EP0929570A1 - Modifizierte cytostatika - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the present invention relates to conjugates of cytostatics and N-thiocarbonyl-modified amino acids or peptides, processes for their preparation and their use as medicaments, in particular in connection with cancer.
- Chemotherapy for tumor diseases is accompanied by mostly serious side effects due to the toxicity of chemotherapeutic agents on proliferating cells of other tissues. Have been busy for many years
- prodrugs which are more or less selective in the target tissue, for example by changing the pH (for example Tietze et al., DE 4 229 903), by enzymes (for example glucuronidases; Jacquesy et al., EP 511 917; Bosslet et al., EP 595 133) or by
- Antibody-enzyme conjugates (Bagshawe et al., WO 88/07378; Senter et al., US Pat. No. 4,975,278; Bosslet et al., EP 595 133) are released. Problems with these approaches include the lack of stability of the conjugates in other tissues and organs and in particular the ubiquitous distribution of active substances, which follows the extracellular release of active substances in the tumor tissue.
- the heterocyclic amine batracylin (1) shows a good antitumor effect in various colon cancer models (US Pat. No. 4,757,072).
- Peptide conjugates of (1) with good in vitro activity and more favorable solubility properties are less tolerable in animal experiments than batracylin itself.
- camptothecin derivatives About 20 years later it was found that the biological activity is due to an enzyme inhibition of topoisomerase I. Since then, the research activities have been intensified again in order to find more contractual and in vivo effective camptothecin derivatives
- conjugates obtained in this way are easily accessible synthetically and show in vitro a similarly high activity towards different tumor cell lines and tumor xenografts as the underlying toxophore
- the conjugates according to the invention show significantly improved solubility properties compared to the underlying cytostatics
- the invention relates to compounds of the general formula (I)
- Ar- ⁇ -NH-C is where n is a number 1 to n 'and n' is the maximum
- Ar stands for an aryl radical with up to 10 carbon atoms, which, in addition to X, can optionally be mono- or polysubstituted by alkyl with up to 6 carbon atoms, alkoxy with up to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl with up to 6 carbon atoms, hydroxy, carboxy, carboxyalkyl with up to 6 carbon atoms, cyano, nitro, isocyanato,
- X represents a direct single bond or alkylene with up to 6 carbon atoms
- M stands for a mono-, di-, tri- or tetrapeptide which has the same or different groups via the ⁇ -amino group and / or via amino and / or hydroxy groups of the side chains
- Ar-X-NH-C is linked, with further functional groups of
- Peptide can optionally carry protective groups
- C represents a residue of a cytostatic or a cytostatic derivative which is linked to M via an amino function or via an oxygen atom,
- C can be an intercalating substance, a topoisomerase inhibitor, an anti-metabolite, an alkylant, a tubulin inhibitor, a tyrosine phosphokinase inhibitor, a protein kinase C inhibitor or an active substance with a different or unknown cytostati or see cytotoxic mechanism of action.
- C can be, for example, a nucleoside, an endiin antibiotic, a quinolone or naphthyridone carbon acid or a cytotoxic peptide antibiotic e.g. be from the class of Dolastatine.
- C can batracylin, quinolone-a, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside, methotrexate, etoposide, camptothecin, a camptothecin derivative, daunomycin, doxorubicin,
- Taxol Taxol, vinblastine, vincristine, dynemicin, calicheamycin, esperamycin, quercetin, suramin, erbstatin, cyclophosphamide, mitomycin C, melphalan, cisplatin, bleomycin, staurosporine or another anti neoplastic active ingredient.
- alkyl groups is intended to include straight-chain, branched, cyclic and cycloalkyl radicals containing alkyl radicals. This definition should also apply analogously to all other radicals containing alkyl groups, such as alkoxy etc.
- Preferred compounds of the formula (I) are those in which
- Ar stands for a phenyl radical which is para to X, also hydroxyl, carboxy,
- M stands for a mono-, di- or T ⁇ peptide which has the same or different groups S via the ⁇ -amino group and / or via amino and / or hydroxy groups of the side chains
- Ar-X-N ⁇ -C is linked, with further functional groups of
- Peptide can optionally carry protective groups
- the peptides M preferably consist of amino acid residues which are derived from alanine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, leucine, histidine, lysine, arginine,
- M carries further functional groups, these are preferably unblocked
- C for a batracyhn, methotrexate, quinolone a, etoposide, melphalan, taxol, camptothecin radical, a camptothecin modified in the A ring or B ring De ⁇ vat, a Dauomycin- or Doxorubicin residue stands, whereby C is linked to M via an amino or hydroxy function.
- the compounds according to the invention can exist in stereoisomeric forms, for example as enantiomers or diastereomers, or as mixtures thereof, for example as a racemate.
- the invention relates both to the pure stereoisomers and to their mixtures If necessary, the stereoisomer mixtures can be separated into the stereoisomerically uniform constituents in a known manner, for example by chromatography or by crystallization processes
- amino acid residues can each be in the D-form or in the L-form
- the compounds according to the invention can occur in rotation isomeric forms or as mixtures thereof as a result of a rotation inhibition
- rotational isomer mixtures can be separated into the uniform constituents by known methods, for example by chromatography (for example HPLC) or by crystallization processes. This is possible not only at the final stage of the conjugates but also, if appropriate, at intermediate stages. If appropriate, the rotamer-pure end stages can be prepared from the rotamer-pure intermediates by suitable synthesis
- the compounds according to the invention can also be present in the form of their salts.
- salts with organic or inorganic bases or acids and internal salts may be mentioned here.
- the acids which can be added preferably include hydrohalic acids, such as, for example, hydrochloric acid and hydrobromic acid, in particular hydrochloric acid, furthermore phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, mono- and bifunctional carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids, such as, for example, acetic acid, trifluoroacetic acid, Maleic acid, malonic acid, oxalic acid,
- hydrohalic acids such as, for example, hydrochloric acid and hydrobromic acid, in particular hydrochloric acid, furthermore phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, mono- and bifunctional carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids, such as, for example, acetic acid, trifluoroacetic acid, Maleic acid, malonic acid, oxalic acid,
- Gluconic acid succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, salicylic acid, sorbic acid and lactic acid as well as sulfonic acids, such as p-toluenesulfonic acid, 1,5-naphthane disulfonic acid or camphorsulfonic acid
- Physiologically acceptable salts can also be metal or ammonium salts of such compounds according to the invention which have a free carboxyl group
- Particularly preferred are, for example, sodium, potassium, magnesium or calcium salts, and also ammonium salts which are derived from ammonia or organic amines such as, for example, ethylamine, di- or t ⁇ ethylamine, di- or t ⁇ ethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, arginine, lysine, Ethylenediamine or phenethylamine
- the invention further relates to a process for the preparation of compounds of the general formula (I), characterized in that compounds of the general formula (II)
- the conjugates according to the invention can be prepared, for example, by linking cytostatics derivatives carrying hydroxyl or amino groups (e.g. batracylin, quinolones or camptothecins) to activated carboxyl components, which in turn can be parts of protected amino acids, peptides or N-thiocarbonyl-modified peptides.
- cytostatics derivatives carrying hydroxyl or amino groups e.g. batracylin, quinolones or camptothecins
- carboxyl components which in turn can be parts of protected amino acids, peptides or N-thiocarbonyl-modified peptides.
- the compounds of the general formula (II) can be obtained by linking protected amino acid building blocks to amino or hydroxy functions of C using customary methods of peptide chemistry and, if appropriate, building up a peptide chain by gradually introducing further amino acid building blocks.
- peptide building blocks carrying protective groups can also be linked to C using customary methods.
- the reactions can be carried out at various pressure and temperature ratios, for example from 0.5 to 2 bar or from -30 to + 100 ° C., in suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, and lower alcohols , Acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
- suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, and lower alcohols , Acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
- adducts with carbodiimides for example N, N'-diethyl, N, N'-diisopropyl, N, N'-dicyclo- hexylcarbodiimide, N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl-carbodiimide hydrochloride, N-cyclohexyl-N '- (2-morpholinoethyl) -carbodiimide-metho-p-toluenesulfonate, or carbonyl compounds such as carbonyldiimidazole, or 1, 2- Oxazolium compounds such as 2-ethyl-5-phenyl-l, 2-oxazolium-3-sulfate or 2-tert-butyl-5-methyl-isoxazolium perchlorate, or acylamino compounds such as 2-ethoxy-l-ethoxycarbonyl-
- carbodiimides for example N, N'-diethyl
- 1,2-dihydroquinoline or propanephosphonic anhydride, or isobutylchloroform, or benzotriazoilyloxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, 1-hydroxybenzotriazole or hydroxysuccinimide ester.
- Triethylamine, Hünig base, ethyldiisopropylamine, pyridine, N, N-dimethylaminopyridine or others can be used as bases, for example.
- the protective groups known in peptide chemistry for example of the urethane, alkyl, acyl, ester or amide type, can be used as protective groups for any further reactive functions in the cytostatic part or for third functions of the amino acids.
- Amino protecting groups in the context of the invention are the usual amino protecting groups used in peptide chemistry.
- benzyloxycarbonyl (Cbz) 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, 4-nitrobenzyloxycarbonyl, 2-nitrobenzyloxycarbonyl, 2-nitro-4,5 -dimethoxybenzyloxycarbonyl, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, (Boc) allyloxycarbonyl, vinyloxycarbonyl, 3,4,5-trimethoxybenzyloxycarbonyl, phthaloyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, 2,2,2-trichloro-tert -butoxycarbonyl, menthyloxycarbonyl, 4-nitrophenoxycarbonyl, fluoro-enyl-9-methoxycarbonyl (Fmoc), formyl, acet
- Particularly preferred protecting groups are Fmoc, Boc and Cbz.
- Protective groups can be split off in the corresponding reaction steps, for example by exposure to acid or base, hydrogenolytically or in some other way reductively.
- Biological testing can be split off in the corresponding reaction steps, for example by exposure to acid or base, hydrogenolytically or in some other way reductively.
- the human colon tumor cell lines SW 480 and HT 29 (ATCC No. CCL 228 and HBT-38) and the mouse melanoma cell line B16F10 were grown in Roux dishes in RPMI 1640 medium with the addition of 10% FCS. It was then trypsinized and taken up in RPMI plus 10% FCS to a cell number of 50,000 cells / ml. 100 ⁇ l of cell suspension / well were placed in a 96 microwell plate and incubated for 1 day at 37 ° C. in a C0 9 incubator. A further 100 ⁇ l of RPMI medium and 1 ⁇ l of DMSO with the test substances were then added.
- Microwell 40 ⁇ l MTT solution (3- (4,5-dimethyIthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoline bromide) with an initial concentration of 5 mg / ml H., 0 was added. It was
- the cytotoxic effect is given in Table 1 as an IC 50 value for the SW 480 and HT 29 and B16F10 cell lines:
- Bone marrow cells were rinsed from the mouse femur. 10 5 cells are in McCoy 5A medium (0.3% agar) together with recombinant murine GM
- CSF Genzyme; stem cell colony formation
- substances (10 "4 to 100 ⁇ g / ml) were incubated at 37 ° C. and 7% CO 2. 7 days later the colonies ( ⁇ 50 cells) and clusters (17-50 cells ) counted.
- Athymic nude mice (NMRI nu / nu strain) were used for all in vivo experiments to investigate the inhibition of tumor growth.
- the selected large cell lung carcinoma LXFL 529 was by serial passage in Nude mice developed.
- the human origin of the tumor was proven by iso-enzymatic and immunohistochemical methods.
- the tumor was implanted subcutaneously in both flanks of 6 to 8 week old nu / nu nude mice. Depending on the doubling time, the treatment was started as soon as the tumors had reached a diameter of 5-7 mm. The mice were randomized to the treatment group and the control group (5 mice per group with 8-10 evaluable tumors). The individual tumors in the control group all grew progressively.
