T. Jones, W. R. Taylor, J. M. Thornton, Nature 1992, 358, 86–89) wurde für ein "automatisches" Binden der Liganden verwendet. Um ein optimales Anbinden jedes Liganden an alle drei Rezeptoren sicherzustellen, wurden zwei leicht unterschiedliche Bindungsstellen untersucht. Unter Verwendung von GOLD wurden für jeden Durchlauf 20 Bindestrukturen (insgesamt 40) bestimmt. Da die Proteinstrukturen als fest angenommen werden, wurden alle 40 Anordnungen unter Beibehaltung nur des Rückgrats des Rezeptors optimiert.
(c) Bestimmung der Affinitätskonstanten
Für alle Protein-Ligand-Komplexe wurden die Wechselwirkungsenergien der Liganden mit den Rezeptoren unter Verwendung des Tripos-Kraftfeldes, des sogenannten Fitnesswertes, unter Verwendung von GOLD und dem Programm SCORE (siehe Wang et al., ibid), um die pKd-Werte zu bestimmen, die den pKi-Werten im Fall von Enzyminhibitorkomplexen entsprechen, berechnet (je höher die Fitness- oder die pKd-Werte, desto höher ist die Affinität der Liganden). SCORE berücksichtigt nicht nur Wechselwirkungsenergien, sondern auch die Solvatisierung, Desolvatisierung und Entropieeffekte in den Bindungsanordnungen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst, die die besten pKd (pKi)-Werte für jeden der Liganden an den Rezeptor zeigen. Die Tabelle zeigt auch die Werte der wie oben bestimmten Blut-Hirn-Verteilungen.
Die höchste Affinität wurde für Et2-IFP-NH-Et (pKi-Wert von 7,29; etwa 100 nM) beim Binden an TrkA vorhergesagt (durch SCORE). Einige Wasserstoffbindungen können detektiert werden, am wichtigsten sind jedoch hydrophobe Wechselwirkungen von sowohl N-terminalen Ethylgruppen wie auch der Ile-Seitenkette mit drei Histidinresten und der Phenylalanin-Seitenkette mit Phe327 des Rezeptors. Für alle restlichen Liganden ist die Affinität etwa eine Grössenordnung geringer.
(4) Synthesen
(a) Synthese von HCl-H-Gly-L-Phe-L-Pro-NH₂
Schritt 1: Boc-L-Phe-OH + H-L-Pro-NH₂ → Boc-L-Phe-L-Pro-NH₂

87,6 g Boc-L-Phe-OH wurden in einer Mischung aus 50 ml Dimethylformamid (DMF) und 300 ml 1,2-Dimethoxyethan (DME) gelöst und auf –15°C abgekühlt. Dann wurden 37 ml N-Methylmorpholin (NMM) (1 Äquivalent) auf einmal hinzugefügt und dann 45 ml Isobutylchloroformiat (IBCF)(1 Äquivalent) über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugetropft. Die Mischung wurde dann bei –15°C weitere 5 Minuten gerührt. 40 g TFA·H-L-Pro-NH₂ (1,06 Äquivalente) wurden hierzu nach und nach über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt, und anschliessend wurden 315 ml N,N-Diisopropyl-N-ethylamin (DIEA) (1 Äquivalent) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck umgesetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung in einem Rotationsverdampfer, ausgestattet mit einer Wasserstrahlpumpe und einer Trockeneis/Aceton-Falle, aufkonzentriert, und der Rest wurde in 1 l Ethylacetat aufgenommen. Anschliessend wurde zwölfmal mit jeweils 80 ml einer 1 N wässrigen KHSO₄-Lösung, einmal mit 80 ml Kochsalzlösung, zehnmal mit jeweils 80 ml einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung, einmal mit einer 80 ml Kochsalzlösung in einem 2 l-Trenntrichter gewaschen. Das anschliessende Trocknen erfolgte über 50 g Na₂SO₄. Nach Filtrieren durch einen Sinterglastrichter (grobe Porosität) wurde wiederum wie oben aufkonzentriert. Dann wurde der Verdampfungsrest (ein trockener Schaum) in 1 l Hexan verrieben, und ein Feststoff wurde auf einem Sinterglastrichter (120 mm im Durchmesser × 120 mm, mittlere Porosität) aufgesammelt. Das anschliessende Trocknen erfolgte in einem Exsikkator über einen Zeitraum von 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Druck von 0,1 bis 1 mmHg (Vakuumölpumpe, mit Trockeneis/Aceton-Falle). So wurden 92,8 g Boc-L-Phe-L-Pro-NH₂ erhalten (Ausbeute: 77,8%). Analysedaten

