JP2004526702A

JP2004526702A - 神経系の損傷後疾患の処置のためのトリペプチド及びトリペプチド誘導体

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Publication number: JP2004526702A
Application number: JP2002562379A
Authority: JP
Inventors: ラパン，ジャン; ヴィッツマン，ハンス・クラウス; グリュメル，ジャン−マリー; ゴネラ，ジャック
Original assignee: NeuroTell AG
Current assignee: NeuroTell AG
Priority date: 2001-02-05
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2022-02-05
Also published as: WO2002062373A2; EP1363656B1; DE60202356T2; ES2230480T3; PT1363656E; DE10105038B4; DE60202356D1; EP1363656A2; ATE285244T1; JP4183507B2; US20050080016A1; DE10105038A1; WO2002062373A3; US7122524B2

Abstract

本発明は、虚血、外傷又は中毒由来の損傷後疾患の処置のための、特定のトリペプチドの使用に関する。このトリペプチド誘導体は、次の式（Ｉ）（書面にある式（Ｉ）を参照のこと）［式中、Ｘは、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルコキシ、ＮＨ₂、ＮＨ−Ｃ_1-5−アルキル、Ｎ（Ｃ_1-5−アルキル）₂を表し；Ｒ₁は、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ（それぞれ、場合により１個以上の（Ｃ_1-5）アルコキシ基、（Ｃ_1-5）アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよい）、更にはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅの１つから誘導される残基であり；Ｒ₂は、アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＰｒｏの１つから誘導される残基であり；Ｙ₁及びＹ₂は、相互に独立に、Ｈ又は（Ｃ_1-5）アルキルを表し；Ｒ₃及びＲ₄は、相互に独立に、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ₃及びＲ₄は、両方ともＯＨ又は（Ｃ_1-5）アルコキシであることはない）；そしてＲ₅は、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表す］、又は薬学的に許容しうるその塩を満たす。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経系の損傷後疾患、特に例えば、虚血、外傷又は中毒のような、壊死由来の疾患の処置のための、トリペプチド及びトリペプチド誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経又は神経組織の虚血は、一般に血管疾患により、例えば、塞栓症又は血栓症のため引き起こされる。よって、例えば、脳梗塞により、中枢神経系の神経が影響を受けることがある。虚血は、最終的に患部組織の壊死をもたらす。
【０００３】
外傷性衝撃もまた、このような神経の死をもたらすことがある。例えば、脊髄損傷及び末梢神経の機械的傷害が知られている。更に、毒性物質、例えば、重金属による環境的影響により神経の壊死に至ることもある。
【０００４】
このような神経損傷に対する新しい治療的方法は、別々のニューロン集団の生存、成長及び分化に著しい影響を及ぼすとされている、神経栄養因子又はニューロトロフィンの投与を含む。ニューロトロフィンファミリーは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）及びＣＮＴＦ−ファミリー（毛様体神経栄養因子）を含む。ニューロトロフィンは、分子量２６〜２８kDaの塩基性の小タンパク質である。ＮＧＦは、多くの異なる組織において活性を示す、ニューロトロフィンファミリーの最もよく性状解析されたメンバーである。
【０００５】
末梢神経系（ＰＮＳ）において、ＮＧＦは、交感神経及びある種の知覚神経の発生に決定的に重要である。中枢神経系（ＣＮＳ）において、ＮＧＦは、前脳基底部のコリン作動性ニューロンの発生及び維持における栄養的役割を担う。これはまた、ニューロン再生における成体ＣＮＳ組織においても、ある役割を演じる。
【０００６】
例えば、外傷、虚血又は中毒由来の損傷後ニューロン疾患の処置のための神経栄養因子の使用は、これまでのところ期待される成功をおさめていない。
【０００７】
特に脳における神経損傷の処置の場合には、神経栄養因子は、血液脳関門を通過せず、このため非経口又は経腸投与に利用できないため、適していない。
【０００８】
発明の概要
よって、本発明の基礎をなす目的は、神経成長を刺激し、このため例えば、虚血、外傷又は中毒由来の疾患のような損傷後ニューロン疾患の処置に適している物質を提供することである。
【０００９】
本発明のこの目的は、虚血、外傷又は中毒由来の損傷後疾患の処置に有用な医薬の製造のための、式（Ｉ）：
【００１０】
【化２】

