KR20070105093A - 개구린 ５로부터 합성 및 제조된 항비만용 펩타이드유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 멜라노 코르틴-4-수용체(melanocortin-4-receptor;MC4R)에 특이적으로 결합하는 개구린 5로부터 합성 및 제조된 펩타이드 유도체를 함유한 항비만제에 관한 것으로, 본 발명의 유도체는 식욕조절과 비만유발에 중추적인 역할을 하는 멜라노 코르틴-4-수용체를 탐색하고 분석하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 세포 독성이 없고 인간 적혈구 세포에 대한 용혈활성이 적으므로 인체에 안전한 비만관련 질환 예방 및 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

개구린 5, 항비만제, 멜라노 코르틴-4-수용체,

Description

개구린 ５로부터 합성 및 제조된 항비만용 펩타이드 유도체{Analogues of peptide synthesized and produced from Gaegurin 5 showing antiobesity activity}

도 1은 개구린 5 및 이의 유도체들의 서열 목록을 나타낸 도이며,

도 2는 TAMRA-NDP-αMSH의 인간 MC4 수용체막에 대한 결합 안정성을 나타낸 도이고,

도 3은 리간드에 의한 TAMRA-NDP-αMSH의 치환을 나타낸 도이며,

도 4는 개구리 펩타이드에 의한 TAMRA-NDP-αMSH의 치환을 나타낸 도이다.

본 발명은 개구린 5로부터 합성 및 제조된 펩타이드 유도체의 신규용도에 관한 것이다.

최근 생활수준의 향상으로 위생환경이 개선되고 식생활이 서구화하여 평균 수명이 연장되면서, 질병의 양상 또한 선진국형으로 급격히 변화되고 있다. 따라서 성인병이 오늘날 가장 큰 의학적 과제로 등장하게 되었으며 이러한 성인병의 주요한 원인이 되고 있는 비만도 급격하게 증가되고 있는 상황이다. 비만은 소모하는 열량에 비해 과다한 열량을 섭취함으로써 여분의 열량이 체내에 지방의 형태로 축적되어지는 현상을 말한다. 비만은 유전적 영향, 서구화되는 식생활에 의한 환경적인 영향, 스트레스에 의한 심리적인 영향 등 다양한 원인에 의해 유발되어지는 것으로 생각되고 있으나 아직 그 정확한 원인이나 기작에 관해서는 명확히 정립된 바가 없는 상황이다. 그러나 비만은, 비만 그 자체가 갖는 문제점뿐만 아니라, 심혈관계 질환이나 당뇨와 같은 질병의 원인으로도 작용할 수 있기 때문에(Manson et al., New England J. Med., 333, pp677-685, 1995; Kopleman P.G., Nature, 404 pp635-643, 2000; Must et al., JAMA, 282, pp1523-1529, 1999) 전 세계적으로 비만치료에 많은 관심이 모아지고 있다.

한편, 콜레스테롤은 주로 간에서 생성되며, 지질단백질(lipoprotein)이라는 작고 둥근 입자형태로 혈액 중에 존재하게 되는데, 이 지질단백질이 콜레스테롤을 우리 몸 곳곳으로 운반한다. 지질단백질에는 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 고밀도 지질단백질(high density lipoprotein, HDL) 두 종류가 있으며, HDL은 다른 조직에서 간으로 콜레스테롤을 운반하기 때문에 HDL이 많으면 혈관 등에서 콜레스테롤이 제거되며, 반면 LDL은 간에서 주로 생성되어 인체의 다른 조직으로 콜레스테롤을 운반하므로 LDL이 많으면 혈관에 콜레스테롤이 많이 쌓여 동맥경화가 촉진되고, 혈 중 콜레스테롤의 약 70 %는 위해한 콜레스테롤인 LDL로 존재한다(김경환, 이우주의 약리학 강의, 제 4 판, p466-481, 2001).

실제적으로 콜레스테롤은 인체의 기능을 정상적으로 유지시키는 데 필수적으로 필요한 구성 성분이며, 세포를 만드는데 꼭 필요한 영양소이고, 부신피질 호르몬, 남성 호르몬, 여성 호르몬 등 여러 가지 호르몬의 재료가 되는 성분이며, 담즙을 만드는 재료가 되므로 특히 지방질 음식을 소화시키는 데 도움을 준다. 또한, 생체막의 구성성분인 동시에 호르몬 합성의 출발물질로 쓰이는 등 인체에 반드시 필요한 영양소이다. 그러나 이러한 콜레스테롤도 과다 섭취하게 되면 혈관 내에 축적하여 심장계 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 아직까지는 저콜레스테롤 식이요법 이외에 예방할 방법이 없으며, 콜레스테롤 저하제 등의 약품 복용이 효과는 있으나, 콜레스테롤 합성효소의 작용억제에 따른 간 기능 장애와 같은 부작용을 유발하는 등의 이유로 인하여 사용이 극히 제한적이다.

