WO1998015573A1 - 20-o-verknüpfte glycokonjugate von camptothecin - Google Patents

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WO1998015573A1
WO1998015573A1 PCT/EP1997/005190 EP9705190W WO9815573A1 WO 1998015573 A1 WO1998015573 A1 WO 1998015573A1 EP 9705190 W EP9705190 W EP 9705190W WO 9815573 A1 WO9815573 A1 WO 9815573A1
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WO
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carbon atoms
formula
compounds
group
optionally
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Application number
PCT/EP1997/005190
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Georg Lerchen
Karsten Von Dem Bruch
Jörg Baumgarten
Michael Sperzel
Original Assignee
Bayer Aktiengesellschaft
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/003—Peptides being substituted by heterocyclic radicals, e.g. bleomycin, phleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to glycoconjugates of camptothecin in which at least one carbohydrate component is suitably linked to camptothecin via an oligopeptide bridge.
  • the invention further relates to processes for the preparation of the compounds according to the invention and their use as medicaments, in particular in connection with cancer.
  • camptothecin conjugates according to the invention have, for example, the following favorable properties:
  • Tumor cell lines and tumor xenografts Tumor cell lines and tumor xenografts.
  • the invention relates to compounds of the general formula (I)
  • M stands for a peptide with 3 to 7 anunosaur building blocks, which has the same or different groups via 1 to n 'via the ⁇ -amino group and / or via amino and / or hydroxyl groups of the side chains
  • (-L-Sp-K) n stands for n identical or different groups -L-Sp-K
  • n denotes a number from 1 to n 'and n' corresponds to the maximum number of possible connection points of M
  • R 1 represents chlorine or hydroxyalkylamino
  • Sp stands for arylene with up to 10 carbon atoms or for alkylene with up to carbon atoms, which are each optionally substituted
  • A denotes methyl, hydroxymethyl, alkoxymethyl with up to 6 carbon atoms, acyloxymethyl with up to 6 carbon atoms or a radical of the formula -CH 2 -B, in which
  • R 2 , R 3 and R 4 independently of one another are hydrogen, hydroxy, optionally substituted by hydroxy-substituted alkoxy having up to 6 carbon atoms, optionally substituted by alkyl or acyl having up to 6 carbon atoms, amino, halogen, sulfate or a group of the formulas
  • R 5 and R 6 independently of one another represent hydroxyl or alkoxy having up to 6 carbon atoms or amino, which is optionally substituted by alkyl having up to 6 carbon atoms, and
  • s and t can independently assume the values 0, 1, 2, 3 or 4, in particular the values 1, 2, 3 or 4
  • R> 2 r R> 3 and R independently of one another represent a radical of the formula (II) or
  • the building blocks L are usually linked to the building block Sp via their -NH function, if present.
  • alkyl groups is intended to include, in the context of the invention, straight-chain, branched, cyclic and cycloalkyl-containing alkyl radicals. This definition should also apply analogously to all other radicals containing alkyl groups, such as, for example, alkoxy, acyl, etc.
  • Preferred compounds of the general formula (I) are those in which M is a peptide which is linked to the residues L via amino functions, is linked to the camptothecin residue via an acyl function and whose amino acid units can optionally carry protective groups.
  • M is a peptide which is linked to the residues L via amino functions, is linked to the camptothecin residue via an acyl function and whose amino acid units can optionally carry protective groups.
  • Tri, tetra and pentapeptides, in particular tripeptides, are particularly preferred.
  • the amino acid units are preferably selected from the group glycyl,
  • amino acid building blocks glycyl, alanyl, valyl, leucyl, lysyl, seryl, asparagyl, histidyl and / or glutamyl are particularly preferred.
  • L particularly preferably stands for
  • Sp is particularly preferably unsubstituted or optionally mono- or disubstituted by halogen, nitro, alkyl having up to 4 carbon atoms, alkoxy having up to 2 carbon atoms, -OCF 3 and / or
  • Sp is very particularly preferably linked to K and L in a para-position and has no further substituents.
  • A denotes methyl, hydroxymethyl, methoxymethyl or acetoxymethyl
  • R 2 is hydrogen, hydroxyl, methoxy or a group of the formulas
  • s and t can independently assume the values 1 or 2 and R 5 and R 6 independently of one another represent hydroxyl or alkoxy having up to 4 carbon atoms,
  • R 2 represents a radical of the formula (II),
  • R 3 is hydrogen, hydroxyl, halogen, alkoxy with up to 4 carbon atoms,
  • s and t can independently assume the values 1 or 2 and
  • R 5 and R 6 independently of one another for hydroxyl or alkoxy with up to 4
  • R 4 is hydroxyl, alkoxy with up to 4 carbon atoms, which is optionally substituted by hydroxy, amino, which is optionally substituted by alkyl or acyl with up to 4 carbon atoms, or a group of
  • s and t can independently assume the values 1 or 2 and R 5 and R 6 independently of one another represent hydroxyl or alkoxy having up to 4 carbon atoms,
  • R 2 and R 3 together represent an epoxy group
  • K very particularly preferably represents a radical of the formula (II) in which
  • A denotes methyl, hydroxymethyl, methoxymethyl or acetoxymethyl
  • R and R each represent a hydroxy group
  • R is hydrogen, hydroxyl, halogen, alkoxy with up to 4 carbon atoms, sulfate or a group of the formulas
  • s and t can independently assume the values 1 or 2 and
  • R 5 and R 6 independently of one another represent hydroxyl or alkoxy having up to 4 carbon atoms or amino, which may be through
  • Alkyl is substituted with up to 4 carbon atoms
  • the carbohydrate building blocks K each comprise a maximum of two monosaccharide building blocks
  • the compounds according to the invention can be present in stereoisomeric forms, for example as enantiomers or diastereomers, or as mixtures thereof, for example as a racemate.
  • the invention relates both to the pure stereoisomers and to their mixtures.
  • Stereoisomer mixtures can, if necessary, be separated into the stereoisomerically uniform constituents in a known manner, for example by chromatography or by crystallization processes.
  • the stereochemistry at the anomeric center of the carbohydrate building blocks K can be ⁇ or ⁇ .
  • the stereochemistry at the other centers can result in the gluco, manno, galacto, gulo, rhamno or fuco configuration.
  • amino acid building blocks can each be present in the D or L form.
  • the camptothecin building block Cp can be present in the 20 (R) or in the 20 (S) configuration or as a mixture of these two steroisomeric forms.
  • the 20 (S) configuration is preferred.
  • the compounds according to the invention can occur in rotation-isomeric forms or as a mixture thereof as a result of rotation inhibition.
  • the invention relates both to the pure rotational isomers and to their mixtures.
  • rotational isomer mixtures can be separated into the uniform constituents by known methods, for example by chromatography (e.g. HPLC) or by crystallization processes. This is possible not only on the final stage of the glycoconjugates, but also on intermediate stages if necessary. If appropriate, the rotamer-pure end stages can be produced from the rotamer-pure intermediates by suitable synthesis.
  • chromatography e.g. HPLC
  • crystallization processes e.g.
  • the compounds according to the invention can also be in the form of their salts.
  • salts with organic or inorganic bases or acids and internal salts are mentioned here. 98/15573 - 10 -
  • the acids which can be added preferably include hydrohalic acids, such as, for example, hydrochloric acid and hydrobromic acid, in particular hydrochloric acid, furthermore phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, mono- and bifunctional carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids, such as, for example, acetic acid, trifluoroacetic acid, Malonic acid, oxalic acid, gluconic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, salicylic acid, sorbic acid and lactic acid as well as sulfonic acid, such as p-toluenesulfonic acid, 1,5-naphthalenedisulfonic acid or camphorsulfonic acid
  • hydrohalic acids such as, for example, hydrochloric acid and hydrobromic acid, in particular hydrochloric acid, furthermore phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, mono- and bifunctional carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids, such
  • Physiologically acceptable salts can also be metal or ammonium salts of the compounds according to the invention which have a free carboxyl group.
  • sodium, potassium, magnesium or calcium salts and ammonium salts which are derived from ammonia or organic amines such as ethylamine, di- or triethylamine, di- or triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, arginine, lysine, ethylenediamine are particularly preferred or phenethylamine
  • glycoconjugates according to the invention can be produced, for example, by linking camptothecin with activated carboxyl components, which in turn can be parts of protected amino acids, peptides or carbohydrate-modified peptides.
  • the invention therefore further relates to a process for the preparation of compounds of the general formula (I), characterized in that compounds of the formula (III)
  • K and Sp are as defined above and La represents a reactive precursor of group L, where appropriate the protective groups are split off selectively and other groups of the formula K-Sp-L- can be gradually introduced in a comparable manner,
  • a first amino acid residue in the form of the corresponding activated carboxyl component, optionally carrying protective groups is introduced in a comparable manner, optionally splitting off protective groups, furthermore optionally linking amino acid residues carrying protective groups either successively or as a peptide building block, optionally splitting off protective groups, as indicated above, residues of the formula K. -Sp-L introduces and, if necessary, splits off protective groups
  • the reactions can be carried out at various pressure and temperature ratios, for example 0.5 to 2 bar or -30 to + 100 ° C., in suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, Dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned are usually carried out in reactions
  • suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, Dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned are usually carried out in reactions
  • the coupling reagents known in peptide chemistry such as those described in Jakubke / Jeschkeit amino acids, peptides, proteins, Verlag Chemie 1982 or Tetrahedr Lett 34, 6705 (1993), are suitable.
  • acid chlorides, N- Carbonic acid anhydrides or mixed anhydrides are suitable.
  • Adducts with carbodimides such as BN, N'-dimethyl, N, N'-diisopropyl, N, N ' ⁇ dicyclohexylcarbodiimide, N- (3-dimethylamino-nopopyl) -N'-ethyl-carbodiimide hydrochloride, N-Cyclohexyl-N '- (2-morphol ⁇ noethyl) -carbodnm ⁇ d-metho-p-toluenesulfonate, or carbonyl compounds such as carbonyldumidazole, or 1,2-oxazohumverb ⁇ nditch such as 2-ethyl-5-phenyl-l, 2-oxazohum-3-sulfate or 2-tert-butyl-5-methyl- ⁇ soxa- zolium perchlorate, or acylamino compounds such as 2-ethoxy-l-ethoxycarbonyl-1,2-d ⁇ hydroch ⁇ nohn, or
  • T ⁇ ethylamin, ethyl-dnsopropylamine, Py ⁇ din, N, N-D ⁇ methylam ⁇ nopynd ⁇ n or others can be used
  • the protective groups known in peptide chemistry for example of the urethane, alkyl, acyl, ester or amide type, can be used as protective groups for any third functions of the amino acids
  • Amino protecting groups in the context of the invention are the usual amino protecting groups used in peptide chemistry
  • These preferably include benzyloxycarbonyl, 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl,
  • the Fmoc group and the Boc group are particularly preferred.
  • Preferred carboxyl protecting groups are linear or branched C, -C 4 alkyl esters
  • Derivatives with carbohydrate residues can be carried out using various methods and linker groups. For example, preference is given to converting p-aminophenylglycosides to isothiocyanates and linking them, for example, to amino groups Furthermore, carboxyalkyl or aminoalkyl glycosides can also be easily coupled with amino or carboxyl groups. The production of N- or O-glycopeptides is also conceivable
  • Protective groups can be split off in corresponding reaction shells, for example by acid or base action, hydrogenolytically or in some other way reductively
  • the human colon cell lines SW 480 and HT 29 (ATCC No. CCL 228 and HBT-38) as well as the mouse melanoma cell line B16F10 were in
  • Roux dishes drawn in RPMI 1640 medium with the addition of 10% FCS were drawn in RPMI 1640 medium with the addition of 10% FCS.
  • MTT solution (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoline bromide) with an initial concentration of 5 mg / ml H 2 O was added. It was 5th
  • the absorbance at 540 nm was shaken with 100 ⁇ l H 2 O.
  • the cytotoxic effect is given in Table 1 as an IC 50 value for the SW 480 and HT 29 and B16F10 cell lines:
  • Bone marrow cells are washed out of the femur of the mouse. 10 5 cells are in McCoy 5A medium (0.3% agar) together with recombinant murine GM-CSF (genzymes, stem cell colonization) and the substances (10 4 to 100 ⁇ g / ml) incubated at 37 ° C and 7% CO 2 7 days later the colonies ( ⁇ 50 cells) and clusters (17-50 cells) are counted
  • the glycoconjugates investigated show a drastically reduced inhibition of bone marrow stem cell proliferation compared to the underlying active ingredient.
  • Athymic nude mouse (NMRI nu / nu strain) was used for all in vivo experiments to investigate the inhibition of tumor growth.
  • the selected large cell lung carcinoma LXFL 529 was developed by serial passage in nude mice. Human The tumor has been detected by isoenzymatic and immunohistochemical methods • ⁇ gt 1 -
  • the tumor was implanted subcutaneously in both flanks of 6 to 8 week old nu / nu nude mice. Treatment was dependent on the
  • mice were randomized to the treatment group and the control group (5 mice per group with 8-10 evaluable tumors). The individual tumors in the control group all grew progressively
  • the size of the tumors was measured in two dimensions using a slide gauge.
  • the tumor volume which correlates well with the cell number, was then used for all evaluations.
  • the volume was calculated according to the formula "length x width x width / 2" ([axb 2 ] / 2 , a and b stand for two diameters arranged at right angles)
  • the relative tumor volume (RTV) values were calculated for each individual tumor by dividing the tumor size on day X by the tumor size on day 0 (at the time of randomization). The mean values of the RTV were then used for further evaluation
  • the final measurement was the inhibition of the increase in tumor volume (tumor volume of the test group / control group, T / C, in percent)
  • the compounds 1 1 and 1 2 show the therapeutic activity of the glycoconjugates according to the invention against the large-cell human lung tumor xenograph LXFL 529 in the case of lv application.
  • the therapy leads to tumor remissions or significant inhibitions of the at the maximum tolerable dose (MTD) and 1/2 MTD Tumor growth 98/15573 17th
  • the compounds according to the invention have a surprisingly strong cytotoxic activity against various tumors, in particular those of the lungs and the large intestine, combined with a high selectivity towards non-malignant cells.
  • the present invention includes pharmaceutical preparations which, in addition to non-toxic, inert pharmaceutically suitable excipients, contain one or more compounds according to the invention or which consist of one or more active compounds according to the invention, and processes for the preparation of these preparations
  • the active ingredient (s) can optionally also be in microencapsulated form in one or more of the above-mentioned carriers.
  • the therapeutically active compounds should be present in the pharmaceutical preparations listed above preferably in a concentration of about 0.1 to 99.5, preferably of about 0.5 to 95% by weight of the total mixture.
  • the pharmaceutical preparations listed above can also contain further active pharmaceutical ingredients.
  • a single dose contains the active ingredient (s) according to the invention preferably in amounts of about 1 to about 80, in particular 3 to 30 mg / kg of body weight.
  • I.2.a) p-Nitrophenyl-3-O-methoxycarbonylmethyl I-ß-L-fucopyranoside 1 g (3.5 mmol) p-nitrophenyl-ß-L-fucopyranoside and 1.3 g (5.2 mmol) Dibutyltin oxide are refluxed in 50 ml of methanol for 2 hours. The solution is concentrated, the residue is taken up in 50 ml of dioxane, 2 ml of methyl bromoacetate and 100 mg of tetrabutylammonium iodide are added and the mixture is heated under reflux for 16 h.
  • Ethyl-diisopropylamine is then concentrated in vacuo and the residue is dried for 1 h in an oil pump vacuum.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Glycokonjugate von Camptothecin, in denen mindestens eine Kohlenhydratkomponente in geeigneter Weise über eine Oligopeptid-Brücke mit Camptothecin verknüpft ist. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen.

Description

0-O-verknüpfte Glycokonjugate von Camptothecin
Die vorliegende Erfindung betrifft Glycokonjugate von Camptothecin, in denen mindestens eine Kohlenhydratkomponente in geeigneter Weise über eine Oligopeptid-Brücke mit Camptothecin verknüpft ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen.
20(S)-Camptothecin ist ein pentacyclisches Alkaloid, das 1966 von Wall et al. isoliert wurde (J.Am.Chem.Soc. 88, 3888 (1966)). Es besitzt ein hohes Antitumor- Wirkpotential in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Tests. Leider scheiterte jedoch die Realisierung des vielversprechenden Potentials in der Klinik an Toxizitäts- und Löslichkeitsproblemen.
Durch Öffnung des E-Ring-Lactons und Bildung des Natriumsalzes wurde eine wasserlösliche Verbindung erhalten, die in einem pH-abhängigen Gleichgewicht mit der ringgeschlossenen Form steht. Klinische Studien führten auch hier bisher nicht zum Erfolg.
Figure imgf000003_0001
Etwa 20 Jahre später wurde gefunden, daß die biologische Aktivität auf eine
Enzyminhibition der Topoisomerase I zurückzuführen ist. Seither wurden die Forschungsaktivitäten wieder verstärkt, um verträglichere und in-vivo wirksame Camptothecin-Derivate zu finden.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit wurden Salze von A-Ring- und B-Ring- modifizierten Camptothecin-Derivaten sowie von 20-O-Acyl-Derivaten mit ionisierbaren Gruppen beschrieben (Vishnuvajjala et al. US 4 943 579). Letzteres Prodrug-Konzept wurde später auch auf modifizierte Camptothecin-Derivate übertragen (Wani et al. WO 9602546). Die beschriebenen 20-O-Acyl-Prodrugs haben allerdings in-vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und werden sehr schnell zum Grundkörper gespalten.
In unserer ebenfalls anhängigen Patentanmeldung PCT/96/01279 wird beschrieben, daß die Anknüpfung von Kohlenhydratresten über Aminosäure- oder Dipeptid- Spacer an Cytostatika, unter anderem an die 20-Hydroxyl-Gruppe von Camptothecin zu antineoplastisch hochwirksamen und darüber hinaus tumorselektiveren Verbindungen führt.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch eine Verlängerung des Peptidspacers mit geeigneten Aminosäuren die Wasserlöslichkeit der betreffenden Konjugate drastisch verbessert wird. Gleichzeitig zeigen diese Konjugate eine sehr gute biologische Aktivität.
Im einzelnen weisen die erfindungsgemäßen Camptothecin-Konjugate beispielsweise folgende günstige Eigenschaften auf:
Durch die esterartige Anknüpfung der Carrier-Reste an die 20- Hydroxygruppe wird der für die Wirkung wichtige Lactonring der
Camptothecin-Derivate stabilisiert.
Die so erhaltenen Konjugate zeigen in-vitro eine hohe Aktivität gegenüber
Tumorzellinien und Tumorxenografts.
Sie weisen gegenüber den zugrundeliegenden Toxophoren eine deutlich höhere Verträglichkeit und Tumorselektivität auf.
In-vivo zeigen sie exzellente therapeutische Wirksamkeit über mehrere
Dosisstufen.
Sie sind in extrazellulärem Medium und in Blut wesentlich stabiler als die zuvor beschriebenen 20-O-Acyl-Prodrugs von Camptothecin.
Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000004_0001
worin
M für ein Peptid mit 3 bis 7 Anunosaurebausteinen steht, das über die α- Aminogruppe und/oder über Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit 1 bis n' gleichen oder voneinander verschiedenen Gruppierungen
-L-Sp-K
verknüpft ist, wobei weitere funktioneile Gruppen des Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können und
(-L-Sp-K)n für n gleiche oder voneinander verschiedene Gruppierungen -L-Sp-K steht,
wobei
n eine Zahl von 1 bis n' bedeutet und n' der maximalen Anzahl möglicher Anknupfungsstellen von M entspricht,
L für eine Gruppe der Formeln
-NH , steht
Figure imgf000005_0001
worin
R1 Chlor oder Hydroxyalkylamino bedeutet,
Sp für Arylen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder für Alkylen mit bis zu Kohlenstoffatomen steht, die jeweils gegebenenfalls substituiert sind
K für einen Rest der Formel (II)
Figure imgf000006_0001
steht, worin
A Methyl, Hydroxymethyl, Alkoxymethyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Acyloxymethyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formel -CH2-B bedeutet, worin
B für einen Rest der Formel (II) steht,
R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls durch Hydroxy substituiertes Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls durch Alkyl oder Acyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiertes Amino, Halogen, Sulfat oder eine Gruppe der Formeln
Figure imgf000006_0002
bedeuten, worin
R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen stehen oder für Amino, das gegebenenfalls durch Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, stehen und
s und t unabhängig voneinander die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4, insbesondere die Werte 1, 2, 3 oder 4 annehmen können
oder
R >2 , r R> 3 und R unabhängig voneinander für einen Rest der Formel (II) stehen oder
zwei der Reste R2, RJ, R4 zusammen für eine Epoxygruppe stehen,
sowie deren Isomere, Isomerengemische und Salze.
Die Bausteine L sind üblicherweise über ihre -NH-Funktion, sofern vorhanden, mit dem Bausteinen Sp verknüpft.
Der Begriff "Alkylgruppen" soll, sofern nicht anders angegeben, im Sinne der Erfindung geradkettige, verzweigte, cyciische und Cycloalkylreste enthaltende Alkylreste umfassen. Diese Definition soll sinngemäß auch für alle anderen Alkylgruppen enthaltenden Reste gelten, wie beispielsweise Alkoxy, Acyl usw.
Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin M für ein Peptid steht, das über Aminofunktionen mit den Resten L verknüpft ist, über eine Acyl- funktion mit dem Camptothecin-Rest verknüpft ist und dessen Aminosäurebausteine gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können. Besonders bevorzugt sind Tri-, Tetra- und Pentapeptide, insbesondere Tripeptide.
Die Aminosäurebausteine werden bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Glycyl,
Alanyl, Valyl, Leucyl, Lysyl, Seryl, Glutamyl, Threonyl, Asparagyl, Isoleucyl, Diaminopropionyl, Diaminobutyryl, Histidyl, Arginyl und/oder Ornithyl.
Besonders bevorzugt sind die Aminosäurebausteine Glycyl, Alanyl, Valyl, Leucyl, Lysyl, Seryl, Asparagyl, Histidyl und/oder Glutamyl.
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel
worin
L für eine Gruppe der Formel
O
-NH oder /C\ steht,
sowie deren Isomeren, Isomerengemische und Salze. Besonders bevorzugt steht L für
Figure imgf000008_0001
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin Sp für Arylen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen steht, das gegebenenfalls noch ein- oder mehrfach durch Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Nitro, Cyano, Halogen, Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Halogenalkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder durch Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, sowie deren Isomere, Isomerengemische und Salze.
Besonders bevorzugt ist Sp abgesehen von K und L unsubstituiert oder gegebenenfalls ein- oder zweifach substituiert durch Halogen, Nitro, Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit bis zu 2 Kohlenstoffatomen, -OCF3 und/oder
-CF3.
Ganz besonders bevorzugt ist Sp paraständig mit K und L verknüpft und trägt keine weiteren Substituenten.
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin K für einen Rest der Formel (II) steht,
wobei
A Methyl, Hydroxymethyl, Methoxymethyl oder Acetoxymethyl bedeutet,
R2 Wasserstoff, Hydroxyl, Methoxy oder eine Gruppe der Formeln
Figure imgf000008_0002
bedeutet, worin
s und t unabhängig voneinander die Werte 1 oder 2 annehmen können und R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen,
oder
R2 für einen Rest der Formel (II) steht,
R3 Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen,
Sulfat oder eine Gruppe der Formeln
Figure imgf000009_0001
bedeutet, worin
s und t unabhängig voneinander die Werte 1 oder 2 annehmen können und
R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 4
Kohlenstoffatomen stehen oder für Amino, das gegebenenfalls durch Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, stehen,
R4 Hydroxyl, Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Hydroxy substituiert ist, Amino, das gegebenenfalls durch Alkyl oder Acyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, oder eine Gruppe der
Formeln
Figure imgf000009_0002
bedeutet, worin
s und t unabhängig voneinander die Werte 1 oder 2 annehmen können und R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen,
oder worin
R2 und R3 gemeinsam für eine Epoxygruppe stehen,
sowie deren Isomere, Isomerengemische und Salze
Ganz besonders bevorzugt steht K für einen Rest der Formel (II), worin
A Methyl, Hydroxymethyl, Methoxymethyl oder Acetoxymethyl bedeutet,
R und R jeweils eine Hydroxygruppe bedeuten und
R Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Sulfat oder eine Gruppe der Formeln
oder
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
bedeutet, worin
s und t unabhängig voneinander die Werte 1 oder 2 annehmen können und
R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen oder für Amino, das gegebenenfalls durch
Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, stehen
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfassen die Kohlenhydrat- Bausteine K jeweils maximal zwei Monosaccharid-Bausteine
Durch Kombination der für die einzelnen Reste angegebenen bevorzugten oder besonders bevorzugten Bedeutungen ergeben sich entsprechend ganz besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) 98/15573 9
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, beispielsweise als Enantiomere oder Diastereomere, oder als deren Gemische, beispielsweise als Racemat, vorliegen. Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Stereoisomere als auch deren Gemische.
Stereoisomerengemische können, falls erforderlich, in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile getrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie oder durch Kristallisationsverfahren.
Die Stereochemie am anomeren Zentrum der Kohlenhydratbausteine K kann α oder ß sein. Durch die Stereochemie an den anderen Zentren kann sich die gluco-, manno-, galacto-, gulo-, rhamno- oder fuco-Konfiguration ergeben.
Die Aminosäurebausteine können ebenso wie die Kohlenhydratbausteine jeweils in der D- oder in der L-Form vorliegen.
Der Camptothecin-Baustein Cp kann in der 20(R)- oder in der 20(S)-Konfιguration oder als Gemisch dieser beiden steroisomeren Formen vorliegen. Bevorzugt ist die 20(S)-Konfιguration.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bedingt durch eine Rotationshinderung in rotationsisomeren Formen oder als deren Gemisch auftreten. Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Rotationsisomere als auch deren Gemische.
Rotationsisomerengemische können gegebenenfalls, falls erforderlich, mittels be- kannter Methoden in die einheitlichen Bestandteile getrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie (z.B. HPLC) oder durch Kristallisationsverfahren. Möglich ist dies nicht nur auf der Endstufe der Glycokonjugate, sondern gegebenenfalls auch auf Zwischenstufen. Aus den rotamerenreinen Zwischenstufen können gegebenenfalls durch geeignete Syntheseführung die rotamerenreinen Endstufen herge- stellt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Form ihrer Salze vorliegen. Im allgemeinen seien hier Salze mit organischen oder anorganischen Basen oder Säuren sowie innere Salze genannt. 98/15573 - 10 -
Zu den Sauren, die addiert werden können, gehören vorzugsweise Halogenwasserstoffsauren, wie z B die Chlorwasserstoffsaure und die Bromwasserstoffsaure, insbesondere die Chlorwasserstoffsaure, ferner Phosphorsaure, Salpetersaure, Schwefelsaure, mono- und bifunktionelle Carbonsauren und Hydroxycarbonsauren, wie z B Essigsaure, Trifluoressigsaure, Maleinsäure, Malonsaure, Oxalsäure, Glucon- saure, Bernsteinsaure, Fumarsaure, Weinsaure, Zitronensaure, Salizylsäure, Sorbinsaure und Milchsaure sowie Sulfonsauren, wie z.B p-Toluolsulfonsaure, 1,5- Naphthalindisulfonsaure oder Camphersulfonsaure
Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze der erfϊndungsgemaßen Verbindungen sein, welche eine freie Carboxylgruppe besitzen. Besonders bevorzugt sind z B Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze, sowie Ammoniumsalze, die abgeleitet sind von Ammoniak oder organischen Aminen wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw Triethylamin, Di- bzw Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylendiamin oder Phenethylamin
Die erfmdungsgemaßen Glycokonjugate können beispielsweise hergestellt werden durch Verknüpfung von Camptothecin mit aktivierten Carboxylkomponenten, die ihrerseits beispielsweise Teile von geschützten Aminosäuren, Peptiden oder kohlenhydratmodifizierten Peptiden darstellen können.
Die Erfindung betrifft daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel (III)
Figure imgf000012_0001
mit einer dem oben definierten Rest M entsprechenden aktivierten Carboxylkom- ponente Ma, die gegebenenfalls Schutzgruppen tragt, in einem geeigneten Losungsmittel, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, nach üblichen Methoden umsetzt, gegebenenfalls mittels bekannter Methoden selektiv eine, mehrere oder alle Schutzgruppen von M abspaltet und das Produkt mit Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)
K-Sp-La (IV),
worin
K und Sp wie oben definiert sind und La für eine reaktive Vorstufe der Gruppe L steht, umsetzt, wobei gegebenenfalls die Schutzgruppen selektiv abgespalten und schrittweise noch andere Gruppen der Formel K-Sp-L- in vergleichbarer Weise eingeführt werden können,
oder daß man in vergleichbarer Weise nach üblichen Methoden einen ersten Aminosäurerest in Form der entsprechenden gegebenenfalls Schutzgruppen tragenden aktivierten Carboxylkomponente einfuhrt, gegebenenfalls Schutzgruppen abspaltet, weiterhin gegebenenfalls Schutzgruppen tragende Aminosäurereste entweder sukzessiv oder als Peptidbaustein anknüpft, gegebenenfalls Schutzgruppen abspaltet, wie oben angegeben Reste der Formel K-Sp-L einfuhrt und falls erforderlich Schutzgruppen abspaltet
Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhaltnissen, beispielsweise 0,5 bis 2 bar, bzw -30 bis +100°C, in geeigneten Losungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Acetonitπl, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Losungsmittel durchgeführt werden In der Regel sind Reaktionen in
DMF oder THF/ Dichlormethan bei Normaldruck und bei einer Temperatur von 0 bis 60°C, insbesondere bei Raumtemperatur, bevorzugt
Für die Aktivierung der Carboxylgruppen kommen die in der Peptidchemie bekannten Kupplungsreagenzien wie sie z B in Jakubke/Jeschkeit Aminosäuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr Lett 34, 6705 (1993) beschrieben sind, in Frage Bevorzugt sind beispielsweise Saurechloπde, N-Carbon- saureanhydπde oder gemischte Anhydride
Weiterhin geeignet zur Aktivierung der Carboxylgruppen ist die Bildung von
Addukten mit Carbodnmiden z B N,N'-Dιethyl-, N,N'-Dusopropyl-, N,N'~Dicyclo- hexylcarbodiimid, N-(3-Dιmethylamιnopιopyl)-N'-ethyl-carbodiιmid-Hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholιnoethyl)-carbodnmιd-metho-p-toluolsulfonat, oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldumidazol, oder 1,2-Oxazohumverbιndungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazohum-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-ιsoxa- zolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl- 1,2-dιhydrochιnohn, oder Propanphosphonsaureanhydπd, oder Isobutylchloroform, oder Benzotπazolyloxy-tπs(dιmethylamιno)phosphonιum-hexafluorophosphat, 1 -Hydroxy benzotπazol oder N-Hydroxysuccinimid
Als Basen können beispielsweise Tπethylamin, Ethyl-dnsopropylamin, Pyπdin, N,N-Dιmethylamιnopyndιn oder andere eingesetzt werden
Als Schutzgruppen für eventuelle Drittfunktionen der Aminosäuren können die in der Peptidchemie bekannten Schutzgruppen beispielsweise vom Urethan-, Alkyl-, Acyl-, Ester- oder Amid-Typ eingesetzt werden
Aminoschutzgruppen im Rahmen der Erfindung sind die üblichen in der Peptid- Chemie verwendeten Aminoschutzgruppen
Hierzu gehören bevorzugt Benzyloxycarbonyl, 3,4-Dιmethoxybenzyloxycarbonyl,
3,5-Dιmethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dιmethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxy- benzyloxycarbonyl, 4-Nιtrobenzyloxycarbonyl, 2-Nιtrobenzyloxycarbonyl, 2-Nιtro- 4,5-dιmethoxybenzyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, tert -Butoxy- carbonyl (Boc), Allyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 3,4,5-Tπmethoxybenzyloxy- carbonyl, 2,2,2-Tπchlorethoxycarbonyl, 2,2,2-Tπchlor-tert-butoxycarbonyl,
Menthyloxycarbonyl, 4-Nιtrophenoxy carbonyl, Fluorenyl-9-methoxy carbonyl (Fmoc), Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, 2,2,2- Tπfluoracetyl, 2,2,2-Tπchloracetyl, Benzoyl, Benzyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brom- benzoyl, 4-Nιtrobenzoyl, Phthahmido, Isovaleroyl oder Benzyloxymethylen, 4-Nιtrobenzyl, 2,4-Dιnιtrobenzyl, 4-Nιtrophenyl oder 2-Nιtrophenylsulfenyl
Besonders bevorzugt sind die Fmoc-Gruppe und die Boc-Gruppe
Bevorzugte Carboxylschutzgruppen sind lineare oder verzweigte C,-C4-Alkylester
Die Modifizierung von Aminosäure- oder Peptidkonjugaten von Camptothecin-
Deπvaten mit Kohlenhydratresten kann über verschiedene Methoden und Linker- gruppen erfolgen Bevorzugt ist z B die Überführung von p-Aminophenylglycosi- den in Isothiocyanate und die Verknüpfung beispielsweise mit Aminogruppen Weiterhin können auch Carboxyalkyl- oder Aminoalkylglycoside leicht mit Amino- bzw Carboxylgruppen gekuppelt werden Denkbar ist ebenso die Herstellung von N- oder O-Glycopeptiden
Die Abspaltung von Schutzgruppen in entsprechenden Reaktionsschπtten kann zum Beispiel durch Saure- oder Base-Ein Wirkung, hydrogenolytisch oder auf andere Weise reduktiv erfolgen
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Biologische Testung
1. Wachstumsinhibitionstest zur Bestimmung der cytotoxischen Eigenschaften:
Die humanen Dickdarmzellinien SW 480 und HT 29 (ATCC-Nr. CCL 228 und HBT-38) sowie die Maus-Melanom-Zellinie B16F10 wurden in
Rouxschalen in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10 % FCS gezogen.
Anschließend wurde trypsiniert und in RPMI plus 10 % FCS zu einer
Zellzahl von 50.000 Zellen/ml aufgenommen. 100 μl Zellsuspension/Well wurden in eine 96 Mi krowell platte gegeben und 1 Tag bei 37°C im CO2-
Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden weitere 100 μl RPMI Medium und 1 μl DMSO mit den Prüfsubstanzen zugesetzt. Das Wachstum wurde nach Tag 3 und Tag 6 überprüft. Dazu wurde zu jedem Mikrowell 40 μl
MTT-Lösung(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolinbromid) mit einer Ausgangskonzentration von 5 mg/ml H2O zugesetzt. Es wurde 5
Stunden im CO2-Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das
Medium abgesaugt und 100 μl i-Propanol/Well zugesetzt. Nach 30 min
Schütteln mit 100 μl H2O wurde die Extinktion bei 540 nm mit einem
Titertek Multiskan MCC/340 (Flow) gemessen.
Die cytotoxische Wirkung ist in der Tabelle 1 als IC50-Wert jeweils für die SW 480- und HT 29- und B16F10-Zellinie angegeben:
Tabelle 1:
IC50 / μM IC50 / μM IC50 / μM
Beispiel SW 480 HT 29 B16F10
1.1 0,015 0,025 0,1
1.2 0,06 0,06 0,2 8/15573 15
Hämatopoetische Aktivität von Glycokonjugaten im Vergleich zum zugrundeliegenden Wirkstoff:
Material und Methoden:
Knochenmarkzellen werden aus dem Femur der Maus gespült 105-Zellen werden in McCoy 5A-Medium (0,3 % Agar) zusammen mit rekombinanten murinen GM-CSF (Genzyme, Stammzellen-Kolonienbildung) und den Substanzen (10"4 bis 100 μg/ml) bei 37°C und 7 % CO2 inkubiert 7 Tage später werden die Kolonien (<50 Zellen) und Kluster (17-50 Zellen) ausgezählt
Ergebnisse:
Wie in Tab. 2 dargestellt, zeigen die untersuchten Glycokonjugate gegenüber dem zugrundeliegenden Wirkstoff eine drastisch verminderte Hemmung der Knochenmarkstammzellproliferation.
Tabelle 2:
Hemmung der CSF-induzierten Proliferation von Knochenmarkstammzellen der
Maus
Beispiel IC50 [μg/ml]
20(S)-Camptothecin 0,0004
1.1 0,03
1.2 0,28
In-vivo-Hemmung des Tumorwachstums im Nacktmaus-Modell
Material:
Für alle in-vivo-Expeπmente zur Untersuchung der Hemmung des Tumorwachstums wurden athymische Nacktmause (NMRI nu/nu-Stamm) verwendet Das ausgewählte großzellige Lungenkarzinom LXFL 529 wurde durch serielle Passage in Nacktmausen entwickelt Der menschliche Ui sprung des Tumors wurde durch isoenzymatische und lmtnunohisto- chemische Methoden bele •Όgt1-
Experimenteller Aufbau:
Der Tumor wurde subcutan in beide Flanken von 6 bis 8 Wochen alten nu/nu-Nacktmausen implantiert Die Behandlung wurde, abhangig von der
Verdopplungszeit, gestartet sobald die Tumoren einen Durchmesser von 5 - 7 mm erreicht hatten Die Mause wurden der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe (5 Mause pro Gruppe mit 8 - 10 auswertbaren Tumoren) durch Randomisieren zugeteilt Die einzelnen Tumoren der Kontrollgruppe wuchsen alle progressiv
Die Große der Tumoren wurde in zwei Dimensionen mittels Schieblehre vermessen Das Tumorvolumen, das gut mit der Zellzahl korreliert, wurde anschließend für alle Auswertungen verwendet Das Volumen wurde gemäß der Formel "Lange x Breite x Breite / 2" berechnet ([a x b2] / 2, a bzw b stehen für zwei rechtwinklig angeordnete Durchmesser)
Die Werte des relativen Tumorvolumens (RTV) wurden für jeden einzelnen Tumor durch Dividieren der Tumorgroße am Tag X mit der Tumorgroße des Tages 0 (zum Zeitpunkt der Randomisierung) berechnet Die mittleren Werte des RTV wurden dann für die weitere Auswertung verwendet
Die Hemmung der Zunahme des Tumorvolumens (Tumorvolumen der Testgruppe/ Kontrollgruppe, T/C, in Prozent) war der abschließende Meßwert
Behandlung:
Die Applikation der Verbindungen erfolgte an Tag 1, 2 und 3 nach Randomisierung intravenös (i v )
Ergebnisse:
Anhand der Verbindungen 1 1 und 1 2 ist die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemaßen Glycokonjugate gegenüber dem großzelligen humanen Lungentumorxenografts LXFL 529 bei l v -Applikation dargestellt Die Therapie fuhrt bei der maximal tolerablen Dosis (MTD) und bei 1/2 MTD zu Tumorremissionen bzw deutlichen Hemmungen des Tumorwachstums 98/15573 17
Tabelle 3:
Figure imgf000019_0001
Die erfindungsgemaßen Verbindungen weisen sowohl in-vitro als auch in-vivo eine überraschend starke cytotoxische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Tumoren, insbesondere solchen der Lunge und des Dickdarms, verbunden mit einer großen Selektivität gegenüber nicht malignen Zellen auf.
Sie eignen sich daher zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere von solchen der Lunge und des Dickdarms
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht-toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Tragerstoffen eine oder mehrere erfindungsgemaße Verbindungen enthalten oder die aus einem oder mehreren erfindungsgemaßen Wirkstoffen bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls in einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
Die therapeutisch wirksamen Verbindungen sollen in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-%, der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungsgemäßen Verbindungen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinär- medizin als vorteilhaft erwiesen, den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in
Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 3 bis 30mg/kg Körpergewicht.
Beispiele:
Kohlenhydrat-Edukte
Beispiel 1.1: p-Aminophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyranosid
Figure imgf000021_0001
I.l.a) p-Nitrophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyranosid:
6 g (21 mmol) p-Nitrophenyl-ß-L-fucopyranosid in 300 ml absol. Methanol werden mit 7,84 g (31,5 mmol) Dibutylzinnoxid versetzt und 2 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird eingeengt, der Rückstand getrocknet und dann in 300 ml DMF aufgenommen. Nach Zugabe von 15,7 ml Methyliodid wird der
Ansatz 40 h bei 70°C gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 300 ml Dichlormethan aufgenommen. Die Suspension wird filtriert, die verbleibende Lösung erneut eingeengt und einer Flash-Chromatographie (Dichlormethan/Methanol 99:1) unterzogen. Nach Einengen erhält man 3,82 g (61 %) des Zielproduktes.
1.1) p-Aminophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyranosid:
3,81 g (12,73 mmol) p-Nitrophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyranosid werden in Methanol gelöst und nach Zusatz von Platindioxid in einer Wasserstoffatmosphäre bei geringem Überdruck hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Fällen mit Ether erhält man 3 g (88%) des Zielprodukts. [DC: Dichlormethan/Methanol
9:1 Rf= 0,53].
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Beispiel 1.2: p-AminophenyI-3-O-carboxymethyl-ß-L-fucopyranosid
Figure imgf000022_0001
I.2.a) p-Nitrophenyl-3-O-methoxycarbonylmethyI-ß-L-fucopyranosid: 1 g (3,5 mmol) p-Nitrophenyl-ß-L-fucopyranosid und 1,3 g (5,2 mmol) Dibutyl- zinnoxid werden in 50 ml Methanol 2 h unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird eingeengt, der Rückstand in 50 ml Dioxan aufgenommmen, mit 2 ml Bromessig- säure-methylester sowie 100 mg Tetrabutylammoniumiodid versetzt und 16 h unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wird abgedampft und das Produkt durch Flash-Chromatographie (Dichlormethan/Methanol 99: 1) gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Fällen aus Methanol/Ether erhält man 455 mg (37%) der Zielverbindung.