【００１１】
［式中、Ｘは、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルコキシ、ＮＨ₂、ＮＨ−Ｃ_1-5−アルキル、Ｎ（Ｃ_1-5−アルキル）₂を表し；
Ｒ₁は、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及びＰｒｏ（それぞれ、場合により１個以上の（Ｃ_1-5）アルコキシ基、（Ｃ_1-5）アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよい）、更にはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅの１つから誘導される残基であり；
Ｒ₂は、アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ及びＰｒｏの１つから誘導される残基であり；
Ｙ₁及びＹ₂は、相互に独立に、Ｈ又は（Ｃ_1-5）アルキルを表し；
Ｒ₃及びＲ₄は、相互に独立に、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ₃及びＲ₄は、両方ともＯＨ又は（Ｃ_1-5）アルコキシであることはない）；そして
Ｒ₅は、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表す］で示される化合物、又は薬学的に許容しうるその塩の使用により解決される。
【００１２】
発明の詳細な説明
他に記載がなければ、アミノ酸残基は、Ｌ型だけでなくＤ型との両方で存在しうる（Ｌ型が好ましい）。
【００１３】
好ましい化合物は、Ｒ₁が、アミノ酸：Ｉｌｅ、又はアミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ（それぞれ、場合により１個以上の（Ｃ_1-5）アルコキシ基、（Ｃ_1-5）アルキル基又は１個以上のハロゲン原子で置換されていてもよい）の１つから誘導される残基、特にＩｌｅ又はＰｈｅ（場合により１個以上の（Ｃ_1-5）アルコキシ基、１個以上の（Ｃ_1-5）アルキル基又は１個以上のハロゲン原子で置換されている）から誘導される残基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００１４】
式（Ｉ）において、Ｘは、好ましくは（Ｃ_1-5）アルコキシ、ＮＨ₂、ＮＨ−（Ｃ_1-5）アルキル又はＮ（Ｃ_1-5−アルキル）₂であり、更に好ましいのは、ＮＨ₂、ＮＨ（Ｃ_1-3）アルキル及びＮ（Ｃ_1-5−アルキル）₂である。
【００１５】
Ｒ₂は、好ましくはアミノ酸：Ｇｌｙ又はＩｌｅから誘導される残基である。
【００１６】
Ｒ₃及びＲ₄は、好ましくは相互に独立に、Ｈ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ₃及びＲ₄は、両方ともＯＨ又は（Ｃ_1-5）アルコキシであることはない）、更に好ましいのは、Ｈ、（Ｃ_1-3）アルキル又は（Ｃ_1-3）アルコキシである。
【００１７】
Ｒ₅は、好ましくはＨ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表し、特に好ましいのは、Ｈ、（Ｃ_1-3）アルキル又は（Ｃ_1-3）アルコキシである。
【００１８】
Ｙ₁及びＹ₂は、好ましくは相互に独立に、Ｈ又は（Ｃ_1-3）アルキルを表す。
【００１９】
式（Ｉ）の特に好ましい化合物では、Ｒ₁は、Ｐｈｅ（場合により１個以上の（Ｃ_1-5）アルコキシ基、１個以上の（Ｃ_1-5）アルキル基又は１個以上のハロゲン原子で置換されている）から誘導されるか、又はアミノ酸：Ｉｌｅから誘導される残基であり、Ｒ₂は、アミノ酸：Ｇｌｙ又はＩｌｅから誘導される残基であり、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅は、水素原子を表し、Ｘは、ＮＨ₂、ＮＨ−（Ｃ_1-3）アルキル又はＮ（Ｃ_1-3−アルキル）₂を表し、そしてＹ₁及びＹ₂は、相互に独立に、Ｈ又は（Ｃ_1-3）アルキルを表す。
【００２０】
最も好ましい式（Ｉ）の化合物は、グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル−イソロイシル−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンエチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル−イソロイシル−イソロイシル−プロリンアミド、又は薬学的に許容しうるこれらの塩である。
【００２１】
アミノ酸に関して使用した略語（フェニルアラニンではＰｈｅであるなど、更には部分的にフェニルアラニンではＦのような、１文字コードを以下に使用した）は、当業者には既知である（例えば、BeyerとWalter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 第21版, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988を参照のこと）。よって、Ｐｈｅは、フェニルアラニンを意味し、Ｇｌｙはグリシンを意味するなどである。「アミノ酸：Ｐｈｅから誘導される残基」という表現は、よってベンジル（−ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₅）残基を意味する。したがって、「アミノ酸：Ｇｌｙから誘導される残基」は、水素原子を意味し、「アミノ酸：Ａｌａから誘導される残基」は、メチル基を意味するなどである。
【００２２】
本発明により使用される式（Ｉ）の化合物は、水溶性物質であり、よって経腸又は非経口投与に適している。
【００２３】
しかし、本発明により使用される化合物は、全てが等しく経口／経腸又は非経口投与に適しているわけではない。例えば、ＨＣｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ₂は、主として非経口投与用と考えられるが、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂及びＮ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨＥｔは、非経口及び特に経口投与に適している。本発明により使用される化合物の経口投与に対する適性は、以下に更に詳細に記述される、いわゆる並列人工膜透過測定法（Parallel Artificial Membrane Permeation Assay）を用いて推定することができる。経口投与には、この測定法により求める場合、１０を超える、好ましくは３０を超える、更に好ましくは４５を超える値を有する化合物が好ましい。
【００２４】
本発明により使用されるトリペプチド及びトリペプチド誘導体の作用に必須の前提条件は、ＣＮＳにおけるその濃度である。他の因子のほかに、これは、能動又は受動輸送により起こりうる、血液脳関門の通過の程度による影響を受ける。いわゆる媒介輸送又は脂質筏を介する輸送が機序として考えられる。輸送の均衡は、血液脳分布係数（ｌｏｇＢＢ）によりその型又は機序から独立に表現される。この係数が高いほど、ＣＮＳにおける濃度が高い。
【００２５】
ＱＳＡＲ（定量的構造活性相関）に関連しての分子モデリングによる脳血液分布係数の定義及び測定は、以下に更に詳細に記述されている。本発明により使用される化合物の血液脳分布係数は、好ましくは−３．５以上、特に好ましくは−３．０以上の範囲にある。
【００２６】
更に、本発明により使用される式（Ｉ）の物質は、チロシンキナーゼ受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、及びＴｒｋＣ）に対する高い親和性を示す。神経栄養物質のＮＧＦは、これらの受容体へのドッキングを介して作用することが知られているため、この受容体への高い親和性は、本発明により使用される化合物の神経栄養作用の強力な指標である。ドッキング定数（ｐＫＤ）は、分子モデリングツールにより求められ、そして対応する方法は、以下に更に詳細に記述される。本発明により使用される化合物は、好ましくは５．５以上のｐＫＤ値を有し、更に好ましいのは、７以上のｐＫＤ値である。
【００２７】
本発明により使用されるトリペプチド及びトリペプチド誘導体の合成には、特に制限がなく、既知の方法、好ましくは、各アミノ酸又はその誘導体のＬ−又はＤ立体配置が維持される、ペプチド化学の立体特異的製造法により行うことができる。BeyerとWalter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 第21版, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988, pages 829-834には、種々のペプチド合成法が記載されている。好ましい方法は、以下の反応式に図解されるような、Ｎ−カルボン酸無水物法（ＮＣＡ法）及び混合カルボン酸無水物を使用する方法を含む。
【００２８】
ＮＣＡ法：
【００２９】
【表１】