지방대사의 항상성은 지방의 생성과 분해간의 균형에 의해서 유지된다. ADD1/SREBP1은 지방생성을 조절하는 전사인자로서, 지방산, 중성지질, 콜레스테롤, 인지질 등의 합성과 흡수를 조절한다(Horton J.D. et al., J. Clin . Invest., 109, pp 1125-1131, 2002). SREBPs는 소포체막에 결합한 불활성 전구체로 합성되고, N 말단이 잘려나간 후, 활성화되어 핵으로 이동하게 되고 조절 유전자 프로모터의 SRE (sterol regulatory elements)에 결합하게 된다. 그 이형질체 중 SREBP1c는 중성지질의 합성을 주로 조절하는 반면, SREBP2는 콜레스테롤 합성에 관여하는 것으로 알려졌다. SREBP1c에 의해 조절되는 유전자는 ACL (ATP citrate lyase), ACC (acetyl CoA carboxylase), FAS (fatty acidsynthase) 및 SCD (stearoyl-CoA desarurase) 등이다 (Osborn TF et al., J. Biol . Chem ., 275, pp 32379-32382, 2000; Soazig L. L et al., J. Biol . Chem ., 277, pp 35625-35634, 2002).

현재 비만치료제 개발 전략은 식사량 감소, 열량흡수의 억제, 발열반응 촉진, 에너지 대사 조절, 신경계를 통한 신호전달조절과 같은 것들이다(Kopleman P.G., Nature, 404, pp 635-643, 2000). 이러한 전략에 대하여 어느 하나 이상의 기능을 할 수 있도록 약물을 개발함으로써 비만치료에 이용하고자 하는 시도는 오랫동안 이어져오고 있으나, 아직까지 안전성과 효능을 동시에 갖고 있는 약물을 개발하는 것이 쉽지 않은 것이 현실이다.

따라서 안전성이 입증된 천연물로부터 비만 치료 전략에 부합하는 성분을 찾아 약물로써 이용하려는 시도는 합성 제제로부터 치료제를 개발하는 것에 비해 더욱 효율적인 접근방법이라 할 수 있을 것이다.

멜라노코르틴 4 수용체 (MC4R)는, 에너지 항상성과 음식 흡수의 중요한 조절자로서, 해열, 고열(hyperthermic) 작용의 매개체로서, 최근 큰 관심을 모으고 있다. MC4R과 그것의 메신저 RNA가 발현된 세포는 중추신경계에 주요하게 존재하고, MC4R은 피질, 시상하부, 뇌, 척수의 주요한 멜라노코르틴 수용체 서브타입(subtype)이다. MC4R 작동제(agonist)는 음식물 흡수를 낮추고 MC4R 길항제(antagonist)는 음식물 흡수를 높인다. MC4R은 인슐린, 황체형성호르몬과 프롤락틴의 배출(release) 및 비만과 같은 다른 생리활성 과정과 관련되어 있다.

또한 MC4R은 멜라노사이트 자극 호르몬 펩타이드, 아고티(agouti) 단백질, 아고티 관련 펩타이드(AgRP) 효과의 조절에 중요하다. MC4R의 작동제인 MTⅡ를 ICV 투여하면, 4시간까지 음식물 흡수를 줄였으며, 식재 마우스(food-derived mouse)에 서 투여 후 첫 4시간 동안 수분 흡수를 크게 상승시켰다. MTⅡ의 COS-1 세포에 적용하면, 마이토젠 활성 단백질 키나아제 (MAPK)의 인산화와 cAMP의 형성을 증가시켰다. 0.7nM 아고티 존재시, 다양한 농도의 알파 멜라노사이트 자극 호르몬 (αMSH)은 인간 MC4R의 αMSH의 활성화를 길항하였다. 1nM 또는 그 이상 농도의 AgRP는 MC4R에 의해 매개되는 αMSH에 의해 유도되는 cAMP 축적을 농도 의존적으로 저해하였다.

MC4R은, 음식물 흡수를 위한 시상하부의 렙틴(leptin) 시그널을 저해하며, 특이적인 MC4R 길항제인 HS014는, 음식물 흡수에 있어 렙틴의 저해적인 효과를 길항한다. 인간 MC4R은 7개의 TM(transmembrane) 도메인을 가진 333 아미노산 길이의 GPCR (GTP-binding protein-coupled 수용체)이며, MC4R을 코딩하는 유전자가 들어간 L-세포에서, αMSH는 세포속의 cAMP 농도를 양 의존적(dose-dependent)으로 상승시킨다. NDP-αMSH와 αMSH는 MC4R 수용체에 특이적으로 결합하고 상대적인 Ki값은 각각 2.93nM과 900nM이다.

이에 본 연구자들은 MC4R 막 제조와 형광(fluorescent) NDP-αMSH를 이용하여, 인간 MC4 수용체의 FP 결합 분석법의 개발과 함께 한국산 개구리 펩타이드 유도체로부터, MC4 수용체의 잠재적인 모듈레이터를 확인(identify)하였고, 세포 토대의 실험에서, 다양한 펩타이드 유도체와 αMSH의 자극에 반응하여 세포내의 cAMP의 생성된다는 것을 증명하여 MC4R이 항생 펩타이드인 옴개구리(Rana Rugosa) 유도체들과 무차별적으로 서로 작용하여 비만을 억제시키는 효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성 하였다.

