KR100547565B1

KR100547565B1 - 개구린 5로부터 합성 및 제조된 항생 펩타이드 유도체

Info

Publication number: KR100547565B1
Application number: KR1020040000730A
Authority: KR
Inventors: 이봉진; 원형식; 정서정; 김형은; 서민덕
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2004-01-06
Filing date: 2004-01-06
Publication date: 2006-01-31
Also published as: WO2005070956A1; KR20050072337A

Abstract

본 발명은 국내산 옴개구리(Rana rugosa)로부터 분리된 항생 펩타이드인 개구린 5(Gaegurin 5)의 체계적인 펩타이드 엔지니어링을 통해 분자 크기가 개구린 5의 절반 이하이면서도 높은 항생활성을 가지는 항생 펩타이드에 관한 것으로서, 상세하게는 국내산 개구리의 표피로부터 분리된 항생 펩타이드인 개구린 1 내지 개구린 6 중, 가장 짧은 길이를 가진 개구린 5로부터 합성, 제조된 항생 펩타이드 유도체들은 지금까지 알려진 항생펩타이드 중 가장 짧은 길이를 가지며, 세포 독성이 없고 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 인간 적혈구 세포에 대한 용혈활성이 적으므로 인체에 안전한 최적의 항생제로서 유용하게 이용될 수 있다.

옴개구리, 항생 펩타이드, 항균활성, 항생제, 양친화성, 개구린

Description

개구린 5로부터 합성 및 제조된 항생 펩타이드 유도체{Analogues of antimicrobial peptide synthesized and produced from Gaegurin 5}

도 1a는 SDS 미셀(micells)에서 개구린 5(GGN5)의 펩타이드를 측면에서 본 구조를 나타낸 도이고,

도 1b는 SDS 미셀에서 개구린 5의 α-헬릭스 구역의 N-말단 부분 (G3~V13)을 상면에서 본 구조를 나타낸 도이며,

도 2는 개구린 5 및 이의 유도체들의 서열 목록을 나타낸 도이고,

도 3a는 개구린 5의 유도체인 A4W(또는 V8W)-GGN5N11의 헬리컬 휠 다이어그램(helical wheel diagram)을 나타낸 도이며,

도 3b는 개구린 4의 유도체인 D16W-GGN4N23의 헬리컬 휠 다이어그램을 나타낸 도이고,

도 4는 스타필로코쿠스 아우레스 및 에스체르치아 코라이 균체에 대한 GGN5, A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11의 타임-킬 커브 분석을 나타낸 도이며,

도 5는 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11의 CD 스펙트럼 분석을 나타낸 도이고,

도 6은 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11의 NMR 분석을 나타낸 도이다.

본 발명은 개구린 5로부터 합성 및 제조된 항생 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 빨리 일어난다. 예를 들어, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다(stuart B. Levy., Scientific American, pp46-53, 1998).

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견되었으며, 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다. 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz, Rev. Infec. Dis., 7, pp368-386, 1985). 아울러, 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이라고 간주되는데, 이것은 항생제 치료에도 불구하구 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 세균들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로(Liu and Tomasz, J. Infect. Dis., 152, pp365-372, 1985), 이러한 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.

세균은 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신(bacteriocin)들은 구조적으로 세 부류로 분류된다. 첫 번째는 란티바이오틱스(lantibiotics)이며, 두 번째는 비-란티바이오틱스(non-lantibiotics)이고, 세 번째는 신호 펩타이드(signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다(Cintas et al., J. Bad., 180, pp1988-1994, 1998). 곤충을 포함하는 동물들 역시 자연적으로 생성되는 펩타이드 항생제를 생산하는데, 상기의 항생제는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나뉘어진다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-회전형의 양친화성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다(Mayasaki et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 9, pp269-280, 1998). 이들 항생 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 항생 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 많은 것은 곤충에서 발견된 항생 펩타이드인 세크로핀(cecropine)과 같이 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선을 형성하는 구조이다.