【００３０】
混合カルボン酸無水物合成：
【００３１】
【表２】

【００３２】
ここで、ＡＡ１及びＡＡ２は、それぞれ中間及び末端アミノ酸（Ｒ₁又はＲ₂から誘導される）を表し、Ｂｏｃは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル残基を表し、ＮＣＡは、Ｎ−カルボン酸無水物を表し、そしてＴＦＡは、トリフルオロ酢酸を表す。出発物質は、市販されている。
【００３３】
例えば、セリンのような、官能基を有するアミノ酸を使用する場合は、当業者には既知の方法でこれらを保護することができる。
【００３４】
更に、本発明により使用されるトリペプチド又はトリペプチド誘導体は、好ましくはフルオレン−９−イル−メトキシ−カルボニル保護基（Ｆｍｏｃ残基）又はＦｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）保護アミノ酸を用いて、固相で、場合により改変されたメリーフィールド（Merryfield）合成法で合成することができる。
【００３５】
上述の反応は、個々の反応工程に関して一般に９０％を超える収率であり、そして６０％を超える全収率である。こうして合成されたトリペプチド及びトリペプチド誘導体の純度は、一般に９８％を超えており、よって医薬組成物に使用するのに充分である。トリペプチド及びトリペプチド誘導体の構造は、質量分析（ＭＳ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、自動アミノ酸分析（ＡＡＡ）、旋光度（ＯＲ）、及び／又は赤外及び紫外分光法（ＩＲ、ＵＶ）により確認することができる。
【００３６】
１日に体重１キログラム当たり５mgを超える用量の投与が通常有効であり、特に非経口多回投与が有効である。
【００３７】
これらの物質は、その分子構造のため、急性及び慢性毒性試験の両方において非常に低い毒性を示す。ラットにおける最小致死量（静脈内）は、体重１キログラム当たり２５０〜３５０mgであった。よって、本試験物質は、ヒトにおける治療的使用の前提条件となる、好都合な治療係数を示す。
【００３８】
本トリペプチド又はトリペプチド誘導体は、種々の方法、例えば、非経口（静脈内、筋肉内、皮下）、呼吸器管経由（バッカル、舌下、鼻内、気管支内）、経皮経路（経皮（percutane））及び経腸経路（経口）での投与に適した、医薬組成物の製造に使用することができる。最後の場合、適切な用量は、初回通過効果を克服することが必要である。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、更に薬学的に許容しうる賦形剤、薬学的に許容しうる希釈剤又は補助剤を含む。その処方には、例えば、「レミントンの製剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」, 第20版, Williams & Wilkins, PA, USAのような、標準法を利用することができる。
【００４０】
投与剤形は、投与経路に応じて選択され、特に錠剤、カプセル剤、粉剤及び液剤を含む。
【００４１】
経口投与には、好ましくは錠剤及びカプセル剤が使用されるが、これらは、適切な結合剤（例えば、ゼラチン又はポリビニルピロリドン）、適切な賦形剤（例えば、乳糖又はデンプン）、適切な滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、及び場合により更に別の添加剤を含む。
【００４２】
経口投与に特に好ましい処方は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂ １００mg又は２００mg、二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、マクロゴール（Macrogol）４００／６００、ヒプロメロース（Hypromellose）（Ｅ４０４）、二酸化チタン、及びクロスカルメロース−Ｎａを含むコーティング錠である。
【００４３】
非経口投与には、滅菌水性溶液が好ましい。適切な水性溶媒は、水、生理食塩水、ハンクス液及びリンガー溶液を含む。好ましいのは、特に２０g/lのトリペプチド又はトリペプチド誘導体、例えば、グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンアミドを含む生理食塩水である。
【００４４】
非経口投与のための特に好ましい処方は、凍結乾燥ＨＣｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ₂ １００mg又は２００mg、酢酸、酢酸ナトリウム、及び注射用水を含む、点滴用注射液５又は１０mlを含む、注射用アンプルである。
【００４５】
特に脊髄損傷及び末梢神経の機械的傷害の処置には、本発明により使用される化合物が固定化された材料の移植が、誘導される神経再生を保証するのに適切な方法である。広く変化に富んだ材料へのペプチドの固定化の種々の方法が知られている（参考文献として、US 6,156,572を参照のこと）。本発明では、よって式（Ｉ）の化合物を、ヒドロゲル、好ましくは（アガロース、アルギナート又はキトサンのような）多糖類ヒドロゲル、又はポリ（ラクチド）、ポリエチレンオキシド、及びヒアルロナートのような、生体適合性及びできれば生分解性物質に固定化することが特に好ましい。これらの材料へのペプチドの固定化方法は、当業者には知られており、そしてＥＤＣ活性化又は二官能性イミダゾールカップリング剤（例えば、１，１’−カルボニルジイミダゾール）の使用のような、カルボジイミドのようなアミド結合を形成するためのヒドロキシル基の典型的な活性化工程を含む。特に有用な固定化マトリックスは、US 6,156,572に開示されている。
【００４６】
更に、本発明により使用されるトリペプチドは、末梢神経の橋に導入することができ、そして次にこれが横断面の傷害ギャップに移植される（S. Varon, J.M. Conner, ＣＮＳ修復における神経成長因子, Journal of Neurotrauma, Vol. 11, No.5, 1994を参照のこと）。
【００４７】
ペプチドは、通常エンド−又はエキソペプチダーゼによるタンパク質分解及び更に別の代謝を受けるものであり、ゆえにこれらが血液脳関門に到達し、通過まですることは予想できなかったため、本発明により使用されるトリペプチド又はトリペプチド誘導体の神経再生作用は、驚くべきものである。この分解の程度及び速度は、血漿中のトリペプチド又はトリペプチド誘導体の半減期により示される。例えば、チレオリベリン（thyreoliberin）（ＴＲＨ）のようなトリペプチドの半減期は、非常に短いことが知られている。したがって、本発明により使用されるトリペプチド及びトリペプチド誘導体が、予期しないほど長い半減期（≧２４時間）を示すことは驚くべきことである。この長い半減期は、充分な抗神経変性作用に対する更に別の前提条件である。
【００４８】
更に、肝細胞での実験において、本発明のトリペプチド及びトリペプチド誘導体は、肝臓において専らゆっくり代謝されることを実験的に証明できた。この結果は、血漿及び添加肝細胞の分析により確認したが、ここでは４時間を超える曝露後、変質していないトリペプチドのみが分析された。
【００４９】
本発明により使用されるトリペプチド及びトリペプチド誘導体の優れた治療特性は、神経突起成長測定法（発芽測定法）を用いて以下に更に説明されよう。しかし、これらの実験を詳細に記述する前に、血液脳分布係数の測定、ＰＡＭＰＡ測定法、ＴｒＫドッキング定数の測定、次の実験において使用されるトリペプチド誘導体の半減期及び選択された合成法が記述される。
【００５０】
実験のセクション
１．脳血液分布係数の測定
上記のように、血液脳関門は、一般に水溶性物質に対する障害物を与えて、普通の投与法によるＣＮＳの処置用の多くの水溶性物質の使用を妨げている。しかし、本発明により使用されるトリペプチド又はトリペプチド誘導体は、該血液脳関門を通過する能力があることが証明できた。本発明により使用されるトリペプチド及びトリペプチド誘導体の血液脳分布は、以下のとおり定量される。
【００５１】
いわゆるＱＳＡＲ（定量的構造活性相関）法は、化学物質の特定の物理化学的又は薬理学的性質の定量のための確立された方法である。この方法は、一般に、いわゆる記述子（Ｘ１、Ｘ２など）の変調による、化合物の特定の実験特性（例えば、脳血液分布係数（ＢＢ）など）と計算された構造パラメーターＡ、Ｂ、Ｃなどとの間の線形相関の決定を含み、一般には下記の形の等式が得られる：
ＬｏｇＢＢ＝（Ｘ１×Ａ）＋（Ｘ２×Ｂ）＋（Ｘ３×Ｃ）＋・・・＋定数
【００５２】
こうして得られる記述子により、次に例えば、実験データが入手できない化合物の脳血液分布係数のような、それぞれの実験特性を計算することができる。したがって、脳血液分布は、本発明により以下のとおり求められる。
【００５３】
７５個の化合物の実験データ（Luco, J.M., J. Chem. Inf. Comput. Sci. (1999), 39, 396-404を参照のこと）及び特定のパラメーターに基づいて、以下に説明されるように、計算値と実験値の間の線形相関を得ることができた。
【００５４】
本化合物は、分子モデリングプログラムパッケージのＳＹＢＹＬ（トリポス・アソシエーツ社（Tripos Associates Inc.）, 1699 S. Henley Road, Suite 303, セントルイス, MO63144, 米国）を用いて作成した。選択したセット（Ａ−Ｆ−Ｐ、Ａ−ｄＦ−Ｐ、Ａ−Ｆ−ｄＰ、Ａ−ｄＦ−ｄＰ）に関して化合物の低エネルギーコンフォメーションを決定するために、ランダム検索を行った。ペプチド結合のものを除く全ての二面角は、可撓性であると考えた。最も低エネルギーの構造の基本骨格コンフォメーションを、全ての化合物の出発コンフォメーションとした。
【００５５】
全ての手動で作成した化合物は、ガスタイガー（Gasteiger）（ＰＥＯＥ）部分電荷（Gasteiger, J., Marsili, M. (1980; Tetrahedron 36, 3219-3238)）及び４という距離依存性誘電率での、トリポス（Tripos）力場（Clark, M., Kramer, III, R.D. 及びvan Optenbosch, N. (1989), J. Comp. Chem. 10, 982-991を参照のこと）を用いてエネルギー論的に最小化した。
【００５６】
分子グラフィックスプログラムのＭＯＥ（ケミカル・コンピューティング・グループ社（Chemical Computing Group Inc.）, モントリオール, カナダ, http://www.chemcomp.com）により、化合物の結合性及び原子型（力場パラメーターの意味での型）だけに依存する記述子の広く適用できるセットの計算が可能である（上に引用したホームページのLabuteを参照のこと）。本明細書において使用される全ての記述子は、化合物のファン・デル・ワールス（van der Walls）表面の単純な近似を含む。１９４７個の有機化合物の試験セットでは、厳密なファン・デル・ワールス表面と２Ｄ近似の間に高い相関（ｒ²＝０．９６６６）が得られた。１４個のパラメーターの第１のセット（ＰＥＯＥ−ＶＳＡ）は、一定間隔境界を用いる分子の電荷分布（ＰＥＯＥ）と考えられた。１０個の記述子の第２のセット（ＳｌｏｇＰ−ＶＳＡ）は、化合物のｌｏｇ（Ｐ）を記述し、そして８個の第３のセット（ＳＭＲ−ＶＳＡ）は、分子の分極率に依存する。
【００５７】
上述の全部で３２個の記述子の値は、実験の脳血液分布への相関を見い出すために、７５個の化合物のそれぞれについて計算された（Lucco, J.M., J. Chem. Inf. Comput. SCI. (1999), 39, 396-404を参照のこと）。主成分の回帰を行うことにより、記述子の関数としてＬｏｇ（ＢＢ）の線形モデルを推定した。１回目の計算において、寄与が非常に低いため８個の記述子を無視できると考えられた。これら８個を除いた２回目のラン後、寄与が０．１未満である更に別の９個の記述子が現れた。最後に、残った１５個の記述子を用いる、７０個の化合物（明らかな異常値を示す５個は除去した）の計算に基づいて、比較的良好な線形の、更には相互検証した（リーブ・ワン・アウト法（leave-one-out））相関が得られた。この相関は、図１において図で表現される（この図では、使用成分：１５個；条件数６６３．７６５８；２乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）：０．２０１２６；相関係数（Ｒ２）：０．０３２４０；相互検証Ｒ２：０．８８３２１）。
【００５８】
Ｌｏｇ（ＢＢ）は、以下のとおり定義される：
Ｌｏｇ（ＢＢ）＝Ｌｏｇ（脳内の濃度）／（血液中の濃度）。
【００５９】
この相関により得られた記述子は、次に本発明のトリペプチド及びトリペプチド誘導体の血液脳分布の計算のために使用することができた。
【００６０】
特に、生理的ｐＨ範囲に存在する形に関連する、以下の値が得られた：
【００６１】
【表３】