Molmasse (Massenspektrometrie):	317 g/mol
Schmelzpunkt:	60°C (Zersetzung)
Reinheit (HPLC):	95,2%
optische Rotation [Na/20°C]:	–23,9
H₂O [KF]:	1,84%
Schwermetalle:	25,4 ppm
Lösungsmittel:	2,02‰
Elementaranalyse:	64,0% C 7,4% H 11,4% N 17,0% O

Schritt 2: Boc-L-Phe-L-Pro-NH₂ → TFA·H-L-Phe-L-Pro-NH₂
Das in Schritt 1 erhaltene Boc-L-Phe-L-Pro-NH₂ (180 g) wurde in einem 2 l-Rundhalskolben, ausgestattet mit einem magnetischen Rührer, in 250 ml Methylenchlorid gelöst bzw. suspendiert. Dann wurden 250 ml Trifluoressigsäure über eine Stunde mit der Lösung bei Raumtemperatur (15–25°C) und Atmosphärendruck umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann in 5 l tert-Butylmethylether (TBME) unter Rühren ausgefällt und das Präzipitat auf einem Sinterglastrichter aufgesammelt, und anschliessend wurde zweimal mit 1,5 l Diethylether und zweimal mit 1 l Hexan gewaschen. Das anschliessende Trocknen erfolgte wie in Schritt 1.
Schritt 3: Boc-Gly-OH + TFA·H-L-Phe-L-Pro-NH₂ → Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH₂

44 g Boc-Gly-OH (1 Äquivalent) wurden in einer Mischung von 50 ml DMF und 300 ml DME gelöst und dann auf –15°C abgekühlt. Dann wurden 28 ml NMM (1 Äquivalent) in einem Schub hinzugefügt und dann 34 ml (1 Äquivalent) IBCF über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugetropft. Die Mischung wurde dann bei –15°C über weitere 5 Minuten gerührt. 94,5 g TFA·H-L-Phe-L-Pro-NH₂ (1,06 Äquivalente) wurden hierzu nach und nach über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt, und anschliessend wurden 44 ml DIEA (1 Äquivalent) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck umgesetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung in einem Rotationsverdampfer, ausgestattet mit einer Wasserstrahlpumpe und einer Trockeneis/Aceton-Falle, aufkonzentriert, und der Rest wurde in 1,2 l Ethylacetat aufgenommen. Anschliessend wurde fünfmal mit jeweils 80 ml einer 1 N wässrigen KHSO₄-Lösung, einmal mit 80 ml Kochsalzlösung, fünfmal mit jeweils 80 ml einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung, und einmal mit einer 80 ml Kochsalzlösung in einem 2 l-Trenntrichter gewaschen. Das anschliessende Trocknen erfolgte über 50 g Na₂SO₄. Nach Filtrieren durch einen Sinterglastrichter (grobe Porosität) wurde wiederum wie oben aufkonzentriert. Dann wurde der Verdampfungsrest (ein trockener Schaum) in einer Mischung aus 1 l Diethylether und 2 l Hexan verrieben, und ein Feststoff wurde auf einem Sinterglastrichter (120 mm im Durchmesser × 120 mm, mittlere Porosität) aufgesammelt. Das anschliessende Trocknen erfolgte in einem Exsikkator über einen Zeitraum von 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Druck von 0,1 bis 1 mmHG (Vakuumölpumpe, mit Trockeneis/Acetonfalle). So wurden 100 g Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH₂ erhalten (Ausbeute: 94,7%). Analysedaten

Molmasse (Massenspektrometrie):	418 g/mol
Schmelzpunkt:	66°C (Zersetzung)
Reinheit (HPLC):	98,6%
optische Rotation [Na/20°C]:	–27,9
H₂O [KF]:	3,78%
Schwermetalle:	40,2 ppm
Lösungsmittel:	1,8‰
Elementaranalyse:	61,2% C 7,5% H 12,8% N 18,4% O

Schritt 4: Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH₂ → HCL·H-Gly-L-Phe-L-Pro-NH₂

