KR20010012558A - 20(ｓ) 캄프토테신 당결합체 - Google Patents

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KR20010012558A
KR20010012558A KR1019997010513A KR19997010513A KR20010012558A KR 20010012558 A KR20010012558 A KR 20010012558A KR 1019997010513 A KR1019997010513 A KR 1019997010513A KR 19997010513 A KR19997010513 A KR 19997010513A KR 20010012558 A KR20010012558 A KR 20010012558A
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South Korea
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camptothecin
compound
amino acid
side chain
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KR1019997010513A
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한스-게오르그 레르헨
카르스텐 폰뎀부르흐
외르그 바움가르텐
미카엘 스페르첼
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빌프리더 하이더
바이엘 악티엔게젤샤프트
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof

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Abstract

본 발명은 3-O-메틸화된 β-L-푸코스 성분이 티오우레아-개질된 펩티드 스페이서(spacer)에 의해 캄프토테신 유도체의 20-히드록실기에 결합된 20(S) 캄프토테신 당결합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 화합물의 제조 방법 및 약제, 특히 암 질환 분야에의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

20(Ｓ) 캄프토테신 당결합체 {20(S) Camptothecin Glycoconjugates}
20-(S)-캄프토테신은 1966년 월(Wall) 등에 의해 단리된 펜타시클릭 알카로이드이다[문헌 J. Am. Chem. Soc. 88, 3888(1966) 참조]. 이 화합물은 수많은 시험관내 및 생체내 시험에서 높은 항종양 활성능을 나타내고 있다. 그러나, 유감스럽게도 독성 및 용해도 문제로 인하여 임상 효능이 실현되지 못하였다.
E 고리 락톤의 개환 및 나트륨염의 형성에 의해, 폐환 형태와 pH 의존성 평형 상태에 있는 수용성 화합물을 얻었다. 그러나, 임상 연구는 지금까지 성공적이지 못했다.
대략 20년 후, 생물학적 활성이 토포이소머라제의 효소 억제에 기인하는 것으로 밝혀졌다. 그 이후로, 생체내에서 보다 상용적이고 활성인 캄프토테신 유도체를 찾기위하여 연구 활동이 다시 증가하였다.
수용성을 개선하기 위하여, A 고리- 및 B 고리-개질된 캄프토테신 유도체 및 이온화가능한 기를 갖는 20-O-아실 유도체의 염이 기술되어 왔다 [비쉬누바잘라(Vishnuvajala)등의 US 4943579 참조]. 또한 후자의 약물전구체 구상은 변형 캄프토테신 유도체에 응용되었다[와니(Wani) 등의 WO 9602546 참조]. 그러나, 상기 기술된 20-O-아실 유도체는 생체내에서 매우 짧은 반감기를 갖고 매우 신속하게 분해되어 모 구조를 제공한다.
WO 9631532 A1에서는 특정 스페이서(spacer)를 통한 다양한 세포독성 또는 세포증식 억제 활성 화합물과, 예를 들면, 지역선택적으로 개질된 탄수화물 단위에 결합시켜 종양 선택성을 개선시키는 당-개질된 세포증식 억제제를 기술하고 있다. 문헌에 광범위하게 기술된 탄수화물, 스페이서 및 활성 화합물의 조합으로부터, 본 원 발명자들은 놀랍게도 입체적 요구성 비-극성 측쇄 및 염기성 측쇄를 함유하는 아미노산으로 구성된 티오우레아-개질된 펩티드 스페이서를 통해 3번 위치에서 개질되는 β-L-푸코스 단위의 20(S)-캄프토테신의 20-히드록실기상의 결합이 하기 특성을 갖는 매우 특별하게 바람직한 결합체임을 밝혔다.
- 캐리어 라디칼의 20-히드록실기로의 에스테르형 결합에 의해, 캄프토테신 잔기중 활성에 중요한 락톤 고리가 안정화된다.
- 디펩티드 스페이서의 특별한 형태에 의해, 세포외 매질 및 혈중 결합체는 상기 WO 9631532호에서 기술된 기타 스페이서를 갖는 유사한 결합체와 비교해서 현저하게 개선된 안정성을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 결합체는 US 4943579에 기술된 캄프토테신의 20-O-아실 약물전구체보다 더 안정하다.
- 본 발명에 따른 결합체는 WO 9631532의 유사한 결합체와 비교하여 보다 나은 수용성을 갖는다.
- 시험관내에서, 본 발명에 따른 결합체는 종양 세포주 및 종양 이종 이식에 대한 높은 활성을 갖는다.
- 생체내에서, 본 발명에 따른 결합체는 정맥내 투여 후 다양한 종양에 대한 여러차례 복용 단계에 걸쳐 뛰어난 치료 활성을 갖는다.
- 잠재적인 독소단과 비교하여, 특히 골수 독성에 관하여 현저하게 높은 내성 및 종양 선택성을 갖는다.
본 발명은 3-O-메틸화된 β-L-푸코스 단위가 티오우레아-개질된 펩티드 스페이서(spacer)에 의해 캄프토테신 유도체의 20-히드록실기에 결합된 20(S) 캄프토테신의 당결합체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 화합물의 제조 방법 및 약제, 특히 암 질환에 관련된 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 화학식(I)의 화합물 및 그의 염, 입체이성체 및 입체이성체 혼합물에 관한 것이다.
상기 식에서,
R1은 아미노산의 입체적 요구성 비-극성 측쇄를 나타내고,
R2는 아미노산의 염기성 측쇄를 나타낸다.
바람직한 화학식(I)의 화합물은
R1이 4개 이하의 탄소 원자를 갖는 분지된 알킬 라디칼이고,
R2가 화학식 -(CH2)n-R3의 라디칼(여기서, R3는이고 n은 1 내지 4의 수임)인 것들이다.
특히 바람직한 일반 화학식(I)의 화합물은
R1이 화학식의 분지된 알킬 라디칼이고,
R2가 화학식 의 라디칼인 화합물이다.
캄프토테신 단위는 20(R) 또는 20(S) 배열로 존재하거나 이러한 2종의 입체이성체 형태의 혼합물로서 존재할 수 있다. 20(S) 배열이 바람직하다.
아미노산은 L 또는 D 배열이거나, D 및 L 형태의 혼합물일 수 있다.
용어 "아미노산"은 특히 천연 α-아미노산을 의미하지만, 또한 그들의 동족체, 이성체 및 유도체를 포함한다. 이성체의 예로서 에난티오머를 언급할 수 있다. 유도체는, 예를 들면, 보호기가 부착된 아미노산일 수 있다.
"입체적 요구성" 측쇄를 갖는 아미노산은 그의 측쇄가 β- 또는 γ-위치에서 분지된, 예를 들면, 발린 및 이소류신 또는 류신과 같은 아미노산을 의미한다.
언급될 수 있는 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산의 전형적인 예로는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌이 있다.
염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 전형적인 예로는 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 오르니틴, 디아미노부티르산이 있다.
본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 그들의 염의 형태로 존재한다. 일반적으로, 유기산 또는 무기산의 염이 본 명세서에서 언급된다.
부가될 수 있는 산에는 바람직하게는, 예를 들면, 염산 또는 브롬화 수소산, 특히 염산과 같은 할로겐화 수소산, 또는 인산, 질산, 황산, 또는, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 말론산, 옥살산, 글루콘산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 살리실산, 소르브산 및 락트산과 같은 일관능성 및 이관능성 카르복실산 및 히드록시카르복실산, 또는, p-톨루엔술폰산, 1,5-나프탈렌디술폰산 또는 캄포술폰산과 같은 술폰산이 포함된다.
본 발명에 따른 당결합체는, 예를 들면, 20(S)-캄프토테신을 활성화된 카르복실 성분에 결합시켜 제조되며, 그 자체가 보호된 아미노산, 펩티드 또는 탄수화물-개질된 펩티드의 잔기일 수 있다.
바람직하게는, 당결합체의 합성은 통상의 방법에 따라서 적절한 용매 중에서, 경우에 따라 염기의 존재하에 20(S)-캄프토테신을 비-극성 입체적 요구성 아미노산의 N-보호된 카르복실-활성화 단위로 아실화시키는 것으로부터 시작하여 순차적으로 진행된다. 아미노 보호기는 공지된 방법에 의해 선택적으로 제거된다. 필요한 경우, 적절히 보호된 염기성 아미노산의 단위는 결합된 후, 적합한 경우 측쇄 보호기의 보유로 α-아미노산 관능기에서 탈차단된다. 중요한 단계에서, 탄수화물 라디칼로의 결합은 p-아미노페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드를 상응하는 이소티오시아네이트로 전환시킨 후, 펩티딜 캄프토테신의 탈차단된 α-아미노기에 결합시킴으로써 수행된다. 여전히 존재할 수 있는 측쇄 보호기를 제거하고 임의로는 유리 아미노기를 적절한 암모늄염으로 전환시킨다.
따라서, 본 발명은 화학식(II)의 이소티오시아네이트를 임의로는 측쇄가 보호된 화학식(III)의 펩티딜-캄프토테신과 반응시켜 화학식(IV)의 당결합체를 수득하고, 존재하는 경우 측쇄 아미노 보호기를 통상의 방법에 따라 제거하고 임의로는 수득한 화합물을 목적하는 염으로 전환시키는 것을 특징으로하는, 화학식(I)의 당결합체 또는 그의 염의 제조 방법에 관한 것이다.
〈화학식 I〉
상기 식에서,
R1은 아미노산의 입체적 요구성 비-극성 측쇄를 나타내고,
R2는 아미노산의 염기성 측쇄이고,
R2'은 상기 언급된 염기성 라디칼 R2의 의미를 가지며 염기성 기상에 펩티드 화학에서 통상의 보호기를 가질 수 있다.
또한, 목적 화합물의 합성에 있어서 반응 단계의 또다른 순서를 생각해볼 수 있다. 마찬가지로 바람직한 변형에 따라서, p-이소티오시아네이토페닐-3-O-메틸-β-L-푸코시드를 우선 임의로 적절하게 보호된 말단 염기성 아미노산과 결합시키고, 이 단위를 20(S)-캄프토테신과 비-극성의 입체적 요구성 아미노산의 아미노산 결합체의 유리 아미노기와 반응시킬 수 있다. 존재할 수 있는 측쇄 보호기를 제거하고 임의로는 유리 아미노기를 적절한 암모늄염으로 전환시킨다.
따라서, 본 발명은 화학식(II)의 이소티오시아네이트를 임의로 적절히 보호된 화학식(V)의 말단 염기성 아미노산과 반응시켜 화학식(VI)의 아미노산 결합체를 수득한 후, 이를 화학식(VII)의 아미노산 결합체와 반응시키고, 측쇄 보호기를 제거하고 화합물을 적절한 염으로 전환하는 것을 특징으로하는 화학식(I)의 화합물 또는 그의 염의 제조 방법에 관한 것이다.
〈화학식 II〉
상기 식에서,
R1은 제1항에 정의된 의미와 같고,
R2'은 염기성 기가 보호될 수 있는 아미노산의 염기성 측쇄이다.
특히, 최초 아미노산을 캄프토테신에 결합시킨 후, 디아스테레오머 혼합물이 형성될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 순수한 디아스테레오머는 상기 정의된 방법, 예를 들면, 최초 아미노산 단위를 캄프토테신과 결합시킨후 보호기를 제거하는 적절한 방법으로 디아스테레오머를 분리함으로써 제조될 수 있다. 디아스테레오머적으로 순수한 목적 화합물은 상기 정의된 경로에 의해 디아스테레오머적으로 순수한 중간체 화합물로부터 제조될 수 있다.
또한, 목적 화합물의 디아스테레오머 혼합물은 일반적인 방법에 의해 각각의 디아스테레오머로 분리될 수 있다.
반응은 다양한 압력 및 온도 조건하에, 예를 들면, 0.5 내지 2 bar 및 -30 내지 +100℃에서, 디메틸포름아미드(DMF), 테트라히드로푸란(THF), 디클로로메탄, 클로로포름, 저급 알코올, 아세토니트릴, 디옥산, 물 또는 언급된 용매의 혼합물과 같은 적절한 용매에서 수행될 수 있다. 일반적으로, DMF, 디클로로메탄 또는 THF/디클로로메탄 중 실온 및 정상 압력에서의 반응이 바람직하다.
카르복실기를 활성화시킬 수 있는 커플링제는, 예를 들면, 문헌 [Jakubke/Jeschkeit: Amino Acids, Peptides, Proteins; Verlag Chemie 1982 또는 Tetrahedr. Lett. 34, 6705(1993)]에 기술된 바와 같은 펩티드 화학에 공지되어 있는 것들이다.
추가로, 카르복실기의 활성화에 적절한 것은 카르보디이미드, 예를 들면, N,N'-디에틸-, N,N'-디이소프로필-, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카르보디이미드 염산염, N-시클로헥실-N'-(2-모르폴리노에틸)-카르보디이미드-메토-p-톨루엔술포네이트, 또는 카르보닐디이미다졸과 같은 카르보닐 화합물, 또는 2-에틸-5-페닐-1,2-옥사졸리움-3-술페이트 또는 2-tert-부틸-5-메틸-이속사졸리움 퍼클로레이트와 같은 옥사졸리움 화합물, 또는 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린과 같은 아실아미노 화합물, 또는 프로판포스폰산 무수물, 또는 이소부틸 클로로포르메이트, 또는 벤조트리아졸릴옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 1-히드록시벤조트리아졸 에스테르 또는 N-히드록시석신이미드 에스테르와의 부가물 형성이다.
사용된 염기는, 예를 들면, 트리에틸아민, 에틸-디이소프로필아민, 피리딘, N,N-디메틸아미노피리딘 또는 기타 화합물일 수 있다.
아미노산의 3번째 관능기로 사용되는 보호기는, 예를 들면, 우레탄, 알킬, 아실, 에스테르 또는 아미드형의 펩티드 화학에 있어서 공지된 보호기들이 가능하다.
본 발명에 있어서 아미노 보호기는 펩티드 화학에서 사용되는 일반적인 아미노 보호기이다.
바람직하게는, 벤질옥시카르보닐, 3,4-디메톡시벤질옥시카르보닐, 3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐, 2,4-디메톡시벤질옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, 4-니트로벤질옥시카르보닐, 2-니트로벤질옥시카르보닐, 2-니트로-4,5-디메톡시벤질옥시카르보닐, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐(Boc), 알킬옥시카르보닐, 비닐옥시카르보닐, 3,4,5-트리메톡시벤질옥시카르보닐, 프탈로일, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, 2,2,2-트리클로로-tert-부톡시카르보닐, 메틸옥시카르보닐, 4-니트로페녹시카르보닐, 플루오레닐-9-메톡시카르보닐(Fmoc), 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 피발로일, 2-클로로아세틸, 2-브로모아세틸, 2,2,2-트리플루오로아세틸, 2,2,2-트리클로로아세틸, 벤조일, 벤질, 4-클로로벤조일, 4-브로모벤조일, 4-니트로벤조일, 프탈이미도, 이소발레로일 또는 벤질옥시메틸렌, 4-니트로벤질, 2,4-디니트로벤질, 4-니트로페닐 또는 2-니트로페닐술페닐이 포함된다.
바람직한 카르복실 보호기는 직쇄 또는 분지쇄의 C1내지 C4-알킬 에스테르이다.
적절한 반응 단계, 예를 들면, 산 또는 염기의 반응에 의해서 다른 방식으로는 가수소 첨가 분해적으로 또는 보호호기의 제거를 수행할 수 있다.
시험관내 및 생체내 모두에서, 본 발명에 따른 당결합체는 비 악성 세포에 대한 뛰어난 선택성과 함께 다양한 종양, 특히 폐, 유방, 췌장, 흑색종 및 대장 종양에 대하여 매우 강한 항종양 활성을 갖는다.
따라서, 이들은 사람 및 수의학적 약제 모두에 있어서 특이적인 암 질환의 치료에 적절하다.
본 발명은 비독성, 불활성인 약제학적으로 적절한 부형제에 추가하여 1종 이상의 본 발명에 따른 화합물을 포함하거나, 본 발명에 따른 1종 이상의 활성 화합물로 구성된 약제학적 제제 및 그의 제조 방법을 포함한다.
활성 화합물은 상기 정의된 1종 이상의 부형제에 임의로 존재할 수 있고, 또한 미세캡슐화된 형태로 존재할 수도 있다.
치료학적 활성 화합물은 상기 언급된 약제학적 제제 중 총 혼합물의 대략 0.1 내지 99.5 중량%, 바람직하게는 대략 0.5 내지 95 중량%의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물과는 별도로, 상기 언급된 약제학적 제제는 약제학적으로 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 사람 및 수의학적 약제 모두에 있어서 본 발명에 따른 활성 화합물을 체중의 kg 당 대략 0.5 내지 대략 500 mg, 바람직하게는 5 내지 100 mg의 총량으로 매 24시간 마다 투여하고, 적절한 경우 수차례 개별적인 복용의 형태로 투여하는 것이 목적하는 결과를 얻는데 유리한 것으로 증명되었다. 개별적인 복용량은 본 발명에 따른 활성 화합물(들)을 바람직하게는 체중의 kg 당 대략 1 내지 80 mg, 특히 3 내지 30 mg을 함유한다.
생물학적 시험
1. 세포독성 특성을 결정하기 위한 성장 억제 시험
사람의 대장 세포주 SW480 및 HT29(ATCC 번호 CCL228 및 HBT38) 및 마우스의 흑색종 세포주 B16F10(CRL6475)를 10% FCS를 첨가한 RPMI 1640 매질 중 Roux 용기에서 생육시켰다. 이들을 트립신처리하고, SW480 및 HT29은 50,000 세포/ml로, B16F10은 20,000 세포/ml의 세포수로 RPMI + 10% FCS에 용해시켰다. 100 μl의 세포 현탁액/웰을 96 마이크로웰 판에 가하고 37℃로 1일 동안 CO2배양기 중에서 배양하였다. 추가로 100 μl의 RPMI 매질 및 시험 물질을 함유한 1 μl의 DMSO를 가했다. 6일 후 성장을 검사했다. 이를 위해 물 ml 당 5 mg의 출발 농도를 갖는 25 μl의 MTT 용액(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)를 각 마이크로웰에 가했다. 배양은 37℃로 5시간 동안 CO2배양기 중에서 수행하였다. 매질을 흡입 제거하고 100 μl의 i-프로판올/웰을 가했다. 100 μl의 물을 사용하여 30분 동안 교반한 후, 멀티플레이트 판독기(바이오..) 3550UV를 사용하여 595 nm에서 흡광을 측정하였다.
SW480 및 HT29 및 B16F10 세포주 각각에 대하여 IC50값으로 세포독성 작용을 표1에 나타내었다.
실시예 IC50/nM SW480 IC50/nM HT29 IC50/nM B16F10
20(S)-캄프토테신 10 5 20
실시예 1 70 40 200
실시예 2 100 40 300
실시예 3 100 20 500
실시예 4 100 20 500
실시예 5 80 50 200
실시예 6 60 30 300
실시예 7 80 30 20
실시예 8 200 100 800
실시예 9 200 70 400
실시예 10 100 50 300
2. 기본 활성 화합물과 비교한 당결합체의 조혈 활성.
물질 및 방법
골수 세포를 마우스의 대퇴골로부터 세척해냈다. 105개의 세포를 37℃ 및 7%의 CO2로 재조합 쥐의 GN-CSF(G효소; 간세포 군체 형성) 및 물질(10-4내지 100 μg/ml)과 함께 McCoy 매질(0.3% 아가)에서 배양하였다. 7일 후, 군체(〈50 세포) 및 클러스터(17 내지 50 세포)가 측정되었다.
결과
표2에 나타낸 바와 같이, 조사된 당결합체는 기본 활성 화합물과 비교하여 골수 세포증식의 억제를 현저하게 감소시킴을 나타냈다.
마우스 골수 간세포의 CSF-유도된 증식의 억제
IC50[ng/ml]
20(S)-캄프토테신 0.05
실시예 1 15
실시예 2 30
실시예 3 15
실시예 4 15
실시예 5 20
실시예 6 10
실시예 7 8
실시예 8 45
실시예 9 15
실시예 10 30
3. 누드 마우스 모델에 있어서 종양 성장의 생체내 억제
물질
종양 성장의 억제 조사를 위한 생체내 실험을 위하여, 무흉선 누드 마우스(NMRI nu/nu 균주)가 사용되었다. 선택된 거대-세포 암종 LXFL 529를 누드 마우스에 있어서 연속적인 통과에 의해 성장시켰다. 사람의 종양 기원은 동위효소적 및 면역조직화학적 방법에 의해 확인되었다.
실험 구성
6 내지 8주 된 작은 nu/nu 누드 마우스의 양 옆구리에 종양을 피하 이식하였다. 배가시간에 따라서, 종양의 직경이 5 내지 7 mm에 도달하면 치료를 개시하였다. 마우스를 무작위로 치료군과 표준군(8 내지 10개의 평가가능한 종양을 갖는, 군당 5마리의 마우스). 표준군의 각 종양은 모두 점진적으로 성장하였다.
종양의 크기는 슬라이드 게이지에 의해 2차원으로 측정되었다. 세포수와 잘 상관되는 종양의 용적은 모든 평가에서 사용되었다. 용적은 공식 "길이 x 폭 x 폭/2"에 따라 계산되었다([a x b2]/2, a 및 b는 직각에서의 직경을 나타냄).
상대 종양 부피(RTV)의 값은 X일에서의 종양크기를 0일(무작위 분류시점)에서 종양크기로 나눔으로써 각 개별 종양에 대해서 계산하였다. RTV의 평균값은 평가에 추가로 사용되었다.
종양 부피의 억제(시험군/표준군 x 100의 상대 종양 부피, 백분율에 의한 T/C)는 최종 측정값이었다.
치료
화합물의 투여는, 예를 들면, 무작위 분류 후 0, 1 및 2일에 정맥내로 투여하며, 1일당 총 복용량은 2회 투여로 분할되었다.
결과
본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 당결합체의 치료적 효능은 거대-세포인 사람의 폐종양 이식편 LXFL 529를 예로서 나타냈다. 최대 허용가능한 복용량(MTD) 및 1/2 MTD에서의 경우, 치료는 현저한 종양의 완화로 완료되었다. 또한 기타 종양에서도 뛰어난 작용이 설명될 수 있다.
치료 복용량[mg/kg/day] 생존시간[일수] 종양의 수 opt. T/C[%] 7일차 상대 체중 [0일차의 %]
표준 - 7 〉28〉28 〉28〉28 8 100 104
실시예 1 16 〉28 〉28〉28 〉28〉28 10 0 (28일차) 95
실시예 1 8 0 〉28〉28 〉28〉28 8 0 (14일차) 95
실시예 2 32 〉28 〉28〉28 201 8 0 (21일차) 98
실시예 2 16 〉28 〉28〉28 〉28〉28 8 3.3(28일차) 103
16 내지 8 mg/kg의 복용량에 있어서 실시예 1로부터의 화합물의 장기간 지속되는 완전한 완화 및 작용의 복용량-의존성은 1 내지 3회 정맥내 투여하는 치료 일정을 사용하여 도1의 추가 실험으로 나타냈다.
4. 가수분해 안정성
본 발명에 따른 실시예 1, 2, 8 및 9의 화합물은 물에 용해되고, 실온으로 24시간 동안 방치한 후, 이들은 면적 백분율에 따른 HPLC에서 1% 미만의 캄프토테신 방출을 현저하게 나타냈다.
10 μM의 실시예 1 및 2의 화합물은 10% FCS가 가해진 RPMI 매질 및 PBS 완충액 중 30% 농도의 사람의 온전한 혈액에 용해되고, 24시간 동안 방치후 단지 5% 미만의 캄프토테신 방출이 발생하였다.
방법
HPLC 시스템 Hewlett Packard HP 1050
칼럼 : Nucleosil 120-5C 18 250 mm x 4 mm(Macherey ＆ Nagel; 독일)
용출액 : A : 물 중 0.01 M KH2PO4(H2= Milli-pore급)
B : 80% 아세토니트릴/ 20% 용출액 A
유속 : 1.2 ml
구배 : t0: 20% B 내지 t40: 100% B
t45: 100% 내지 t47: 20% B
검출 : 240 nm 또는 370 nm
5. 락톤 안정화
본 발명에 따른 실시예 1, 2, 8 및 9의 당결합체는 80%의 물 및 20%의 아세토니트릴에 용해되고, 2당량의 수산화 나트륨 용액을 사용하여 pH 9로 조정되었다. 실온으로 1시간 동안 방치한 후, 락톤 개환은 5% 미만이었다(상기 방법에 따른 검출).
탄수화물 출발 물질
I) p-아미노페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드
I.a) p-니트로페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드
300 ml의 순수한 메탄올 중 6 g (21 mmol)의 p-니트로페닐-β-L-푸코피라노시드를 7.84 g (31.5 mmol)의 디부틸주석 옥시드로 처리하고 2시간 동안 환류하였다. 혼합물을 농축하고, 잔사를 건조시켜 300 ml의 DMF로 취했다. 15.7 ml의 메틸 요오드를 가한 후, 배치를 70℃로 40시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고 잔사를 300 ml의 디클로로메탄에 취했다. 현탁액을 여과하고, 잔류용액을 다시 농축시켜 섬광 크로마토그래피 (디클로로메탄/메탄올 99:1). 농축 후, 3.82 g (6 1 %)의 목적 생성물을 얻었다.
I) p-아미노페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드
3.81 g (12.73 mmol)의 p-니트로페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드를 메탄올에 용해시키고, 이산화 백금을 가한 후, 약간 과압하에 수소분위기에서 수소화하였다. 촉매를 여과하고 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 3 g (88%)의 목적 생성물을 얻었다. [TLC: 디클로로메탄/메탄올 9:1 Rf = 0.53].
펩티딜-캄프토테신 출발 물질
II) 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L/D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
II)L 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L-류실)-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
II)D 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트:
II.a) 20(S)-20-O-[N-(tert-부톡시카르보닐)-L/D-류실]-캄프토테신
250 ml의 순수한 디메틸포름아미드 중 1O g (28.7 mmol)의 20(S)-캄프토테신 현탁액을 11.1 g (43 mmol)의 N-(tert-부톡시카르보닐)-류신-N-카르복실산 무수물 1 g의 4-(N,N-디메틸아미노)-피리딘과 교반하며 처리하였다. 16시간 동안 실온으로 초음파조에서 처리한 후, 3.7 g의 N-(tert-부톡시카르보닐)-류신-N-카르복실산 무수물을 추가로 가하고, 혼합물을 실온으로 2시간 동안 추가로 방치하였다. 잔사로부터 용해되지 않은 캄프토테신 및 여액을 분리하고 진공에서 농축하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피하여 정제하였다[석유 에테르/에틸 아세테이트 1:1 -〉 1:4]. 13.55 g (84%)의 목적 화합물 IIa)을 얻었다. [TLC: 아세토니트릴 Rf = 0.47].
II.b) 20(S)-20-O-L/D-류실-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
H.b)L 20(S)-20-O-L-류실-캄프토테신, 트리플루오아세테이트
H.b)D 20(S)-20-O-D-류실-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
100 ml의 디클로로메탄 및 40 ml의 무수 트리플루오로아세트산의 혼합물 중 화합물 II.a (13.55 g, 24.1 mmol)의 용액을 실온으로 3분 동안 교반하였다. 진공에서 작은 용적으로 농축한 후, 생성물을 디에틸 에테르로 침전시키고 디에틸 에테르로 완전히 세척하였다. Rf 값이 0.4 및 0.32인 2종류의 점이 박층 크로마토그램에서 검출되었다(아세토니트릴/물 20:1) [수율: 9.5 g (68%)]. 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 수차례 침전시킴으로써, 혼합물을 2종의 개별 성분 II.b) L 및 II.b) D로 분리할 수 있다.1H-NMR 스펙트럼이 약간 다른 두 형태는 디아스테레오머인 것으로 판명되었다.
극성 디아스테레오머
400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD3OD 1:1): δ s C-H (B-고리) 8.63 ppm
s C-H (D 고리) 7.4 ppm
비-극성 디아스테레오머
400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD3OD 1:1): δ s C-H (B-고리) 8.60 ppm
s C-H (D 고리) 7.32 ppm
추가의 단계에서, 두 형태의 혼합물 또는 정제된 디아스테레오머적으로 순수한 형태가 사용될 수 있다.
II.c) 20(S)-20-O-[Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이실-L/D-류실]-캄프토테신
II.c)L 20(S)-20-O-[Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이실-L-류실]-캄프토테신
II.c)D 20(S)-20-O-[Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이실-D-류실]-캄프토테신
25.6 g (54.6 mmol)의 [Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이신 및 11.1 g (82 mmol)의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물을 500 ml의 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 12.6 g (1.2 당량)의 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염을 가한 후, 혼합물을 실온으로 1시간 동안 교반하였다. 화합물 II.b (26.2 g, 0.83 당량) 및 7.83 ml (1 당량)의 에틸디이소프로필아민을 가하고, 배치를 실온으로 16시간 동안 추가로 교반하였다. 진공에서 농축하고, 섬광 크로마토그래피[석유 에테르/에틸 아세테이트 1:2 -〉 에틸 아세테이트]로 정제하여, 목적 화합물 (43.5 g, 87%)을 얻었다[TLC: 아세토니트릴 Rf = 0.44].
추가의 실시예도 마찬가지로, 배치는 II.b 중 정제된, 디아스테레오머적으로 순수한 각 형태와 완전히 유사하게 수행될 수 있다.
II) 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L/D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
II)L 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
II)D 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
화합물 II.c (43.3 g, 47.5 mmol)을 150 ml의 디클로로메탄으로 취하고 50 ml의 무수 트리플루오로아세트산으로 처리했다. 생성된 용액을 실온으로 1시간 동안 교반하였다. 진공에서 작은 용적으로 농축하고, 디에틸 에테르를 가하여 생성물을 침전시켰다. 39.4 g (90%)의 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물 1O:1 Rf = 0.35].
III) 20(S)-20-(L-히스티딜-L/D-발릴)-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
III.a) 20(S)-20-O-[N-tert-부톡시카르보닐)-L/D-발릴)-캄프토테신
500 ml의 순수한 디메틸포름아미드 중 1O g (28.7 mmol)의 20(S)-캄프토테신의 현탁액을 21.5 g (3 당량)의 N-(tert-부톡시카르보닐)-발린-N-카르복실산 무수물 및 1 g의 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘으로 교반하며 처리하였다. 16시간 동안 실온으로 초음파조에서 처리한 후, 용해되지 않은 캄프토테신 잔사를 분리하고 여액을 진공에서 농축하였다. 섬광 크로마토그래피 [석유 에테르/에틸 아세테이트 1:3 -〉 에틸 아세테이트]하여 잔사를 정제하였다. 11.65 g (73%)의 목적 화합물을 얻었다. [TLC: 아세토니트릴 Rf = 0.44]. 유사한 반응을 디메틸포름아미드 대신 디클로로메탄의 조건하에 환류하는 경우, L 배열의 발린 단위를 사용하는 디아스테레오머의 형성이 크게 유리하였다.
Ill.b) 20(S)-20-O-L/D-발릴-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
III.b)L 20(S)-20-O-L-발릴-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
III.b)D 20(S)-20-O-D-발릴-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
100 ml의 디클로로메탄 및 100 ml의 무수 트리플루오로아세트산의 혼합물 중 화합물 III.a (11.65 g, 21 mmol)의 용액을 실온으로 1시간 동안 교반하였다. 진공에서 작은 용적으로 농축시킨 후, 생성물을 디에틸 에테르로 침전시키고, 디에틸 에테르로 완전히 세척하였다. 생성물을 다시 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 침전시키고, 디아스테레오머의 형태의 혼합물로서 단리시켰다. 수율: 10.9 g (92%) [TLC: 아세토니트릴/물 20:1 Rf = 0.31 및 0.39]. L-배열의 발린 단위를 갖는 비-극성 디아스테레오머를 보다 잘 정제하는 것은 메탄올로부터의 결정화에 의한 본 단계로 가능하다. 8 g의 비-극성 디아스테레오머가 풍부한 생성물을 80 ml의 메탄올에 용해시키고, O℃로 냉각시키고 1O ml 단계로 디에틸 에테르를 사용하여 처리하였다. 총 60 ml의 디에틸 에테르를 가한 후, 침전된 생성물을 흡입을 사용하여 여과하고 건조시켰다. 4.6 g (58%)의 순수한 L-배열의 발린 단위를 갖는 비-극성 디아스테레오머를 얻었다. 디에틸 에테르를 사용한 모액의 침전은 730 mg (9%)의 디아스테레오머 비율이 1:18인 생성물 분획을 추가로 얻게하였다.
추가 반응에서, 디아스테레오머 혼합물 및 정제된 비-극성 또는 극성 디아스테레오머 모두를 사용할 수 있다. 반응은 완전히 유사하게 진행된다.
III.c) 20(S)-20-O-[N-tert-부톡시카르보닐)-L-히스티딜-L/D-발릴]-캄프토테신
III.c)L 20(S)-20-O-[N-tert-부톡시카르보닐)-L-히스티딜-L-발릴]-캄프토테신
III.c)D 20(S)-20-O-[N-tert-부톡시카르보닐)-L-히스티딜-D-발릴]-캄프토테신
5.95 g (23.3 mmol)의 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-히스티딘 및 4.73 g의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물을 200 ml의 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 5.38 g의 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염을 가한 후, 혼합물을 실온으로 1시간 동안 교반하였다. 화합물 III.b (10.9 g, 19.44 mmol) 및 6.7 ml의 에틸-디이소프로필아민을 가한 후, 배치를 실온으로 16시간 동안 추가로 교반하였다. 진공에서 농축하고 섬광 크로마토그래피 [아세토니트릴/물 50:1 -〉 20:1]로 정제하여, 즉시 추가 반응하는 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물 10:1 Rf = 0.42].
III) 20(S)-20-O-(L-히스티딜-L/D-발릴)-캄프토테신, 비스-트리플루오로아세테이트
III)L 20(S)-20-O-(L-히스티딜-L-발릴)-캄프토테신, 비스-트리플루오로아세테이트
III)D 20(S)-20-O-(L-히스티딜-D-발릴)-캄프토테신, 비스-트리플루오로아세테이트
화합물 III.c를 100 ml의 디클로로메탄으로 취하고 50 ml의 무수 트리플루오로아세트산으로 처리했다. 생성된 용액을 실온으로 30분 동안 교반하였다. 진공에서 작은 용적으로 농축하고, 디에틸 에테르를 가하여 생성물을 침전시켰다. 13.05 g (83%)의 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.2].
IV) 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-D-라이실-L/D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
IV)L 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-D-라이실-L-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트:
IV)D 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-D-라이실-D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트:
이 화합물의 합성은 디아스테레오머 화합물 II와 완전히 유사하게 수행되었다. II.c 단계에서, Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이신 대신 상응하는 D 이성체가 사용된다[TLC: 아세토니트릴/물 10:1 Rf = 0.4].
V) 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-오르니틸-L/D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
V)L 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-오르니틸-L-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
V)D 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-오르니틸-D-류실}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
이 화합물의 합성은 상응하는 라이신 화합물 II와 완전히 유사하게 수행되었다. 단계 II.c에서, Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이신 대신 Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐9-메톡시카르보닐)-L-오르니틴을 사용하였다[TLC: 아세토니트릴/물 20:1 Rf = 0.125].
VI) 20(S)-20-O-(L-아르기닐-L/D-류실)-캄프토테신, 트리-트리플루오로아세테이트
VI)L 20(S)-20-O-{L-아르기닐-L-류실}-캄프토테신, 트리-트리플루오로아세테이트
VI)D 20(S)-20-O-{L-아르기닐-D-류실}-캄프토테신, 트리-트리플루오로아세테이트
VI.a) 20(S)-20-O-(트리-tert-부톡시카르보닐-L-아르기닐-L/D-류실)-캄프토테신
VI.a)L 20(S)-20-O-{트리-tert-부톡시카르보닐-L-아르기닐-L-류실}-캄프토테신
VI.a)D 20(S)-20-O-{트리-tert-부톡시카르보닐-L-아르기닐-D-류실}-캄프토테신
200 mg (0.42 mmol)의 트리-tert-부톡시카르보닐-L-아르기닌 및 80 mg의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물을 20 ml의 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 97 mg의 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염을 가한 후, 혼합물을 실온으로 1시간 동안 교반하였다. 화합물 II.b (200 mg, 0.35 mmol) 및 217 μl의 에틸-디이소프로필아민을 가한 후, 배치를 실온으로 3시간 동안 추가로 교반하였다. 진공에서 농축하고 물로 처리한 후, 즉시 추가로 반응하는 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물 5:1:0.2 Rf = 0.77].
VI) 20(S)-20-O-{L-아르기닐-L/D-류실}-캄프토테신, 트리-트리플루오로아세테이트
VI)L 20(S)-20-O-{L-아르기닐-L-류실}-캄프토테신, 트리-트리플루오로아세테이트
VI)D 20(S)-20-O-{L-아르기닐-D-류실}-캄프토테신, 트리-트리플루오로아세테이트
0.35 mmol의 VI.a)의 화합물을 실온으로 2시간 동안 10 ml의 디클로로메탄 중 5 ml의 무수 트리플루오로아세트산과 반응시켰다. 혼합물을 농축시키고 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 2회 추출하였다. 280 mg (82%)의 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물 10:3:1.5 Rf = 0.42].
VII)L 20(S)-20-O-{Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L-발릴}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
VII.a)L 20(S)-20-O-[Nα-(tert-부톡시카르보닐)-Nε-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이실-L-발릴}-캄프토테신
10.02 g (21.4 mmol)의 N-(tert-부톡시카르보닐)-N-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)-L-라이신 및 4.4 g (32.1 mmol)의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물을 400 ml의 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 4.92 g (1.2 당량)의 N-에틸-N'(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염을 가한 후, 혼합물을 0℃로 30분 동안 교반하였다. 10 g (17.8 mmol)의 화합물 III.b의 비-극성 디아스테레오머 III.b L 및 9.2 ml (3 당량)의 에틸-디이소프로필아민을 가한 후, 혼합물을 실온으로 16시간 동안 추가로 교반하였다. 진공에서 농축시킨 후, 잔사를 500 ml의 물을 사용하여 30분 동안 교반하고 흡입하고 여과했다. 생성물을 400 ml의 디클로로메탄으로 취하고, 잔류한 물을 제거하고, 용액을 200 ml로 농축시킨 후 800 ml의 디에틸 에테르를 사용하여 침전시켰다. 잔사를 흡입하여 여과하고 디에틸 에테르로 세척하였다. 14.712 g의 목적 화합물을 얻었다 (92%) [TLC: 아세토니트릴 Rf = 0.6].
VII)L 20(S)-20-O-{N-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L-발릴}-캄프토테신, 트리플루오로아세테이트
화합물 VII.a) L (14.65 g, 16.3 mmol)을 300 ml의 디클로로메탄으로 취하고 0℃에서 50 ml의 무수 트리플루오로아세트산으로 처리하였다. 생성된 용액을 아이스-냉각하며 2시간 동안 교반하였다. 진공에서 작은 용적으로 농축한 후, 생성물을 디에틸 에테르를 가함으로써 침전시켰다. 13.8 g (93%)의 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물 1O:1 Rf = 0.35].
실시예 1
20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-라이실-L/D-류실}-캄프토테신, 염산염
1.a) 20(S)-20-O-{Nα-[O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노-티오카르보닐]-Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L/D-류실)-캄프토테신
500 ml의 1:1의 디옥산/물 중 9.82 g (36.5 mmol)의 p-아미노페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드(실시예 I) 3.94 ml의 티오포스젠 (1.4 당량)을 사용하여 교반하며 처리하였다. 10분 후, 혼합물을 4 당량의 에틸디이소프로필아민으로 처리한 후, 진공에서 농축시키고 잔사를 1시간 동안 오일 펌프 진공하에 건조시켰다. 얻은 이소티오시아네이트를 500 ml의 순수한 디메틸포름아미드에 용해시키고 30.4 g (32.8 mmol)의 화합물 II 및 22.6 ml의 에틸디이소프로필아민으로 처리하였다. 혼합물을 실온으로 16시간 동안 교반한 후, 진공에서 농축시키고 물로 처리하였다. 잔사를 섬광 크로마토그래피하여 정제하였다 [아세토니트릴 -〉 아세토니트릴/물 30:1]. 생성물을 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 재침전시키고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 28.7 g (78%)의 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물 10:1 Rf = 0.44].
1.b) 20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-라이실-L/D-류실}-캄프토테신
28.6 g (25.5 mmol)의 결합체 1.a)를 200 ml의 디메틸포름아미드 중 5 ml의 피페리딘으로 처리하였다. 실온으로 2시간 동안 교반한 후, 혼합물을 농축시키고, 잔사를 디클로로메탄으로 2회 증해하고, 디에틸 에테르를 가했다. 디메틸포름아미드/디클로로메탄으로 취하고 에테르를 사용하여 침전시켰다. 이러한 정제 과정을 2회 반복하였다. 생성물을 흡입하여 여과하고 에테르로 세척하였다. 수율: 19.5 g (85%) [TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.3].
1) 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-라이실-L/D-류실}-캄프토테신, 염산염
1O g (11.1 mmol)의 실시예 1.b의 화합물을 100 ml의 물로 취하고, 11.1 ml (1 당량)의 1N HCl 용액으로 처리 및 동결 건조하였다. 생성물을 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 수차례 침전시켰다. 수율: 9.15 g (88%) [TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.3].
실시예 2
20(S)-20-O-{N-[0-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-히스티딜-L/D-발릴}-캄프토테신, 염산염
300 ml의 디옥산/물 1:1 중 7.14 g (26.5 mmol)의 p-아미노페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드(탄수화물 출발 물질 I)의 용액을 2.86 ml의 티오포스젠 (1.4 당량)을 사용하여 교반하며 처리했다. 10분 후, 혼합물을 4 당량의 에틸디이소프로필아민으로 처리한 후, 진공에서 농축하고 잔사를 1시간 동안 오일 펌프 진공하에 건조시켰다. 얻은 이소티오시아네이트를 500 ml의 순수한 디메틸포름아미드에 용해시키고 17.45 g (22 mmol)의 화합물 III 및 22.7 ml의 에틸-디이소프로필아민으로 처리하였다. 혼합물을 실온으로 16시간 동안 교반한 후, 진공에서 농축시키고 잔사를 물로 취했다. 1N 수산화 나트륨 수용액을 사용하여 pH 7.8로 조정하고, 고체를 흡입하여 여과하였다. 고진공하에 건조한 후, 잔사를 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올으로부터 2회 재침전시키고 디에틸 에테르로 세척하였다. 17.97 g (91%)의 목적 생성물을 얻었으며, 이는 1 당량의 0.1N 염산 수용액을 사용하여 염산염으로 전환되었다[TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.36] [FAB-MS: m/e = 896 (M + H+)].
실시예 3
20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-D-라이실-D-류실}-캄프토테신, 염산염
합성은 실시예 1과 완전히 유사하게 수행하였다. 출발 물질 I 및 IV.D는 출발 화합물로 사용되고, 극성 디아스테레오머 II.b) D는 II.b 단계의 20-O-류실-캄프토테신으로부터 사용되었다. [TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.31] [FAB-MS: m/e = 901 M + H+]
실시예 4
20(S)-20-O-{Nα-[0-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-오르니틸-D-류실}-캄프토테신, 염산염
합성은 실시예 1과 완전히 유사하게 수행하였다. 출발 물질 I 및 V)D는 출발 물질로 사용되고, D-leu 배열을 갖는 극성 디아스테레오머 II.b) D는 II.b 단계의 20-O-류실-캄프토테신으로부터 사용되었다. [TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.25].
실시예 5
20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-아르기닐-D-류실}-캄프토테신
20 ml의 디옥산/물 1:1 중 73 mg (0.27 mmol)의 p-아미노페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드 (출발 물질 I)의 용액을 30 ml의 티오포스젠 (1.4 당량)을 사용하여 교반하며 처리하였다. 10분 후, 혼합물을 4 당량의 에틸디이소프로필아민으로 처리한 후, 진공에서 농축하고 잔사를 1시간 동안 오일 펌프 진공하에 건조시켰다. 얻은 이소티오시아네이트를 20 ml의 순수한 디메틸포름아미드에 용해시키고 175 mg (0.18 mmol)의 화합물 VI) D 및 620 μl의 에틸-디이소프로필아민으로 처리하였다. 화합물 VI) D의 합성을 위하여, 극성 디아스테레오머 II.b) D는 II.b 단계의 20-O-류실-캄프토테신으로부터 사용되었다. 혼합물을 실온으로 16시간 동안 교반한 후, 진공에서 농축하고 디클로로메탄으로 교반하였다. 잔사는 디에틸 에테를를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 침전시키고 디에틸 에테르로 세척하였다. 이를 디옥산/물로부터 동결 건조시킨 후, 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 다시 결정화하였다. 154 mg (90%)의 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.39] [FAB-MS: m/e = 929 M + H+].
실시예 6
20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-라이실-D-류실}-캄프토테신, 염산염
화합물은 실시예 1과 유사하게 제조되고, D-류신 배열의 극성 디아스테레오머 II.b) D는 II.b 단계의 20-O-류실-캄프토테신에서 사용된 것이었다.
별법으로, 예를 들면, 실시예 1의 화합물 또한 제조 HPLC에 의해 각각의 이성체 형태로 분리될 수 있다.
조건
분리 칼럼 : Macherey ＆ Nagel 25O x 21 mm Nucleosil 1OO-7 C18 AB
용출액 A : H20 + 0.1 M KH2PO4
용출액 B : 아세토니트릴/물 4:1 + 0.02M KH2PO4
유속 : 0 ml/min
주입 용적 : 1500 μl
구배 : 0-30% B
20-90
22-90
24-30
파장 : 215 nm
HPLC 분리 후, 상응하는 분획을 동결 건조하고 잔사를 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 수차례 침전시켰다. 혼합물을 pH 8-9로 조정하고, 잔사를 여과하고 0.1N 염산을 사용하여 염산염으로 전환하였다.
1H-NMR 스펙트럼에서, 실시예 6 및 7 중 이성체는 상이한 화학적 이동, 특히 캄프토테신 B 고리 또는 D 고리 중 방향족 H 원자의 2종의 단일선을 나타냈다.
D-류신을 사용한 디아스테레오머
400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD30D 1:1): δ s C-H (B 고리) 8.52 ppm
s C-H (D 고리) 7.42 ppm
[FAB-MS: m/e = 901 M + H+]
실시예 7
20(S)-20-O-{Nα-[0-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-라이실-L-류실}-캄프토테신, 염산염
화합물은 실시예 1과 유사하게 제조되고, L-배열의 류신을 갖는 비-극성 디아스테레오머 II.b) L은 II.b 단계의 20-O-류실-캄프토테신에서 사용된 것이었다.
별법으로, 예를 들면, 실시예 1 의 화합물은 또한 제조 HPLC에 의해 각 이성체 형태로 분리될 수 있다.
조건 : 실시예 6에 주어진 바와 같음
HPLC 분리 후, 상응하는 분획을 동결 건조하고 잔사를 디에틸 에테르를 사용하여 디클로로메탄/메탄올로부터 수차례 침전시켰다. 혼합물을 pH 8-9로 조정하고, 잔사를 여과하고, 0.1N 염산을 사용하여 염산염으로 전환시켰다.
1H-NMR 스펙트럼에서, 실시예 6 및 7 중 이성체는 상이한 화학적 이동, 특히 캄프토테신 B 고리 또는 D 고리 중 방향족 H 원자의 2종의 단일선을 나타냈다.
L-류신을 사용한 디아스테레오머
400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD30D 1:1): δ s C-H (B 고리) 8.6 ppm
s C-H (D 고리) 7.35 ppm
[FAB-MS: m/e = 901 M + H+]
실시예 8
20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-라이실-L-발릴}-캄프토테신, 염산염
화합물은 실시예 1과 유사하게 화합물 VII) L로부터 출발하여 비-극성 계열로 제조되었다.
디아스테레오머 비율은 분석 HPLC에 의해 결정되었다. 적절한 경우, L-배열의 발린을 갖는 디아스테레오머의 추가 정제를 메탄올로부터의 결정화에 의해 성취할 수 있다 (〉 20:1).
HPLC 조건
분리 칼럼 : Macherey ＆ Nagel 25O x 4 mm Nucleosil 1OO-7 C18 AB
용출액 A : H20 + 0.1 M KH2PO4
용출액 B : 아세토니트릴/물 4:1 + 0.02 M KH2PO4
유속 : 1 ml/min
주입 용적 : 15 μl
1H-NMR 스펙트럼에서, 순수한 디아스테레오머는 단지 1종의 신호 세트, 예를 들면, 캄프토테신 B 고리 또는 D 고리중 방향족 H 원자의 두 단일선만 나타냈다.
400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD30D 1:1): δ s C-H (B 고리) 8.55 ppm
s C-H (D 고리) 7.35 ppm
[FAB-MS: m/e = 887 M + H+]
실시예 8의 화합물의 합성에 있어서 별법이 마찬가지로 가능하다. 이러한 방법에서, 실시예 1의 탄수화물 단위는 우선 측쇄가 보호된 라이신 유도체에 결합된다
8a) Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이신
600 ml의 디옥산/물 1:1 중 6.8 g (25.3 mmol)의 p-아미노페닐-3-O-메틸-β-L-푸코피라노시드 (실시예 1)의 용액을 2.72 ml의 티오포스젠 (1.4 당량)을 사용하여 교반하며 처리하였다. 10분 후, 26 ml의 에틸디이소프로필아민으로 처리하고, 실온으로 5분 동안 추가로 교반한 후, 진공에서 150 ml의 용적으로 농축시켰다. 800 ml의 디클로로메탄을 가하고 상은 분리되었다. 유기상을 물로 2회 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시키고, 농축시켰다. 잔사를 200 ml의 메틸 tert-부틸 에테르 및 200 ml의 석유 에테르로 교반하고, 흡입하여 여과하였다. 7.26 g (92%)의 이소티오시아네이트를 얻었다.
2.92 g (9.4 mmol)의 얻은 이소티오시아네이트를 200 ml의 디옥산/물 1:1에 용해시키고 3.11 g (0.9 당량)의 Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-라이신 및 3.2 ml의 에틸-디이소프로필아민으로 처리하였다. 혼합물을 실온으로 16시간 동안 교반한 후, 진공에서 농축하고 잔사를 물로 취했다. 1N HCl을 사용하여 pH 2로 조정하고, 생성물을 침전시키고, 30분 후 흡입하여 여과하였다. 잔사를 디클로로메탄 중에 부유시키고 용매를 2회 증류하였다. 에테르 및 석유 에테르로 수차례 세척한 후, 5.3 g (92%)의 목적 생성물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.69].
8b) 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이실-L-발릴}-캄프토테신
1.2 g (1.76 mmol)의 Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시페닐아미노티오카르보닐]-Nε-[플루오레닐-9-메톡시카르보닐]-L-라이신 (실시예 8a) 및 675 mg (1.2 mmol)의 화합물 III.b) L을 50 ml의 디메틸포름아미드에 용해시키고, 혼합물을 O℃ 냉각시킨 후, 346 mg (1.8 mmol)의 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염으로 처리하였다. 온도를 실온으로 가열하고 하룻 밤동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시키고 잔사를 물로 교반하였다. 실리카 겔상에서 섬광 크로마토그래피하여 정제하고, 용출액으로서 아세토니트릴로 출발하여 아세토니트릴/물 50:1로 전환하였다. 상응하는 분획으로 농축시킨 후, 1.06 g (76%)의 목적 화합물을 얻었다 [TLC: 아세토니트릴/물 20:1 Rf = 0.34].
탈 차단 및 염산염으로의 전환은 실시예 1과 유사하게 수행되었다.
실시예 9
20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-히스티딜-L-발릴}-캄프토테신, 염산염
20-O-발릴-캄프토테신의 비-극성 디아스테레오머로부터 출발하여, 트리플루오로아세테이트 (III.b) L인 화합물은 실시예 2와 유사하게 제조되었다. 디아스테레오머 비율은 분석 HPLC에 의해 결정되었다. 적절한 경우, L-배열의 발린을 갖는 비-극성 디아스테레오머의 추가 정제는 메탄올 (〉 20:1)로부터의 결정화에 의해 성취될 수 있다.
HPLC 조건
분리 칼럼 : Macherey ＆ Nagel 25O x 4 mm Nucleosil 1OO-7 C18 AB
용출액 A : H20 + 0.1 M KH2PO4
용출액 B : 아세토니트릴/물 4:1 + 0.02M KH2PO4
유속 : 1 ml/min
주입 용적 : 15 μl
1H-NMR 스펙트럼에서, 순수한 디아스테레오머는 단지 1종의 신호 세트, 예를 들면, 캄프토테신 B 고리 또는 D 고리중 방향족 H 원자의 두 단일선만 나타냈다.
L-발린을 사용한 디아스테레오머
400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD30D 1:1): δ s C-H (B 고리) 8.58 ppm
(히스티딘의 CH 원자에 의해 중 첩됨)
s C-H (D 고리) 7.35 ppm
[TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.36] [FAB-MS: M/e = 896 (M + H+)].
실시예 10
20(S)-20-O-{Nα-[0-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노티오카르보닐]-L-아르기닐-L-류실}-캄프토테신
생성물은 실시예 5와 유사하게 제조되었다. 비-극성 디아스테레오머 II.b) L은 II.b) 단계의 20-O-류실-캄프토테신에서 사용된 것이다.
[TLC: 아세토니트릴/물/빙초산 5:1:0.2 Rf = 0.4] [FAB-MS: m/e = 929 M + H+].
실시예 8 및 9의 HPLC 조건하에, 실시예 5 및 10의 디아스테레오머를 구별하였다.

Claims (9)

  1. 화학식(I)의 캄프토테신 당결합체, 그의 염, 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물.
    〈화학식 I〉
    상기 식에서,
    R1은 아미노산의 입체적 요구성 비-극성 측쇄를 나타내고,
    R2는 아미노산의 염기성 측쇄를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이 4개 이하의 탄소 원자를 갖는 분지된 알킬 라디칼이고,
    R2가 화학식 -(CH2)n-R3의 라디칼(여기서, R3는이고, n은 1 내지 4의 수임)인 화학식(I)의 화합물, 그의 염, 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물.
  3. 제1항에 있어서,
    R1이 화학식의 분지된 알킬 라디칼이고,
    R2가 화학식 의 라디칼인 화학식(I)의 화합물, 그의 염, 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물.
  4. 화학식(II)의 이소티오시아네이트를 임의로는 측쇄가 보호된 화학식(III)의 펩티딜-캄프토테신과 반응시켜 화학식(IV)의 당결합체를 수득하고, 존재할 수 있는 측쇄 아미노 보호기를 통상의 방법에 따라 제거하고, 임의로는 수득된 화합물을 목적하는 염으로 전환시키는 것을 특징으로하는, 화학식(I)의 당결합체 또는 그의 염의 제조 방법.
    〈화학식 I〉
    〈화학식 II〉
    〈화학식 III〉
    〈화학식 IV〉
    상기 식에서,
    R1은 아미노산의 입체적 요구성 비-극성 측쇄를 나타내고,
    R2는 아미노산의 염기성 측쇄이고,
    R2'은 상기 언급된 염기성 라디칼 R2의 의미를 가지며 염기성 기상에 펩티드 화학에 통상적인 보호기를 가질 수 있다.
  5. 화학식(II)의 이소티오시아네이트를 임의로 적절히 보호된 화학식(V)의 말단 염기성 아미노산과 반응시켜 화학식(VI)의 아미노산 결합체를 수득한 후, 이를 화학식(VII)의 아미노산 결합체와 반응시키고, 임의로 측쇄 보호기를 제거하고, 임의로 화합물을 적절한 염으로 전환시키는 것을 특징으로하는, 화학식(I)의 화합물 또는 그의 염의 제조 방법..
    〈화학식 II〉
    〈화학식 V〉
    〈화학식 VI〉
    〈화학식 VII〉
    상기 식에서,
    R1은 제1항에 정의된 의미와 같고,
    R2'은 염기성 기가 보호될 수 있는 아미노산의 염기성 측쇄이다.
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노-티오카르보닐]-L-라이실-L-발릴}-캄프토테신 또는 그의 염.
  7. 제1항에 있어서, 하기 화학식의 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-메틸-β-L-푸코피라노실)-4-히드록시-페닐아미노-티오카르보닐]-L-히스티딜-L-발릴}-캄프토테신 또는 그의 염.
  8. 약제 생산을 위한 제1항에 따른 화학식(I)의 화합물의 용도.
  9. 제1항에 따른 화학식(I)의 화합물을 함유하는 약제.
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