【００６２】
Ａ₁：式（Ｉ）のＹ₁Ｙ₂Ｎ−ＣＲ₂Ｈ−ＣＯ−に対応する、アミノ基での置換を含む脂肪族アミノ酸。
Ａ₂：式（Ｉ）の−ＮＨ−ＣＨＲ₁−ＣＯ−による、フェニル環での置換を含む芳香族アミノ酸、更には脂肪族アミノ酸。
Ａ₃：プロリン及び誘導体Ｄ：右旋性
【００６３】
以下の結論は、これらの計算から導かれる：
（ａ）プロリンの遊離酸の代わりのプロリンアミド、プロリン（ジエチル）アミド及びプロリンメチルエステルの使用は、血液脳関門の通過に関して好ましい。
（ｂ）Ａ₂の構造単位（Ｒ₁に対応する）では、芳香族アミノ酸Ｆ及びそのアルキル誘導体、更にはイソロイシン（Ｉ）が好ましい。
（ｃ）構造単位Ａ₁（Ｒ₂に対応する）では、脂肪族アミノ酸（Ｉ）、更には２個のエチル基での（Ｇ）及び（Ｉ）のアミノ基の置換が、特に好ましい。
（ｄ）アミノ酸単位の光学的キラリティーは、少なくとも血液脳関門の受動通過には貢献していないようである。
【００６４】
２．消化管吸収
経口投与薬物の吸収は、消化管バリアを通過するその能力により決定される。並列人工膜透過測定法システム（Parallel Artificial Membrane Permeation Assay system）（ＰＡＭＰＡ）は、消化管薬物吸収の予測に関して単純かつ迅速な方法である。生物学的細胞層の薬物透過は、主として受動拡散プロセスに関連している。ＰＡＭＰＡ法によって、受動拡散により人工膜を通過する潜在的な新しい薬物の透過を測定して、低、中及び高吸収物質への分類ができる。
【００６５】
Kansyらに報告された並列人工膜透過測定法による手順を利用した（Kansy M., Senner F., Gobernator K., 物理化学的高処理能力スクリーニング：受動吸収プロセスの説明における並列人工膜透過測定法, J. Med. Chem., 1998, 41(7), 1007-1010）。この人工膜は、有機溶媒中のレシチンの溶液を９６ウェルプレート中の支持フィルター物質にピペットで加えることにより作成した。
【００６６】
全ての試験化合物について、５mMのストック溶液をエタノール中に調製した。次にこれらをトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．４）に希釈して、５００μMの最終濃度にした。全ての試験化合物の透過速度は、三重測定又は四重測定で測定した。人工膜を通過する拡散時間は、１６時間であった。全ての化合物について、リン脂質層のない参照値は、個別に求めた。アクセプター区画における濃度は、モレキュラー・ディヴァイシーズ（Molecular Devices）製のマイクロタイタープレートリーダーであるスペクトラマックス・プラス³⁸⁴（Spectramax Plus³⁸⁴）を用いるＵＶ差分光法によって測定した。各化合物について、λmax値は先の試験で求め、測定はこの波長で実施した。透過速度は、フラックス速度として表されるが、これは、以下の式により計算される：フラックス（％）＝ＯＤ（試験ウェル）／ＯＤ（対照ウェル）×１００。内部標準として、低、中及び高透過性である既知のフラックス速度の３つの薬物を、試験プレートに含めた：ブレチリウム（Bretylium）、ヒドロコルチゾン（Hydrocortizone）及びクマリン（Coumarin）。透過実験後、膜の完全性のチェックを行うことにより、試験化合物が、毒性又は非特異的作用によって人工膜を傷害した（そしてそのため偽陽性の結果を構成している）かどうかを検査した。非透過性染料であるルシファー・イエロー（Lucifer Yellow）を、各ウェルに実験後に適用して、マーカーの濃度を、ワラック・ビクター²１４２０マルチラベル・カウンター（Wallac Victor²1420 Multilabel Counter）で測定した。ルシファー・イエローの濃度が対照ウェル（人工膜なし）で検出された量の１％を超えたウェルは、廃棄した。本実験において、１個のウェルだけ（参照化合物ブレチリウムに対して）がこの限界を超えたため、これを考慮に入れなかった。
【００６７】
表１は、７つの試験化合物及び３つの参照化合物のフラックス速度を示す。
【００６８】
【表４】