본 발명의 목적은 인간 멜라노코틴-4-수용체를 특이적으로 인식하는 개구린 5로부터 설계 및 합성된 펩타이드의 유도체 및 이를 포함하는 비만관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개구린 5로부터 설계 및 합성된 F-L-G-W-L-F-K-V-A-S-K(A4W-GGN5N11) 및 F-L-G-A-L-F-K-W-A-S-K(V8W-GGN5N11)로 표시되는 펩타이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 비만 관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 펩타이드 유도체는 펩타이드의 특정 부위를 트립토판(Tryptopan)으로 치환시켜 합성하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 펩타이드 유도체는 인간 멜라노코틴 4 수용체와 결합함을 특징으로 한다.

상기 비만관련 질환은 과식, 과음 및 과식증, 고혈압, 당뇨, 증가된 혈장 인슐린 농도, 인슐린 내성, 지혈증 이상, 과지혈증, 대사 증후군, 인슐린 내성 증후군, 비만 관련 위식도 역류, 동맥경화증, 과콜레스테롤혈증, 요산과다혈증, 하부등 통증, 심장비대 및 좌심실 비대로 이루어진 그룹중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 개구린 5로부터 설계 및 합성된 펩타이드 유도체는 하기와 같은 방법으로 수득될 수 있다.

본 발명의 한국산 개구리인 옴개구리로부터 분리된 펩타이드(개구린 1 내지 개구린 6) 중 가장 짧은 길이(24잔기)를 가지는 개구린 5의 공학적 변형을 통하여 본 발명의 펩타이드 유도체들을 합성 및 제조할 수 있다.

구체적으로 최적의 펩타이드 유도체를 합성하기 위하여, 개구린 4 및 개구린 5를 모분자로 하여 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 고체상 합성방법을 사용하여 합성할 수 있으며, 바람직하게는 개구린 4에 대하여 개구린 4의 C-말단 잔기들을 하나씩 제거하면서 펩타이드 유도체들의 항생능을 검증하여 개구린 4의 C-말단 14 잔기를 제거하여 N-말단의 23 잔기만을 남겼을 경우 항생능이 모두 사라짐을 확인한 후, 이렇게 비활성화된 개구린 4 유도체의 16번 위치에 Trp(트립토판) 잔기로 치환하여 개구린 4의 유도체(DI6W-GGN4N23)를 합성하고 이의 항생능을 검증한 결과, 항생능을 다시 가지게 됨을 확인하여 Trp 잔기 도입의 중요성을 인지하여 이를 개구린 5의 유도체 합성에 이용할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 개구린 5에 대하여도 개구린 5의 C-말단잔기들을 하나씩 제거하면서 항비만 활성을 검증한 결과, 항비만 활성을 가지는 최소 잔기가 13 잔기임을 확인하고, 상기 언급한 바와 같이 개구린 4의 유도체 연구로부터 항비만 펩타이드 유도체 개발시 Trp 도입의 유용성이 예상되므로, 개구린 5의 13 잔기 활성 분절 대신 11 잔기 불활성 분절에 Trp 잔기를 치환하여 총 11가지의 개구린 5의 Trp 치환체를 합성할 수 있으며, 이들의 활성을 검토하여 개구린 5의 Trp 치환체들 중, 4번 위치에 Trp를 도입한 A4W-GGN5N11 및 8번 위치에 Trp를 도입한 V8W-GGN5N11 유도체가 모분자인 개구린 5와 유사한 항 비만활성을 보임을 확인한 다음, 4번과 8번 위치에서 Trp만이 특이적인지를 알아보기 위하여 다른 아미노산, 바람직하게는 소수성 잔기 Leu(로이신), 친수성이며 특히 양성이온을 가지는 Lys(리신) 및 Trp과 같이 방향성 고리(aromatic ring)를 가지고 있는 Phe(페닐 알라닌)의 세 가지 아미노산으로 치환하여 총 7가지의 개구린 5의 아미노산 치환체를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드의 유도체들은, 펩타이드 합성기를 이용하는 화학적 방법에 의하여 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함하고, 상기의 펩타이드들을 발현하기에 적합한 유전자 클론을 유전자 조작에 의하여 만들고 이를 적합한 세포에 이식하여 발현된 상기의 펩타이드를 수득하는 유전자 재조합 기술에 의하여도 수득될 수 있다.

상기와 같이 수득된 본 발명의 펩타이드 유도체들 중에서 분자량과 안정성 면에서 탁월한 최적의 항비만용 펩타이드를 찾기 위하여, 펩타이드 유도체들의 항비만 활성 및 용혈활성 등을 조사한 결과, 개구린 5의 유도체 중, 하기와 같은 유도체들은 개구린 5와 유사한 항비만 활성 및 용혈활성을 나타냄을 확인하였다.