생체막에 작용하는 항생 펩타이드는 현재 거의 모든 생물종에서 발견되고 있다. 최근 내성균의 증가와 더불어 이를 극복할 수 있는 새로운 항생제 개발의 대상으로서 항생 펩타이드가 주목받고 있는데, 특히, 1969년 봄비닌(bombinin)이란 항생 펩타이드가 발견된 이래로, 개구리나 두꺼비와 같은 양서류의 표피가 풍부한 항생 펩타이드를 제공한다는 것이 밝혀졌고, 이러한 항생 펩타이드들이 현재 세계적으로 가장 많이 연구되어 있다. 이후, 1987년 아프리카 발톱 개구리의 표피로부터 마가이닌(magainin)이라는 항생 펩타이드가 발견되면서부터 개구리 표피 항생 펩타이드가 새로운 항생제 개발의 대상으로 더욱 주목받게 되었다.

항생 펩타이드는 세균의 세포막에만 선택적으로 작용하여 세포막을 파괴함으로써 세균을 사멸시키는 작용기전을 가지고 있기 때문에, 이는 기존 항생제들의 작용기전들과 전혀 다른 새로운 기전이므로, 내성균 극복의 대안으로서 가치가 높다. 또한 일반적으로 항생 펩타이드들은 그램 양성 및 그램 음성균과 진균 및 바이러스를 비롯하여 암세포 등에 대해서까지 폭넓은 항생 작용을 나타내며, 자연 물질이므로 약으로 개발될 경우 부작용이 적을 것으로 예상되고 있다. 또한, 제제학적인 측 면에서도 항생 펩타이드는 수용성과 지용성을 모두 가지는 양성 친화적 성질을 가지고 있기 때문에 약물로 개발시 흡수 및 약물수송 등에서도 매우 유리할 것으로 기대되고 있다. 그러나, 이러한 다양한 이점에도 불구하고 약물개발 대상으로서 항생 펩타이드가 가지는 가장 큰 문제점은 안정성과 분자량이다. 첫째 안정성 측면에서, 항생 펩타이드는 생체 내에 존재하는 수많은 단백질 분해효소들에 대한 저항성을 가지지 않으므로 분해되기가 쉽다. 이러한 문제는 현재, D-아미노산의 도입, β-아미노산 등의 비-자연 물질(unnatural) 유래의 아미노산의 도입 및 화학적 구조 변형 등으로 극복될 수 있다는 것이 많이 제안되고 있으나, 일반적으로 항생 펩타이드의 분자량이 3,000 이상으로 매우 크다는 점은 약물 개발시 흡수와 수송 면에서 매우 어려운 점으로 작용할 수밖에 없다. 이는, 기본적으로 작은 크기의 항생 펩타이드를 발견 또는 설계하는 것으로서만 극복될 수 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래 항생 펩타이드들의 단점을 극복하기 위하여, 본 발명자들에 의해 이미 그 구조가 밝혀진 국내산 개구리로부터 분리된 6종의 항생 펩타이드(개구린 1 내지 개구린 6)들 중 가장 짧은 길이를 가진 개구린 5를 기반으로 하여 훨씬 더 작은 크기의 새로운 항생 펩타이드를 설계하고 합성하여, 이와 같이 합성된 항생 펩타이드들의 탁월한 항균활성 및 용혈활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생물학적 활성도가 높고 활성 작용범위가 넓으며 인체에 사용할 경우, 용혈현상을 일으키지 않는 개구린 5로부터 설계 및 합성된 항생 펩타이드 유도체 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개구린 5로부터 설계 및 합성된 F-L-G-W-L-F-K-V-A-S-K(A4W-GGN5N11) 및 F-L-G-A-L-F-K-W-A-S-K(V8W-GGN5N11)로 표기되는 신규한 항생 펩타이드 유도체를 제공한다.

상기 항생 펩타이드 유도체는 펩타이드의 특정 부위를 트립토판(Tryptopan)으로 치환시켜 합성하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 개구린 5로부터 설계 및 합성된 항생 펩타이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 항균 또는 항진균용 약학조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 개구린 5로부터 설계 및 합성된 항생 펩타이드 유도체는 하기와 같은 방법으로 수득될 수 있다.

본 발명의 한국산 개구리인 옴개구리로부터 분리된 6종의 항생펩타이드(개구린 1 내지 개구린 6) 중 가장 긴 길이(37잔기)를 가지는 개구린 4와 가장 짧은 길이(24잔기)를 가지는 개구린 5의 공학적 변형을 통하여 본 발명의 항생 펩타이드 유도체들을 합성 및 제조할 수 있다.