【００６９】
フラックス速度が我々や他の研究者（Kansyら、上記を参照のこと）により数回測定されている、３つの参照化合物により構成された内部対照は、異常を示さず、実験が行われた良好な条件を立証している。また、ヒトにおいて低い生物学的利用能を示す、能動輸送される化合物であるブレチリウムは、この実験で同様に０％のフラックス速度を示した。Kansyら（上記を参照のこと）により発表された、ヒドロコルチゾン及びクマリンのフラックス速度は、それぞれ５２及び６６％であった。これらのデータは、我々が実験で得た結果と非常に良好な一致を見ている（表１）。
【００７０】
ＰＡＭＰＡ法により、化合物を３群に分類できる：
低（フラックス速度＜２０％）、中（２０％＜フラックス速度＜５０％）及び高（フラックス速度＞５０％）透過物質。この分類によれば、ＨＣｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ₂、更にはＴＲＨ及びＨ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＯＨは、弱く吸収される化合物であり、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂、Ｎ−イソプロピル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂及びＮ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨＥｔは、経口適用後、中度〜高度に吸収される化合物であると予測される。
【００７１】
この試験で得られる結果に基づいて、生物学的膜の透過性に関して試験化合物の以下の格付けを行うことができる：
ＨＣｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨ₂、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ＜ＴＲＨ、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂ ＜Ｎ−イソプロピル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂ ＜Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−ＰｒｏＮＨ₂ ＜Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＰｒｏＮＨＥｔ。
【００７２】
本明細書に記述されるＰＡＭＰＡ透過試験システムの限界は、これが、経細胞経路により輸送される化合物だけしか検出できないという事実である。傍細胞経路又は能動経路を選ぶ化合物は、経口適用後、ヒトでの良好な吸収にもかかわらずフラックス速度が低いであろう。
【００７３】
３．ドッキング定数の測定
ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ及びＴｒｋＣの二量体断片のＸ線構造又はモデルに基づいて、式（Ｉ）の幾つかの化合物のドッキング試験を実施した。両方のモノマーの間のリガンドの全ての配置について、理論的方法によってその親和定数（ｐＫｄ＝ｐＫｉ）を計算する必要がある（Wang, R.; Liu, L.; Lai, L.; Tang, Y.; J. Mol. Model., 1998, 4, 379-394を参照のこと）。
【００７４】
ａ）受容体の二量体配置のモデリング
以下の全ての研究の論拠は、ＮＧＦがドッキングしたＴｒｋＡ断片のＸ線構造（ｐｄｂ＝１ｗｗｗ）である（Wiesmann, C., Ultsch, M.H., Bass, S.H., De Vos, A.M., Nature 1999, 401, 184を参照のこと）。
【００７５】
我々は、リガンドが、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ又はＴｒｋＣの２つのモノマーにＮＧＦと同様に結合することを仮定する。リガンドの親和性が高いほど、両方のモノマーがより密に結合され、そしてこれが、活性の主要な機能として考えられる。ＮＧＦは、トリペプチド誘導体よりもはるかに大きいため、モデルは、少し小さい分子が結合できるように作るべきである。この目的のために、ＮＧＦの座標をＸ線構造から除去して、１つのモノマーを他のモノマーへのファン・デル・ワールス接触に手動で近づけた（分子モデリングパッケージのＳＹＢＹＬ（トリポス・アソシエーツ社（TRIPOS Associates Inc.））を用いて）。両方の空いているモノマーを一緒にする適切な配置を見い出すために、ＡＭＢＥＲ−ＡＬＬ−ＡＴＯＭ力場（S.J. Weinerら, J. Amer. Chem. Soc. 1984, 106, 765-784を参照のこと）を１５０Ｋで２００００fsの間用いる、分子動力学シミュレーション（ＭＤ）を実行した。このシミュレーション後に生じた構造を、０．１kcal/mol Å2のエネルギー勾配に最適化した。この構造を、ＴｒｋＢ及びＴｒｋＣの構造のモデル作成の鋳型として、更にはドッキング試験のために使用した。
【００７６】
ＴｒｋＢ及びＴｒｋＣの二量体配置のモデルは、ＳＹＢＹＬの相同性モデリングツールのＣＯＭＰＯＳＥＲ（Blundell, T.L., Carney, D., Gardner, S., Hayes, F., Howlin, B., Hubbard, T., Eur. J. Biochem. 1988, 172-513-20を参照のこと）並びにこれに続くＭＤ及びエネルギー最小化を用いて作成した。生じた構造は、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S., Thornton, J.M., J. Appl. Cryst., 1993, 26, 283-91を参照のこと）を用いて特性を照合した。
【００７７】
ｂ）リガンドのドッキング試験
プログラムＧＯＬＤ［Jones, D.T., J. Mol. Biol., 1999, 292(2), 195-202；Jones, D.T., Taylor, W.R., Thornton, J.M., Nature 1992, 358, 86-89を参照のこと］をリガンドの「自動」ドッキングのために使用した。３つ全ての受容体に対するリガンドそれぞれの最適なドッキングを確保するために、２つのわずかに異なる結合部位を調査した。各ランにつきＧＯＬＤを用いて、２０個のドッキング構造（全部で４０個）を測定した。タンパク質構造は、固定していると考えられるため、固定した受容体の基本骨格だけを保持しながら４０個全ての配置を最適化した。
【００７８】
ｃ）親和定数の決定
全てのタンパク質−リガンド複合体について、酵素インヒビター複合体の場合のＰＫｉ値に相当するｐＫｄ値を求めるために、ＧＯＬＤ及びプログラムのＳＣＯＲＥ［Wangら、同文献を参照のこと］を用いたいわゆる適合度の値である、リガンドと受容体との相互作用エネルギーをトリポス（Tripos）力場を用いて計算した（適合度、即ちｐＫｄ値が高いほど、リガンドの親和性は高い）。ＳＣＯＲＥは、ドッキング配置において、相互作用エネルギーだけでなく、溶媒和、脱溶媒及びエントロピー効果も考慮に入れる。
【００７９】
結果は、受容体に対するリガンドそれぞれの最も良好なｐＫｄ（ｐＫｉ）値を示す、以下の表に要約される。この表はまた、上記で測定された脳血液分布の値をも示す。
【００８０】
最も高い親和性は、Ｅｔ2−ＩＦＰ−ＮＨ−Ｅｔについて予測された（ＴｒｋＡに結合する場合、７．２９（約１００nM）のｐＫｉ値（ＳＣＯＲＥによる））。幾つかの水素結合が検出できるが、最も重要なものは、両方のＮ末端エチル基の、更にはＩｌｅ側鎖と３個のヒスチジン残基との、及びフェニルアラニン側鎖と受容体のＰｈｅ３２７との疎水性相互作用である。残りの全てのリガンドについては、親和性が約一桁小さい。
【００８１】
【表５】