GGN5N13 : F-L-G-A-L-F-K-V-A-S-K-V-L

A4W-GGN5N11 : F-L-G-W-L-F-K-V-A-S-K

V8W-GGN5N11 : F-L-G-A-L-F-K-W-A-S-K

반면에, 개구린 5의 유도체들 중, 하기와 같은 유도체들은 개구린 5와 유사한 항비만 활성을 보였으나, 용혈활성이 높게 나타남을 확인하였다.

AL4-GGN5N11 : F-L-F-L-L-F-K-V-A-S-K

V8L-GGN5N11 : F-L-G-A-L-F-K-L-A-S-K

W4,8-GGN5N11 : F-L-G-W-L-F-K-W-A-S-K

본 발명의 펩타이드 유도체들이 개구린 5에 대하여 구조적 유사성을 가지는지 여부, 항비만 활성 및 용혈활성을 가지는지 여부에 근거하여 개구린 5와 유사한 구조, 항비만 활성 및 용혈활성을 가지기 위해서는 이것의 유도체들이 개구린 5의 23개의 아미노산 잔기 중 최소한 11개의 잔기를 가지고 있어야 하며, 또한 유도체들이 충분한 항비만 활성을 가지기 위해서는 친수성 끝과 소수성 시작 면 사이의 위치에서의 Trp 치환을 통하여 양친화성을 가져야 함을 확인할 수 있었으며, 상기와 같은 결과로부터 비만 예방 및 치료제 개발을 위한 최적의 항비만용 펩타이드 유도체는 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 비만 관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형 태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수 성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드의 합성 및 정제

양친화성 구조를 갖는 최적의 항비만용 펩타이드를 합성하기 위하여, 국내산 옴개구리의 표피에서 분리된 펩타이드인 개구린 5를 모분자로하여 이보다 훨씬 더 작은 크기의 새로운 펩타이드를 표준화된 Fmoc-법을 이용한 고상법(Wellings, D. A., and Atherton, E., Methods Enzymol., 289, pp 44-67, 1997)으로 펩타이드 합성기(Model 90, Advanced Chemtech, Inc. United States of America)를 사용하여 자동으로 합성하였다. 즉, 수지(Rink Resin) 70mM을 반응 용기(reaction vessel)에 넣은 후에 수지에 대해 3 당량에 해당하는 아미노산, 아미노산에 대해 2 당량에 해당하는 HOBT(1-Hydroxybenzotriazole) 및 아미노산에 대해 2 당량에 해당하는 DIC(1,3-Diisopropylcarbodiimide)를 아미노산 용기(amino acid vessel)에 넣고 DMF(Dimethylformamide)10㎖로 녹인 다음, DMF를 사용하여 반응 용기의 수지를 스웰링(swelling)시켰다. 25% 피페리딘/DMF를 사용하여 수지의 Fmoc 기를 제거한 다음, DMF, DCM(Dichloromethane) 및 IPA(Isopropanol)을 사용하여 수지를 씻어내었다. 아미노산 용기 안에 녹아있는 아미노산을 반응 용기로 옮겨 수지와 함께 2~3시간 반응시켰다. 여러 개의 아미노산을 붙여나갈 경우, 상기의 과정을 연속해서 실행시켜 아미노산을 차례로 결합시킨 다음, 맨 마지막 아미노산의 N-말단에 붙어있는 Fmoc 기를 25% 피페리딘/DMF를 사용하여 제거하였다. 라이신이나 세린 잔기에 붙어있는 보호기(protecting group)를 제거하고, 합성된 펩타이드를 수지로부터 분리하기 위하여 10% TFA(Trifluoro acetic acid)/DCM 20㎖를 넣어 4시간 동안 반응

시킨 후, 고체 수지를 걸러내고 반응액을 둥근 플라스크에 넣어 증류시켰다. 용매가 모두 증발되면 20% 아세토니트릴(0.1% TFA) 10㎖를 적가하여 다시 녹인 다음, 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후, 상등액을 동결건조하고 C-18 컬럼을 이용한 역상 HPLC(WE J55B5, HITACHI, 이동상:아세토나이트릴, 고정상:C-18 수지, 유속:1ml/min)를 수행하여 정제하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluor acetic acid)을 포함한 아세토니트릴/물 혼합용매를 사용하여 1㎖/분의 유속으로 45분간 수행하여 용리액 중 목적하는 펩타이드만이 검출된 분획들을 모아 동결 건조하여, 펩타이드를 수득한 후, 질량 분석기(Mass Spectroscopy)를 이용하여 분자량을 측정하여, A4W(M.W:1295.75) 및 V8W(M.W:1267.72)의 결과를 수득하였다. 합성된 개구린 5의 펩타이드 유도체들의 서열목록을 도 1에 나타내었다.

참고예 1. 시약 및 기기

1-1. 재료

αMSH와 다른 상업적 펩타이드는 베이켐(Bachem)에서 구입하였으며, 안정한 HEK-293 세포와 BODIPY-TMR NDP-αMSH로부터 인간 재조합 MC4 수용체 막은 퍼킨엘머(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)에서 제작하였다. 아미노 말단이 수정된 TAMRA(5-carboxymethylrhodamine)로 표지(label)된 NDP-αMSH는 아나스펙(AnaSpec)에서 구입하였다. 프라조신(Prazosin)과 요힘빈(yohimbine), 인데놀정(propranolol)은 서울대학교 류판동 교수로부터 받았다. 한국산 개구리 펩타이드 유도체는 표준 Fmoc 화학(standard Fmoc chemistry)을 이용하여 고체상 합성법(solid-phase methods)으로 합성하였다. 화학적 라이브러리(libraries)는 한국한 약초 추출물에서 나온 HPLC 분리액에서 구했다. 모든 다른 시약들은 시그마사(Sigma Chemical Co.)에서 구입하였다.

1-2. 기기

형광분광 분석은 왈렉 빅터(Wallac Victor) 3VTM (PerkinElmer Life and Analytical Sciences)로 수행하였다. 여기 필터, 544(15) nm와 발산 필터, 595(60) nm는 공장에서 공급되었다. 수용체막이 없을 때, 0.1% 플루로닉(Pluronic)을 포함한 50 mM HEPES에서 1.0 nM TAMRA-NDP-αMSH에 대한 mP값은 99 ± 4 mP였다. 일차와 이차 수용체-리간드 결합 분석. 인간 MC4R 막 균질현탁액은 막 농도에 필요한정도로 결합 버퍼로 희석되었다. (50 mM HEPES 완충용액, pH 7.4, 2 mM CaCl₂, 다양한 농도의 계면활성제(various concentrations of detergents)) 일반적으로 결합 분석은 최종 부피가 40μl이 되도록 수행된다.: 치환 리간드 20μl와 10μl의 형광 추적자, 그리고 10μl의 희석된 수용체 막이 차례대로 가해졌으며, 반응은 FP가 각 실험에 따라 측정될 때가지 0.5-24시간 동안 실온에서 배양하였다.

1-3. 자료분석

FP 결합 자료는 그래프페드 프리즘 소프트 웨어(GraphPad Prismㄾ software)를 사용하여 분석하였다. 경쟁적 결합 자료는 비선형회기 곡선적합(nonlinear regression curve fitting)법을 사용하여 원-사이트 길항적 결합 방정식(one-site competitive binding equation)에 맞추었다. IC50값은 저해 곡선에서의 비선형회기 분석(nonlinear regression analysis)을 통해 결정되었다. 자료는 4-6회 반복한 것의 평균값이며, 모든 에러는 치환 곡선을 제외하고 자료가 흩어져있는 ±1 표준편차(standard deviation) 단위를 의미하며, 여기서 에러는 ±SE를 말한다. FP결합을 억제함으로써 얻어진 친화도 (IC50값)는 쳉-프로스오프 방정식(Cheng-Prusoff equation)을 이용하여 Ki값으로 변환되었고, MC4R에 대한 Kd값은 방사선리간드 (radioligand) 결합분석을 통해 얻었으며 막 제조업자에 의해 제시되었다. 사용된 [125I] NDP-αMSH의 농도는 0.18 nM이었다. MC4R의 cDNA는 일반적인 클로닝 과정에서 높은 발현율을 나타내는 인간 뇌 조직에서 얻었다. 전체적인 RNA는 산염(guanidine isothiocyanate)을 사용하여 준비한 후, 폴리아데닐레이티드(polyadenylated) RNA는 폴리 어트랙드 mRNA 아이솔레이션 시스템 III(Poly ATract mRNA Isolation System III, Promega)를 이용하여 준비하였다. 또한, cDNA는 MC4Rdp특이한 두개의 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 생성하였다. (sense, 5'-CTCAAGCTTCGACTGAACTCCACCCACCGTGGG-3' and antisense, 5'-CGGTGGATCCCGGGCTTAATATCTGCTAGACAAGTCACA-3'). NM005912에 의거한 MC4R의 999-bp ORF(open reading frame)은 양방향으로 염기 서열화하였다. cDNA는 배양된 포유세포에서 MC4R를 발현하기 위해 pEGFP-N1에 클로닝 하였으며, 아데닐 고리화효소(Adenylyl cyclase) 분석. 루시페라아제 리포터(luciferase reporter) 분석으로부터 나온 CRE(Cyclic AMP responsive element)는 아래에 설명한 것과 같이 수행되었다. COS-7 세포는 리포터 플라스미드인 CRE-Luc (Stratagene)로, 리포펙타민 시약(Lipofectamine reagent, Invitrogen)을 이용하여 인간 MC4R을 발현한 플라스미드로 일시적으로 감염되었다. 감염 효율을 평준화하기 위하여, pCMV-β-갈락토시다아제(galactosidase, Promega)에 대한 DNA를 함께 감염시켰다. 다양한 농도의 αMSH나 순수한 펩타이드로 6시간 동안 자극한 후, 전체 세포 추출물은 분리되었고, 루시페라아제 활성은 판매자(Promega)의 프로토콜에 따라 결정되었다. 각 값은 갈락토시다아제 활성으로 평준화 되었다.