구체적으로 최적의 항생 펩타이드 유도체를 합성하기 위하여, 개구린 4 및 개구린 5를 모분자로 하여 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 고체상 합성방법을 사용하여 합성할 수 있으며, 바람직하게는 개구린 4에 대하여 개구린 4의 C-말단 잔기들을 하나씩 제거하면서 펩타이드 유도체들의 항생능을 검증하여 개구린 4의 C-말단 14 잔기를 제거하여 N-말단의 23 잔기만을 남겼을 경우 항생능이 모두 사라짐을 확인한 후, 이렇게 비활성화된 개구린 4 유도체의 16번 위치에 Trp(트립토판) 잔기로 치환하여 개구린 4의 유도체(D16W-GGN4N23)를 합성하고 이의 항생능을 검증한 결과, 항생능을 다시 가지게 됨을 확인하여 Trp 잔기 도입의 중요성을 인지하여 이를 개구린 5의 유도체 합성에 이용할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 개구린 5에 대하여도 개구린 5의 C-말단 잔기들을 하나씩 제거하면서 항생활성을 검증한 결과, 항생활성을 가지는 최소 잔기가 13 잔기임을 확인하고, 상기 언급한 바와 같이 개구린 4의 유도체 연구로부터 항생 펩타이드 유도체 개발시 Trp 도입의 유용성이 예상되므로, 개구린 5의 13 잔기 활성 분절 대신 11 잔기 불활성 분절에 Trp 잔기를 치환하여 총 11가지의 개구린 5의 Trp 치환체를 합성할 수 있으며, 이들의 활성을 검토하여 개구린 5의 Trp 치환체들 중, 4번 위치에 Trp를 도입한 A4W-GGN5N11 및 8번 위치에 Trp를 도입한 V8W-GGN5N11 유도체가 모분자인 개구린 5와 유사한 항생활성 및 용혈활성을 보임을 확인한 다음, 4번과 8번 위치에서 Trp만이 특이적인지를 알아보기 위하여 다른 아미노산, 바람직하게는 소수성 잔기 Leu(로이신), 친수성이며 특히 양성이온을 가지는 Lys(리신) 및 Trp과 같이 방향성 고리(aromatic ring)를 가지고 있는 Phe(페닐 알라닌)의 세 가지 아미노산으로 치환하여 총 7가지의 개구린 5의 아미노산 치환체를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명의 항생 펩타이드 유도체들은, 펩타이드 합성기를 이용하는 화학적 방법에 의하여 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 항생 펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함하고, 상기의 항생 펩타이드들을 발현하기에 적합한 유전자 클론을 유전자 조작에 의하여 만들고 이를 적합한 세포에 이식하여 발현된 상기의 항생 펩타이드를 수득하는 유전자 재조합 기술에 의하여도 수득될 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 방법으로 수득된 항생 펩타이드 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 항생 펩타이드 유도체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 항균 또는 항진균용 약학조성물을 제공한다.

상기와 같이 수득된 본 발명의 항생 펩타이드 유도체들 중에서 분자량과 안정성면에서 탁월한 최적의 항생 펩타이드를 찾기 위하여, 항생 펩타이드 유도체들의 항균활성 및 용혈활성 등을 조사한 결과, 개구린 5의 유도체 중, 하기와 같은 유도체들은 개구린 5와 유사한 항균활성 및 용혈활성을 나타냄을 확인하였다.

GGN5N13 : F-L-G-A-L-F-K-V-A-S-K-V-L

A4W-GGN5N11 : F-L-G-W-L-F-K-V-A-S-K

V8W-GGN5N11 : F-L-G-A-L-F-K-W-A-S-K

반면에, 개구린 5의 유도체들 중, 하기와 같은 유도체들은 개구린 5와 유사한 항균활성을 보였으나, 용혈활성이 높게 나타남을 확인하였다.