【００８２】
４．合成
ａ）ＨＣｌ−Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂の合成
工程１：Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ＋Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ → Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ８７．６ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ml及び１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）３００mlの混合物に溶解して、−１５℃に冷却した。次に、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）３７ml（１当量）を一度に加え、次いでクロロギ酸イソブチル（ＩＢＣＦ）４５ml（１当量）を１０分かけて滴下により加えた。次にこの混合物を−１５℃で更に５分間撹拌した。続いてＴＦＡ．Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ ４０ｇ（１．０６当量）を５分かけて少量ずつ加え、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（ＤＩＥＡ）３１５ml（１当量）を一度に加えた。反応混合物を室温及び大気圧で一晩反応させた。続いて、この反応混合物を、水流吸引器及びドライアイス／アセトントラップを取り付けたロータリーエバポレーターで濃縮し、そして残渣を酢酸エチル１ｌにとり、次に２ｌ分液ロートで、１ＮＫＨＳＯ₄水溶液８０mlで１２回洗浄し、食塩水８０mlで１回洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液８０mlで１０回洗浄し、食塩水８０mlで１回洗浄した。次いでＮａ₂ＳＯ₄ ５０ｇで乾燥した。焼結ガラスロート（粗い多孔度）での濾過後、上述のように濃縮した。次に蒸発の残渣（乾燥泡状物）を１ｌヘキサン中で粉砕して、固体を焼結ガラスロート（１２０mm内径×１２０mm、中度の多孔度）上に回収した。続いてこれをデシケーター中で室温及び０．１〜１mmHg（真空油ポンプ、ドライアイス／アセトントラップ付き）の圧力で１２時間かけて乾燥した。こうしてＢｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ ９２．８ｇを得た（収率：７７．８％）。
【００８３】
分析データ：

【００８４】
工程２：Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ → ＴＦＡ．Ｈ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂
工程１で得られたＢｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂（１８０ｇ）を、マグネティックスターラーを取り付けた２ｌ丸底フラスコ中で塩化メチレン２５０mlに溶解／懸濁した。次に、トリフルオロ酢酸２５０mlをこの溶液と室温（１５〜２５℃）及び大気圧で１時間反応させた。次に反応混合物を、撹拌しながらｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）５ｌ中で沈殿させた。沈殿物を焼結ガラスロート上に回収し、次にジエチルエーテル１．５ｌで２回及びヘキサン１ｌで２回洗浄した。続いて工程１で上述したように乾燥を行った。
【００８５】
工程３：Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ＋ＴＦＡ．Ｈ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ → Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ４４ｇ（１当量）を、ＤＭＦ５０ml及びＤＭＥ３００mlの混合物に溶解し、次に−１５℃に冷却した。ＮＭＭ２８ml（１当量）を一度に加え、続いてＩＢＣＦ３４ml（１当量）を１０分かけて滴下により加えた。この混合物を−１５℃で更に５分間撹拌した。ＴＦＡ．Ｈ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ ９４．５ｇ（１．０６当量）をここに５分かけて少量ずつ加え、続いてＤＩＥＡ４４ml（１当量）を加えた。この反応混合物を室温及び大気圧で一晩反応させた。次に、反応混合物を、水流吸引器及びドライアイス／アセトントラップを取り付けたロータリーエバポレーターで濃縮し、そして残渣を酢酸エチル１．２ｌにとり、次に２ｌ分液ロートで、１ＮＫＨＳＯ₄水溶液８０mlで５回洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液８０mlで５回洗浄し、そして食塩水８０mlで１回洗浄した。次いでＮａ₂ＳＯ₄ ５０ｇで乾燥した。焼結ガラスロート（粗い多孔度）での濾過後、上述のように濃縮した。次に蒸発の残渣（粘着性油状物）をジエチルエーテル１ｌとヘキサン２ｌの混合物中で粉砕して、固体を焼結ガラスロート（１８０mm内径×１８０mm、中度の多孔度）上に回収した。続いてこれをデシケーター中で室温及び０．１〜１mmHg（真空油ポンプ、ドライアイス／アセトントラップ付き）の圧力で１２時間かけて乾燥した。こうして、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ １００ｇを得た（収率：９４．７％）。
【００８６】
分析データ：

【００８７】
工程４：Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂ → ＨＣｌ．Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂
工程３で得られたＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂（１４９ｇ）を塩化メチレン３００mlに溶解／懸濁して、次に４ＮＨＣｌ／ジオキサン３００mlを一度に加えた。この混合物を、マグネティックスターラーを取り付けた２ｌ丸底フラスコ中で、室温（１５〜２５℃）で大気圧で１時間反応させた。次に、ジエチルエーテル１ｌを反応混合物に加え、沈殿物を焼結ガラスロート上に回収した。次に沈殿物をジエチルエーテル１．５ｌで２回洗浄して、工程１に記載されたように乾燥した。
【００８８】
分析データ：

【００８９】
ｂ）Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｅｔの合成
Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｅｔは、固相合成法により以下のとおり調製した：
【００９０】
【表６】

【００９１】
Ｈ−Ｒ：Ｈ−Ｐｒｏ−（ＳＡＳＲＩＮ）−Ｎ−Ｅｔ（バッケム社（Bachem AG）（スイス）の所有権；ポリスチレンが基剤）
Ａ：ＤＭＦ中２０％ピペリジン
Ｂ：ＤＣＣｌ／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ
Ｃ：９５％ＴＦＡ、次いで留去
Ｄ：Ｃ１８でのＲＰ−ＨＰＬＣ、システム：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
Ｅ：アセタート型のアニオン交換体、水で溶出
【００９２】
分析データ：

【００９３】
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｅｔの合成
Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ−Ｅｔは、固相合成法により以下のとおり調製した：
【００９４】
【表７】

【００９５】
Ｆｍｏｃ−Ｒ＝Ｆｍｏｃ−ラメージ（Ramage）−樹脂（Ｄ−２２００）
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｂ−２１３５）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Ｂ−１３４０）
Ａ＝ＤＭＦ中２０％ピペリジン
Ｂ＝ＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ
Ｃ＝９５％ＴＦＡ、次いでＩＰＥで沈殿
Ｄ＝Ｃ₁₈でのＲＰ−ＨＰＬＣ、システム：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
Ｅ＝アセタート型のアニオン交換体、Ｈ₂Ｏで溶出
【００９６】
分析データ：