Das in dem Schritt 3 erhaltene Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH₂ (149 g) wurde in 300 ml Methylenchlorid gelöst bzw. suspendiert und dann wurden 300 ml 4 N HCL/Dioxan hinzugefügt. Die Mischung wurde über eine Stunde bei Raumtemperatur (15–25°C) bei Atmosphärendruck in einem 2 l-Rundhalskolben mit magnetischem Rührer umgesetzt. Anschliessend wurde 1 l Diethylether zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und das Präzipitat mit einem Sinterglastrichter aufgesammelt. Das Präzipitat wurde dann zweimal mit 1,5 l Diethylether gewaschen und wie in Schritt 1 getrocknet. Analysedaten

Molmasse (Massenspektrometrie):	318 g/mol
Schmelzpunkt:	93°C (Zersetzung)
Reinheit (HPLC):	98,8%
optische Rotation [Na/20°C]:	–19,1
H₂O [KF]:	2,79%
Schwermetalle:	15,9 ppm
Lösungsmittel:	0,72‰
Elementaranalyse:	53,7% C 6,4% H 14,3% N 14,9% O

(b) Synthese von N,N-Diethyl-Ile-Phe-Pro-NH-Et
N,N-Diethyl-Ile-Phe-ProNH-Et wurde durch Festphasensynthese wie folgt hergestellt:

H-R: H-Pro-(SASRIN)-N-Et (geschützt von Bachem AG, Schweiz; auf Polystyrolbasis)
A: 20% Piperidin in DMF
B: DCCl/HOBt/DMF
C: 95% TFA, danach Verdampfung
D: RP-HPLC auf C18, System: 0,1% TFA/Acetonitril
E: Anionenaustauscher in Acetatform, Eluierung mit Wasser

Erscheinung:	gelbliches Produkt
Löslichkeit:	1 mg/ml in 5% Essigsäure (klare, farblose Lösung)
Aminosäureanalyse:	Pro 1,00 (1) Phe 0,03 (1) Ile 0,01 (1) N,N-Diethyl-Ile kann nicht bewertet werden; Ile-Phe-Bindung, unvollständige Hydrolyse
ESI-MS:	m = 458,5 u (durchschnittliche Masse)
Reinheit (HPLC):	> 95%
Wassergehalt:	3,9%

(c) Synthese von N,N-Diethyl-Ile-Ile-Pro-NH-Et
N,N-Diethyl-Ile-Ile-Pro-NH-Et wurde durch Festphasensynthese wie folgt hergestellt:

Fmoc-R: Fmoc-Ramage-Harz (D-2200)
Fmoc-Ile-Pro-PH: (B-2135), Fmoc-Ile-OH (B-1340)
A: 20% Piperidin in DMF
B: TBTU/DIPEA/DMF
C: 95% TFA, danach Ausfällung mit IPE
D: RP-HPLC auf C18, System: 0,1% TFA/Acetonitril
E: Anionenaustauscher in Acetatform, Eluierung mit H₂O

Erscheinung:	gelbliches Produkt
Löslichkeit:	1 mg/ml in Wasser (klare, farblose Lösung)
Aminosäureanalyse:	Pro 1,00 (1) Phe 0,03 (1) N,N-Diethyl-Ile kann nicht bewertet werden; Ile-Ile-Bindung, unvollständige Hydrolyse
ESI-MS:	m = 396,5 u (durchschnittliche Masse)
Reinheit (HPLC):	> 96%
Wassergehalt:	2,0%