A4L-GGN5N11 : F-L-G-L-L-F-K-V-A-S-K

V8L-GGN5N11 : F-L-G-A-L-F-K-L-A-S-K

W4,8-GGN5N11 : F-L-G-W-L-F-K-W-A-S-K

이외에 다른 유도체들은 일부 균을 제외하고는 대부분의 균들에 대하여 거의 항균활성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 항생 펩타이드 유도체들이 개구린 5에 대하여 구조적 유사성을 가지는지 여부, 항균활성 및 용혈활성을 가지는지 여부에 근거하여 개구린 5와 유사한 구조, 항균활성 및 용혈활성을 가지기 위해서는 이것의 유도체들이 개구린 5의 23개의 아미노산 잔기 중 최소한 11개의 잔기를 가지고 있어야 하며, 또한 유도체들이 충분한 항균활성을 가지기 위해서는 친수성 끝과 소수성 시작 면 사이의 위치에서의 Trp 치환을 통하여 양친화성을 가져야 함을 확인할 수 있었으며, 상기와 같은 결과로부터 항생제 개발을 위한 최적의 항생 펩타이드 유도체는 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 항생 펩타이드 유도체는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 항생 펩타이드 유도체는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 항생 펩타이드 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제학적으로 허용된 여러 가지 담체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 항생 펩타이드 유도체의 유효 용량은 0.1 내지 2㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.5 내지 1㎎/㎏이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물에서 상기 항생 펩타이드 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 또는 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 항생 펩타이드 유도체의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량에 따라 적절하게 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용 이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드의 합성 및 정제

양친화성 구조를 갖는 최적의 항생 펩타이드를 합성하기 위하여, 국내산 옴개구리의 표피에서 분리된 항생 펩타이드인 개구린 5를 모분자로하여 이보다 훨씬 더 작은 크기의 새로운 항생 펩타이드를 표준화된 Fmoc-법을 이용한 고상법(Wellings, D. A., and Atherton, E., Methods Enzymol., 289 , pp44-67, 1997)으로 펩타이드 합성기(Model 90 manufactured by Advanced Chemtech, Inc.)를 사용하여 자동으로 합성하였다. 즉, 레진(Rink Resin) 70mM을 반응 용기(reaction vessel)에 넣은 후에 아미노산(레진에 대해 3 당량 사용), HOBT(1-Hydroxybenzotriazole)(아미노산에 대해 2 당량 사용) 및 DIC(1,3-Diisopropylcarbodiimide)(아미노산에 대해 2 당량 사용)를 아미노산 용기(amino acid vessel)에 넣고 DMF(Dimethylformamide) 10㎖로 녹인 다음, DMF를 사용하여 반응 용기의 레진을 스웰링(swelling)시켰다. 25% 피페리딘/DMF를 사용하여 레진의 Fmoc 기를 제거한 다음, DMF, DCM(Dichloromethane) 및 IPA(Isopropanol)을 사용하여 레진을 씻어내었다. 아미노산 용기 안에 녹아있는 아미노산을 반응 용기로 옮겨 레진과 함께 2~3시간 반응시켰다. 여러 개의 아미노산을 붙여나갈 경우, 상기의 과정을 연속해서 실행시켜 아미노산을 차례로 결합시킨 다음, 맨 마지막 아미노산의 N-말단에 붙어있는 Fmoc 기를 25% 피페리딘/DMF를 사용하여 제거하였다. 라이신이나 세린 잔기에 붙어있는 프로텍팅 그룹(protecting group)을 떼어내고, 합성된 펩 타이드를 레진으로부터 분리하기 위하여 10% TFA(Trifluoro acetic acid)/DCM 20㎖를 넣어 4시간 동안 반응시킨 후, 고체 레진을 걸러내고 액을 둥근 플라스크에 넣어 증류시켰다. 용매가 모두 증발되면 20% 아세토니트릴(0.1% TFA) 10㎖를 적가하여 다시 녹인 다음, 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후, 상등액을 동결건조하고 C-18 컬럼을 이용한 역상 HPLC를 수행하여 정제하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoracetic acid)을 포함한 아세토니트릴/물 혼합용매를 사용하여 1㎖/분의 유속으로 45분간 수행하여 용리액 중 목적 펩타이드만이 검출된 분획들을 모아 동결건조한 후, 질량(Mass)을 측정하였다. 합성된 개구린 5의 항생 펩타이드 유도체들의 서열목록을 도 2에 나타내었다.

실험예 1. 항생 펩타이드의 항생 활성 측정

1-1. 생육 최소 저해 농도(MIC)의 측정

표준화된 마이크로딜루션 브로스 법(microdilution broth assay)으로 다양한 균주에 대한 MIC 측정을 함으로써 항생활성을 검증하였다. 브로스(Broth) 배지로는 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지를 사용하여, 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 레인 1 웰에 2㎎/㎖의 약물(상기 실시예 1에서 얻은 항생 펩타이드 유도체) 30㎕와 액체배지 270㎕ 넣고, 나머지 레인의 웰에는 배지만을 150㎕ 넣었다. 레인 1의 약물액 150㎕를 취해 레인 2에 섞어줌으로써 약물농도 2배 희석액을 만들었다. 같은 방식으로 이후 레인들에 대하여 2배씩 연속 희석(serial dilution)시킴으로써 각 웰에 최종 약물농도가 1.6 ~ 200㎍/㎖에서 2배 간격으로 희석되어 있는 150㎕의 약물액을 만들었다. 이후 3㎖ 브로스에서 10⁶~10⁸ cfu/㎖까지 키운 균주액을 각각의 웰에 25㎕ 씩 첨가한 후, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)를 37℃에서 하룻밤동안 배양한 다음, 각 샘플액의 UV 흡광도를 630nm에서 측정함으로써 균의 성장 여부를 파악하였다. 결과를 바탕으로 균의 성장을 완전히 저해시킨 약물농도 중 가장 작은 값을 생육 최소 저해 농도(MIC)로 결정하였다.

그 결과, 하기 표 1 내지 3에 나타낸 바와 같이 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11 모두 다양한 균주에 대해 항생작용을 보였으며, 항생능 또한 모분자인 개구린 5에 비교하여 떨어지지 않았다.

1-2. 용혈활성(Hemolysis) 측정

건강한 남성으로부터 채취된 혈액 3㎖를 PBS(phosphate buffered saline, 등장액)와 1:1(v/v)로 섞은 후, 원심분리하여 연막(buffy coat) 및 혈장을 제거하고 다시 생리식염수를 사용하여 3회 세척하여 순수한 적혈구를 분리하였다. 이를 20㎖ PBS에 현탁시켜 37℃, 수욕조에서 15분간 전배양하였다. 적혈구액 190㎖ 당 펩타이드액 10㎖씩 혼합하여 최종 펩타이드 농도가 100, 50, 25㎎/㎖ 인 혼합액을 각각 만든 다음, 이들을 37℃, 수욕조에서 30분간 배양한 후 원심분리하고 상등액을 100㎖ 씩 취해 각각 PBS 1㎖에 희석하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도와 0.2% 트리톤(Triton) X-100으로 처리한 세포 현탁액(cell suspension)의 흡광도와의 비로부터 % 용혈활성(hemolysis)을 계산하였다.

그 결과, 하기 표 1 내지 3에 나타낸 바와 같이 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11의 용혈활성능도 모분자인 개구린 5와 마찬가지로 미약하므로 항생제 개발에 적합한 물질임을 확인할 수 있었으며, 특히 V8W-GGN5N11이 A4W-GGN5N11보다 좀더 작은 용혈활성을 나타내었다.

최소 성장 저해 농도(㎍/㎖)
미생물	0	4	5	10	11	12	13	1-3, 6-9
그램-양성 박테리아
바실리스 서브틸리스	6.3	12.5	>200	12.5	25	25	6.3	>200
마이크로코쿠스 루테스	6.3	6.3	>200	3.1	6.3	200	1.6	>200
스타필로코쿠스 아우레스	3.1	3.1	200	3.1	3.1	12.5	1.6	>200
스타필로코쿠스 에피더미스	12.5	3.1	>200	3.1	3.1	50	3.1	>200
그램-음성 박테리아
에스체르치아 코라이(대장균)	12.5	25	200	6.3	50	50	12.5	>200
시겔라 디센타리아	50	25	200	6.3	50	200	25	>200
살모넬라 티피무리움	100	100	>200	12.5	>200	>200	100	>200
크레브지엘라 퓨움모니아	25	25	>200	3.1	100	100	25	>200
프로테스 미라빌리스	>200	>200	>200	200	>200	>200	>200	>200
슈도모나스 아에루기노사	200	100	>200	25	>200	200	100	>200
펩타이드 농도	용혈 활성(Hemolysis) %
100㎍/㎖	6.78	25.8	3.72	42.6	113	10.9	104	-

최소 성장 저해 농도(㎍/㎖)
미생물	14	15	16	17	19	21	23	18, 20, 22, 24
그램-양성 박테리아
바실리스 서브틸리스	100	50	12.5	6.3	200	12.5	25	>200
마이크로코쿠스 루테스	100	100	50	25	>200	50	25	>200
스타필로코쿠스 아우레스	100	25	12.5	3.1	100	12.5	12.5	>200
스타필로코쿠스 에피더미스	200	100	25	12.5	>200	25	50	>200
그램-음성 박테리아
에스체르치아 코라이(대장균)	200	100	100	25	200	25	100	>200
시겔라 디센타리아	>200	200	>200	12.5	>200	25	100	>200
살모넬라 티피무리움	>200	>200	>200	50	>200	100	200	>200
크레브지엘라 퓨움모니아	>200	100	100	12.5	100	12.5	50	>200
프로테스 미라빌리스	>200	>200	>200	>200	>200	>200	>200	>200
슈도모나스 아에루기노사	>200	>200	>200	100	>200	200	>200	>200
펩타이드 농도	용혈 활성(Hemolysis) %
100㎍/㎖	4.99	11.8	49.9	11.9	2.43	6.76	23.7	-

최소 성장 저해 농도(㎍/㎖)
미생물	25	26	27	28	29	30	31
그램-양성 박테리아
바실리스 서브틸리스	50	100	12.5	25	100	25	3.2
마이크로코쿠스 루테스	12.5	200	12.5	12.5	12.5	25	6.3
스타필로코쿠스 아우레스	25	200	12.5	25	200	50	3.2
스타필로코쿠스 에피더미스	50	>200	50	100	>200	100	6.3
그램-음성 박테리아
에스체르치아 코라이(대장균)	200	200	100	100	>200	100	12.5
시겔라 디센타리아	200	200	100	100	200	100	6.3
살모넬라 티피무리움	>200	>200	>200	>200	>200	>200	50
크레브지엘라 퓨움모니아	100	200	100	200	>200	100	12.5
프로테스 미라빌리스	>200	>200	>200	>200	>200	>200	>200
슈도모나스 아에루기노사	>200	200	>200	200	>200	>200	50
펩타이드 농도	용혈 활성(Hemolysis) %
100㎍/㎖	14.4	14.4	108	13.4	10.9	12.3	172

1-3. 타임-킬 커브(Time-Kill Curve) 분석

MIC로부터 검증된 항생활성이 박테리아 세포를 사멸시키는 살균(bactericidal) 활성인지 박테리아세포의 성장, 분열을 억제하는 세균 발육 저지(bacteriostatic) 활성인지를 규명하기 위하여 대표적인 그램 양성균인 스타필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus)와 그램 음성균인 에스체르치아 코라이(E. coli)에 대하여 타임-킬 커브 분석을 수행하였다.

우선, 테스트 균주를 LB 액체배지 2㎖에서 하룻밤동안 배양한 다음, 상기 실 시예 1에서 수득한 항생 펩타이드 2㎎/㎖을 LB 액체배지로 희석하여, MIC 농도 기준 ×4, ×2, ×1, ×0.5, ×0.25, ×0 농도가 되도록 6개의 튜브에 각각 2㎖가 되도록 만들고, 배양한 균주(약 10¹⁰ CFU/㎖) 20㎕를 새로운 LB 액체배지 2㎖에 희석한 후, 다시 20㎕를 취해 앞서 만든 5개 약물 희석액에 각각 첨가하여, 균주의 농도가 약 10⁶ CFU/㎖가 되게 하였다(10¹⁰에서부터 10⁴배 희석효과). 이를 37℃에서 다시 배양하고, 약물-균주 혼합으로부터 0, 2, 4, 6, 24 시간 배양 후의 샘플을 각각 취해 부-배양(subculturing)하였다. 각 특정 시간에서의 부-배양 과정은 우선 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 0.9% NaCl을 270㎕씩 넣은 후, 첫 번째 레인의 웰에 6개의 샘플을 각각 30㎕씩 첨가한(10배 희석) 다음, 여기서 다시 30㎕을 취해 다음 레인으로 섞어주는 방식으로, 각 샘플에 대해 연속적인 희석을 하여 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10 ⁸ 희석액을 만들었다. 각 희석액(6개 약물농도에 대한 8종의 희석액 = 48 개 희석액)을 100㎕씩 취하여 LB 고체배지(LB-agar plate)에 뿌린(spreading) 후, 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배양 후, 육안으로 셀 수 있는 적절한 수의 콜로니(colony)가 형성된 희석배수를 찾아 생성된 콜로니 개수에 희석배수를 곱하여 CFU/㎖를 계산하고, 각 약물농도에 대하여 시간에 따른 log10(CFU/㎖)을 플로팅하였다.

그 결과, A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11 두 유도체 모두 모분자인 개구린 5와 마찬가지로 MIC 농도 이상으로 적용시 시간이 지날수록 생존 박테리아의 수가 감소 하는 살균(bactericidal) 능력을 가지는 것으로 규명되었으며, 이러한 결과로부터, A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11 모두 모분자인 개구린 5의 절반도 안 되는 작은 크기를 가지면서도, 인간세포에 대한 부작용 없이 박테리아 세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 항생 펩타이드의 구조-기능관계 분석

2-1. 원이색성광도(Circular Dichroism, CD)

상기 실시예 1에서 얻은 건조된 펩타이드 분말의 양을 정밀히 재어 다양한 용매에 각각 50mM의 농도가 되도록 녹인 후, pH를 4.0으로 맞춘 다음 CD 스펙트럼 실험에 사용하였다. 용매로는 20mM 소디움 아세테이트 완충액(pH 4.0), 50% TFE/물, 5 mM DPC 미셀(micelles) 및 10 mM SDS 미셀 용액이 사용되었다. 온도 조절기가 달린 JASCO J-720 분광기를 이용하여 20℃에서 250nm에서 190nm까지 0.5nm 간격으로 CD 신호(signal)를 측정하였다. 이때, 측정용 세포의 지름은 0.2cm 이었으며, 스캔(scan) 속도는 50nm/min, 밴드너비(bandwidth)는 1nm, 응답시간(response time)은 4초로 설정하였다. 개개의 실험에 대하여 개별적인 3회의 측정을 하였으며, 검정 용매(blank solvent)의 신호를 뺀 후, 평균값에 대하여 하기 수학식 1에 의해 평균 잔류 몰 타원율(mean residue molar ellipticity)로 변환하였다.

여기서

(deg·㎠·dmol^-1)와

(mdeg) 는 각각 평균 잔류 몰 타원율과 특정파장 λ에서 측정된 CD 강도(3회 평균치)이고, ℓ, c, n 은 각각 측정 세포의 지름(cm), 시료농도(mM), 시료 펩타이드의 잔기수이다.

그 결과, 다양한 용매 조건에서 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11의 두 유도체 모두 모분자인 개구린 5와 같은 양상의 CD 스펙트럼 변화를 보여주었다(도 5 참조).

2-2. 핵자기공명(Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 분석

중수소 표지된 SDS를 물에 녹여 300mM SDS 미셀 용액을 만들고 여기에 펩타이드 분말을 녹여 3mM이 되게 한 후, 40℃에서 브룩커(Bruker) DRX 500 분광기로 NMR 측정을 수행하였다. 측정 스펙트럼의 종류는 DQF-COSY, TOCSY(60 ms mixing time 적용), NOESY (200 ms mixing time 적용)의 이차원 스펙트럼들이며 용매 신호 제거는 선택적인 전-포화(pre-saturation) 방법이 사용되었으며, 측정된 NMR 데이터는 NMR Pipe/NMR Draw 및 NMR View 프로그램을 사용하여 표현 분석되었고 ¹H의 화학적 이동( chemical shift)의 기준물질로는 DSS를 사용하였다. NMR 분석은 우드리치(Wuthrich)에 의해 표준화된 방법(Wuthrich, K., NMR of Proteins and Nucleic Acids, John Wiley and Sons, New York, 1986)을 사용하였다. 즉, TOCSY와 DQF-COSY에 기반한 스핀-시스템(spin-system) 분류 후 NOESY 스펙트럼상의 NOE 연결성(connectivity)을 따라 서열-특이성 분석(sequence-specific assignment)을 수행하였다.

그 결과, 보다 정밀한 구조 정보를 NMR 분석으로부터 얻을 수 있었으며, 분석결과 A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11의 두 유도체 모두 Gly 3 또는 Leu 2 잔기로부터 Ser 10 또는 Lys 11 잔기까지 안정한 헬릭스 구조를 이루고 있음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

2-3. 형광(Fluorescence) 분석

pH 4.0의 다양한 용액조건(정제수, 10 mM SDS 미셀, 5 mM DPC 미셀)에서 5mM 의 펩타이드와 NATA에 대한 형광 강도를 분석하였다. 온도 조절기가 달린 JASCO FP-6500 분광기와 1cm 직경의 측정 세포를 사용하여 20℃에서 300nm에서 450nm 영역의 형광 발산을 측정하였다. 트립토판(Tryptophan)에 의한 형광만을 검출하기 위해 여기 파장(excitation wavelength)은 295nm를 사용하였으며, 이때 여기 (excitation) 및 발광(emission)의 띠폭(bandwidth)은 5nm, 응답시간(response time)은 0.5초, 스캔 속도는 1000nm/min이었다. 형광 켄칭(quenching) 실험은 에프틴(Eftink) 및 지론(Ghiron)에 의해 표준화된 방법(Eftink, M. R. Ghiron, C. A., Biochemistry, 15, pp672-680, 1976; Eftink, M. R. Ghiron, C. A., J. Phys. Chem., 80, pp486-493, 1976; Eftink, M. R. Ghiron, C. A., Biochemistry, 16 , pp5546-5551, 1977)을 사용하였다. 즉, 2㎖의 시료 용액에 8M의 아크릴아미드(acrylamide)를 소량씩 적가하면서, λ_max(최고 형광강도가 나타나는 파장)에서의 신호 강도를 연속적으로 측정하였다. 아크릴아미드 첨가 시 피펫을 이 용하여 형광강도가 안정화 될 때까지 부드럽게 섞어 준 후 측정값을 기록하였다. F0/(F·e^V[Q]) 값을 켄처(quencher)인 아크릴아미드 농도에 대하여 플랏한 후, 그래프가 직선이 될 때까지 정상(static) 켄칭 상수(V)값을 변화시켜 얻어진 직선의 기울기로부터 충돌(collisional) 켄칭 상수(또는 Stern-Volmer 상수, K _SV)를 얻었다. 이는 하기 수학식 2의 스테른-볼머(Stern-Volmer) 변형식에 근거하여 계산하였다.

여기서 F 와 F₀ 는 각각 켄처인 아크릴아미드가 있을 때와 없을 때의 λ_max에서의 형광 강도를 나타낸다.

그 결과, A4W-GGN5N11 및 V8W-GGN5N11의 두 유도체의 Trp 잔기로부터의 형광 곡선은 물에서보다 SDS 미셀과 DPC 미셀 상에서 블루-쉬프트(blue-shift), 즉 낮은 파장쪽으로 10nm 이상 이동하여 있음을 확인할 수 있었다. 또한 아크릴아미드를 이용한 켄칭 실험에서 구해진 충돌 켄칭 상수 K _SV 와 정상 켄칭 상수 V의 값이 물에서보다 DPC 및 SDS와 같은 계면활성제 미셀(detergent micelles)에서 크게 감소된 것을 알 수 있었다(표 4 참조).

구분	λ_max(nm)/F_max			K _sv(M^-1)/V(M^-1)
구분	H₂O	SDS	DPC	H₂O	SDS	DPC
NATA	358.5/567	358.0/542	355.5/662	17.4/1.9	17.0/1.9	15.4/2.5
A4W	355.5/161	335.0/178	340.5/610	10.8/2.0	6.8/0.1	5.0/1.4
V8W	355.5/243	336.5/150	339.5/537	11.0/1.5	4.5/0.1	7.3/1.3

상술한 바와 같이, 본 발명의 개구린 5로부터 설계 및 합성된 항생 펩타이드 유도체들은 그램 양성균 및 그램 음성균 모두에서 탁월한 항균활성을 나타낼 뿐만 아니라, 인간 적혈구 세포에 대한 용혈활성 또한 매우 낮으므로 인체에 안전하며, 지금까지 알려진 항생 펩타이드 중 가장 짧은 길이를 가지고 있으므로 약물로 개발시 흡수 및 약물 수송 등에서 매우 유리하므로 최적의 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

개구린 5로부터 설계 및 합성된 F-L-G-W-L-F-K-V-A-S-K(A4W-GGN5N11)로 표기되는 신규한 항생 펩타이드 유도체.
개구린 5로부터 설계 및 합성된 F-L-G-A-L-F-K-W-A-S-K(V8W-GGN5N11)로 표기되는 신규한 항생 펩타이드 유도체.
삭제
제 1항의 항생 펩타이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 항균용 약학조성물.
삭제
제 2항의 항생 펩타이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 항균용 약학조성물.