【００９７】
５．代謝安定性の測定
ラット肝細胞の単離及び培養
オスの成体ウィスターラット（ＩＦＦＡクレド（IFFA Credo）、L'Arbresle、フランス）からの肝細胞を、Seglen（単離ラット肝細胞の調製, Methods Cell Biol. 13, 29-83, 1976）により報告され、Williamsら（ラット肝細胞初代培養。III．分離及び接着の改善法並びに培地による生存率の増強、in vitro 13: 809-817, 1977）により改変された手順により、コラゲナーゼ（シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入）を用いるインサイチュー肝灌流によって単離した。位相差顕微鏡法及びトリパンブルー試験における未変性細胞の周縁部不応性による細胞生存率の推定後、新たに単離した肝細胞を、１０％（v/v）ウシ胎仔血清、７０μMコルチゾル、２mM Ｌ−グルタミン、１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液、及び４mM ＮａＯＨを補足した基礎ウィリアム培地Ｅ（basal William's medium E）（ＷＭＥ）中で洗浄した。次にこれらを、３７℃で６時間細胞接着のために前述の培地で５０mmプラスチック細胞培養シャーレ当たり０．５×１０⁶個の細胞の密度で培養した。続いて、肝細胞を、７．８μMの遊離脂肪酸の混合物のための輸送体として４g/lウシアルブミン画分Ｖ（シグマ（Sigma））を含む無血清及び無コレステロール培地（ＳＦ−ＷＭＥ）中で３回洗浄し（Cheesebeuf MとPadieu P, 長期無血清ラット肝上皮細胞株における主要代謝機能の発現, In vitro 20: 780-795, 1984）、次に式（Ｉ）の種々のトリペプチドを補足したＳＦ−ＷＭＥに移した。実験の各群について、３又は４つの肝臓由来の肝細胞を使用した。
【００９８】
統計
有意性は、スチューデントのｔ検定を用いて計算する。値は、平均±ＳＤとして表される。
【００９９】
肝細胞におけるトリペプチドの分析：
方法：（懸濁した肝細胞）
血漿試料：トリクロロ酢酸で沈殿。遠心分離及び上清のアリコートをＨＰＬＣに。
イオン交換カラム：ヌクレオシル（Nucleosil）Ｃ１８（２５０×４．６mm）。
緩衝液ＴＥＡＰ０．１％／ＣＨ₃ＣＮ、１ml/分
２１０nmで読み取り。
【０１００】
トリペプチドの試験条件
２０μg/２４時間/１０⁶細胞
１０⁶細胞/ml
物質濃度を１０μg/ml及び１．０μg/mlまで下げる。
【０１０１】
各濃度の各物質は、２４時間に１０回（１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間）分析される。
【０１０２】
結果
下記の半減期の値を得た：
【０１０３】
【表８】

【０１０４】
６．発芽測定法
神経細胞の発芽は、樹状突起の長さにより測定される。本発明では、本発明により使用される物質の発芽に及ぼす影響がインビボ測定法で試験される。
【０１０５】
ラット１０匹の海馬の隔壁を破壊した（Haggら; Exp. Neurol., 101, 303-312を参照のこと）。２１日後、海馬の損傷は、挙動試験により確認すると明白であったが、ラットをそれぞれ５匹の２つの群に分割した。本発明により使用される物質（ＧＦＰＮＨ₂）を１日に体重１kg当たり２０mgを、ラット５匹の試験群に少なくとも１５日間投与した。
【０１０６】
投与後、ラットを屠殺し、コリン作動性神経末端をＣＡＴ（コリン−アセチル−トランスフェラーゼ）免疫蛍光測定法により蛍光顕微鏡下で観察した。こうして樹状突起の長さを測定した。
【０１０７】
対照群のラットでは、２μm以下の樹状突起長の変化を観察した。これに反して、本発明により使用される物質の投与によって、試験群では８〜１０μmの樹状突起長の増加が起こった。よって、ＧＦＰＮＨ₂は、樹状突起の成長をもたらす成長因子である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、血液脳分布の実験値及び計算値の相関を示す。

Claims

虚血、外傷又は中毒由来の損傷後疾患の処置に有用な医薬の製造のための、下記式（Ｉ）：

［式中、Ｘは、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルコキシ、ＮＨ₂、ＮＨ−Ｃ_1-5−アルキル、Ｎ（Ｃ_1-5−アルキル）₂を表し；
Ｒ₁は、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ（それぞれ、場合により１個以上の（Ｃ_1-5）アルコキシ基、（Ｃ_1-5）アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよい）、更にはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅの１つから誘導される残基であり；
Ｒ₂は、アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ及びＰｒｏの１つから誘導される残基であり；
Ｙ₁及びＹ₂は、相互に独立に、Ｈ又は（Ｃ_1-5）アルキルを表し；
Ｒ₃及びＲ₄は、相互に独立に、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表し（ただし、Ｒ₃及びＲ₄は、両方ともＯＨ又は（Ｃ_1-5）アルコキシであることはない）；そして
Ｒ₅は、Ｈ、ＯＨ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表す］で示される化合物、又は薬学的に許容しうるその塩の使用。
Ｘが、（Ｃ_1-5）アルコキシ、ＮＨ₂、ＮＨ−Ｃ_1-5−アルキル、又はＮ（Ｃ_1-5−アルキル）₂を表す、請求項１記載の使用。
Ｒ₃及びＲ₄が、相互に独立に、Ｈ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表す（ただし、Ｒ₃及びＲ₄は、両方ともＯＨ又は（Ｃ_1-5）アルコキシであることはない）、請求項１又は２記載の使用。
Ｒ₅が、Ｈ、（Ｃ_1-5）アルキル又は（Ｃ_1-5）アルコキシを表す、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
Ｒ₁が、アミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ（それぞれ、場合により（Ｃ_1-5）アルコキシ基、（Ｃ_1-5）アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよい）の１つから誘導されるか、又はＩｌｅから誘導される残基である、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
Ｒ₁が、場合により（Ｃ_1-5）アルコキシ基、（Ｃ_1-5）アルキル基又はハロゲン原子で置換されていてもよい、Ｐｈｅから誘導される残基である、請求項５記載の使用。
Ｒ₂が、アミノ酸：Ｇｌｙ又はＩｌｅから誘導される残基である、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
式（Ｉ）の化合物が、グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル−イソロイシル−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンエチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル−イソロイシル−イソロイシル−プロリンアミド、又は薬学的に許容しうるこれらの塩である、請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。