- the size of the tumors was measured in two dimensions using a slide gauge.
- the tumor volume which correlates well with the cell number, was then used for all evaluations.
- the volume was calculated according to the formula "length x width x width / 2" ([axb 2 ] / 2, a and b stand for two diameters arranged at right angles).
- Relative tumor volume (RTV) values were calculated for each tumor by dividing the tumor size on day X by the tumor size on day 0 (at the time of randomization). The mean values of the RTV were then used for the further evaluation.
- the final measured value was the inhibition of the increase in tumor volume (tumor volume of the test group / control group, T / C, in percent).
- the compounds were applied intraperitoneally (i.p.) on days 1, 2 and 3 after randomization.
- Results The compound from Example 4.4) shows the therapeutic activity of the conjugates according to the invention against the large-cell human lung tumor xenograph LXFL 529. Therapy leads to tumor remission at the maximum tolerable dose (MTD) and half of the MTD.
- MTD maximum tolerable dose
- the compounds according to the invention have a surprisingly strong cytotoxic activity against various, both in vitro and in vivo
- Tumors especially those of the lungs and colon, are associated with a high selectivity towards non-malignant cells.
- the present invention includes pharmaceutical preparations which, in addition to non-toxic, inert pharmaceutically suitable excipients, contain one or more compounds according to the invention or which consist of one or more active compounds according to the invention, and processes for the preparation of these preparations.
- the active ingredient (s) can optionally also be in microencapsulated form in one or more of the above-mentioned carriers.
- the therapeutically active compounds should be present in the pharmaceutical preparations listed above preferably in a concentration of about 0.1 to 99.5, preferably of about 0.5 to 95% by weight of the total mixture.
- the pharmaceutical preparations listed above can also contain further active pharmaceutical ingredients.
- the active ingredient (s) according to the invention in total amounts of about 0.5 to about 500, preferably 5 to 100 mg / kg of body weight per 24 hours, optionally in the form multiple doses to achieve the desired results.
- a single dose contains the active ingredient (s) according to the invention preferably in amounts of about 1 to about 80, in particular 3 to 30 mg / kg of body weight.
- Remaining protective groups are then removed in a second step by methods known from the literature (a fluorenyl-9-methoxycarbonyl group e.g. with piperidine in absolute dimethylformamide at room temperature; a tert-butoxycarbonyl group e.g. with trifluoroacetic acid in absolute dichloromethane at room temperature).
- N-Benzyloxycarbonyl-D-alanine (3.9 g, 17.5 mmol) is reacted with batracylin (4.1 g, 16.4 mmol) analogously to Example I 1 a.
- batracylin 4.1 g, 16.4 mmol
- the mixture is treated with ethyl acetate made up to 300 ml and immediately heated to boiling for 10 min.
- the mixture is then allowed to cool to room temperature, filtered and the filter material is boiled again with ethyl acetate (200 ml) by cooling to 0 ° C. with stirring and filtration gives yellow crystals.
- N- (tert-Butoxycarbonyl) -D-alanine (3.6 g, 19.2 mmol) and 2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1, 2-dihydroquinoline (5.8 g, 19.2 mmol ) are dissolved in 200 ml of dimethylformamide.
- quinolone-a (4 g, 9.6 mmol) and ethyldiisopropylamine (3.3 ml) are added and the mixture is treated with ultrasound for 10 h.
- the mixture is concentrated, the residue is taken up in dichloromethane and precipitated with ether. After filtration, washing with ether and drying in a high vacuum, 4.58 g (81%) of the target product are obtained, which is reacted without further purification.
- N ⁇ - (tert-Butoxycarbonyl) -N ⁇ - (fluorenyl-9-methoxycarbonyl) -lysine (1.57 g, 3.36 mmol) is dissolved in dimethylformamide (25 ml) and at 0 ° C with N-
- Camptothecin 500 mg, 1.44 mmol are dissolved in absolute dimethylformamide (20 ml) and then with 4-dimethylaminopyridine (50 mg) and N-tert-butoxycarbonylalanine-N-carboxy-anhydride (775 mg, 3, 6 mmol) was added. After 3 h, a further 775 mg (3.6 mmol) of N-tert-butoxycarbonyl-alanine-N-carboxy-anhydride are added and the suspension is treated with ultrasound for 16 h. The mixture is concentrated, the raw material is taken up in dichloromethane (50 ml) and 5 ml of trifluoroacetic acid are added at 0 ° C. After 30 min.
- Example I.4.a The conjugate from Example I.4.a is linked according to standard instructions (see Example I. la) with N ⁇ - (tert-butoxycarbonyl) -N ⁇ - (fluorenyl-9-methoxycarbonyl) lysine and then in analogy to Example Il unblocked at the ⁇ -amino function.
- the target compound is obtained in a yield of 24% [TLC (acetonitrile / water 20: 1): R f - 0.15].
- This camptothecin derivative is produced according to Wall et al (J Med Chem 29 (1986), 2358) from the S-configured, enantiomerically pure tricyclic compound, which can be obtained, for example, by racemate resolution
- Dimethylformamide is stirred with 9.64 g (30.0 mmol) of O-benzyl-N- (tert-butoxycarbonyl) -serine-N-carboxylic acid anhydride and 367 mg (3.0 mmol) of 4- (N, N-dimethylamino) -pyridine added. After stirring for 8 h at 60 ° C., a further 4.82 g (15.0 mmol) of O-benzyl-N- (tert-butoxycarbonyl) -serine-N-carboxylic acid anhydride and 183.5 mg (1.5 mmol) 4 are added - (N, N-Dimethylamino) pyridine and stir for three
- the compound is prepared using the method described in I 5 a from 392.4 mg (1.0 mmol) of 20 (S) -7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin (S Sawada et al, Chem Pharm Bull 39 (1991) 3183-3188) and a total of 2.43 g (10.0 mmol) of N- (tert-butoxycarbonyl) -valine-N-carboxylic acid anhydride within 6 days.
- Hydrochloride The compound is dissolved in dioxane / water and converted into the hydrochloride with one equivalent of 0.1 N hydrochloric acid. The resulting solution is then lyophilized.
- Trifluoroacetate salt-free precursor 68% over 2 stages [TLC (acetonitrile / water / glacial acetic acid
- Trifluoroacetate salt-free precursor 79% over 2 stages [TLC (acetonitrile / water / glacial acetic acid
- Trifluoroacetate salt-free precursor 86% over 2 stages [TLC (acetonitrile / water / glacial acetic acid
- Trifluoroacetate salt-free precursor 67% over 2 stages [TLC (acetonitrile / water / glacial acetic acid
- Trifluoroacetate salt-free precursor 55% over 2 stages [TLC (acetonitrile / water / glacial acetic acid
- Hydrochloride The compound is dissolved with dioxane / water and converted into the hydrochloride with one equivalent of 0.1N hydrochloric acid. The resulting solution is then lyophilized.
- Trifluoroacetate salt-free precursor 71% over 2 stages [TLC (acetonitrile / water / glacial acetic acid
- Sodium salt The compound is suspended in water and one equivalent of a 0.1 N sodium hydroxide solution is added. The resulting solution is then lyophilized.
- Hydrochloride water is added to the compound and the suspension is acidified to pH 2 with 1N hydrochloric acid. The resulting solution is filtered through Celite and then lyophilized. 98/15571
- Hydrochloride The compound is dissolved in dioxane / water and converted into the hydrochloride with one equivalent of 0.1 N hydrochloric acid. The resulting solution is then lyophilized.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate aus Cytostatika und N-Thiocarbonyl-modifizierten Aminosäuren bzw. Peptiden, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen.
Description
Modifizierte Cytostatika
Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate aus Cytostatika und N-Thiocarbonyl- modifizierten Aminosäuren bzw. Peptiden, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen.
Die Chemotherapie bei Tumorerkrankungen ist begleitet von meist schwerwiegenden Nebenwirkungen, bedingt durch die Toxizität von Chemotherapeutika auf proliferierende Zellen anderer Gewebe. Seit vielen Jahren beschäftigen sich
Wissenschaftler mit dem Problem der Verbesserung der Selektivität von eingesetzten Wirkstoffen. Ein vielfach verfolgter Ansatz ist die Synthese von Prodrugs, die mehr oder weniger selektiv im Zielgewebe beispielsweise durch Veränderung des pH-Wertes (z.B. Tietze et al., DE 4 229 903), durch Enzyme (z.B. Glucu- ronidasen; Jacquesy et al., EP 511 917; Bosslet et al., EP 595 133) oder durch
Antikörper-Enzym-Konjugate (Bagshawe et al., WO 88/07378; Senter et al., US PS 4 975 278; Bosslet et al., EP 595 133) freigesetzt werden. Problematisch bei diesen Ansätzen ist u.a. die mangelnde Stabilität der Konjugate in anderen Geweben und Organen und insbesondere die ubiquitäre Wirkstoffverteilung, die sich an die extrazelluläre Wirkstofffreisetzung im Tumorgewebe anschließt.
Im folgenden werden beispielhaft drei cytostatisch aktive Grundkörper aus verschiedenen Substanzklassen, die mit schweren Nebenwirkungen behaftet sind, vorg oestellt.
Das heterocyclische Amin Batracylin (1) zeigt in verschiedenen Darmkrebs- Modellen eine gute Antitumorwirkung (US PS 4 757 072).
(1)
Peptidkonjugate von (1) mit guter In-vitro-Wirkung und günstigeren Löslichkeits- eigenschaften (US 4 180 343) sind im Tierversuch schlechter verträglich als Batracylin selbst. So reichern sich z.B. die in EP 501 250 beschriebenen Fucose-
Kon)ugate sehr stark in der Leber an Glycokonjugate von Cytostatika, wie sie in unserer ebenfalls anhangigen Anmeldung PCT/96/01279 beschrieben sind, weisen zwar gunstigere Eigenschaften auf, sind aber synthetisch nur mit größerem Aufwand zuganglich
Das Chinolon-a (2) 7-[(3aRS, 4RS, 7aSR)-4- Amino- 1,3,3 a,4,7,7a-hexahy dro-i so- indol-2-yl]-8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor-l,4-dihydro-4-oxo-3-chinolincarbonsaure zeigt neben einer hervorragenden anti bakteriellen Aktivität auch eine sehr gute Wi rksamkeit gegenüber verschiedenen Tumorzell inien (EP 520 240, JP 4 253 973) Dem stehen jedoch erhebliche toxikologische Probleme gegenüber (z B Genotoxizitat, Knochenmarks-Toxizitat, hohe akute Toxizität in vivo etc )
(2) (Chinolon-a)
20(S)-Camptothecιn (3) ist ein pentacyclisches Alkaloid, das 1966 von Wall et al isoliert wurde (J Amer Chem Soc 88 (1966) 3888) Es besitzt ein hohes Anti- tumor-Wirkpotential in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Tests Leider scheiterte jedoch die Realisierung des vielversprechenden Potentials in der Klinik an Toxizitats- und Loslichkeitsproblemen
Durch Öffnung des E-Ring-Lactons und Bildung des Natriumsalzes wurde eine wasserlösliche Verbindung erhalten, die in einem pH-abhangigen Gleichgewicht mit der ringgeschlossenen Form steht Klinische Studien führten auch hier bisher nicht zum Erfolg
NaOH
Etwa 20 Jahre spater wurde gefunden, daß die biologische Aktivität auf eine Enzyminhibition der Topoisomerase I zurückzuführen ist Seither wurden die Forschungsaküvitaten wieder verstärkt, um vertraglichere und in vivo wirksame Camptothecin-Deπvate zu finden
Zur Verbesserung der Wasserloshchkeit wurden z B Salze von A-Ring- und
B-Ring-modifizierten Camptothecin-Deπvaten sowie von 20-O-Acyl -Derivaten mit lonisierbaren Gruppen beschrieben (Vishnuvajjala et al , US 4 943 579) Das letztere Prodrug-Konzept wurde spater auch auf modifizierte Camptothecin- Deπvate übertragen (Wani et al , WO 96/02546) Die beschriebenen 20-O-Acyl- Prodrugs haben allerdings in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und werden sehr schnell zum Grundkorper gespalten
Wir fanden nun, daß die Modifizierung von Cytostatika wie z B Batracyhn, anti- tumoraktive Chinolone (wie z B Chinolon-a) oder Camptothecin bzw Campto- thecin-Deπvate mit N-thiocarbonyl-modifizierten Aminosäuren zu neuen Ver- bindungen mit überraschenden, hochinteressanten Eigenschaften fuhrt
Die so erhaltenen Konjugate sind synthetisch gut zugänglich und zeigen in vitro eine ähnlich hohe Aktivität gegenüber verschiedenen Tumor- zellinien und Tumorxenografts wie das zugrundeliegende Toxophor
In Abhängigkeit von der Zusammensetzung der N-thiocarbonyl-modifi- zierten Aminosäuren zeigen die erfindungsgemaßen Konjugate im Vergleich zu den zugrundeliegenden Cytostatika wesentlich verbesserte Los- hchkeitseigenschaften
Sie weisen gegenüber den zugrundeliegenden Toxophoren eine höhere Verträglichkeit und Tumorselektivitat auf
- In vivo zeigen sie eine gute bis sehr gute therapeutische Aktivität
Sie sind in extrazellularem Medium und in Blut wesentlich stabiler als die zuvor beschriebenen reinen Aminosaure-Prodrugs von Batracyhn, Chino- lonen oder von Camptothecin-Deπvaten
Im Fall von 20-O-Acylierungen von Camptothecin-Deπvaten wiid durch die esterartige Verknüpfung der Carrier-Reste mit der 20-Hydroxygruppe der für die Wirkung wichtige Lactonring stabilisiert
ie Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
S
II
(Ar-X-NH-C-)nM-C
worin
^ n für 1 bis n' gleiche oder voneinander verschiedene Gruppierungen
S
II
Ar-λ-NH-C steht, wobei n eine Zahl 1 bis n' bedeutet und n' der maximalen
Zahl möglicher Anknüpfungsstellen von M entspricht,
worin
Ar für einen Arylrest mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen steht, der zusatzlich zu X gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann durch Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Isocyanato,
Isothiocyanato, Halogen, Sulfonyl und/oder Sulfonamid,
X für eine direkte Einfachbindung oder für Alkylen mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht,
M für ein Mono-, Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht, das über die α-Amino- gruppe und/oder über Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit den n gleichen oder voneinander verschiedenen Gruppierungen
S
II
Ar-X-NH-C verknüpft ist, wobei weitere funktioneile Gruppen des
Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können,
C für einen Rest eines Cytostatikums oder eines Cytostatikum-Derivats steht, das über eine Aminofunktion oder über ein Sauerstoffatom mit M verknüpft ist,
sowie deren Stereoisomere, Stereoisomerengemische und Salze.
C kann eine interkalierende Substanz, ein Topoisomerase-Inhibitor, ein Anti- metabolit, ein Alkylanz, ein Tubulinhemmer, ein Tyrosinphosphokinase- Inhibitor, ein Proteinkinase-C-Inhibitor oder ein Wirkstoff mit einem anderen oder unbekannten cytostati sehen oder cytotoxischen Wirkmechanismus sein. C kann beispielsweise ein Nucleosid, ein Endiin-Antibiotikum, eine Chinolon- oder Naphtyridoncarbonäure oder ein cytotoxisches Peptidantibiotikum z.B. aus der Klasse der Dolastatine sein. C kann Batracylin, Chinolon-a, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid, Methotrexat, Eto- posid, Camptothecin, ein Camptothecin-Derivat, Daunomycin, Doxorubicin,
Taxol, Vinblastin, Vincristin, Dynemicin, Calicheamycin, Esperamycin, Quercetin, Suramin, Erbstatin, Cyclophosphamid, Mitomycin C, Melphalan, Cisplatin, Bleomycin, Staurosporin oder ein anderer anti neoplastisch aktiver Wirkstoff sein.
Der Begriff "Alkylgruppen" soll hierin sofern nicht anders angegeben geradkettige, verzweigte, cyclische und Cycloalkylreste enthaltende Alkylreste umfassen. Diese Definition soll sinngemäß auch für alle anderen Alkylgruppen enthaltenden Reste gelten, wie beispielsweise Alkoxy etc.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin
Ar für einen Phenylrest steht, der para-ständig zu X noch Hydroxy, Carboxy,
Isothiocyanato oder Halogen tragen kann.
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin
X für eine Einfachbindung oder für Methylen steht
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I),
worin
M für ein Mono-, Di- oder Tπpeptid steht, das über die α-Aminogruppe und/oder über Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit den n gleichen oder voneinander verschiedenen Gruppierungen S
II
Ar-X-Nπ-C verknüpft ist, wobei weitere funktionelle Gruppen des
Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können
Bevorzugt bestehen die Peptide M aus Aminosaureresten, die sich ableiten von Alanin, Asparaginsaure, Glutaminsäure, Glycin, Leucin, Histidin, Lysin, Arginin,
Ornithin, Senn, Tyrosin, Valin, Diaminopropionsaure, , γ-Diaminobuttersaure oder Phenylalamin, wobei mehrere Aminosaurereste sowohl über die α-Amino- gruppe als auch gegebenenfalls über die Seitenketten-Aminofunktionen oder auch über beide Funktionen peptidisch verknüpft sein können
Falls M weitere funktionelle Gruppen tragt, so sind diese bevorzugt deblockiert
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin C für einen Batracyhn-, Methotrexat-, Chinolon-a-, Etoposid-, Melphalan,- Taxol-, Camptothecin- Rest, ein im A-Ring oder B-Ring modifiziertes Camptothecin-Deπvat, einen Dau- nomycin- oder Doxorubicin-Rest steht, wobei C über eine Amino- oder Hydroxy- funktion mit M verknüpft ist Ganz besonders bevorzugte Beispiele für C sind
Reste des Batracyhn, Chinolon-a und Doxorubicin, Camptothecin, 7-Ethylcampto- thecin, 10,l l-(Methylendιoxy)camptothecιn, 7-Hydroxymethylcamptothecιn und 7-Ethyl- 10-hydroxy camptothecin
Die erfindungsgemaßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, bei- spielsweise als Enantiomere oder Diastereomere, oder als deren Gemische, beispielsweise als Racemat, vorliegen Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Stereoisomere als auch deren Gemische
Die Stereoisomerengemische können, falls erforderlich, in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile getrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie oder durch Kristallisationsverfahren
Die Aminosaurereste können jeweils in der D-Form oder in der L-Form vorliegen
Die Nomenklatur der Aminosäuren folgt den von der IUPAC aufgestellten Regeln
Bei fehlender Angabe der Stereochemie wurden Aminosäuren der L-Form eingesetzt
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bedingt durch eine Rotationshinderung in rotationsisomeren Formen oder als deren Gemische auftreten Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Rotationsisomere als auch deren Gemische
Rotationsisomerengemische können gegebenenfalls, falls erforderlich, mittels bekannter Methoden in die einheitlichen Bestandteile gtrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie (z B. HPLC) oder durch Kristallisationsverfahren Möglich ist dies nicht nur auf der Endstufe der Konjugate, sondern gegebenenfalls auch auf Zwischenstufen. Aus den rotamerenreinen Zwischenstufen können gegebenenfalls durch geeignete Synthesefuhrung die rotamerenreinen Endstufen hergestellt werden
Die erfmdungsgemaßen Verbindungen können auch in Form ihrer Salze vorliegen Im allgemeinen seien hier Salze mit organischen oder anorganischen Basen oder Sauren sowie innere Salze genannt.
Zu den Sauren, die addiert werden können, gehören vorzugsweise Halogen wasserstoffsauren, wie z.B die Chlorwasserstoffsaure und die Bromwasserstoffsaure, insbesondere die Chlorwasser stoff säure, ferner Phosphorsaure, Salpetersaure, Schwefelsaure, mono- und bifunktionelle Carbonsauren und Hydroxycarbonsauren, wie z B Essigsaure, Trifluoressigsaure, Maleinsäure, Malonsaure, Oxalsäure,
Gluconsaure, Bernsteinsaure, Fumarsaure, Weinsaure, Zitronensaure, Salizylsäure, Sorbinsaure und Milchsaure sowie Sulfonsauren, wie z B p-Toluolsulfonsaure, 1,5-Naphthahn-disulfonsaure oder Camphersulfonsaure
Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze solcher erfmdungsgemaßen Verbindungen sein, die eine freie Carboxylgruppe
besitzen Besonders bevorzugt sind z B Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze, sowie Ammoniumsalze, die abgeleitet sind von Ammoniak oder organischen Aminen wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw Tπethylamin, Di- bzw Tπethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylendiamin oder Phenethylamin
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
M'-C (II),
worin C die oben angegebene Bedeutung hat und M' für einen Rest M steht, der an den gewünschten Verknupfungsstellen Wasserstoffatome tragt und dessen übrige potentielle Verknupfungsstellen durch Schutzgruppen blockiert sind,
mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III)
Ar - X- N = C - S (III)
in geeigneten Losemitteln in Gegenwart einer Base zu Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia)
S ιι (Ia)
Ar-X-NH-C- M"-C
umsetzt,
worin Ar, X und C die oben angegebenen Bedeutungen haben und M" für einen Rest M steht, dessen weitere potentielle Verknupfungsstellen durch Schutzgruppen blockiert sind,
S
II und im Fall der Einfuhrung weiterer Gruppen Ar-X-NH-C ^
die sich von der bzw den zunächst eingeführten unterscheiden, die entsprechenden Schutzgruppen gegebenenfalls selektiv von den Verbindungen der Formel (Ia)
abspaltet, diese in der oben angegebenen Weise mit weiteren Verbindungen der allgemeinen Formel (III), die sich von den zunächst eingeführten unterscheiden, umsetzt und gegebenenfalls diese Reaktionssequenz zu Einführung weiterer von
S
II den eingeführten Resten verschiedener Reste Ar-X-NH-C wiederholt,
und daß man verbleibende Schutzgruppen gegebenenfalls abspaltet.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können beispielsweise hergestellt werden durch Verknüpfung von Hydroxy- oder Aminogruppen tragenden Cytostatika-Derivaten (z.B. Batracylin, Chinolone oder Camptothecine) mit aktivierten Carboxyl- komponenten, die ihrerseits Teile von geschützten Aminosäuren, Peptiden oder N-thiocarbonyl-modifizierten Peptiden darstellen können.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) sind zugänglich, indem man nach üblichen Methoden der Peptidchemie gegebenenfalls geschützte Aminosäurebausteine an Amino- oder Hydroxyfunktionen von C anknüpft und gegebenenfalls durch schrittweise Einführung weiterer Aminosäurebausteine eine Peptidkette auf- baut. Alternativ können auch gegebenenfalls Schutzgruppen tragende Peptid-Bau- steine nach üblichen Methoden mit C verknüpft werden.
Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, beispielsweise 0,5 bis 2 bar, bzw. -30 bis +100°C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloro- form, niederen Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in DMF oder THF/Dichlormethan bei Normaldruck und bei einer Temperatur von 0 bis 60°C, insbesondere bei etwa Raumtemperatur, bevorzugt.
Für die Aktivierung der Carboxylgruppen kommen die in der Peptidchemie be- kannten Kupplungsreagenzien wie sie z.B. in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren,
Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993) beschrieben sind, in Frage. Bevorzugt sind beispielsweise Säurechloride, N-Carbonsäureanhydride oder gemischte Anhydride.
Weiterhin bevorzugt zur Aktivierung der Carboxylgruppen ist die Bildung von Addukten mit Carbodiimiden z.B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclo-
hexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1 ,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l ,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyI-isoxa- zolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-
1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroform, oder BenzotriazoIyloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat, 1-Hydroxybenzotriazol oder Hydroxysuccinimidester.
Als Basen können beispielsweise Triethylamin, Hünig-Base, Ethyl-diisopropyl- amin, Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin oder andere eingesetzt werden.
Als Schutzgruppen für eventuelle weitere reaktive Funktionen im Cytostatikum- Teil oder für Drittfunktionen der Aminosäuren können die in der Peptidchemie bekannten Schutzgruppen beispielsweise vom Urethan-, Alkyl-, Acyl-, Ester- oder Amid-Typ eingesetzt werden.
Aminoschutzgruppen im Rahmen der Erfindung sind die üblichen in der Peptidchemie verwendeten Aminoschutzgruppen.
Hierzu gehören bevorzugt: Benzyloxycarbonyl, (Cbz) 3,4-Dimethoxybenzyl- oxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxy- carbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Ethoxy- carbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, (Boc) Allyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 3,4,5- Trimethoxybenzyloxycarbonyl, Phthaloyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2,2,2-Tri- chlor-tert-butoxycarbonyl, Menthyloxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluor- enyl-9-methoxycarbonyl (Fmoc), Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, 2-Chlor- acetyl, 2-Bromacetyl, 2,2,2-Trifluoracetyl, 2,2,2-Trichloracetyl, Benzoyl, Benzyl,
4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Phthalimido, Isovaleroyl oder Benzyloxymethylen, 4-Nitrobenzyl, 2,4-Dinitrobenzyl, 4-Nitrophenyl oder 2-Nitro- phenylsulfenyl. Besonders bevorzugte Schutzgruppen sind Fmoc, Boc und Cbz.
Die Abspaltung von Schutzgruppen in den entsprechenden Reaktionsschritten kann zum Beispiel durch Säure- oder Baseneinwirkung, hydrogenoly tisch oder auf andere Weise reduktiv erfolgen.
Biologische Testung
1. Wachstumsinhibitionstest zur Bestimmung der cytotoxischen Eigenschaften
Die humanen Dickdarmtumorzellinien SW 480 und HT 29 (ATCC-Nr. CCL 228 und HBT-38) sowie die Maus-Melanom-Zellinie B16F10 wurden in Rouxschalen in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10 % FCS gezogen. Anschließend wurde trypsiniert und in RPMI plus 10 % FCS zu einer Zellzahl von 50.000 Zellen/ml aufgenommen. 100 μl Zellsuspension/Well wurden in eine 96 Mi krowell platte gegeben und 1 Tag bei 37°C im C09-Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden weitere 100 μl RPMI Medium und 1 μl DMSO mit den Prüfsubstanzen zugesetzt.
Das Wachstum wurde nach Tag 3 und Tag 6 überprüft. Dazu wurde zu jedem
Mikrowell 40 μl MTT-Lösung (3-(4,5-DimethyIthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolin- bromid) mit einer Ausgangskonzentration von 5 mg/ml H.,0 zugesetzt. Es wurde
5 Stunden im C02-Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt und 100 μl i-Propanol/Well zugesetzt. Nach 30 min. Schütteln mit 100 μl H20 wurde die Extinktion bei 540 nm mit einem Titertek Multiskan
MCC/340 (Flow) gemessen.
Die cytotoxische Wirkung ist in der Tabelle 1 als IC50-Wert jeweils für die SW 480- und HT 29- und B16F10-Zellinie angegeben:
Tabelle 1:
IC50 / μM IC50 / μM IC50 / μM
Beispiel SW 480 HT 29 B16F10
1.2) 25 40 -
1.3) 45 70 -
1.4) 40 40 30
1.5) 250 400 -
1.6) 550 800
"
eispi ιc5o μM IC50 / μM
B el ιc50 / μM
SW 480 HT 29 B 16F10
2.1) 20 9 9
2.2) 15 6 4
2.3) 0,9 0,7 0,2
2.4) 0,8 0,9 1
2.5) 200 > 200 200
2.6) 0,2 0,3 0,06
2.8) 0,2 o,ι 0,1
2.9) 2 2 1
2.10) 2 2 0,4
2.11) 60 150 30
3) 3 2 1
4.1) 0,01 0,02 o,ι
4.2) 0,07 0,06 0,3
4.3) 0,02 0,02 o,ι
4.4) 0,3 0,2 0,6
4.5) 0,3 0,2 0,8
4.6) 0,2 0,15 0,5
4.7) 0,1 0,06 0,3
4.8) 0,3 0,15 0,8
4.9) 0,02 0,015 0,2
4.10) 0,02 0,01 0,2
4.1 1) 0,06 0,03 0,2
4.12) 0,04 0,03 0,2
4.13) 0,06 0,04 0,2
4.14) 0, 16 0,075 0,75
1
13 -
Beispiel ιc50 / μM ιc50 / μ ιc50 / μ
SW 480 HT 29 B16F10
4.15) 0,09 0,06 0,2
4.16) 0,15 0,12 0,6
4.17) 0,3 0,17 0,8
4.18) 0,3 0,12 0,4
4.19) 0,08 0,04 0,4
4.20) 0,07 0,06 0,3
4.21) 0,7 0,3 3
4.22) 0,04 0,04 0,1
4.23) 0,08 0,07 0,15
5.1) 0,025 0,02 0,05
5.2) 0,5 0,3 0,9
6) 0,005 0,003 0,015
7) 0,06 0,08 1
8) 0,15 0,2 3,0
2. Hämatopoetische Aktivität von Konjugaten im Vergleich zum zugrundeliegenden Wirkstoff
Material und Methoden:
Knochenmarkzellen wurden aus dem Femur der Maus gespült. 105-Zellen werden in McCoy 5A-Medium (0,3 % Agar) zusammen mit rekombinanten murinen GM-
CSF (Genzyme; Stammzellen-Kolonienbildung) und den Substanzen (10"4 bis 100 μg/ml) bei 37 °C und 7 % CO2 inkubiert. 7 Tage später wurden die Kolonien (<50 Zellen) und Kluster (17-50 Zellen) ausgezählt.
Ergebnisse: Wie in Tabelle 2 dargestellt zeigen die untersuchten Konjugate eine gegenüber dem zugrundeliegenden Wirkstoff eine drastisch verminderte Hemmung der Knochenmarkstammzellproliferation.
Tabelle 2: Hemmung der CSF-induzierten Proliferation von Knochenmarkstammzellen der Maus
Beispiel IC50 [ng/ml]
Chinolon-a 0,2
2.4) 60,0
Camptothecin 0,4
4.4) 10
4.9) 22
In-vivo-Hemmung des Tumorwachstums im Nacktmaus-Modell
Material:
Für alle in-vivo-Experimente zur Untersuchung der Hemmung des Tumorwachstums wurden athymische Nacktmäuse (NMRI nu/nu-Stamm) verwendet. Das ausgewählte großzellige Lungenkarzinom LXFL 529 wurde durch serielle Passage in
Nacktmäusen entwickelt. Der menschliche Ursprung des Tumors wurde durch iso- enzymatische und immunohistochemische Methoden belegt.
Experimenteller Aufbau:
Der Tumor wurde subcutan in beide Flanken von 6 bis 8 Wochen alten nu/nu- Nacktmäusen implantiert. Die Behandlung wurde, abhängig von der Verdopplungszeit, gestartet sobald die Tumoren einen Durchmesser von 5-7 mm erreicht hatten. Die Mäuse wurden der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe (5 Mäuse pro Gruppe mit 8-10 auswertbaren Tumoren) durch Randomisieren zugeteilt. Die einzelnen Tumoren der Kontrollgruppe wuchsen alle progressiv.
Die Größe der Tumoren wurde in zwei Dimensionen mittels Schieblehre vermessen. Das Tumorvolumen, das gut mit der Zellzahl korreliert, wurde anschließend für alle Auswertungen verwendet. Das Volumen wurde gemäß der Formel "Länge x Breite x Breite / 2" berechnet ([a x b2] / 2, a bzw. b stehen für zwei rechtwinklig angeordnete Durchmesser).
Die Werte des relativen Tumorvolumens (RTV) wurden für jeden einzelnen Tumor durch Dividieren der Tumorgröße am Tag X mit der Tumorgröße des Tages 0 (zum Zeitpunkt der Randomisierung) berechnet. Die mittleren Werte des RTV wurden dann für die weitere Auswertung verwendet.
Die Hemmung der Zunahme des Tumorvolumens (Tumorvolumen der Test- gruppe / Kontrollgruppe, T/C, in Prozent) war der abschließende Meßwert.
Behandlung:
Die Applikation der Verbindungen erfolgte an Tag 1, 2 und 3 nach Randomisierung intraperitoneal (i.p.).
Ergebnisse: Anhand der Verbindung aus Beispiel 4.4) ist die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate gegenüber dem großzelligen humanen Lungen- tumorxenografts LXFL 529 dargestellt. Die Therapie führt bei der maximal tolerablen Dosis (MTD) und bei der Hälfte der MTD zu Tumorremissionen.
Tabelle 3:
Dosis OberlebensZahl der relatives relatives
Therapie ht [mg/kg/Tag] zeit Tumore Tumorvolumen Köipergewic [Tage] [Tag 21] an Tag 21 an Tag 21 [% des Tags 0] [% des Tags 0]
>39 35
Kontrollgruppe - 35 >18 16 1137 1 11,6 >35
7 >43
Beispiel 6,25 4.4) (MTD) >43 >43 9 0,2 1 13,0 >43
Beispiel >43 >43 4.4) 3,125 7 69,5 105,8 >43 >43
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen sowohl in-vitro als auch in-vivo eine überraschen starke cytotoxische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen
Tumoren, insbesondere solchen der Lunge und des Dickdarms, verbunden mit einer großen Selektivität gegenüber nicht malignen Zellen auf.
Sie eignen sich daher zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere von solchen der Lunge und des Dickdarms.
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht-toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen enthalten oder die aus einem oder mehreren erfindungsgemäßen Wirkstoffen bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.
Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls in einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
Die therapeutisch wirksamen Verbindungen sollen in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-%, der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungsgemäßen Verbindungen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 3 bis 30mg/kg Körpergewicht.
Synthesebeispiele
Alle Thiocarbonyl-Aminosäure- bzw. Thiocarbonyl-Peptidkonjugate, die Gegenstand dieser Erfindung sind, werden nach der folgenden allgemeinen Vorschrift synthetisiert:
Eine Lösung von 1 mmol des zugrundeliegenden Aminosäure- bzw. Peptid- konjugats in 50 ml absolutem Dimethylformamid wird mit je 1,1 mmol des entsprechenden Isothiocyanats pro freier Aminogruppe versetzt. Nach Zugabe von 1,74 ml (10 mmol) Ethyldiisopropylamin wird der Ansatz bei Raumtemperatur gerührt bis sich im Dünnschi chtchromatogramm kein Aminosäure- bzw. Peptid- konjugat mehr nachweisen läßt, längstens jedoch 16 h. Man engt i. Vak. ein und reinigt den Rückstand nach Trocknung i. Hochvak. durch Flash-Chromatographie an Kieselgel z.B. mit einem Ethylacetat / Petrolether- oder einem Dichlormethan / Methanol-System. Auch mehrmaliges Umfallen aus Dichlormethan / Methanol 1 : 1 (v/v) mit Diethylether ergibt vielfach reine Produkte.
Verbleibende Schutzgruppen werden anschließend in einer zweiten Stufe nach literaturbekannten Verfahren entfernt (eine Fluorenyl-9-methoxycarbonyl-Gruppe z.B. mit Piperidin in absolutem Dimethylformamid bei Raumtemperatur; eine tert- Butoxycarbonyl-Gruppe z.B. mit Trifluoressigsäure in absolutem Dichlormethan bei Raumtemperatur).
Die entsprechenden Isothiocyanate sind im Chemikalienfachhandel zu erwerben oder werden nach literaturbekannten Methoden synthetisiert.
SynthesebeispieleVorstufen: Aminosäure- bzw Peptidkonjugate
Beispiel 1.1
N-[NR-(FIuorenyl-9-methoxycarbonyI)-Iysyl]-batracylin, Trifluoracetat
1.1. a) N-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyI-9-methoxycarbonyl)- lysyl]- batracylin:
Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin (5,3 g,
1 1,3 mmol) und 2-Isobutoxy-l-isobutoxycarbonyl-l,2-dihydro-chinolin (4 ml,
14 mmol) werden in 40 ml Dichlormethan gelost Nach 20 min Ruhren bei Raum- temperatur setzt man eine Losung von Batracylin (2,5 g, 10 mmol) in Dimethylformamid (80 ml) zu und rührt den Ansatz für weitere 24 h bei Raumtemperatur Anschließend wird im Vakuum eingeengt bis Kristallisation einsetzt Die erhaltene Suspension wird mit Ethanol (500 ml) versetzt und für 1 h unter Rückfluß gekocht Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird das Produkt abfiltriert und mit Aceton und dann mit Diethylether gewaschen Man erhalt gelbe Kristalle
(5,9 g, 84 %) [DC (Ethylacetat) R{ = 0,57, Schmp = 158 °C (Zers )]
1.1) N- [Nε-(FIuorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-batracyIin, Trifluoracetat:
Eine Suspension der obigen Verbindung (5,6 g, 8 mmol) in Dichlormethan (75 ml) wird mit wasserfreier Trifluoressigsaure (25 ml) versetzt und die resultierende
Losung für 90 min bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen im Vakuum wird der Ruckstand durch Zugabe von Diethylether (200 ml) kristallisiert Der Niederschlag wird abfiltriert und intensiv mit Diethylether gewaschen Nach mehrmaligem Umfallen aus Dichlormethan/Methanol 1.1 mit Diethylether erhält man gelb-orange Kristalle (5,13 g, 90 %) [DC (Ethylacetat) Rf = 0,05; Schmp. = 162 °C (Zers )].
Beispiel 1.2
N-[Seryl-D-alanyI]-batracylin, Trifluoracetat
I.2.a) N-[N-Benzyloxycarbonyl-D-alanyl]-batracylin:
N-Benzyloxycarbonyl-D-alanin (3,9 g, 17,5 mmol) wird in Analogie zu Beispiel I 1 a mit Batracylin (4,1 g, 16,4 mmol) umgesetzt Nach Einengen im Vakuum auf 50 ml wird mit Ethylacetat auf 300 ml aufgefüllt und sofort für 10 min zum Sieden erhitzt Anschließend läßt man auf Raumtemperatur abkühlen, filtriert ab und kocht das Filtergut erneut mit Ethylacetat (200 ml) aus Abkühlung unter Rühren auf 0 °C und Filtration ergibt gelbe Kristalle Die Kristalle (6,4 g, 80 %) werden durch Filtration abgetrennt und die vereinigten Filtrate nach Einengen im Vakuum durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 3 2 - 1 1] gereinigt Man erhält weitere 1,35 g (17 %) [DC (Ethylacetat)- Rf = 0,45, Schmp = 256 °C, [α]20 = +75,1° (c = 1,0 / CH2C12 + 0,5 % CH3OH)]
I.2.b) N-[D-AlanyI]-batracylin:
Verbindung 1.2 a (1 1,4 g, 25 mmol) wird in einer 33%-igen Losung von Bromwasserstoff in Eisessig (100 ml) gelost Nach 30 min bei Raumtemperatur wird der Ansatz im Vakuum auf 30 ml eingeengt und anschließend unter kraftigem Ruhren in gesattigte Natriumhydrogencarbonat-Losung (1000 ml) gegossen Man
8/15571 20 -
rührt für 10 min. weiter, filtriert ab und wäscht mit Wasser, wenig Isopropanol und Diethylether. Das Produkt fällt in gelben Kristallen (7,87 g, 98 %) an [DC (Ethylacetat): Rf = 0,06; Schmp. = 267 °C (Zers.)].
I.2.c) N-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-seryl-D-alanyl]-batracylin:
Darstellung in Analogie zu Beispiel I.l.a aus N-(tert-Butoxycarbonyl)-serin und N-
[D-Alanyl]-batracylin (Beispiel I.2.b); Ausb.: 77 %.
1.2) N-[Seryl-D-alanyl]-batracylin, Trifluoracetat:
Darstellung in Analogie zu Beispiel 1.1 aus Verbindung I.2.c; Ausb.: 98 %.
Beispiel 1.3
N-[Nε-(FIuorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyI-D-aIanyl]-chinolon-a,
Trifluoracetat
1.3.a) N-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-D-alanyl]-chinolon-a:
N-(tert-Butoxycarbonyl)-D-alanin (3,6 g, 19,2 mmol) und 2-Isobutoxy-l-isobutoxy- carbonyl-l,2-dihydro-chinolin (5,8 g, 19,2 mmol) werden in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 8 h Rühren bei Raumtemperatur setzt man Chinolon-a (4 g, 9,6 mmol) und Ethyldiisopropylamin (3,3 ml) zu und behandelt den Ansatz 10 h mit Ultraschall. Man engt ein, nimmt den Rückstand in Dichlormethan auf und fällt mit Ether. Nach Filtration, Waschen mit Ether und Trocknen im Hochvakuum erhält man 4,58 g (81 %) vom Zielprodukt, welches ohne weitere Reinigung umgesetzt wird.
I.3.b) N-[D-Alanyl]-chinoIon-a, Trifluoracetat:
4,56 g (7,75 mmol) der Verbindung aus obigem Beispiel werden in einer Mischung aus Dichlormethan (50 ml) und wasserfreier Trifluoressigsäure (50 ml) bei 0 °C gelöst und 1 h bei dieser Temperatur gerührt. Man engt ein, destilliert mit Dichlormethan nach und fällt den Rückstand aus Methanol mit Diethylether um. Man erhält 4,07 g (87 %) des kristallinen Zielproduktes [DC (Aceto- nitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf = 0,34].
I.3.c) N-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)- lysyl-D-alanyl]-chinolon-a:
Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin (1,57 g, 3,36 mmol) wird in Dimethylformamid (25 ml) gelöst und bei 0 °C mit N-
Hydroxysuccinimid (600 mg, 5,04 mmol) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (820 mg, 4,03 mmol) versetzt. Nach 3 h filtriert man den entstandenen Harnstoff ab, gibt zum Filtrat 1,5 g (2,86 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1.3.b) und rührt 16 h bei Raumtemperatur. Restlicher Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat durch Flash-Chromatographie [Dichlormethan/Methanol 97,5 :2,5 → 90: 10] gereinigt. Anschließend fällt man aus Dichlormethan/Methanol 1 : 1 mit Diethylether um. Ausb.: 1,5 g (56 %) [DC (Dichlormethan/Methanol 9: 1): Rf = 0,47].
1.3) N-[Nε-(FluorenyI-9-methoxycarbonyI)-lysyI-D-aIanyl]- chinolon-a, Trifluoracetat
Abspaltung der tert-Butoxycarbonyl-Gruppe aus Verbindung I.3.c in Analogie zu Beispiel I.l und Umfällung des Rohproduktes aus Methanol mit Diethylether ergibt gelbe Kristalle. Ausb.: 80 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak (17 %ig) 15:4:0,5): Rf = 0,36].
Beispiel 1.4
20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyι)-lysyl-aIanyl]-camptothecin, Trifluoracetat
CF3COOH
I.4.a) 20-O-(Alanyl)-camptothecin, Trifluoracetat:
Camptothecin (500 mg, 1,44 mmol) werden in absolutem Dimethylformamid (20ml) gelöst und dann mit 4-Dimethylaminopyridin (50 mg) und N-tert-Butoxy- carbonyl-alanin-N-carboxy-anhydrid (775 mg, 3,6 mmol) versetzt. Nach 3 h werden weitere 775 mg (3,6 mmol) N-tert-Butoxycarbonyl-alanin-N-carboxy- anhydrid zugegeben und die Suspension 16 h mit Ultraschall behandelt. Man engt ein, nimmt das Rohmaterial in Dichlormethan (50 ml) auf und gibt bei 0 °C 5 ml Trifluoressigsäure zu. Nach 30 min. Rühren wird erneut eingeengt und das Produkt durch Flash-Chromatographie gereinigt (Acetonitril/Wasser 20: 1). Die entsprechen- den Fraktionen werden gesammelt, eingeengt und nach Lösen in Dioxan/Wasser
lyophilisiert. Man erhält 712 mg (93 %) der Ziel Verbindung [FAB-MS: m/z = 420 (M+H)+],
1.4) 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-alanyl]- camptothecin, Trifluoracetat:
Das Konjugat aus Beispiel I.4.a wird nach Standard-Vorschrift (siehe Beispiel I. l.a) mit Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin verknüpft und anschließend in Analogie zu Beispiel I.l an der α-Aminofunktion deblockiert. Man erhält die Zielverbindung in einer Ausbeute von 24% [DC (Aceto- nitril/Wasser 20:1): Rf - 0,15].
Beispiel 1.5
7-Ethyl-20-O-(lysyl-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat
I.5.a) 7-Ethyl-20-O-[N-(tert-butoxycarbonyl)-alanyl]-camptothecin:
Eine Lösung von 1,88 g (5,0 mmol) 20(S)-7-Ethyl-camptothecin (S. Sawada et al., Chem.Pharm.Bull. 39 (1991) 1446-1454) in 100 ml absolutem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 2,15 g (10,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-alanin-N- carbonsäureanhydrid sowie 150 mg (1,2 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 3 h bei Raumtemperatur setzt man weitere 2,15 g (10,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-alanin-N-carbonsäureanhydrid und 150 mg (1,2 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur.
Anschließend wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 2:1 — > 1 : 1 — > Ethylacetat] gereinigt. Man
erhalt 2,02 g (73,8 %) an farblosen Kristallen [DC (Ethylacetat) R( - 0,56, Schmp = 206-212°C, FAB-MS m/z = 548 (M+rf )]
1.5. b) 20-O-Alanyl-7-ethyl-camptothecin, Trifluoracetat:
Eine Losung von Verbindung 1 5 a (1,81 g, 3,3 mmol) in einer Mischung aus 70 ml Dichlormethan und 7 ml wasserfreier Trifluoressigsaure wird für 90 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefallt und grundlich mit Diethylether gewaschen Man erhalt 1,34 g (72,3 %) an hellgelben Kristallen [DC (Ethylacetat) Rt = 0,05, Schmp = 242°C (Zers )]
I.5.c) 7-Ethyl-20-O- [Nα,Nε-di-(tert-butoxycarbonyl)-IysyI-aIanyl]- camptothecin:
1,57 g (4,55 mmol) N,N-Di-(tert-butoxycarbonyl)-lysin und 923 mg (6,83 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat werden in 35 ml Dimethylformamid gelost Nach Zugabe von 1,09 g (5,7 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylamιnopropyl)-carbodi- imid Hydrochlorid und 990 μl (5,7 mmol) Ethyl-diisopropylamin rührt man für
30 min bei Raumtemperatur Anschließend setzt man eine Losung aus Verbindung 1 5 b (1,3 g, 2,32 mmol) in 35 ml Dimethylformamid und 408 μl (2,32 mmol) Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromato- graphie [Petrolether/Ethylacetat 2 1 — > 1 1 - Ethylacetat] erhalt man hellgelbe
Kristalle Ausb 1,38 g (75,3 %) [DC (Ethylacetat). Rf = 0,53, Schmp - 125°C (Zers )]
1.5) 7-EthyI-20-O-(lysyl-alanyι)-camptothecin, Di-Trifluoracetat:
Eine Suspension der obigen Verbindung (1,18 g, 1,5 mmol) in Dichlormethan (50 ml) wird mit wasserfreier Trifluoressigsaure (5 ml) versetzt und die resultierende Losung für 1 h bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen auf ein kleines Volumen im Vakuum wird das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefallt Der Niederschlag wird abfiltriert und aus Ethylacetat umkristalhsiert Man erhalt 862 mg (71,5 %) an gelben Kristallen [DC (Ethylacetat) Rf = 0,05, Schmp = 137°C (Zers )]
Beispiel 1.6:
7-lNe-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-valyIoxymethyl)-camptothecin, Trifluoracetat
I.6.a) 7-Hydroxymethyl-camptothecin:
Diese Verbindung wird nach der Vorschrift von Miyasaka et al (Chem Pharm
Bull 39 (1991) 2574) hergestellt
I.6.b) 7-L-ValyIoxymethyl)-camptothecin, Trifluoracetat:
1 g (2,64 mmol) 7-Hydroxymethyl-camptothecin werden in 100 ml DMF gelost und dann mit 100 mg 4-N,N-Dimethylaminopyridin und einem Äquivalent N-tert- Butoxycarbonyl-L-valin-N-carboxy-anhydrid versetzt und die Suspension 16 h bei
Raumtemperatur gerührt Man engt ein und reinigt durch Flash-Chromatographie an Ethylacetat/Petrol ether 1 1 und spater 1,5 1 Das gereinigte Material wird in 30 ml Dichlormethan aufgenommen und bei 0°C mit 5 ml Trifluoressigsaure versetzt Nach 30 min Ruhren wird eingeengt und das aminodeblockierte Produkt aus Dichlormethan/Ether gefällt Man erhalt die Zielverbindung in einer
Gesamtausbeute von 55 % [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2) Rf = 0,37]
1.6 7-lNε-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-valyloxymethylJ- camptothecin, Trifluoracetat
560 mg des Konjugats aus Beispiel I 6 b werden zu einer Losung aus 560 mg (1,5 Aq ) Nα, Ne-bis-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin, 239 mg N-Hydroxybenzo- triazol und 271 mg N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid in 50 ml Dimethylformamid gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt Man engt ein, nimmt in Dichlormethan auf und extrahiert dreimal mit Wasser Nach Trocknen der organischen Phase wird eingeengt und durch Flashchromatographie (Petrolether/Essigester 1 1 > Essigester) gereinigt
Anschließend wird das erhaltene Produkt in 20 ml Dichlormethan aufgenommen, bei 0°C mit 3 ml Trifluoressigsaure versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen und Fallen aus Dichlormethan/Ether erhalt man die
Zielverbindung in 62-%iger Ausbeute [DC Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2 R, = 0,62]
1.7 10,l l-Methylendioxy-20-O-{Nε-[FluorenyI-9-methoxycarbonyl]-lysyl- leucylj-camptothecin, Trifluoracetat
I.7.a) 10,11-Methylendioxy-camptothecin:
Dieses Camptothecin-Derivat wird nach Wall et al (J Med Chem 29 (1986), 2358) aus dem S-konfigurierten, enantiomerenreinen Tricyclus, der z B durch Racematspaltung gewonnen werden kann, hergestellt
I.7.b) 10,1 l-(Methylendioxy)-20-O-leucyl-camptothecin, Trifluoracetat
150 mg (0,382 mmol) 10,11-Methylendioxy-camptothecin werden in 20 ml DMF gelost und dann mit 20 mg 4-N,N-Dimethylaminopyridin und 10 Äquivalenten N-tert -Butoxycarbonyl-L-leucin-N-carboxy-anhydrid versetzt und die Suspension 16 h bei 40°C gerührt. Man engt ein und reinigt durch Flash-Chromatographie an Ethylacetat/Petrol ether 2 1 Das gereinigte Material wird in 15 ml Dichlormethan aufgenommen und bei 0°C mit 2 ml Trifluoressigsaure versetzt Nach 30 min
Ruhren wird eingeengt und das aminodeblockierte Produkt aus Dichlormethan/Methanol mit Ether gefallt Man erhalt die Zielverbindung in einer Gesamtausbeute von 35 %
I.7.c) 10,U-Methylendioxy-20-O-{Ne-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-IysyI- leucylj-camptothecin, Trifluoracetat
Das Konjugat aus Beispiel I 7 b wird nach Standardvorschrift (siehe Beispiel I 1 a mit Nα-(tert -Butoxycarbonyl)-NE-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl-)-lysιn verknüpft und anschließend an der α-Aminofunktion durch Einwirkung von Trifluoressigsaure deblockiert Ausb 69 % über 2 Stufen [DC Acetomtril/Wasser 10 1 Rf = 0,4]
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Beispiel 1.8
20-O-(Lysyl-aspartyI)-camptothecin, Di-Hydrobromid
I.8.a) 20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-aspartyl-(γ-benzylester)]-camptothecin:
Eine Suspension von 5,23 g (15,0 mmol) 20(S)-Camptothecin in 400 ml absolutem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 10,45 g (30,0 mmol) N-(tert-Butoxy- carbonyl)-asparaginsäure-(γ-benzylester)-N-carbonsäureanhydrid sowie 367 mg (3,0 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 8 h Rühren bei 60 °C setzt man weitere 5,23 g (15,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-asparaginsäure-(γ- benzylester)-N-carbonsäureanhydrid und 183,5 mg (1,5 mmol) 4-(N,N-Dimethyl- amino)-pyridin zu und rührt für drei Tage bei Raumtemperatur. Anschließend wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie [Petrol- ether/Ethylacetat 1 :2] gereinigt. Man erhält 2,3 g (23,4 %) an orange-gelben Kristallen [DC (Ethylacetat): Rf - 0,59; Schmp. = 130°C (Zers.)].
I.8.b) 20-O-Aspartyl-(γ-benzylester)-camptothecin, Trifluoracetat:
Eine Lösung von Verbindung I.8.a (2,22 g, 3,4 mmol) in einer Mischung aus 70 ml Dichlormethan und 7 ml wasserfreier Trifluoressigsaure wird für 90 min. bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt und gründlich mit Diethylether gewaschen. Man erhält 1,08 g (72,3 %) an beigen Kristallen [DC (Ethylacetat): Rf = 0,14, Schmp. = 216°C (Zers.)].
1.8.c) 20-O-[N ,Nε-di-(tert-Butoxycarbonyl)-lysyl-aspartyl-(γ-benzylester)]- camptothecin:
433 mg (1,25 mmol) N,N-Di-(tert-butoxycarbonyl)-lysin und 338 mg (2,50 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 360 mg (1,88 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodi- imid Hydrochlorid und 500 μl (3,0 mmol) Ethyl-diisopropylamin rührt man für 15 min. bei Raumtemperatur. Anschließend setzt man eine Lösung aus Verbindung I.8.b (500,7 mg, 0,75 mmol) in 15 ml Dimethylformamid und 200 μl (1,13 mmol) Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raum- temperatur. Nach Einengen im Vakuum wird der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und die Lösung einmal mit Wasser gewaschen. Man trocknet über MgSO4 und reinigt den nach Einengen im Vakuum verbleibenden Rückstand durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 1:2] zu beigen Kristallen. Ausb.: 473,8 mg (70,5 %) [DC (Ethylacetat): Rf = 0,42; Schmp. = 99°C (Zers.)].
1.8) 20-O-(Lysyl-aspartyl)-camptothecin, Di-Hydrobromid:
Eine Lösung der obigen Verbindung (462 mg, 0,52 mmol) in Dichlormethan (25 ml) wird mit einer 33%-igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure (5 ml) versetzt und die nach wenigen Minuten resultierende Suspension für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Man dekantiert von dem ausgefallenen Produkt ab und wäscht den Rückstand gründlich mit Diethylether. Zur Reinigung wird nach
Lösung in warmem Ethanol durch Zugabe von Diethylether umgefällt. Man erhält 391 mg (100 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Wasser 5: 1): Rf = 0,05; Schmp. = 225°C (Zers.)].
Beispiel 1.9
20-O-(Lysyl-seryl)-camptothecin, Di-Hydrobromid
I.9.a) 20-O-[O-BenzyI-N-(tert-butoxycarbonyl)-seryl]-camptothecin:
Eine Suspension von 5,23 g (15,0 mmol) 20(S)-Camptothecin in 400 ml absolutem
Dimethylformamid wird unter Rühren mit 9,64 g (30,0 mmol) O-Benzyl-N-(tert- butoxycarbonyl)-serin-N-carbonsäureanhydrid sowie 367 mg (3,0 mmol) 4-(N,N- Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 8 h Rühren bei 60 °C setzt man weitere 4,82 g (15,0 mmol) O-Benzyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-serin-N-carbonsäureanhydrid und 183,5 mg (1,5 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin zu und rührt für drei
Tage bei Raumtemperatur. Anschließend wird der Ansatz filtriert, das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie [Petrol- ether/Ethylacetat 2: 1 → 1 : 1 → 1 :2] gereinigt. Man erhält 6,66 g (70,9 %) eines gelben Schaums [DC (Acetonitril Ethylacetat 1 : 1): R = 0,66; FAB-MS: m/z = 626 (M+H+)].
I.9.b) 20-O-[O-Benzyl-seryl]-camptothecin, Trifluoracetat:
Eine Lösung von Verbindung I.9.a (2,5 g, 4,0 mmol) in einer Mischung aus 20 ml Dichlormethan und 4 ml wasserfreier Trifluoressigsaure wird für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt und gründlich mit Diethylether gewaschen. Man erhält 2,51 g (98,1 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): Rf = 0,17; Schmp. = 198°C (Zers.)].
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1.9.c) 20-O-[Nα,NF-di-(tert-Butoxycarbonyl)-Iysyl-(O-benzyI)-seryl]- camptothecin:
1,73 g (5,0 mmol) N,N-Di-(tert-butoxycarbonyl)-lysin und 1,35 g (10 mmol) 1- Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 1,44 g (7,5 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid
Hydrochlorid und 2,0 ml (12 mmol) Ethyl-diisopropylamin rührt man für 15 min. bei Raumtemperatur. Anschließend setzt man eine Lösung aus Verbindung I.9.b (1,92 g, 3,0 mmol) in 50 ml Dimethylformamid und 790 μl (4,5 mmol) Ethyldiisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum wird der Rückstand durch Flashchromatographie
[Petrolether/Ethylacetat 3: 1 — » 1 : 1 -> 1 :3] zu gelben Kristallen gereinigt. Ausb.: 2,32 g (89,1 %) [DC (Ethylacetat): Rf = 0,45; Schmp. = 130°C (Zers.)].
1.9) 20-O-(Lysyl-seryl)-camptothecin, Di-Hydrobromid:
Eine Lösung der obigen Verbindung (2,13 g, 2,46 mmol) in Dichlormethan (120 ml) wird mit einer 33%-igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure
(25 ml) versetzt und die nach wenigen Minuten resultierende Suspension für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Man dekantiert von dem ausgefallenen Produkt ab und wäscht den Rückstand gründlich mit Diethylether. Zur Reinigung wird nach Lösung in Dichlormethan/Methanol 1 : 1 durch Zugabe von Diethylether umgefällt. Man erhält 1,78 g (100 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Wasser 5: 1):
Rf- = 0,05].
Beispiel 1.10
7-Ethyl-20-O-[Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat
1.10.a) 20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-vaIyl]-7-ethyI-camptothecin:
Die Verbindung wird unter Verwendung des in I.5.a beschriebenen Verfahrens aus 1,88 g (5,0 mmol) 20(S)-7-Ethyl-camptothecin (S. Sawada et al., Chem. Pharm. Bull. 39 (1991) 1446-1454) und 2,43 g (10,0 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)- valin-N-carbonsäureanhydrid hergestellt. Man erhält 1,46 g (51 %) an beigen Kristallen [DC (Acetonitril): Rf = 0,86; Schmp. = 224-227°C (Zers.); FAB-MS: m/z = 576 (M+FT)].
I.lO.b) 7-Ethyl-20-O-valyl-camptothecin, Trifluoracetat:
Aus Verbindung I.lO.a (1,44 g, 2,5 mmol) wird wie unter I.5.b beschrieben die N-
(tert-Butoxycarbonyl)-Gruppe abgespalten. Man erhält 626 mg (43 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril): Rf = 0,45; Schmp. = 160°C (Zers.)].
I.lO.c) 20 -O - [ Nα- (tert-Bu to xy ca rb o nyI)- Nε- (fI u o r e n yl - 9 - methoxycarbonyl)-lysyl-valyI]-7-ethyl-camptothecin:
In Analogie zu 1.5. c werden 797 mg (1,7 mmol) Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-
(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin mit Verbindung I.lO.b (590 mg, 1,0 mmol) umgesetzt. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 1 :2] erhält man beige Kristalle. Ausb.: 287 mg (31 %) [DC (Ethylacetat): Rf = 0,50; Schmp. = 172°C (Zers.)].
1.10) 7-Ethyl-20-O-[Nf-(fIuorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-vaIyl]- camptothecin, Trifluoracetat:
Obige Verbindung (277,8 mg, 0,3 mmol) wird wie beschrieben mit Trifluoressigsaure in Dichlormethan entschutzt Man erhalt 209 mg (74 %) an gelben Kristallen [DC (Ethylacetat). Rf = 0,06, Schmp = 199°C (Zers.)]
Beispiel 1.11
7-Ethyl-20-O-[Nε-(fluorenyI-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-10-hydroxy- camptothecin, Trifluoracetat
I.ll.a) 20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-valyI]-7-ethyI-10-hydroxy- camptothecin:
Die Verbindung wird unter Verwendung des in I 5 a beschriebenen Verfahrens aus 392,4 mg (1,0 mmol) 20(S)-7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin (S Sawada et al , Chem Pharm Bull 39 (1991) 3183-3188) und insgesamt 2,43 g (10,0 mmol) N- (tert-Butoxycarbonyl)-valin-N-carbonsaureanhydrid innerhalb von 6 Tagen hergestellt Man erhalt nach Flash-Chromatographie [Petrolether/Ethylacetat 5 1 -> 2 1 -> 1 1] 353 mg (45 %) an hellgelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 1) Rf = 0,63, Schmp = 95-97°C]
1.1 l.b) 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-valyl-camptothecin, Trifluoracetat:
Aus Verbindung l i l a (340 mg, 0,43 mmol) wird wie unter I 5 b beschrieben die
N-(tert-Butoxycarbonyl)-Gruppe abgespalten Man erhalt 255 mg (98 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 1) Rt = 0,04, Schmp = 189°C (Zers )]
I.ll.c) 20-O-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9- methoxycarbonyl)-lysyl-valyI]-7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin:
In Analogie zu I.5.C werden 562,3 mg (1,2 mmol) N -(tert-Butoxycarbonyl)-Nε- (fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysin mit Verbindung 1.11.b (242,2 mg, 0,4 mmol) umgesetzt. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 5:1 -> 3:1 -> 1:1] erhält man gelbe Kristalle. Ausb.: 251 mg (67%) [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1:1): Rf= 0,68; Schmp. = 163°C (Zers.)].
1.11) 7-Ethyl-20-O-[Nε-(fIuorenyI-9-methoxycarbonyl)-Iysyl-valyl]-10- hydroxy-camptothecin, Trifluoracetat:
Obige Verbindung (244,9 mg, 0,26 mmol) wird wie beschrieben mit Trifluoressigsaure in Dichlormethan entschützt. Man erhält 115 mg (46 %) an gelben Kristallen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1:1): Rf = 0,05; Schmp. = 196°C (Zers.)].
Beispiele 1.1 - 1.3
Konjugate des Batracylins mit einer Aminosäure; allgemeine Formel:
1.1) N-[N-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-D-alanyl]- batracylin
Edukt: N-(D-alanyl)-batracylin Ausb.: 76 % [DC (Ethylacetat/Eisessig 100:1): Rf = 0,53; Schmp.: 185 °C]
1.2) N-[Nα-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-Iysyl]-batracylin
Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-batracylin, Trifluoracetat
Ausb.: 68 % über 2 Stufen [DC (Dichlormethan/Methanol 5:1): Rf= 0,31; Schmp.: 162 °C (Zers.)]
1.3) N-[Nε-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl]-batracyIin
Edukt: N-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-lysyl]-batracylin
Ausb.: 71% über 2 Stufen [DC (Dichlormethan/Methanol 5:1): R, = 0,30;
Schmp.: 162 °C (Zers.)]
Beispiele 1.4 - 1.8
Konjugate des Batracylins mit zwei Aminosäuren; allgemeine Formel:
1.4) N-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-D-alanyl]- batracylin Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-D-alanyl]-batracylin,
Trifluoracetat,
Ausb.: 70 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf =
0,36]
1.5) N-[N-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-seryI-D-alanyl]- batracylin
Edukt: N-(Seryl-D-alanyl)-batracylin, Trifluoracetat
Ausb.: 45 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 15:2:0,2):
Rf - 0,32]
1.6) N-[N-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyI)-glutamyl-D-alanyl]- batracylin
Edukt: N-(Glutamyl-D-alanyl)-batracylin Ausb.: 70 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 15:8:0,8):
Rf - 0,68]
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1.7) N-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl- seryl]-batracylin
Edukt N-(Lysyl-seryl)-batracyhn, Di -Trifluoracetat Ausb 46 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 15 3 0,2)
Rf = 0,24, Schmp 155-157 °C (Zers )]
1.8) N-{Nα-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyI]- α,ß-diaminopropionyl}-batracylin
Edukt N-[Nα-Lysyl-Nß-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-α,ß-diamιno- propionyl]-batracylin, Di-Trifluoracetat Ausb 39 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2) Rf =
0,54]
Beispiele 2.1 - 2.10
Konjugate des Chinolons-a mit einer Aminosäure; allgemeine Formel:
2.1) N-[N-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyι)-alanyl]- chinolon-a
Edukt N-(Alanyl)-chinolon-a, Trifluoracetat
Ausb 48 % [DC (Acetonitril/Wasser 10 1) Rf = 0,55]
2.2) N-[N-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-D-alanyl]- chinolon-a
Edukt N-(D-Alanyl)-chinolon-a, Trifluoracetat Ausb 61 % [DC (Dichlormethan/Methanol/Eisessig 90 10 1) Rf = 0,38]
2.3) N-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-α,γ-diamino- butyryl]-chinolon-a, Hydrochlorid
Edukt: N-[Nγ-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)- ,γ-diaminobutyryl]- chinolon-a, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 60 % über 2 Stufen [DC
(Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 %-ig 10: 10:3): Rf - 0,51; Schmp.: 221 °C (Zers.)]
Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Wasser suspendiert und der pH-
Wert mit 0,1 N Salzsäure auf 2-3 eingestellt. Nach Filtration wird das Filtrat lyophilisiert.
2.4) N-[Nα-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-lysyl]-chinolon-a, Hydrochlorid
Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,
Trifluoracetat Ausb.: 74 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf =
0,33]
2.5) N-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-D-lysyl]- chinolon-a
Edukt: N-(D-Lysyl)-chinolon-a, Di-Trifluoracetat Ausb.: 59 % [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf = 0,33; Schmp.
186 °C]
2.6) N-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-ornithyl]- chinolon-a, Hydrochlorid
Edukt: N-[N -(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-ornithyl]-chinolon-a, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 47 % über 2 Stufen [DC (Dichlormethan/Methanol/Ammo- niak 17 %-ig 10: 10:3): Rf = 0,36; Schmp.: 211 °C (Zers.)] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Wasser suspendiert und der pH-
Wert mit 0, 1 N Salzsäure auf 2-3 eingestellt. Nach Filtration wird das Filtrat lyophilisiert.
2.7) N-[Nα-(Phenylamino-thiocarbonγI)-lysyl]-chinolon-a Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a, Trifluoracetat
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Ausb. 58 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf = 0,48]
2.8) N-[Nα-(4-Isothiocyanato-phenylamino-thiocarbonyI)-Iysyl]- chinolon-a Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,
Trifluoracetat
Ausb.: 73 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf =
0,38]
2.9) N-[N -(4-Carboxy-phenylamino-thiocarbonyI)-lysyl]-chinolon-a Edukt: N-[N*-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,
Trifluoracetat Ausb.: 62 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 10:3: 1,5):
Rf = 0,6]
2.10) N-[Nα-(Phenyl-methyl-amino-thiocarbonyI)-lysγl]-chinoIon-a
Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-chinolon-a,
Trifluoracetat
Ausb.: 59 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf ■
0,44]
Beispiel 2.11
Konjugate des Chinolons-a mit zwei Aminosäuren; allgemeine Formel:
COOH
2.11) N-[Nα-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-lysyl-D-aIanyl]- chinolon-a
Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-D-alanyl]-chinolon-a
Trifluoracetat Ausb.: 53 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2) Rf =
0,33]
Beispiel 3
Konjugate des Doxorubicins; allgemeine Formel:
3) N-[Nα-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyI)-lysyI-aIanyI]- doxorubicin
Edukt: N-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-alanyl]-doxorubicin,
Trifluoracetat,
Ausb.: 46 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf =
0,2; FAB-MS: m/z = 894 (M+H)+]
98/15571 39 -
Beispiele 4.1 - 4.11
Konjugate des 20(S)-Camptothecins; allgemeine Formel:
4.1) 20-O-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-alanyl]- camptothecin
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-alanyl]-camptothecin,
Trifluoracetat Ausb.: 80 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2): Rf =
0,32]
4.2) 20-O-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyI-Ieucyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[ ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-leucyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 71 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2): Rf = 0,48]
Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
4.3) 20-O-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-Iysyl- phenylalanylj-camptothecin
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-phenylalanyl]- camptothecin, Trifluoracetat
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Ausb.: 75 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1 :0,2): Rf =
0,33]
4.4) 20-O-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-IysyI-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 68 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig
5: 1 :0,2): Rf = 0,35; FAB-MS: m/z - 727 (M+H)+] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
4.5) 20-O-[Nα-(4-Carboxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 79 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig
5:1 :0,2): Rf = 0,46] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
4.6) 20-O-[N -(4-ChIor-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyl]- ca ptothecin, Hydrochlorid Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 86 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig
10:1 :0,1): Rf = 0,24] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
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4.7) 20~O-[Nα-(Phenylamino-thiocarbonyl)-Iysyl-valyI]-camptothecin,
Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 67 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig
5:1:0,2): Rf = 0,5] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
4.8) 20-O-[Nα-(Phenyl-methyl-amino-thiocarbonyI)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 55 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig
5: 1:0,2): Rf = 0,5] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyo- philisiert.
4.9) 20-O-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)-IysyI- alanyl]-camptothecin
Edukt: 20-O-(Lysyl-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat
Ausb.: 64% [DC (Acetonitril/Wasser 10:1): Rf = 0,72]
4.10) 20-O-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)-lysyI-D- alanylj-camptothecin
Edukt: 20-O-(Lysyl-D-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat
Ausb.: 77% [DC (Acetonitril/Wasser 20:1): Rf = 0,40; FAB-MS: m/z =
850 (M+H)+]
4.11) 20-O-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-iysyl- phenylalanyl]-camptothecin
Edukt: 20-O-(Lysyl-phenylalanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat
Ausb.: 84% [DC (Acetonitril/Wasser 20: 1): Rf = 0,6]
4.12) 20-O-[Nα-(3-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyI-valyI]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 58 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1:1): Rf =
0,03; Schmp. = 195 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 727 (M+H)+] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.
4.13) 20-O-[Nα-(2-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyl)-Iysyl-vaIyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 36 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): Rf =
0,03; Schmp. = 192 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 727 (M+H)+] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.
4.14) 20-O-[Nα-(4-Methoxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 54 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 :1): Rf =
0,06; Schmp. = 195 °C (Zers.); FAB-MS : m/z = 741 (M+H)+] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.
4.15) 20-O-[N -(3-Methoxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyI]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat
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salzfreie Vorstufe: 65 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): Rf =
0,08; Schmp. = 197 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 741 (M+H)+] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.
4.16) 20-O-[Nα-(4-Nitro-phenyIamino-thiocarbonyI)-Iysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 86 % über 2 Stufen [DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig
5:1:0,2): Rf = 0,5]. Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
4.17) 20-O-[Nα-(3-Nitro-phenylamino-thiocarbonyI)-lysyl-valyI]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 46 % über 2 Stufen. Die Reinigung auf der Fmoc-geschütz- ten Zwischenstufe erfolgt durch Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol 50: 1). Anschließend erfolgt die Deblockierung mit Piperidin. [DC: (Aceto- nitril/Wasser Eisessig 5: 1:0,2): Rf = 0,45;
Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert. [FAB-MS: m/z = 756 (M+H)+].
4.18) 20-O-[N -(4-Amino-phenyIamino-thiocarbonyI)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat mono-Fmoc-geschütztes p-Phenylen-diamin:
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Dieses wird aus Phenylendiamin mit 0,5 Aq Fmoc-Cl ohne weiteren Basenzusatz hergestellt Anslchließend wird es nach Standardbedingungen in das Senfol überfuhrt salzfreie Vorstufe 46 % über 2 Stufen Die Reinigung auf der Fmoc- geschutzten Zwi schenstufe erfolgt durch Fl ash- Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol 50 1). Anschließend erfolgt die Deblockierung mit Piperidin Di e Rei nigung erfolgt dann erneut durch Fl ash- Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Metha- nol/Ammoniak 1 7 %ig 1 5 : 1 .0, 1 ) [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 :0,2) Rf = 0,45]
Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelost und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überfuhrt Die resultierende Losung wird anschließend lyophilisiert [FAB-MS" m/z = 726 (M+H)+]
4.19) 20-O-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)-histidyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt 20-O-[Histidyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe 81 % [DC. (Acetonitril/Wasser 10 1 Rf = 0,4] Hydrochlorid Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelost und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsaure ins Hydrochlorid überfuhrt Die resultierende Losung wird anschließend lyophilisiert
4.20) 20-O-[Nα-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-leucyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt 20-O-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin,
Trifluoracetat salzfreie Vorstufe 71 % über 2 Stufen [DC (Acetonitril/Wasser/Eisessig
5 1 0,2) Rf = 0,45] Hydrochlorid Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelost und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsaure ind Hydrochlorid überfuhrt Die resultierende Losung wird anschließend lyophilisiert
98/15571 45
4.21) 20-O-i[Nα-Ne-bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyI)]-lysyl- valylJ-camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 20-O- ιLysyI-[Nε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl]-valylJ- camptothecin, Bis-Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 79 % über 2 Stufen.
[DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2) Rf = 0,46]; [FAB-MS: m/z = 1006 = (M+H)+]. Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
4.22) 20-O-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl- aspartyI]-camptothecin, Natriumsalz
Edukt: 20-O-(Lysyl-aspartyl)-camptothecin, Di-Hydrobromid salzfreie Vorstufe: 50 % - die Reinigung erfolgt durch mehrmaliges Umfallen aus Dichlormethan/Methanol 1 :1 mit Diethylether [DC (Acetonitril/Wasser 5: 1): Rf = 0,58; Schmp. = 192 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 894 (M+H)+]. Natriumsalz: Die Verbindung wird in Wasser suspendiert und mit einem Äquivalent einer 0,1 N-Natronlauge versetzt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
4.23) 20-O-[Nα,Nε-bis-(4-Hydroxy-phenyIamino-thiocarbonyI)-lysyl- seryl]-camptothecin
Edukt: 20-O-(Lysyl-seryl)-camptothecin, Di-Hydrobromid
Ausb.: 36 % - die Reinigung erfolgt durch Flashchromatographie [Petrol- ether / Ethylacetat 2:1 -> 1 :2 → Ethylacetat] [DC (Acetonitril): Rf = 0,70; Schmp. = 183 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 866 (M+H)+].
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Beispiel 5
Konjugate des 20(S)-7-Ethyl-camptothecins; allgemeine Formel:
5.1) 7-EthyI-20-O-[Nα,Nε-bis-(4-hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)- Iysyl-alanyl]-camptothecin
Edukt: 7-Ethyl-20-O-(lysyl-alanyl)-camptothecin, Di-Trifluoracetat
Ausb.: 27 % [DC (Acetonitril): Rf = 0,68; Schmp. - 122 °C (Zers.);
FAB-MS: m/z = 879 (M+H)+].
5.2) 7-EthyI-20-O-[N -(4-hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-vaIyI]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 7-Ethyl-20-O-[Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]- camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 61% über 2 Stufen [beige Kristalle; DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): Rf = 0,02; Schmp. = 220 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 755 (M+H)+].
Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultierende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.
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Beispiel 6
Konjugate des 10,ll-(Methylcndioxy)-camptothecins; allgemeine Formel:
6) 10,1 l-(MethyIendioxy)-20-O-[Nα-(4-Hydroxy-phenylaminothio- carbonyI)-lysyl-leucyI]-camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 10,l l-(Methylendioxy)-20-O-[Ne-(Fluorenyl-9-methoxy-carbonyl)- lysyl-leucyl]-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 90 % über 2 Stufen [DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig
5: 1 :0,2) Rf = 0,43] Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
Beispiel 7
Konjugate des 7-Hydroxymethyl-camptothecins; allgemeine Formel
7) 7-[N -(4-Hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-lysyl-valyloxymethyl]- camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 7-[N ε-(Fluorenyl-9-methoxy-carbonyl)-lysyl-valyloxymethyl]- camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 60 % über 2 Stufen. Die Reinigung auf der Fmoc- geschützten Zwi schenstufe erfolgt durch Fl ash- Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol 20: 1). Anschließend erfolgt die Deblockierung mit Piperidin. [DC: (Acetonitril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2) Rf = 0,54]
Hydrochlorid: Die Verbindung wird in Dioxan/Wasser gelöst und mit einem Äquivalent einer 0,1 N Salzsäure ins Hydrochlorid überführt. Die resultierende Lösung wird anschließend lyophilisiert.
Beispiel 8
Konjugate des 20(S)-7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecins; allgemeine Formel:
8) 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-[Nα-(4-hydroxy-phenylamino-thiocarbonyl)-
Iysyl-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid
Edukt: 7-Ethyl-20-O-[Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-10- hydroxy-camptothecin, Trifluoracetat salzfreie Vorstufe: 69% über 2 Stufen [beige Kristalle; DC (Acetonitril/Ethylacetat 1 : 1): Rf - 0,03; Schmp. = 225 °C (Zers.); FAB-MS: m/z = 771 (M+H)+] Hydrochlorid: Die Verbindung wird mit Wasser versetzt und die Suspension mit 1 N-Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Die resultie- rende Lösung wird über Celite filtriert und anschließend lyophilisiert.
Claims
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Patentansprüche
1. Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
S
II
(Ar-X-NH-C— )nM-C
worin
S
II
^ 'n für 1 bis n' gleiche oder voneinander verschiedene Grup-
S
II pierungen Ar-λ-NH-C steht, wobei n eine Zahl 1 bis n' bedeutet und n'
der maximalen Zahl möglicher Anknüpfungsstellen von M entspricht,
worin
Ar für einen Arylrest mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen steht, der zusätzlich zu X gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein kann durch Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Carboxy, Carboxylalkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Isocyanato, Isothiocyanato, Halogen, Sulfonyl und/oder Sulfonamid,
X für eine direkte Einfachbindung oder für Alkylen mit bis zu 6
Kohlenstoffatomen steht,
M für ein Mono-, Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht, das über die α-
Aminogruppe und/oder über Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit den n gleichen oder voneinander verschiedenen
S
II
Gruppierungen Ar-Λ-NH-C verknüpft ist, wobei weitere
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funktionelle Gruppen des Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können, und C für einen Rest eines Cytostatikums oder eines Cytostatikum-
Derivats steht, das über eine Aminofunktion oder über ein Sauer- stoffatom mit M verknüpft ist,
sowie deren Stereoisomere, Stereoisomerengemische und Salze.
2. Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Ar für einen Phenylrest steht, der para-ständig zu X noch Hydroxy, Carboxy, Isothiocyanato oder Halogen tragen kann,
sowie deren Stereoisomeren, Stereoisomerengemische und Salze.
3. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
X für eine Einfachbindung oder für Methylen steht,
sowie deren Stereoisomeren, Stereisomerengemische und Salze.
4. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß
M für ein Mono-, Di oder Tripeptid steht, das über die α-Aminogruppe und/oder Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit den 1 bis n gleichen oder voneinander verschiedenen Gruppierungen S
II Ar-X-NH-C verknüpft ist, wobei weitere funktionelle Gruppen
des Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können.,
sowie deren Stereoisomeren, Stereoisomerengemische und Salze.
5. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide M aus Aminosäureresten bestehen, die sich ab-
leiten von Alanin, Asparaginsaure, Glutaminsäure, Glycin, Leusin, Htstidin, Lysin, Arginin, Ornithin, Senn, Tyrosin, Valin oder Diaminopropionsaure, wobei mehrere Aminosaurereste sowohl über die α-Aminogruppe als auch gegebenenfalls über die Seitenketten-Aminofunktionen und auch über beide Funktionen peptidisch verknüpft sein können,
sowie deren Stereoisomere, Stereoisomerengemische und Salze
Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß C für einen Batracylin-, Methotrexat-, Chinolon-a-, Etoposid-, Melphalan-, Taxol-, Camptothecin-Rest, ein im A-Ring oder B-Ring modi- fiziertes Camptothecin-Deπvat, einen Daunomycin- oder Doxorubicin-Rest steht, wobei C über eine Amino- oder Hydroxyfunktion mit M verknüpft
sowie deren Stereoisomere, Stereoisomerengemische und Salze
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
M'-C (II),
worin C die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat und M1 für einen in Anspruch 1 definierten Rest M steht, der an den gewünschten Ver- knupfungsstellen Wasserstoffatome tragt und dessen übrige potentielle Verknupfungsstellen durch Schutzgruppen blockiert sind,
mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III)
Ar - X- N = C = S (III)
in geeigneten Losemitteln in Gegenwart einer Base zu Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia)
S
I I (Ia)
Ar-X-NH-C-I
umsetzt,
worin Ar, X und C die oben angegebenen Bedeutungen haben und M" für einen Rest M steht, dessen weitere potentielle Verknüpfungsstellen durch Schutzgruppen blockiert sind,
und im Fall der Einführung weiterer Gruppen
S
II
Ar-X H , die sich von der bzw. den zunächst eingeführten
unterscheiden, die entsprechenden Schutzgruppen gegebenenfalls selektiv von den Verbindungen der Formel (Ia) abspaltet, diese in der oben angegebenen Weise mit weiteren Verbindungen der allgemeinen Formel (III), die sich von den zunächst eingeführten unterscheiden, umsetzt und gegebenenfalls diese Reaktionssequenz zu Einführung weiterer von den
S
II eingeführten Resten verschiedener Reste Ar-X-NH-C wiederholt,
und daß man verbleibende Schutzgruppen gegebenenfalls abspaltet,
daß man weiterhin gegebenenfalls nach üblichen Methoden die Stereoiso- meren trennt und daß man gegebenenfalls die Verbindungen in ihre Salze überführt.
8. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Arzneimitteln.
9. Arzneimittel enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1.
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