실험예 1. 형광 편광 분석법을 이용한 MC4 수용체 분석

1-1. 실험준비

MC4 수용체에 대한 HTS 분석에서 형광편광 분석법(FP)의 효율성을 증명하기 위해서, 본 발명에서는 MC4 수용체 분석법을 이용하였다. 인간 재조합 MC4R 막 준비와 TAMRA-NDP-α-MSH, 분석용 완충액과 다양한 치환 리간드를 384-웰 마이크로 플레이드(well microplate)에 준비하였으며, 두 가지의 비이온성 계면활성제에 대한 MC4 수용체의 수행능력을 설명하기 위한 파라미터들을 하기 표 1에 나타내었다. 각 웰당 5.2 pmol/mg의 Bmas를 가진 MC4 수용체와 1.0 nM의 TAMRA-NDP-αMSH나 BODIPY-TMR NDP-αMSH가 이용되었다.

1-2. 실험결과

일반적으로 사용되는 계면활성제인 2.5% PEG와 BODIPY-TMR 트레이서는 수정된 FP 분석 윈도우가 118mP로 높았음에도 불구하고 높은 표준편차 때문에 0.26이라는 Z값을 나타내게 되었다. 따라서 HTS 분석을 더 최적화 시키고자 0.1% 플루로닉 F-127을 포함한 더 간단한 완충 시스템으로 수행하였으며, 이는 농도가 최적의 FP 분석 윈도우와 좋은 Z값을 결정한다는 것을 알 수 있었다. 5.0μg의 인간 MC4R 막 단백질에 대한 TAMRA-NDP-αMSH (0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 nM/웰)의 결합은 2μM NDP-αMSH가 있을 때와 없을 때 측정되었다. TAMRA-NDP-αMSH의 가장 최적의 농도(1.0 nM/웰)는 방사능리간드 분석에서 알려진 Kd 값(0.17 nM)보다 5.9배 높았다. FP수행능을 가진 형광발색단(fluorophore) 농도(0.9~1.0 nM)의 범위는 매우 좁았다. 2nM TAMRA-NDP-α-MSH이상의 높은 형광발색단 농도는 결합하지 않은 형광발색단이 많아서 이것이 분석 윈도우를 감소시키는 역할을 하기 때문에 수행능이 좋지 않았다. TAMRA-NDP-αMSH와 MC4R 사이의 결합 반응에 대한 시간 곡선을 도 2에 나타내었다. 평형상태는 최대 치환 신호에 다다르기까지 실온에서 거의 60-90분이 걸렸으며, 결합한 신호와 치환된 신호는 훌륭한 분석 윈도우를 보여주며 적어도 6시간 동안 안정하였다 (79-86 mP). 1.0 nM/웰 의 트레이서의 농도는 8시간 이상 관찰하였을 때 0.5보다 더 큰 Z값을 나타내었다. 분석의 정확성은 분석 윈도우가 7시간과 8시간 사이에 천천히 감소하였으나, 0.51-0.63의 Z 범위에서 안정하였다. 그러나 플레이트가 실온에서 밤새 보관되었을 때, 분석 윈도우는 45mP보다 적게 떨어졌으며, Z값도 0.2보다 낮아졌다. 밤새 결합 신호가 천천히 감소한 것은 마이크로플레이트표면에 MC4R이 소수성과 이온성(hydrophobic and ionic) 반응으로 비특이적으로 결합한 것이 증가하였기 때문이다.

계면 활성제	단백질/웰 (㎍)	결합 신호 (Bound signal, mp)	결합신호안에서의 감마(σa)값	치환신호 (Displaced signal, mp)	치환신호안에서의 감마(σb)값	Z' 값	수정된 FP 분석 윈도우
2.5%폴리에틸렌 글리콜 (PEGc)	5.0	238	19	120	10	0.26	118
0.1% 플루로닉 F-127d	5.0	173	5.0	90	5.7	0.61	84
a:인트라-어세이 정밀성은 결합과 친환된 두 신호값의 6번 반복실험의 평균을 내어 결정되었다. b: 결합된 펩타이드는 2μM NDP-αMSH를 이용하여 완전히 치환되었다. c: BODIPY-TMR-NDP-αMSH(1nM/웰)이 사용되었다. d: TAMRA-NDP-αMSH(1nM/웰)이 사용되었다.

실험예 2. 치환 연구

2-1. 인간 MC4R 에 대한 TAMRA - NDP -α MSH 로의 치환

αMSH와 다른 MC4R 리간드를 사용함으로써 인간 MC4R에 대한 TAMRA-NDP-αMSH의 치환 곡선을 도 3에 나타내었다. FP 분석 시스템은 다양한 실험 조건에서 >80 mPs의 높은 분석 윈도우와 훌륭한 Z값을 낸다. 현재 FP 분석법의 높은 정확성은 각각의 자료점에서 에러를 볼 때 명확하며, HTS에 적합한 분석법임을 알 수 있다. 막제조에 있어 수용체의 농도는 FP 결합 분석에 있어서, 문헌농도(5.0-6.25μg 단백질)와 제조업체에서 추천하는 농도(6.4μg/well)에 따라 결정되었다. 다양한 농도(2.5, 5.0, 6.25μg)의 막 단백질은 1.0 nM TAMRA-NDP-αMSH와 2μM NDP-αMSH 존재 하에 적정되었다. 방사성동위원소 여과(radioisotope filtration) 분석의 78%에 해당하는 많은 양의 MC4R 막(5.0μg)이 좋은 분석 결과를 보였다. 1-10μM NDP-αMSH, MTII와 SHU9119 는 트레이서인 TAMRA-NDP-αMSH로 거의 치환되었으나 18μM αMSH가 트레이서로 치환되는데 필요하였다. FP 분석에 의해 결정된 Kd값이 비례(ratiometric) 한데 비해, 방사능리간드 분석에 의해 결정된 Kd값은 절대적이기 때문에, 본 발명에서는 NPFF 리간드의 KI값을 계산하기 위해서 제조업체의 자료지에 보고되어 있는 [125I]NDP-αMSH (0.17 nM)의 Kd값을 사용하였다.

2-2. 리간드에 따른 수용체의 친화도 비교

HTS 분석을 위해, 자료의 일관성은 서로 다른 3일에 있어 리간드-수용체 결합 분석을 함으로써 시험하였다. 표 2는 FP 실험에서 사용되어진 모든 리간드에 대해 경험적으로 결정되어진 Ki값을 나타내며, 방사성동위원소 여과 분석과 BODIPY-TMR NDP-αMSH를 사용한 FP 분석에 의해 얻어진 비교적인 Ki값의 리스트를 나타낸 것이다. TAMRA-NDP-αMSH를 사용한 FP 분석에서 SHU9119 (Ki = 0.109 nM)은 리간드에 대해 가장 높은 친화도를 나타낸 반면, αMSH (Ki = 77.22 nM)는 가장 낮은 친화도를 나타내었다. NDP-αMSH (Ki = 0.661 nM)와 MTII (Ki = 0.185 nM)는 높은 친화도를 나타내었다. 표 1과 도 3에서 최대 mP값은 상대적으로 다양하게 나타났다. 0.1% 플루로닉에서 시간에 따라 최대mP값과 신호 분석 윈도우값이 감소함을 관찰할 수 있었다. 이에 본 발명에서는 도 3와 표 2에서의 실험에서 0.9 nM 트레이서와 6.25μg 막단백질을 사용하였고. 30%까지의 다양한 mP를 관찰할 수 있었다.

저해제(Inhibitor)	TAMRA-NDP- MSH Human	[125I]리간드여과 (Ligand Filtration) Human	BODIPY-TMR NDP-MSH Human
	aKi(nM)	bKi(nM)	cKi(nM)
MSH	77.22±10.06	900±97	458
NDP-MSH	0.661±0.091	2.93±0.34	0.68
MTⅡ	0.1850.029	6.60±0.82	ND
SHU9119	0.109±0.013	0.360±0.059	0.63
a: Ki로 표현된 FP친화도는 인간 MC4수용체 막 제조와 트레이서로써 TAMRA-NDP-MSH를 사용하는 경쟁 결합 데이타로부터 얻어졌다. 결과는 세번의 분리된 실험으로부터 means±S.E.로 얻어졌다. b: 데이터(from Biochem. Biophys. Res. Commun. 301:399-405(2003) c: 데이터(from J. Recept. Signal Transd. Res. 22: 335-345(2002);ND=결정되지 않았음

실험예 3. 결합특이성 분석

3-1. 개구린 5 펩타이드 유도체의 인간 MC4 수용체결합

표 3은 인간 재조합 MC4 수용체에 대해 검색되고 확인된 한국산 개구리와 약초 추출물을 보여준다. 370 라이브러리가 퍼센트 반응성에 상응을 검토하기 위해 두개의 분리된 실험에서 2번 테스트되었다. 두 개의 384-웰 플레이트가 각각 웰당 40μl씩 처리되었고, 각각 분석되었다. 퍼센트 반응성은 양성 대조군인 2μM NDP-αMSH에 대한 알려지지 않은 라이브러리의 mP값의 퍼센트로 계산되었다. 흥미로운 웰은 705이상의 저해를 보여주는 것으로 정의하였다. 적중률은 재실험시 70% 이상의 저해를 보여주는 라이브러리수의 퍼센트로써 계산되었다. 70%저해라는 제한선에 있어서, 두개의 히트 (0.54% 적중률), 즉, FLGWLFKVASK와 FLGWLFKWASK가 한국산 개구리인 옴개구리 에서 유래한 펩타이드 유도체로 부터 일차 검색으로 확인되었다.

실험된 화합물	%저해율	흥미로운 웰	적중률 (Hit rate)	재실험율
370	>70%	22	5.9%	0.54%

도 4에서 치환 자료의 비선형(nonlinear) 분석은 FLGWLFKVASK와 FLGWLFKWASK에 있어 2.21과 2.54의 저해 상수 (Ki)를 나타내었다. 세 가지의 다른 펩타이드 유도체들도 구조-활성 상관관계를 연구하기 위하여 테스트되었다. 표 4는 MC4 수용체에 대한 리간드 결합 친화도의 순위가 기능과 항생 분석에서 얻어진 능력과 일치한다는 것을 보여준다. FLGALFKVASK는 32.21μΜ에서 가장 높은 Ki값을 보여준 반면, FLGFLFKVASK은 1.41μΜ에서 가장 낮은 Ki값을 보였다. 흥미롭게도, 4번 위치의 Gly을 Phe나 Trp으로 치환하고, 8번 위치의 Val을 Trp으로 치환한 것이 결합 분석에서 성능의 증가를 나타낸 것으로 보아 11개의 펩타이드에서 4번 위치와 8번 위치의 소수성 페닐알라닌(hydrophobic phenylalanine)과 양극성 트립토판(amphipathic tryptophan)이 MC4수용체와의 결합에 중요한 것으로 보인다.

리간드	Ki, μM	EC50	항생활성b, μg/ml
αMSH	0.077±0.01a	1.469±0.605nM	N.D
FLGALFKVASK	32.21±2.97	N.D	>200
FLGFLFKVASK	1.41±0.07	N.D	12.5
FLGWLFKVASK	2.21±0.37	88.68±5.215μM	6.3
FLGALFKWASK	3.17±0.14	N.D	12.5
FLGWLFKWASK	2.54±0.46	16.40±6.566μM	3.2
Ki로 표시되는 친화도는 인간 MC4수용체 막 제조(6.25㎍/웰)와 트레이서로써 TAMRA-NDP-αMSH를 사용하는 경쟁 결합 데이타로부터 얻어졌다. 인트라-어세이 정밀성은 결합과 친환된 두 신호값의 5번 반복실험의 평균을 내어 결정되었다.결합된 트레이서는 10μM NDP-αMSH, 164μM 펩타이드 유도체를 이용하여 완전히 치환되었다. 결과는 세번의 분리된 실험으로부터 means±S.E.로 얻어졌다. EC50은 COS-7세포에서 세포내 cAMP생산의 50%를 높이는 작용물질(agonist)의 농도이다. 항생활성은 Bacillus subtilis의 세포성장을 완벽하게 저해하는 가장 낮은 펩타이드 농도인 ㎍/ml을 최소저해 농도로써 나타냈다. a: 데이터는 표 2를 참고하였다. b: H.S. Won et al., J. Biol. Chem. 279, pp 14784-14791, 2004 N.D는 결정되지 않았다.

3-2, 인간 MC4 수용체의 기능적 개요

개구린 펩타이드 유도체에 대한 인간 MC4 수용체의 기능적인 활성을 측정하기 위해, 펩타이드를 처리했을 때와 처리하지 않았을 때의 CRE-루시페라아제 활성이 측정되었다. 인간 MC4R이 COS-1과 HEK-293 세포에서 아데닐 고리화 효소(adenylyl cyclase) 활성이 증가하였다는 것은 이미 알려져 있다. 표 4에서 보여진 것과 같이, αMSH의 EC50 값은 1.469 nM로 측정되며, 이는 이전에 보고된 값과 유사하다. 5개의 펩타이드 중에서 두개의 펩타이드 유도체인, FLGWLFKVASK와 FLGWLFKWASK가 각각 88.68μM와 16.40μM의 EC50값을 나타내었으나, 다른 3개의 펩타이드는 확연한 루시페라아제 활성을 보이지 않았다.

본 발명의 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 펩타이드 유도체 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 펩타이드 유도체 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 펩타이드 유도체 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 펩타이드 유도체 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1의 펩타이드 유도체 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 개구린 5로부터 설계 및 합성된 펩타이드 유도체들은 식욕조절과 비만유발에 중추적인 역할을 하는 멜라노 코르틴 수용체와 결합함으로써 인간 멜라노 코르틴 4 수용체를 탐색하고 분석하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 세포 독성이 없고 인간 적혈구 세포에 대한 용혈활성이 적으므로 인체에 안전한 비만관련 질환 예방 및 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (4)

1. 개구린 5로부터 설계 및 합성된 F-L-G-W-L-F-K-V-A-S-K(A4W-GGN5N11) 및 F-L-G-A-L-F-K-W-A-S-K(V8W-GGN5N11)로 표시되는 펩타이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 비만 관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드 유도체는 펩타이드의 아미노산 말단 부위를 트립토판(Tryptopan)으로 치환시켜 합성하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드 유도체는 인간 멜라노 코르틴 4 수용체와 결합함을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 비만관련 질환은 과식, 과음 및 과식증, 고혈압, 당뇨, 증가된 혈장 인슐린 농도, 인슐린 내성, 지혈증 이상, 과지혈증, 대사 증후군, 인슐린 내성 증후군, 비만 관련 위식도 역류, 동맥경화증, 과콜레스테롤혈증, 요산과다혈증, 하부등 통증, 심장비대 또는 좌심실 비대인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

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