(5) Bestimmung der metabolischen Stabilität
Isolierung und Kultur von Rattenhepatozyten
Hepatozyten aus erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (IFFA Credo, L'Arbresle, Frankreich) wurden durch eine in situ-Leberperfusion unter Verwendung von Kollagenase (erhalten von Sigma, St. Louis, USA) gemäss dem von Seglen (Preparation of isolated rat liver cell, Methods Cell Biol. 13, 29–83, 1976) beschriebenen und von Williams et al. modifizierten (Rat hepatocyte primary culture, III. Improved dissociation and attachment techniques and the enhancement of survival by culture medium, in vitro 13: 809–817, 1977) Verfahren isoliert. Nach der Abschätzung der Zelllebensfähigkeit durch die periphere Brechung von intakten Zellen im Phasenkontrastmikroskop und dem Trypan Blue-Test wurden frisch isolierte Hepatozyten in basalem Williams-Medium E (WME), versetzt mit 10% (V/V) fötalem Kälberserum, 70 μM Cortisol, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer und 4 mM NaOH, gewaschen. Sie wurden dann in einer Dichte von 0,5 × 10⁶ Zellen pro 50 mm Kunststoff-Zellkulturschalen in dem zuvor beschriebenen Medium zur Zellanhaftung über 6 Stunden bei 37°C ausplattiert. Anschliessend wurden die Hepatozyten dreimal in serum- und cholesterinfreiem Medium (SF-WME), enthaltend 4 g/l Rinderalbuminfraktion V (Sigma), als Transporter für 7,8 μM einer Mischung von freien Fettsäuren (Cheesebeuf M und Padieu P, Expression of major liver metabolic function in long-term serum-free rat liver epithelial cell lines. In vitro 20: 780–795, 1984), und dann in das SF-WME, versetzt mit den verschiedenen Tripeptiden der Formel (I), transferiert. Für jede Gruppe von Experimenten wurden Hepatozyten von drei oder vier Lebern verwendet.
Statistik
Signifikanzen wurden unter Verwendung des Student's t-Tests berechnet. Die Werte werden als Durchschnitt + Standardabweichung ausgedrückt.
Analysen der Tripeptide in Hepatozyten

Methode: (Hepatozyten in Suspension)
Plasmaprobe: Ausfällung mit Trichloressigsäure. Zentrifugieren und Aliquot des Überstandes an HPLC.
Ionenaustauschsäule: Nucleosil C18 (250 × 4,6 mm).
Puffer TEAP 0,1%/CH₃CN, 1 ml/min
Auslesen bei 210 nm

Testbedingungen der Tripeptide

20 μg/24 std/10⁶ Zellen
10⁶ Zellen/ml
Vermindern der Substanz von 10 μg/ml auf 1,0 μg/ml
Jede Substanz bei jeder Konzentration wird 10 mal während 24 Stunden (1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 Stunden) analysiert.

Ergebnisse
Die folgenden Halbwertszeiten wurden erhalten:
(6) Sprouting-Assay
Das Auskeimen der Nervenenden (sprouting) wird bestimmt durch die Länge der Dendriten. Erfindungsgemäss wurde der Einfluss der erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen auf das Sprouting in einem in vivo-Assay untersucht.
Das Septum des Hippokampus von 10 Ratten wurde zerstört (siehe Hagg et al; Exp. Neurol., 101, 303–312). 21 Tage nachdem die Beeinträchtigung auf das Hippokampus eindeutig war, bestätigt durch einen Verhaltenstest, wurden die Ratten in zwei Gruppen à 5 Ratten aufgeteilt. Der Testgruppe von 5 Ratten wurden 20 mg pro kg Körpergewicht pro Tag der erfindungsgemäss verwendeten Substanz (GFPNH₂) über mindestens 15 Tage verabreicht.
Nach Verabreichung wurden die Tiere getötet, und die cholinergen Nervenendungen wurden durch einen CAT (Cholin-Acetyl-Transferase)-Immunofluoreszenz-Assay unter dem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. So wurde die Länge der Dendriten gemessen.
Bei den Kontrollratten wurde gegenüber den behandelten Ratten lediglich eine Veränderung der Dendritenlänge von bis zu 2 μm beobachtet. Andererseits führte die Verabreichung der erfindungsgemässen Substanz zu einer Zunahme der Dendritenlänge von bis zu 8 bis 10 μm. Somit dient GFPNH₂ als Wachstumsfaktor, der zu einem Dendritenwachstum führt.

Claims

Verwendung von Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei X NH₂, NH-C_1-3-Alkyl oder N(C_1-3-Alkyl)₂ darstellt; R₁ ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, die wahlweise mit einer oder mehreren Methoxygruppen oder einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sein kann, oder Ile ableitet; R₂ ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Gly oder Ile ableitet; Y₁ und Y₂ unabhängig voneinander H oder C_1-3-Alkyl darstellen; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon; zur Herstellung eines Medikaments, das bei der Behandlung von postläsionalen Krankheiten ischämischen, traumatischen oder toxischen Ursprungs nützlich ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei R₁ ein Rest ist, der sich von Phe ableitet, die wahlweise mit einem Halogenatom substituiert sein kann.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung der Formel (I) Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-phenylalanyl-L-prolinethylamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-isoleucylprolinamid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist.