CZ401799A3 - Glykokonjugáty 20(S)-camptothecinu, způsob jejich výroby, jejich použití a léčiva tyto látky obsahující - Google Patents

Abstract

Glykonjugáíy 20(S)-camptothecinu, ve kterýchje 3-Omethylovaná β-L-fruktosová stavebníjednotka připojena přes thiomočovinou modifikovaný peptidový spacer s 20- hydroxylovou skupinou derivátu camptothecinu, obecného vzorce I, ve kterémmají substituenty specifické významy. Způsob výroby těchto sloučenin ajejich použití v léčivech, obzvláště v souvislosti s rakovinnými onemocněními.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká glykokonjugátů 20(S)-camptothecinu, ve kterých je 3-0-methylovaná β-L-fruktosová stavební jednotka připojena přes thiomočovinou modifikovaný peptidový spacer s 20-hydroxylovou skupinou derivátu camptothecinu. Dále se týká způsobu výroby těchto sloučenin a jejich použití v léčivech, obzvláště v souvislosti s rakovinnými onemocněními.

Dosavadní stav techniky

20(S)-camptothecin je pentacyklický alkaloid, který byl isolován v roce 1966 Vallem a kol. (J. Am. Chem. Soc. 88, 3888 (1966)). Má vysoký protinádorový účinný potenciál v různých testech in-vitro a in-vivo, bohužel realisace nadějného potenciálu v klinické praxi ztroskotala na problémech s toxicitou a rozpustností.

Otevřením E3-kruhu laktonu a tvorbou sodné soli byla získána ve vodě rozpustná sloučenina, která je v rovnovážném stavu s formou s uzavřeným kruhem, závislém na pH .

OH « 9

Klinické studie však dosud nevedly k úspěchu.

Asi o 20 let později bylo zjištěno, že biologická aktivita se vztahuje na inhibici enzymu topoisomerasy I . Od té doby se výzkumné aktivity pro nalezení přijatelných in-vivo účinných drivátů camptothecinu opět zesílily.

Pro zlepšení rozpustnosti ve vodě byly popsány soli derivátů camptothecinu s modifikovaným A-kruhem a B-kruhem, jakož i 20-O-acyl-deriváty s ionisovatelnými skupinami (Vishnuvajjala a kol. US 4 943 579). Poslední koncept prodrugu byl později převeden také na modifikované deriváty camptothecinu (Váni a kol. VO 9602546). Popisované 20-0-acyl-prodrugy mají ovšem in-vivo velmi krátký poločas rozpadu a velmi rychle se štěpí na základní jednotku.

Podstata vynálezu

Ve VO 9631532 Al jsou popsána cukry modifikovaná cytostatika, u nichž spojení různých cytotoxický nebo cytostaticky aktivních sloučenin s například regioselektivně modifikovanými uhlohydrátovými jednotkami přes určitý spacer vede ke zlepšení nádorové selektivity. Ze zde široce popsaných kombinací uhlohydrátů, spacerů a účinných látek bylo nyní překvapivě zjištěno, že připojení v poloze 3 modifikovaných β-L-fruktosových stavebních jednotek přes thiomočovinou modifikovaný peptidový spacer, sestávající z jedné stericky náročné nepolární a jedné basické aminokyseliny, na 20-hydroxylovou skupinu 20(S)-camptothecinu vede k obzvláště výhodným konjugátům s následujícími vlastnostmi.

Esteru podobným připojením zbytku nosiče na 20-hydroxylovou skupinu se stabilisuje laktonový kruh v camptothecinové části, důležitý pro účinek.

Specielní konstelací dipeptidového spaceru mají konjugáty v extracelulárním mediu a v krvi ve srovnání s podobnými konjugáty s jinými spacery, popsanými již ve VO 9631532 ještě podstatně zlepšenou stabilitu. Obzvláště jsou konjugáty podle předloženého vynálezu stabilnější než 20-O-acyl-prodrugy camptothecinu, popsané v US 4 943 579 .

Konjugáty podle předloženého vynálezu jsou ve srovnání s podobnými konjugáty z VO 9631532 lépe rozpustné.

Konjugáty podle předloženého vynálezu vykazují invitro vysokou aktivitu proti nádorovým buněčným liniím a nádorovým xenograftům.

Konjugáty podle předloženého vynálezu vykazují in-vivo po i.v.-aplikaci excelentní terapeutickou účinnost přes mnoho dávkových stupňů vůči různým nádorům.

Mají ve srovnání s uváděným toxophorem podstatně vyšší přijatelnost a nádorovou selektivitu obzvláště se zřetelem na toxicitu vůči kostní dřeni.

Předmětem předloženého vynálezu jsou glykokonjugáty camptothecinu obecného vzorce I

ve kterém

Rl značí stericky náročný nepolární postranní řetězec aminokyseliny a

R značí basický postranní řetězec aminokyseliny, jakož i jejich soli, stereoisomery a směsi stereoisomerů.

Výhodné jsou glykokonjugáty camptothecinu obecného vzorce I , ve kterém

R1	značí	rozvětvený alkylový	zbytek s až 4	uhlíkovými
	atomy	a
R2	značí	zbytek vzorce -(Cl·^)	a v n-R , přičemž
				NH
	-3		r,—NH	X —NH, NH2
	R3	značí skupinu -NH2 ,	h N nebo	a

n značí číslo 1 až 4

Obzvláště výhodné jsou glykokonjugáty camptothecinu obecného vzorce I , ve kterém

R^J značí alkylový zbytek vzorců

CH,

CH,

CH,

CH,

CH, nebo

CH,

R² značí zbytek vzorců -(CH₂)₂~NH₂ , -(ϋΗ₂)β-ΝΗ₂ ,

-(ch₂)₄-nh₂ ,

NH

-CH/ N

NH

A, f ^neb° -<ch₂)₃-nh^ nh₂ ·

Camptothecinové stavební jednotky se mohou vyskytovat ve 20(R)-konfiguraci nebo 20(S)-konfiguraci nebo jako směs obou stereoisomerních forem, přičemž výáhodná je 20(S)-konfigurace .

aminokyseliny se mohou vyskytovat v L- nebo D-konfiguraci nebo jako směs D- a L-formy.

Výraz aminokyseliny označuje obzvláště v přírodě se vyskytující α-aminokyseliny, zahrnuje ale kromě toho také jejich homology, isomery a deriváty. Jak příklad isomerů je možno uvést enantiomery. Deriváty mohou být například aminokyseliny opatřené ochrannými skupinami.

Pod pojmem aminokyseliny se stericky náročnými po6 stranními řetězci se rozumí takové aminokyseliny, jejichž postranní řetězce mají v β-poloze nebo gama-poloze rozvětvení, jako příklady je možno uvést valin a isoleucin, popřípadě leucin.

Jako typické příklady aminokyselin s nepolárními postranními řetězci je možno uvést alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, tryptofan, fenylalanin a methionin.

Jako typické příklady aminokyselin s basickými porstranními řetězci je možno uvést lysin, arginin, histidin, ornithin a kyselinu diaminomáselnou.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu se vyskytují výhodně ve formě svých solí. Všeobecně je zde možno uvést soli s organickými nebo anorganickými kyselinami.

Ke kyselinám, které se mohou adovat, patří výhodně halogenovodíkové kyseliny, jako je například kyselina chlorovodíková a kyselina bromovodíková, obzvláště kyselina chlorovodíková, dále kyselina fosforečná, kyselina dusičná, kyselina sírová, monofunkční a bifunkční karboxylové kyseliny a hydroxykarboxylové kyseliny, jako je například kyselina octová, kyselina trifluoroctová, kyselina maleinová, kyselina malonová, kyselina šťavelová, kyselina glukonová, kyselina jantarová, kyselina fumarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina sorbová a kyselina mléčná, jakož i sulfonové kyseliny, jako je například kyselina p-toluensulfonová, kyselina 1,5-naftalendisulfonová nebo kyselina camfersulfonová.

Glykokonjugáty podle předloženého vynálezu se mohou například vyrobit spojením 20(S)-camptothecinu s aktivovaný« · • * * * » · ι · • * · · · · *···♦· • · · · « · * · ···«··· 4 · « · mi karboxylovými komponentami, které samy mohou představovat části chráněných aminokyselin, peptidů nebo uhlohydráty modifikovaných peptidů.

Výhodně se provádí výstavba glykokonjugátu sekvenčně, počínaje acylací 20(S)-camptothecinu s N-chráněnou karboxyl-aktivovanou stavební jednotkou nepolární stericky náročné aminokyseliny ve vhodném rozpouštědle, popřípadě za přítomnosti base, pomocí obvyklých metod. Potom se pomocí známých metod selektivně ochranná skupina aminoskupiny odštěpí. Dále se v případě potřeby připojí vhodně chráněná stavební jednotka basické aminokyseliny, načež se popřípadě za získání ochranné skupiny postranního řetězce na a-aminofunkci deblokuje. V závěrečném kroku se provede spojení se zbytkem uhlohydrátu převedením p-amino-fenyl-3-0-methyl-p-L-fukopyranosidu na odpovídající isothiokyanát a následujícím spojením s deblokovanou α-aminoskupinou peptidyl-camptothecinu. Popřípadě ještě přítomné ochranné skupiny postranních řetězců se odštěpí a volné aminoskupiny se popřípadě převedou na vhodnou amoniovou sůl.

Předmětem předloženého vynálezu tedy je způsob výroby glykokonjugátů obecného vzorce I

ve kterém

Rl značí stericky náročný nepolární postranní řetězec aminokyseliny a _v R značí basický postranní řetezec aminokyseliny, jakož i jejich solí, jehož podstata spočívá v tom, že se nechá reagovat isothiokyanát vzorce II

s peptidyl-camptothecinem obecného vzorce III , nesoucím popřípadě v postranním řetězci ochrannou skupinu,

ve kterém má

R^J výše uvedený význam a • · · · • * · · · · · • · · « ’ . 9

R má význam výše uvedeného basického zbytku R , který kromě toho může na basické skupině nést v chemii peptidů obvyklou ochrannou skupinu, na glykokonjugát obecného vzorce IV

O

^Och₃

9 ’ ve kterém mají R a R výše uvedený význam, a popřípadě přítomné ochranné skupiny aminoskupin postranních řetězců se pomocí obvyklých metod odstraní a získané sloučeniny se popřípadě převedou na požadované soli.

Možné je také jiné pořadí reakčních kroků při stavbě cílové sloučeniny. Tak se může také podle rovněž výhodné varianty provedení spojit p-isothiokyanáto-fenyl-3-0-methyl-p-L-fukosid také nejprve s popřípadě vhodně chráněnou terminální basickou aminokyselinou a tato stavební jednotka se potom nechá reagovat s volnou aminoskupinou konjugátu aminokyseliny z 20(S)-cymtothecinu a nepolární, stericky náročné aminokyseliny. Popřípadě přítomné ochranné skupiny postranních řetězců se odštěpí a volná aminoskupina se popřípadě převede na vhodnou amoniovou sůl • « ·

Předmětem předloženého vynálezu je tedy alternativní způsob výroby glykokonjugátů obecného vzorce I nebo jejich solí, jehož podstata spočívá v tom, že se nechá reagovat isothiokyanát vzorce II

s popřípadě vhodně chráněnou terminální basickou aminokyselinou obecného vzorce V (V) ve kterém značí R basický postranní řetězec aminokyseliny, jejíž basická skupina může být chráněná, na konjugát aminokyseliny obecného vzorce VI

COOH

R' (VI) ve kterém má R výše uvedený význam,

2’ • ·

• · · · ······· ·· tato se potom nechá reagovat s konjugátem aminokyseliny obecného vzorce VII

ve kterém má výše uvedený význam, ochranné skupiny postranních řetězců se odštěpí a získané sloučeniny se popřípadě převedou na vhodnou sůl.

Obzvláště po připojení první aminokyseliny na camptothecin mohou vznikat směsi diastereomerů. Čisté diastereomery sloučenin podle předloženého vynálezu se dají vyrobit výše uvedeným způsobem, například tak, že se po připojení první aminokyselinové stavební jednotky na camptothecin a následuj ícím odštěpení ochranných skupin diastereomery dělí vhodným způsobem. Z diastereomerně čisté mezisloučeniny se může výše popsaným způsobem vyrobit diastereomerně čistá cílová sloučenina.

Směs diastereomerů cílové sloučeniny se může také obvyklým způsobem dělit na jednotlivé diastereomery.

Reakce se mohou provádět při různých poměrech tlaků a teplot, například 0,05 až 0,2 MPa , popřípadě -3%0 °C až 100 °C , ve vhodných rozpouštědlech, jako je dimethylformamid (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichlormethan, chloroform, nižší alkoholy, acetonitril, dioxan, voda nebo směsi uvedených rozpouštědel. Zpravidla je výhodné provádět reakce v dimethylformamidu, dichlormethanu nebo ve směsi tetrahydrofuranu a dichlormethanu při teplotě místnosti a za noermálního tlaku.

Pro aktivaci karboxylových skupin přicházejí v úvahu kopulační reagencie, známé z chemie peptidů, jaké jsou například popsané v publikaci Jakubke, Jeschkeit, Aminosáuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie 1982 nebo Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993). Výhodné jsou například anhydridy karboxylových kyselin, chloridy kyselin nebo směsné anhydridy.

Dále je pro aktivaci karboxylových skupin vhodná tvorba aduktů s karbodiimidy, například N,N’-diethylkarbodiimid, N,N’-diisopropylkarbodíímid, N,N’-dicyklohexylkarbodiimid, N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethyl-karbodiimidhydrochlorid a N-cyklohexyl-N’-(2-morfolinoethyl)-karbodiimid-metho-p-sulfonát, nebo karbonylovými sloučeninami, jako je karbonyldiimidazol, nebo 1,2-oxazoliovými sloučeninami, jako je 2-ethyl-5-fenyl-l,2-oxazolium-3-sulfát a 2-terc.-butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorát, nebo acylaminosloučeninami, jako je 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolin, nebo anhydridem kyseliny propanfosfonové, nebo isobutylesterem kyseliny chlormravenčí, nebo benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-fosfonium-hexafluorofosfátem, nebo 1-hydroxybenzotriazol- nebo N-hydroxysukcinimidesterem.

Dále se mohou aminokyselinové komponenty používat také ve formě Leusscheho anhydridu.

Jako base se může například použít triethylamin, ethyl-diisopropylamin, pyridin, N,Ν-dimethylaminopyridin nebo j iné.

♦ « • · * · · • · ······· ·· ··

Jako ochranné skupiny pro třetí funkce aminokyselin se mohou použít v chemii peptidů známé ochranné skupiny, například typu urethanů, alkylů, acylů, esterů nebo amidů.

Ochranné skupiny aminoskupin jsou v rámci předloženého vynálezu v chemii peptidů obvykle používané ochranné skupiny aminoskupin.

K těmto patří výhodně benzyloxykarbonylová skupina,

3,4-dimethoxybenzyloxykarbonylová skupina, 3,5-dimethoxybenzyloxykarbonylová skupina, 2,4-dimethoxybenzyloxykarbonylová skupina, 4-ethoxybenzyloxykarbonylová skupina, 4nitrobenzyloxykarbonylová skupina, 2-nitrobenzyloxykarbonylová skupina, 2-nitro-4,5-dimethoxybenzyloxykarbonylová skupina, methoxykarbonylová skupina, ethoxykarbonylová skupina, terč.-butoxykarbonylová skupina (Boc), allyloxykarbonylová skupina, vinyloxykarbonylová skupina, 3,4,5-trimethoxybenzyloxykarbonylová skupina, ftaloylová skupina, 2,2,2-trichlorethoxykarbonylová skupina, 2,2,2-trichlor-terc.-butoxykarbonylová skupina, menthyloxykarbonylová skupina, 4-nitrofenoxykarbonylová skupina, fluorenyl-9-methoxykarbonylová skupina (Fmoc), formylová skupina, acetylová skupina, propionylová skupina, pivaloylová skupina, 2-chloracetylová skupina, 2-bromacetylová skupina, 2,2,2-trifluoracetylová skupina, 2,2,2-trichloracetylová skupina, benzoylová skupina, benzylová skupina, 4-chlorbenzoylová skupina, 4-brombenzoylová skupina, 4-nitrobenzoylová skupina, ftalimidoskupina, isovaleroylová skupina, benzyloxymethylenová skupina, 4-nitrobenzylová skupina, 2,4-dinitrobenzylová skupina, 4-nitrofenylová skupina nebo 2-nitrofenylsulfenylová skupina. Obzvláště výhodné jsou skupiny Fmoc a Boc.

Výhodné ochranné skupiny karboxylových skupin jsou lineární nebo rozvětvené až C^-alkylestery.

Odštěpování ochranných skupin v odpovídajících reakčních krocích se může provádět například pomocí kyseliny nebo base, hydrogenolyticky nebo jinak reduktivně.

Glykokonjugáty podle předloženého vynálezu vykazují jak in-vitro, tak in-vivo překvapivě silnou protinádorovou účinnost vůči různým nádorům, obzvláště vůči plicním nádorům, nádorům prsu, nádorům slinivky, melanomu a nádorům tlustého střeva, spojenou s velkou selektivitou vůči nemaligním buňkám.

Jsou tedy vhodné pro ošetření rakovinných onemocnění a sice jak v humání, tak také ve veterinární medicíně.

Předmětem předloženého vynálezu jsou také farmaceutické přípravky, které vedle netoxických, inertních a farmaceuticky vhodných nosičů obsahují jednu nebo více sloučenin podle předloženého vynálezu nebo z jedné nebo více účinných látek podle předloženého vynálezu sestávají, jakož i způsob výroby těchto přípravků.

Účinné látky podle předloženého vynálezu se mohou vyskytovat popřípadě v jedné nebo více výše uvedených nosných látek také v mikroenkapsulované formě.

Terapeuticky účinné sloučeniny by měly být ve výše uvedených farmaceutických přípravcích přítomné v koncentraci asi 0,1 až 99,5 % hmotnostních, výhodně 0,5 až 95 % hmotnostních, vztaženo na celkovou směs.

Výše uváděné farmaceutické přípravky mohou kromě • · · · · ·· · · • » · · · · ···· • ·· * 9 · 9 9 ······ • · · · ·· · · ·· · · ······· · · » » sloučenin podle předloženého vynálezu obsahovat také další farmaceutické účinné látky.

Všeobecně se jak v humání, tak také ve veterinární medicíně ukázalo jako výhodné pro dosažení požadovaných výsledků podávat účinnou látku podle předloženého vynálezu v celkovém množství asi 0,5 až asi 500 mg/kg , výhodně 5 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti za 24 hodin, popřípadě ve formě více jednotlivých dávek. Jednotlivá dávka obsahuje účinnou látku nebo účinné látky podle předloženého vynálezu výhodně v množství asi 1 až 80 mg/kg , obzvláště 3 až 30 mg/kg tělesné hmotnosti.

Biologické testy

1. Test inhibice růstu pro stanovení cytotoxických vlastností :

Humání buněčné linie tlustého střeva SV 480 a HT 29 (ATCC-Nr.CCL 228 a HBT 38) , jakož i buněčná linie myšího melanomu B16F10 (CRL 6475) se dají do Rouxovy misky do media RPMI 1640 za přídavku 10 % FCS . Potom se trypsinuje a v RPMI plus 10 % FCS se kultivuje až do počtu buněk 50000 buněk/ml pro SV 480 a HT 29 a 20000 buněk pro B16F10. Buněčná suspense se nanese na mikrotitrační desku s 96 miskami v množství 100 μΐ suspense/misku a inkubuje se po dobu jednoho dne při teplotě 37 °C pod oxidem uhličitým. Potom se přidá dalších 100 μΐ RPMI media a 1 μΐ DMSO se zkoušenými substancemi. Růst se zjišťuje po 6 dnech. K tomu se do každé misky přidá 25 μΐ roztoku MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolinbromid) s výchozí koncentrací 5 mg/ml vody. Inkubuje se po dobu 5 hodin pod oxidem uhličitým při teplotě 37 °C . Potom se medium odsaje a do každé misky se přidá 100 μΐ isopropylalkoholu. Po třicetiminutovém třepání se 100 μΐ vody se měří extinkce při 595 nm pomocí Multiplate Readeru (Bio.) 3550-UV .

Cytotoxický účinek je uveden v následující tabulce 1 jako hodnota IC^q pro buněčné linie SV 480 , HT 29 a B16F10 .

Tabulka 1

Příklad	IC50/nM SV 480	IC5„/nM HT 29	IC50/nM B16F10
20(S)-camptothecin	10	5	20
př.	1	70	40	200
v pr .	2	100	40	300
př.	3	100	20	500
Př·	4	100	20	500
př.	5	80	50	200
př.	6	60	30	300
př.	7	80	30	20
Př·	8	200	100	800
Př-	9	200	70	400
Př.	10	100	50	300

• · · · · · · • · · · ······· ·· · ·

2. Hematopoetická aktivita glykokonjugátu ve srovnání s odpovídající účinnou látkou.

Materiál a metody :

Buňky kostní dřeně se vypláchnou z femuru myší. 10$ buněk se inkubuje v mediu McCoy 5A (0,3 % agar) společně s rekombinantním muriním GM-CSF (Genzyme; Stammzellen-Kolonienbildung) a substancemi (10^-^ až 100 pg/ml) při teplotě 37 °C a Ί % oxidu uhličitého. Po 7 dnech se spočítají kolonie (< 50 buněk) a klustery (17 až 50 buněk).

Výsledky :

Jak je znázorněno v tabulce 2 , vykazují zkoušené glykokonjugáty vůči odpovídající účinné látce drasticky sníženou inhibici proliferace buněk kostní dřeně.

Tabulka ί

Inhibice CSF-indukované proliferace buněk kostní dřeně myší

Příklad	IC5Q [ng/ml]
20(S)-camptothecin	0,05
př. 1	15
př. 2	30
př. 3	15
př. 4	15
př. 5	20
př. 6	10
př. 7	8
př. 8	45
př. 9	15
př. 10	30

3. In-vivo inhibice růstu nádoru v modelu lysých myší

Materiál :

Pro všechny in-vivo-experimenty pro zkoumání inhibice růstu nádoru se použily athymické lysé myši (kmen NMRI nu/nu). Zvolený velkobuněčný plicní karcinom LXFL 529 byl vyvíjen sériovým pasážováním v lysých myších. Lidský původ nádoru byl doložen isoenzymatickými a imunohistochemickými • · metodami .

Experimentální stavba :

Nádor byl subcutáně implantován do obou slabin lysých myší nu/nu o stáří 6 až 8 týdnů. Ošetření se startuje v závislosti na době zdvojení, pokud nádory dosáhnou průměru 5 až 7 mm. Myši se přiřadí do ošetřované skupiny a kontrolní skupiny (5 myči pro skupinu s 8 až 10 vyhodnotitelnými nádory) randomisací. Jednotlivé nádory kontrolní skupiny rostou všechny progresivně.

Velikost nádorů se měří ve dvou rozměrech pomocí posuvného měřítka. Objem nádoru, který dobře koreluje s počtem buněk, se potom použije pro všechna vyhodnocení. Objem se počítá podle vzorce délka x šířka x šířka / 2 ([a x b ]/2 , přičemž a a b značí dva navzájem kolmé průměry).

Hodnoty relativního objemu nádoru (RTV) se pro každý jednotlivý nádor vypočtou dělením velikosti nádoru ve dni X velikosti nádoru ve dni 0 (doba randomisace) Střední hodnoty RTV se potom použijí pro další vyhodnocení.

Inhibice objemu nádoru (relativní objem nádoru testovaná skupina/kontrolní skupina x 100 , T/C v %) byla koncovou měřenou hodnotou.

Ošetření :

Aplikace sloučenin se provádí například ve dni 0, a 2 po randomisací intravenosně (i.v.) , přičemž celková dávka na den se rozdělí na dvě dávky.

• ·

Výsledky :

Terapeutická účinnost glykokonjugátů podle předloženého vynálezu z příkladu 1 a 2 je příkladně znázorněna na velkobuněčných humáních plicních nádorech LXFL 529 . Terapie se vede při maximálně tolerovatelné dávce (MTD) a při 1/2 MTD do kompletní až podstatné remissi nádoru. Excelentní účinek je možno demonstrovat také na jiných nádorech.

VBýsledky jsou uvedené v následující tabulce 3 • Β 99 ♦ · a · • · ·* * · A « · • 9 · · t · e *

Tabulka3

Terapie	dávka [mg/kg/ den]	doba přežití [dny]	počet nádorů	opt. T/C (%)	relativní tělesná hmotnost k 7. dni [% dne 0]
kontrola	-	7 >28 >28 >28 >28	8	100	104
1	16	>28 >28 >28 >28 >28	10	0 (den 28)	95
1	8	0 >28 >28 >28 >28	8	0 (den 14)	95
2	32	>28 >28 >28 20 1	8	0 (den 21)	98
2	16	>28 >28 >28 >28 >28	8	3,3 (den 28)	103

• ·>

• »

Dlouhotrvající kompletremise sloučeniny z příkladu 1 v oblasti dávky 16 až 8 mg/kg a závislost účinku na dávce je znázorněna v dalším experimentu s terapií ve dni 1 až 3

1. v. na obr. 1 .

4. Hydrolytická stabilita

Sloučeniny podle předloženého vynálezu z příkladu 1,

2, 8 a 9 se rozpustí ve vodě a vykazují po stání při teplotě místnosti po dobu 24 hodin v HPLC uvolňování camptothecinu podstatně pod 1 % v procentech plochy.

Při rozpuštění 10 μΜ sloučenin z příkladu 1 a 2 v RPMI-mediu plus 10 % FCS a ve 30% lidské krvi v PBS pufru dochází po čtyřiadvacetihodinovém stání k uvolňování camtothecinu pouze pod 5 % .

Metody :

HPLC System Hewlett Packard HP 1050

Sloupec :	Nucleosil 120-5 C 18 Nagel; Germany)	250 mm x 4 mm (Macherey &
Eluent :	A : 0,01 m KH2PO4 ve	vodě (H2=Mili-Pore grade)
	B : 80 % acetonitril/20 % eluent A
Tok :	1,2 ml
Gradient	' x0 ' % B - t^Q :	100 % B
	t^^ 100 % B - T4-7	: 20 % B
Detekce :	240 nm nebo 370 nm .
5. Stabilisace laktonu

Glykokonjugáty podle předloženého vynálezu z příkladů 1, 2, 8 a 9 se rozpustí ve směsi 80 % vody a 20 % aceto23 nitrilu a hodnota pH se upraví 2 ekvivalenty hydroxidu sodného na 9 . Po jednohodinovém stání při teplotě místnosti je otevření laktonového kruhu pod 5 % (detekce výše uvedenou metodou).

Příklady provedení vynálezu

Uhlohydrátový edukt

I) p-aminofenyl-3-0-methyl-p-L-fukopyranosid:

och₃

I.a) p-nitrofenyl-3-0-methyl-p-L-fukopyranosid:

6g (21mmol) p-nitrofenyl-p-L-fukopyranosidu ve 300 ml absolutního methylalkoholu se smísí se 7,48 g (31,5 mmol) dibutylcínoxidu a zahřívá se po dobu 2 hodin k varu pod zpětným chladičem. Potom se reakční směs zahustí, získaný zbytek se usuší a potom se vyjme do 300 ml dimethylformamidu. Po přídavku 15,7 ml methyljodidu se vsázka míchá po dobu 40 hodin při teplotě 70 °C , rozpouštědlo se potom ve vakuu odpaří a získaný zbytek se vyjme do 300 ml dichlormethanu. Suspense se přefiltruje, zbylý roztok se znovu odpaří a podrobí se mžikové chronatografii (dichlormethan/ methylalkohol 99 : 1). Po zahuštění se získá 3,82 g (61 %) konečného produktu.

I) p-aminofenyl-3-0-methyl-P-L-fukopyranosid:

• ·

3,81 g (12,73 mmol) p-nitrofenyl-3-0-methyl-p-L-fukopyranosidu se rozpustí v methylalkoholu a po přídavku oxidu platičitého se hydrogenuje ve vodíkové atmosféře při nepatrném přetlaku. Po odfiltrování katalysátoru a vysrážení pomocí diethyletheru se získají 3 g (88 %) cílového produktu [DC: dichlormethan/methylalkohol 9:1,

R_f = 0,53].

Peptidyl-camptothecin-edukty :

II) 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ-[fluorenyl-9-methoxykarbonyl]-L-lysyl-L/D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

II)L 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ-[fluorenyl-9-methoxykarbonyl]-L-lysyl-L-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

II)D 20 (S) -20-0- [N^eP^sz*-l°ⁿ- [ f luorenyl-9-methoxykarbonyl ] -L-lysyl-D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

II.a) 20(S)-20-0-[N-(terc-butoxykarbonyl)- -L/D-leucyl]-camptothecin

Suspense lOg (28,7 mmol) 20(S)-camtothecinu ve 250 ml absolutního dimethylformamidu se za míchání smísí s 11,1 g (43 mmol) anhydridu kyseliny N-(terc-butoxykarbonyl) -leucin-N-karboxylové as 1 g 4-(N,N-dimethylamino-pyridinu. Po šestnáctihodinovém zpracování v ultrazvukové lázni při teplotě místnosti se přidá dalších 3,7 g anhydridu kyseliny N-(terc-butoxykarbonyl)-leucin-N-karboxylové a reakční směs se ponechá další 2 hodiny při teplotě místnosti. Potom se oddělí nerozpuštěný camptothecin a filtrát se ve vakuu zahustí. Získaný zbytek se čistí pomocí mžikové chromatografie [petrolether/ethylacetát 1 : 1 —> 1 : 4].

Získá se takto 13,55 g cílové sloučeniny Ha) (84 %) [DC: acetonitril, R^ = 0,47] .

II.b) 20(S)-20-0-L/D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

II.b)L 20(S)-20-0-L-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

II.b)D 20(S)-20-0-D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

Roztok sloučeniny II.a (13,55 g, 24,1 mmol) ve směsi 100 ml dichlormethanu a 40 ml bezvodé kyseliny trifluoroctové se míchá po dobu 30 minut při teplotě místnosti. po zahuštění ve vakuu na malý objem se produkt vysráží diethyletherem a důkladně se diethyletherem promyje. Při chromatografii na tenké vrstvě (acetonitril/voda 20 : 1) je patrná dvojitá skvrna s hodnotami R_j? 0,4 a 0,32 (výtěžek 9,5 g (68 %)).

Vícenásobným srážením ze směsi dichlormethan/methylalkohol pomocí diethyletheru se může směs rozdělit na obě jednotlivé komponenty II.b)L a II.b)D . Obě formy se jeví jako diastereomery, které dávají nepatrně rozdílná ^H-NMR-spektra :

Polární diastereomer :

400-MHz-¹H-NMR(CD₂C1₂/CD₃OD 1:1):5 s C-H(B-kruh) 8,63 ppm s C-H(D-kruh) 7,4 ppm

Nepolární diastereomer :

4OO-MHz-¹H-NMR(CD₂C1₂/CD₃OD 1:1):5 s C-H(B-kruh) 8,60 ppm s C-H(D-kruh) 7,32 ppm.

V dalších stupních se může použít jak směs obou forem, • · · · tak také jednotlivé vyčištěné diastereomerně čisté formy.

II.c) 20(S)-20-0-[N^al^^a-(terč.-butoxykarbonyl)-N^eP^sil°ⁿ-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-L/D-leucyl]-camptothecin :

II.c)L 20(S)-20-0-[N^alf^a-(terč.-butoxykarbonyl)-N^eP^si^lon-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-L-leucyl]-camptothecin :

II.c)D 20 (S)-20-0- [N^alf^a- (terč . - butoxykarbonyl) -N^eP^s-*-^^on-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-D-leucyl]-camptothecin :

25,6 g (54,6 mmol) N^a-'^_^^a-(terč .-butoxykarbonyl)_N^eP^sl-*-^on-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysinu a 11,1 g (82 mmol) 1-hydroxy-lH-benzotriazolu se rozpustí v 500 ml dimethylformamidu a po přídavku 12,6 g (1,2 ekvivalentu) N-ethyl-N’-(dimethyl-aminopropyl)-karbodiimid hydrochloridu se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Potom se přidá sloučenina Il.b) (26,2 g, 0,83 ekvivalentu) a 7,83 ml (1 ekvivalent) ethyl-diisopropylaminu a reakční směs se míchá dalších 16 hodin při teplotě místnosti. Po zahuštění ve vakuu a čištění pomocí mžikové chromatografie (petrolether/ethylacetát 1 : 2 -> ethylacetát) se získá cílová sloučenina (43,5 g, 87 %) (DC : acetonitril, Rf = 0,44) .

Stejně je možno také v dalších příkladech zcela analogicky provádět také s každou s vyčištěných chromatografřeky čistých forem ve Il.b).

II) 20(S)-20-0-[N^eP^silon-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-L/D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

II)L 20(S)-20-0-[N^eP^silon-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-L-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

II) D 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát:

Sloučenina II.c) (43,3 g, 47,5 mmol) se vyjme do 150 ml dichlormrthanu a smísí se s 50 ml kyseliny trifluoroctové, načež se získaný roztok míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Po zahuštění na malý objem ve vakuu se produkt vysráží přídavkem diethyletheru, přičemž se získá 39,4 g (90 %) cílové sloučeniny (DC: acetonitril/voda 10 : 1, R_f = 0,35) .

III) 20(S)-20-0-(L-histidyl-L/D-valyl)-camptothecin, trifluoracetát :

III.a) 20(S)-20-0-[N-(terč.-butoxykarbonyl)-L/D-valyl]-camptothecin :

Suspense 10 g (28,7 mmol) 20(S)-camptothecinu v 500 ml absolutního dimethylformamidu se za míchání smísí s 21,5 g (3 ekvivalenty) anhydridu kyseliny N-(terč.-butoxy-karbonyl)-valin-N-karboxylové as 1 g 4-(N,N-dimethylamino)-pyridinu. Po 16 hodinách zpracování v ultrazvukové lázni při teplotě místnosti se oddělí zbytkový nerozpuštěný camptothecin a filtrát se ve vakuu zahustí. Získaný zbytek se čistí pomocí mžikové chromatografie (petrolether/ethylacetát 1 : 3 -> ethylacetát) , přičemž se získá 11,65 g (73 %) cílové sloučeniny (DC : acetonitril, - 0,44) . Když se • · · stejná reakce provádí namísto v dimethylformamidu v dichlormethanu za varu pod zpětným chladičem, tak je silně zvýhodněna tvorba diastereoisomeru s L-konfigurací valinové stavební jednotky.

III

III

III

b)

b)L

b)D

20(S)-20-0-L/D-valyl-camptothecin,

20(S)-20-0-L-valyl-camptothecin,

20(S)-20-0-D-valyl-camptothecin, trifluoracetát :

trifluoracetát :

trifluoracetát :

Roztok sloučeniny III.a) (11,65 g, 21 mmol) ve směsi 100 ml dichlormethanu a 100 ml bezvodé kyseliny trifluoroctové se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Po zahuštění ve vakuu na malý objem se produkt vysráží diethyletherem a dobře se diethyletherem promyje. Produkt se potom ještě vysráží ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu diethyletherem a isoluje se jako směs diastereomerních forem. Výtěžek činí 10,9 g (92 %) (DC : acetonitril/voda 20 : 1 , Rf = 0,31 a 0,39) . Vyšší vyčištění neplárního diastereomeru s L-konfigurací valinové stavební jednotky je v tomto stupni možné krystalisací z methylalkoholu :

g získaného produktu s obohaceným nepolárním diastereomerem se rozpustí v 80 ml methylalkoholu, ochladí se na teplotu 0 °C a v desetimililitrových krocích se mísí s diethyletherem. Po přídavku celkem 60 ml diethyletheru se vysrážený produkt odsaje a usuší. Získá se takto 4,6 g (58 %) čistého nepolárního diastereomeru s L-konfigurací valinových stavebních jednotek. Dodatečné sráženi matečného roztoku diethyletherem poskytne dalších 730 mg (9 %) frakce produktu s poměrem diastereomerů 1 : 18 .

V dalších reakcích se může použít jak směs diastereo• · merů, tak také vyčištěný nepolární nebo polární diastereomer. Reakce probíhají zcela analogicky.

III.c) 20(S)-20-0-[N-(terč.-butoxykarbonyl)L-histidyl-L/D-valyl]-camptothecin :

III.c)L 20(S)-20-0-[N-(terč.-butoxykarbonyl)L-histidyl-L-valyl]-camptothecin :

III.c)D 20(S)-20-O-[N-(terč.-butoxykarbonyl)L-histidyl-D-valyl]-camptothecin :

5,95 g (23,3 mmol) N-(terč.-butoxykarbonyl)-L-histidinu a 4,73 g 1-hydroxy-lH-benzotriazol hydrátu se rozpustí ve 200 ml dimethylformamidu. Po přídavku 5,38 g N-ethyl-N’-(dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochloridu se reakční směs míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, načež se přidá sloučenina Ill.b) (10,9 g, 19,44 mmol) a 6,7 ml ethyl-diisopropylamínu a směs se míchá po dobu dalších 16 hodin při teplotě místnosti. Po zahuštění ve vakuu a čištění pomocí mžikové chromatografie (acetonitril/voda 50 : 1 —> 20 : 1 se získá cílová sloučenina (DC : acetonitril/voda 10 : 1 , Rj? = 0,42) , která se nechá ihned dále reagovat.

III) 20(S)-20-0-(L-histidyl-L/D-valyl)-camptothecin, bis-trifluoracetát :

III)L 20(S)-20-0-(L-histidyl-L-valyl)-camptothecin, bis-trifluoracetát :

III)D 20(S)-20-0-(L-histidyl-D-valyl)-camptothecin, bis-trifluoracetát :

Sloučenina III.c) se vyjme do 100 ml dichlormethanu a smísí se s 50 ml bezvodé kyseliny trifluoroctové, načež se získaný roztok míchá po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Po zahuštění na malý objem ve vakuu se produkt vysráží přídavkem diethyletheru. Získá se takto 13,05 g (83 %) cílové sloučeniny (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2 , = 0,2) .

IV) 20(S)-20-0-[N^eP^silon(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-D-lysyl-L/D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát :

IV)L 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-D-lysyl-L-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát :

IV) D 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-D-lysyl-D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát :

Syntesa této sloučeniny probíhá zcela analogicky jako výroba diastereomerní sloučeniny II . Ve stupni II.c) se použije namísto N^a’*’^^a-(terč .-butoxykarbonyl)-N^eP^s^^^on-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysinu odpovídající D-isomer (DC : acetonitril/voda 10 : 1 , R^ = 0,4) .

V) 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-ornithyl-L/D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát :

V)L 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-ornithyl-L-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát :

V)D 20(S)-20-0-[N^eP^sil°ⁿ(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-ornithyl-D-leucyl]-camptothecin, trifluoracetát :

Syntesa této sloučeniny probíhá zcela analogicky jako výroba odpovídající lysinové sloučeniny II . Ve stupni II.c) se použije namísto N³^³-(terč .-butoxykarbonyl)_N^eP^sil°ⁿ_ (fluorenyl-9-methoxykarbonyl) -L-lysinu N³^³- (terč . -butoxykarbonyl) -N^eP^sϊ-*-^θη- (f luorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-ornithin (DC : acetonitril/voda 20 : 1 , = 0,125).

VI) 20(S)-20-0-(L-arginyl-L/D-leucyl)-camptothecin, tri-trifluoracetát :

VI)L 20(S)-20-0-(L-arginyl-L-leucyl)-camptothecin, tri-trifluoracetát :

VI)D 20(S)-20-0-(L-arginyl-D-leucyl)-camptothecin, tri-trifluoracetát :

VI.a) 20(S)-20-0-(tri-terc.-butoxykarbonyl-L-arginyl-L/D-leucyl)-camptothecin

VI.a)L 20(S)-20-O-(tri-terc.-butoxykarbonyl-L-arginy1-L-leucyl)-camptothecin

VI.a)D 20(S)-20-0-(tri-terc.-butoxykarbonyl-L-arginyl-D-leucyl)-camptothecin

200 mg (0,42 mmol) tri-terc.-butoxykarbonyl-L-argininu a 80 mg 1-hydroxy-lH-benzotrizol hydrátu se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu. Po přídavku 97 mg N-ethyl-N’-(dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochloridu se reakční směs míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, načež se přidá sloučenina Il.b) (200 mg, 0,35 mmol) a 217 μΐ ethyldiisopropylaminu a míchá se po dobu dalších 3 hodin při teplotě místnosti. Po zahuštění ve vakuu a zpracování • · s vodou s ezíská cílová sloučenina (DC : acetonitril/voda 5 : 1 : 0,2 , = 0,77) , která se ihned nechá dále reagovat .

VI) 20(S)-20-0-(L-arginyl-L/D-leucyl)-camptothecin, tri-trifluoracetát

VI) L 20(S)-20-0-(L-arginyl-L-leucyl)-camptothecin, tri-trifluoracetát

VI) D 20(S)-20-0-(L-arginyl-D-leucyl)-camptothecin, tri-trifluoracetát

0,35 mmol sloučeniny z VI.a) se míchá v 10 ml dichlormethanu s 5 ml bezvodé kyseliny trifluoroctové po dobu 2 hodin při teplotě místnosti, načež se reakční směs zahustí a dvakrát se vysráží ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu diethyletherem. Získá se takto 280 mg (82 %) cílové sloučeniny (DC : acetonitril/voda 10 : 3 : 1,5 ,

R_f = 0,42) .

VII) L 20(S)-20-0-[N^eP^s^l°ⁿ-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-L-valyl]-camptothecin, trifluoracetát

VII. a) L 20(S)-20-0- [N^a^^^a- (terč. - butoxykarbonyl) -N^eP^s-*-l°ⁿ-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-L-valyl]-camptothecin

10,02 g (21,4 mmol) N-(terc-butoxykarbonyl)-N-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysinu a 4,4g (32,1 mmol) 1-hydroxy-lH-benzotriazol hydrátu se rozpustí ve 400 ml dimethylformamidu a po přídavku 4,92 g (1,2 ekvivalentu) N-ethyl-N’-(dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochloridu • · · · se reakční směs míchá po dobu 30 minut při teplotě 0 °C. Potom se přidá 10 g (17,8 mmol) nepolárního diastereomeru III.b)L sloučeniny Ill.b) a 9,2 ml (3 ekvivalenty) ethyl-diisopropylaminu a reakční směs se míchá po dobu dalších 16 hodin při teplotě místnosti. Po zahuštění ve vakuu se získaný zbytek míchá po dobu 30 minut s 500 ml vody a odsaje se. Produkt se vyjme do 400 ml dichlormethanu, zbytková voda se odstraní, roztok se zakoncentruje na 200 ml a potom se vysráží 800 ml diethyletheru. Sraženina se odsaje a promyje se diethyletherem, přičemž se získá 14,712 g cílové sloučeniny (92 %) (DC : acetonitril,

R_f = 0,6).

VII)L 20(S)-20-0-[N-(fluorenyl-9-methoxykarbonyl)-L-lysyl-L-valyl]-camptothecin, trifluoracetát

Sloučenina VII.a)L (14,65 g, 16,3 mmol) se vyjme do 300 ml dichlormethanu a při teplotě 0 °C se smísí s 50 ml bezvodé kyseliny trifluoroctové, načež se získaný roztok míchá po dobu 2 hodin za chlazení ledem. po zahuštění na malý objem ve vakuu se produkt vysráží přídavkem diethyletheru. Získá se takto 13,8 g (93 %) cílové sloučeniny (DC : acetonitril/voda 10 : 1 , Rf = 0,35 ).

Příklad 1

20(S)-20-0-{N^a-^^a[0-(3-0-methyl-β-L-fukopyranosyl)-4-hydroxygeny lamino- thiokarbonyl ]-L-lysyl-L/D-leucyl}-camptothecin, hydrochlorid

1. a) 20(S)-20-0-{N^a^^^a[O-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxyfenylamino-thiokarbonyl]-N^eP^sil°ⁿ-[fluorenyl-9-methoxykarbonyl]-L-lysyl-L/D-leucyl}-camptothecin:

Roztok 9,82 g (36,5 mmol) p-aminofenyl-3-0-methyl-p-L-fukopyranosidu (příklad 1) v 500 ml směsi dioxanu a vody 1:1 se za míchání smísí se 3,94 ml thiofosgenu (1,4 ekvivalentu) . Po 10 minutách se smísí se 4 ekvivalenty ethyldiisopropylaminu, zahustí se ve vakuu a získaný zbytek se ve vakuu suší po dobu jedné hodiny za vakua olejové vývěvy. získaný isothiokyanát se rozpustí v 500 ml absolutního dimethylformamidu a smísí se se 30,4 g (32,8 mmol) sloučeniny II a se 22,6 ml ethyldiisopropylaminu. Reakční směs se míchá po dobu 16 hodin při teplotě místnosti, potom se ve vakuu zahustí a získaný zbytek se rozmíchá s vodou. Produkt se čistí pomocí mžikové chromatografie (acetonitril -> acetonitril/voda 30 : 1) . Produkt se vysráží ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu diethyletherem a potom se diethyletherem promyje. Získá se takto 28,7 g (78 %) cílového produktu (DC : acetonitril/ voda 10 : 1 , Rf = 0,44) .

1.b) 20-0-{N^alf^a[0-(3-0-methyl-β-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-lysyl-L/D-leucyl}-camptothecin :

28,6 g (25,5 mmol) konjugátu l.a) se ve 200 ml dimethylformamidu smísí s 5 ml piperidinu. Po dvouhodinovém míchání při teplotě místnosti se směs zahustí a získaný zbytek se dvakrát digeruje s dichlormethanem a potom se smísí s diethaletherem. Potom se vyjme do směsi dimethylformamidu a dichlormethanu a vysráží se diethyletherem am tento proces čištění se dvakrát opakuje. Produkt se potom odsaje a promyje se diethyletherem, přičemž se získá 19,5 g (85 %) produktu (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2 , R^ = 0,3) .

1) 20(S)-20-0-{N^a^^^a[0-(3-O-methyl-β-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-lysyl-L/D-leucyl}-camptothecin, hydrochlorid :

g (11,1 mmol) sloučeniny z příkladu l.b) se vyjkme do 100 ml vody, smísí se s 11,1 ml (1 ekvivalent)

N kyseliny chlorovodíkové a lyofilisuje se, načež se produkt několikrát vysráží diethyletherem ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu. Výtěžek činí 9,15 g (88 %) (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2,

R_f = 0,3) .

Příklad 2

20(S)-20-0-{N-[0-(3-0-methyl-β-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-histidyl-L/D-valyl}-camptothecin, hydrochlorid :

O

Roztok 7,14 g (26,5 mmol) p-aminofenyl-3-0-methyl-p-L-fukopyranosidu (uhlohydrátový edukt) ve 300 ml směsi dioxanu a vody 1 : 1 se za míchání smísí se 2,86 ml thiofosgenu (1,4 ekvivalentu) , po 10 minutách se smísí se 4 ekvivalenty ethyldiisopropylaminu, potom se zahustí ve vakuu a získaný zbytek se suší po dobu jedné hodiny za vakua olejové vývěvy. Získaný isothiokyanát se rozpustí v 500 ml absolutního dimethylformamidu a smísí se se 17,45 g (22 mmol) sloučeniny III , jakož i se 22,7 ml ethyl-díisopropylaminu. Reakční směs se míchá po dobu 16 hodin při teplotě místnosti, potom se zahustí ve vakuu a získaný zbytek se vyjme do vody. Hodnota pH se potom upraví pomocí 1 N vodného hydroxidu sodného na 7,8 a produkt se odsaje. Získaný zbytek se po sušení za vysokého vakua dvakrát přesráží diethyletherem ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu a promyje se diethyletherem. Získá se takto 17,97 g (91 %) cílového produktu, který se potom převede pomocí 1 ekvivalentu 0,1 N vodné kyseliny chlorovodíkové na hydrochlorid (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2 , R_f = 0,36) (FAB-MS : m/z = 896 (M+H⁺)).

• ·

Příklad 3

20(S)-20-0-{N^al^^a-[O-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbony1]-D-lysyl-D-leucyl}-camptothecin, hydrochlorid:

HC1 H₂N

Syntesa se provádí zcela analogicky jako je popsáno v příkladě 1 , přičemž se vychází z eduktů I a IV.)D a od stupně 20-0-leucyl-camptothecinu II.b) se použije polární diastereomer II.b)D . (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5:1:0,2, = 0,31) (FAB-MS . m/z = 901 = m +

H⁺).

Příklad 4 (S)-20-0 - {N³·!^^a- [0- (3-0-methyl-P-L-fukopyranosyl) -4-hydroxy-fenylamino-thiokarbony1]-L-ornithyl-D-leucyl}-camptothecin, hydrochlorid:

• · · • · · · · * · · * ·· ·· · · · tu • · · · · · · • · · «·····« · · ··

Syntesa se provádí zcela analogicky jako je popsáno v příkladě 1 , přičemž se vychází z eduktů I a V.)D a od stupně 20-0-leucyl-camptothecinu II.b) se použije polární diastereomer II.b)D s D-Leu-konfigurací . (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2 , = 0,25) .

Příklad 5 (S)-20-0- {N^a^^a- [0- (3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl) -4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-arginyl-D-leucyl}-camptothecin ;

NH₂ «* »· * » « <

• · *· « · · « · • « · « · · · · » < • ι « » « »

Roztok 73 mg (0,27 mmol) p-aminofenyl-3-0-methyl-β-L-fukopyranosidu (edukt I) ve 20 ml směsi dioxanu a vody 1 : 1 se za míchání smísí se 30 μΐ thiofosgenu (1,4 ekvivalentu). Po 10 minutách se smísí se 4 ekvivalenty ethyldiisopropylaminu, reakční směs se ve vakuu zahustí a získaný zbytek se za vakua olejové vývěvy suší po dobu jedné hodiny. Získaný isothiokyanát se rozpustí ve 20 ml absolutního dimethylformamidu a smísí se se 175 mg (0,18 mmol) sloučeniny VI.)D a 620 μΐ ethyldiisopropylaminu.

Pro syntesu sloučeniny VI.)D se zde použil od stupně 20-0-leucyl-camptothecinu Il.b) polární diastereomer II.b)D. Reakční směs se míchá po dobu 16 hodin při teplotě místnosti, potom se ve vakuu zahustí a získaný zbytek se rozmíchá s dichlormethanem. Tento se potom vysráží diethyletherem ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu a sraženina se promyje diethyletherem. Potom se lyofilisuje ze směsi dioxanu a vody a znovu se krystalisuje ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu pomocí diethyletheru. Získá se takto 154 mg (90 %) cílového produktu (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2 , Rf = 0,39) (FAB-MS : m/z = 929 = M+H⁺).

Příklad 6

20(S)-20-0-{N^al^^a-[0-(3-0-methyl-β-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-lysyl-D-leucyl}-camptothecin, hydrochlorid ;

♦ ·

Syntesa se provádí zcela analogicky jako je popsáno v příkladě 1 , přičemž se od stupně 20-O-leucyl-camptothecinu Il.b) použije polární diastereomer II.b)D s D-Leu-konfigurací .

Alternativně se může sloučenina z příkladu 1 například rozdělit také pomocí preparativní HPLC na jednotlivé isomerní formy.

Podmínky :

Dělící sloupec : Macherey & Nagel 250 x 21 mm Nucleosil 100-7 C 18 AB

Pohyblivá fáze A : H₂0 + 0,1 M KH₂PO4

Pohyblivá fáze B : acetonitril/voda 4 : 1 + 0,02 M KH₂PO4

Tok : 10 ml/min

Inj.-objem : 1500 μΐ

Gradient : 0 až 30 % B až 30 • ·

20	až	90
22	až	90
24	až	30
Vlnová délka :	215	nm

Po HPLC-dělení se odpovídající frakce lyofilisují a zbytek se potom několikrát sráží ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu diethyletherem. Potom se nastaví hodnota pH na 8 až 9 , přefiltruje se a zbytek se převede pomocí 0,1 N kyseliny chlorovodíkové na hydrochlorid.

V ^H-NMR-spektru vykazují isomery z příkladů 6 a 7 různé chemické posuny, obzvláště pro oba singuletty aromatických H-atomů v camtothecin-B-kruhu, popřípadě D-kruhu.

Diastereomer s D-leucinem :

400-MHz-¹H-NMR(CD₂C1₂/CD₃OD 1:1):δ s C-H(B-kruh) 8,52 ppm s C-H(D-kruh) 7,42 ppm (FAB-MS : m/z = 901 = M+H⁺) .

Příklad 7

20(S)-20-0-{N^a^^^a-[0-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbony1]-L-lysyl-L-leucyl}-camptothecin, hydrochlorid :

• ·

Syntesa se provádí analogicky jako je popsáno v příkladě 1 , přičemž se od stupně 20-0-leucyl-camptothecinu Il.b) použije nepolární diastereomer II.b)L s L-Leu-konfigurací .

Alternativně se může sloučenina z příkladu 1 například rozdělit také pomocí preparativní HPLC na jednotlivé isomerní formy.

Podmínky jsou stejné, jaké jsou uvedené v příkladě 6.

Po HPLC-dělení se odpovídající frakce lyofilisují a zbytek se potom několikrát sráží ze směsi dichlormethanu a methylalkoholu diethyletherem. Potom se nastaví hodnota pH na 8 až 9 , přefiltruje se a zbytek se převede pomocí 0,1 N kyseliny chlorovodíkové na hydrochlorid.

V ^H-NMR-spektru vykazují isomery z příkladů 6 a 7 různé chemické posuny, obzvláště pro oba singuletty aromatických H-atomů v camtothecin-B-kruhu, popřípadě D-kruhu.

« ·

Diastereomer s L-leucinem :

400-MHz-¹H-NMR(CD₂C1₂/CD₃OD 1:1):5 s C-H(B-kruh) 8,6 ppm s C-H(D-kruh) 7,35 ppm (FAB-MS : m/z = 901 = M+H⁺)

Příklad 8

20(S)-20-0-{N^a^^^a-[0-(3-0-methyl-P~L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbony1]-L-lysyl-L-valyl}-camptothecin, hydrochlorid :

Sloučenina se vyrobí v nepolární sérii, když se vychází ze sloučeniny VII)L , analogicky jako je popsáno v příkladě 1 .

Poměr diastereomerů se může zjistit analytickou HPLC. Další čištění diastereomerů s L-konfigurací valinu (>

: 1) je možno dosáhnout popřípadě krystalisací z methyl• * • · · · • · · · · • · · · β · · ·

alkoholu.
Podmínky HPLC :
Dělící sloupec :	Macherey & Nagel 250 x 4 mm Nucleosil 100-7 C 18 AB
Pohyblivá fáze A	: H20 + 0,1 M KH2PO4
Pohyblivá fáze B Tok : 1 ml/min	: acetonitril/voda 4:1+ 0,02 M KH2PO4
Inj.-obj em : 15	μ1·

V ^H-NMR-spektru vykazuje čistý diastereomer pouze sadu signálů, například pro oba sínguletty aromatických H-atomů v camtothecin-B-kruhu, popřípadě D-kruhu.

400-MHz-¹H-NMR(CD₂C1₂/CD₃OD 1:1):5 s C-H(B-kruh) 8,55 ppm s C-H(D-kruh) 7,35 ppm (FAB-MS : m/z = 887 - M+H⁺)

Je možná rovněž alternativní cesta stavby sloučeniny z příkladu 8 . Při tom se uhlohydrátová jednotka z příkladu 1 spojí nejprve s derivátem lysinu s chráněným postranním řetězcem.

8a) y[alfa_[0-(3-0-methyl^-L-fukopyranosyl)-4-hydroxyfenylamino-thiokarbonyl]-N^eP^sil°ⁿ-[fluorenyl-9-methoxykarbonyl]-L-lysin

Roztok 6,8 g (25,3 mmol) p-aminofenyl-3-0-methyl-β-L-fukopyranosidu (příklad 1) V 600 ml směsi dioxanu a vody 1:1 se za míchání smísí se 2,72 ml thiofosgenu (1,4 ekvivalentu) Po 10 minutách se přidá 26 ml ethyl45 • · · · · · • · * · · · · • · · · · · ·· · » ···«··· diisopropylaminu, reakční směs se míchá po dobu 5 minut při teplotě místnosti a potom se ve vakuu zahustí na objem 150 ml, načež se přidá 800 ml dichlormethanu a fáze se oddělí. Organická fáze se dvakrát promyje vodou, vysuší se pomocí bezvodého síranu sodného a zahustí se. Získaný zbytek se rozmíchá se 200 ml methyl-terč.-butyletheru a 200 ml petroletheru a odsaje se. Získá se takto 7,26 g (92 %) isothiokyanátu.

2,92 g (9,4 mmol) získaného isothiokyanátu se rozpustí ve 200 ml směsi dioxanu a vody 1:1 a smísí se se 3,11 g (0,9 ekvivalentu) N^eP^sil°ⁿ-(fl_uorenyl-9-methoxykarbonyl)-lysinu a se 3,2 ml ethyl-diisopropylaminu. Reakční směs se míchá po dobu 16 hodin při teplotě místnosti, ve vakuu se zahustí a získaný zbytek se vyjme do vody. Upravením hodnoty pH pomocí 1 N kyseliny chlorovodíkové na 2 se produkt vysráží a po 30 minutách se odsaje. Získaný zbytek se suspenduje v dichlormethanu a rozpouštědlo se dvakrát odsaje. Po vícenásobném promytí diethyletherem a petroletherem se získá 5,3 g (92 %) cílového produktu (DC : acetonitril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2,

R_f = 0,69) .

8b) 20 (S) -20-0 - {N^a-'-^^?a- [0- (3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl) -4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-N^eP^sil°ⁿ-[fluorenyl- 9-methoxykarbonyl]-L-lysin-L-vály1}-camptothecin

1,2 g (1,76 mmol) N^alfa-[0-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-N^eP^sllon-[fluorenyl-9-methoxykarbonyl]-L-lysinu (příklad 8a) a 675 mg (1,2 mmol) sloučeniny III.b)L se rozpustí v 50 ml dimethylf ormamidu , směs se ochladí na teplotu 0 °C a potom se smísí se 346 mg (1,8 mmol) N-ethyl-N’-(dimethylaminopro* · pyl)-karbodiimid hydrochloridu a za míchání se nechá přes noc stoupnout teplota na teplotu místnosati. Rozpouštědlo se potom ve vakuu odpaří a získaný zbytek se rozmíchá s vodou. Čistí se pomocí mžikové chromatografie na silikagelu, přičemž se startuje s acetonitrilem jako pohyblivou fází a později se přejde na směs acetonitril/voda 50 : 1 . Po zahuštění odpovídajících frakcí se získá 1,06 g (76 %) cílového produktu (DC : acetonitril/voda 20 : 1 , R^ = 0,34) .

Deblokace a následující převedení na hydrochlorid se provádí analogicky jako je popsáno v příkladě 1 .

Příklad 9

20(S)-20-0-{N^alf^a-[0-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-histidyl-L-valyl}-camptothecin, hydrochlorid :

Sloučenina se vyrobí analogicky, jako je popsáno v příkladě 2 , přičemž se vychází z nepolárního diastereo• ·

• · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· · · ······ meru 20-0-valyl-camptothecin, trifluoracetátu (III.b)L).

Poměr diastereomerů se může zjistit analytickou HPLC.

Další čištění nepolárního diastereomerů s L-konfigurací valinu (> 20 : 1) je možno dosáhnout popřípadě krystalisací z methylalkoholu.

Podmínky HPLC :

Dělící sloupec : Macherey & Nagel 250 x 4 mm Nucleosil 100-7 C 18 AB

Pohyblivá fáze A : H2O + 0,1 Μ KH2PO4

Pohyblivá fáze B : acetonitril/voda 4 : 1 + 0,02 Μ KH2PO4 Tok : 1 ml/min

Inj.-obj em : 15 μ1.

V ^H-NMR-spektru vykazuje čistý diastereomer pouze sadu signálů, například pro oba singuletty aromatických H-atomů v camtothecin-B-kruhu, popřípadě D-kruhu.

Diastereomer s L-valinem :

400-MHz-¹H-NMR(CD₂C1₂/CD₃OD 1:1):5 s C-H(B-kruh) 8,58 ppm (překryto CH arom. histidinu) s C-H(D-kruh) 7,35 ppm (DC : acetonitiril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2, R_f = 0,36) (FAB-MS : m/z = 896 = M+H⁺) .

A Q ······ ··»<··· — 4+ ο — ···· ·· · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 * · ··

Příklad 10

20(S)-20-0-{N^ab^^a-[0-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbony1]-L-arginyl-L-leucyl}-camptothecin :

Produkt se vyrobí analogicky jako je popsáno v příkladě 5 . Při tom se na stupni 20-0-leucyl-camptothecinu Il.b) použije nepolární diastereomer II.b)L .

(DC : acetonitiril/voda/ledová kyselina octová 5 : 1 : 0,2, R_f = 0,4) (FAB-MS : m/z = 929 = M+H⁺) .

Za HPLC-podmínek, uváděných v příkladech 8 a 9 , se mohou odlišit diastereomery z příkladů 5 a 10 .

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1.

   Glykokonjugáty camptothecinu obecného vzorce I ve kterém

   Rl značí stericky náročný nepolární postranní řetězec aminokyseliny a

   R značí basický postranní řetězec aminokyseliny, jakož i jejich soli, stereoisomery a směsi stereoisomerů.
2. 2. Glykokonjugáty camptothecinu podle nároku 1 obecného vzorce 1 , ve kterém

   R¹ značí rozvětvený alkylový zbytek s až 4 uhlíkovými • ·

   - 50 at omy a

   Ί 3 značí zbytek vzorce -(CH2)_n-R , přičemž

   R^; značí skupinu -NH2 ,

   NH NH ^z ý Λ

   N nebo NH NH₂ a n značí číslo 1 až 4 , jakož i jejich soli, stereoisomery a směsi stereoisomerů.
3. 3. Glykokonjugáty camptothecinu podle nároku 1 obecného vzorce I , ve kterém

   R¹ značí rozvětvený alkylový zbytek vzorců

   CH

   CH,

   CH,

   CH, nebo

   CH,

   CH,

   R^ značí zbytek vzorců ,

   NH nebo

   NH

   -(CH₂)₄-NH₂ , .

   -CH< N

   -(CH₂)—NH NH jakož i jejich soli, stereoisomery a směsi stereoisomerů.
4. 4. Způsob výroby glykokonjugátů obecného vzorce I ve kterém

   Rl značí stericky náročný nepolární postranní řetězec aminokyseliny a

   R značí basický postranní řetězec aminokyseliny, jakož i jejich solí, vyznačující se tím, že se nechá reagovat isothiokyanát vzorce II ch₃ s peptidyl-camptothecinem obecného vzorce III , nesoucím popřípadě v postranním řetězci ochrannou skupinu, • 4 4 4 4 44 44 44

   4 4 4 4 4 4 4

   44 44 4444444 44 44 (Hi) ve kterém má R^· výše uvedený význam a

   R má význam výše uvedeného basického zbytku R , který kromě toho může na basické skupině nést v chemii peptidů obvyklou ochrannou skupinu, na glykokonjugát obecného vzorce IV

   O

   1 2 ’ ve kterem maj1 R a R výše uvedený význam, • · · · • · · · • · · · • « · · a popřípadě přítomné ochranné skupiny aminoskupin postranních řetězců se pomocí obvyklých metod odstraní a získané sloučeniny se popřípadě převedou na požadované solí.
5. 5. Způsob výroby glykokonjugátů obecného vzorce I nebo jejich solí, vyznačující se tím, že se nechá reagovat isothiokyanát vzorce II

   CH₃ s popřípadě vhodně chráněnou terminální basickou aminokyselinou obecného vzorce V h₂n^cooh (V) ve kterém značí R basický postranní řetězec aminokyseliny, jejíž basická skupina může být chráněná, na konjugát aminokyseliny obecného vzorce VI

   A. Λ.,

   N R H

   O

   Me

   COOH (VI)

   - 54 ve kterém má R výše uvedený význam, tato se potom nechá reagovat s konjugátem obecného vzorce VII aminokyseliny (VII) ve kterém má výše uvedený význam, ochranné skupiny postranních řetězců se popřípadě odštěpí a získané sloučeniny se popřípadě převedou na vhodnou sůl.
6. 6. Glykokonjugát camptothecinu podle nároku 1 obecného vzorce I , kterým je 20(S)-20-0-{N^a^^^a-[0-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-lysyl-L-valyl}-camptothecin vzorce a jeho soli.
7. 7. Glykokonjugát camptothecinu podle nároku 1 obecného vzorce I , kterým je 20(S)-20-0-{N^al^^a-[0-(3-0-methyl-p-L-fukopyranosyl)-4-hydroxy-fenylamino-thiokarbonyl]-L-histidyl-L-valyl}-camptothecin vzorce a j eho soli.
8. 8. Použití glykokonjugátů obecného vzorce I podle nároku

   1 pro výrobu léčiv.
9. 9. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje glykokonjugáty obecného vzorce I podle nároku 1 .

   Relativní objem nádoru (%)