1.2) p-Aminophenyl-3-O-carboxymethyl-ß-L-fucopyranosid:
282 mg (0,79 mmol) p-Nitrophenyl-3-methoxycarbonylmethyl-ß-L-fucopyranosid werden in 20 ml Methanol gelöst und mit 440 μl einer wäßrigen 2N Lithiumhydroxid-Lösung versetzt. Nach 2 h Rühren bei Raumtempemperatur wird mit saurem Ionenaustauscher SCI 08 auf pH 3 eingestellt und filtriert. Zum Filtrat werden 250 mg Palladium auf Aktivkohle zugesetzt. Anschließend wird 1,5 h mit Wasserstoff bei geringem Überdruck hydriert, der Katalysator abgetrennt und mit Methanol gewaschen. Einengen, Aufnehmen in Wasser und Gefriertrocknung führen in 86%iger Ausbeute zum Zi elprodukt (212 mg). [DC : Acetoni- tril/Wasser/Eisessig 5: 1 :0,2 R^ 0,24]
Als weitere Kohlenhydratbausteine können beispielsweise die folgenden Derivate eingesetzt werden:
p-Aminophenyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-2-O-methyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-2-O-hydroxyethyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-4-O-methyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3-O-methyl- -L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3-O-n-propyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3-desoxy-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3,4-didesoxy-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3,4-epoxy-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-4-desoxy-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3-O-methoxycarbonylmethyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3-O-hydroxyethyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-2-O-carboxymethyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3-O-succinyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3,4-di-O-methyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-3-O-carbamoylmethyl-ß-L-fucopyranosid p-Aminophenyl-α-L-rhamnopyranosid p-Aminophenyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-2-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-4-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-6-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-2,3-di-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-2,4-di-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-2,6-di-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3,4-di-O-methyl-ß-D-galactopyranosid, Acetat p-Aminophenyl-3,6-di-0-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-4,6-di-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-2,3,4-tri-0-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-2,3,6-tri-0-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-2,4,6-tri-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3,4,6-tri-O-methyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3-desoxy-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3,4-didesoxy-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-6-O-acetyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3-O-methoxycarbonylmethyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3-O-carboxymethyl-ß-D-galactopyranosid, Natriumsalz p-Aminophenyl-3-O-carbamoylmethyl-ß-D-galactopyranosid p-Aminophenyl-3-O-(N-methyl-carbamoylmethyl)-ß-D-galactopyranosid p- Aminophenyl-α-D-mannopyranosi d p-Aminophenyl-3-O-methyl-α-D-mannopyranosid p-Aminophenyl-2,3-di-0-methyl-α-D-ιτιannopyranosid p-Aminophenyl-3-O-methoxycarbonylmethyl-α-D-mannopyranosid p-Aminophenyl-3-O-carboxymethyl-α-D-mannopyranosid p-Aminophenyl-3-O-carbamoylmethyl- -D-mannopyranosid p-Aminophenyl-4-O-(ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-glucopyranosid p-Aminophenyl-4-O-(3'-sulfat-ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-glucopyranosid,
Natriumsalz p-Aminophenyl-4-O-(3'-O-methyl-ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-glucopyranosid p-Aminophenyl-2-O-methyl-4-O-(3'-O-methyl-ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-gluco- pyranosid p-Aminophenyl-4-O-(3',4'-di-O-methyl-ß-D-galactopyranosyl)-ß-D-glucopyranosid
Bereits in EP 501 250 wurde die Synthese der folgenden Kohlenhydratbausteiene beschrieben:
Carboxymethyl-ß-L-fucopyranosid 5-Carboxypentyl-ß-L-fucopyranosid
Die Verknüpfung dieser beiden Bausteine mit Peptidkonjugaten kann in der in EP
501 250 beschriebenen Weise erfolgen.
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Glycokonjugate
Beispiel 1.1:
20(S)-20-O-{Nα,Nε-bis-[O-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyI)-4-hydroxy-phenyl- amino-thiocarbonyl]-Iysyl-lysyf-alanyl}-camptothecin, Hydrochlorid
Figure imgf000025_0001
l.l.a) 20(S)-20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-alanyl]-camptothecin:
Eine Losung von 5 g (14,4 mmol) 20(S)-Camptothecιn in 200 ml absolutem Dimethylformamid wird unter Ruhren mit 7,27 g (36 mmol) N-(tert-Butoxycarb- onyl)-alanin-N-carbonsaureanhydrid sowie 500 mg (12 mmol) 4-(N,N-Dimethyl- amino)-pyπdin versetzt Nach 3 h Ruhren bei Raumtemperatur setzt man weitere
6,18 g (28,8 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)~alanin-N-carbonsäureanhydrid und 500 mg (12 mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin zu und laßt den Ansatz über Nacht bei Raumtemperatur im Ultraschallbad reagieren Anschließend wird im Vakuum eingeengt und der Ruckstand durch Flashchromatographie [Petrol- ether/Ethylacetat 1 : 1] gereinigt Man erhalt 4,7 g 63 % des Zielprodukts.
l.l.b) 20(S)-20-O-Alanyl-camptothecin, Trifluoracetat:
Eine Losung von Verbindung 1 1 a (4,41 g, 8 5 mmol) in einer Mischung aus 290 ml Dichlormethan und 50 ml wasserfreier Trifluoressigsaure wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen im Vakuum wird das Produkt aus Di- chlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefallt und grundlich mit Diethylether gewaschen Ausb . 4,2 g (93 %), [DC Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2 Rf = 0,33]
l.l.c) 20(S)-20-O-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fIuorenyl-9-methoxy- carbonyl)-Iysyl-alanyl]-camptothecin: 3,688 g (7,87 mmol) Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)- lysin und 1 ,595 g 1-Hydroxy-lH-benzotπazol Hydrat werden in 250 ml Dimethylformamid gelost Nach Zugabe von 1,81 g N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)- carbodiimid Hydrochlorid rührt man für 30 min bei Raumtemperatur Anschließend setzt man eine Losung aus Verbindung 1 1 b (3,5 g, 6,56 mmol) in 35 ml Dimethylformamid und 2,25 ml Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 2h bei Raumtemperatur Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromatographie [Petrolether/ Ethylacetat 2 1 -> Ethylacetat] erhalt man 5,212 g (91 %) der Zielverbindung [DC Acetonitril Rt = 0,65]
l.l.d) 20(S)-20-O-[Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-Iysyl-alanyl]-campto- thecin, Trifluoracetat:
Eine Suspension der obigen Verbindung (5,21 g, 5,99 mmol) in Dichlormethan (300 ml) wird mit wasserfreier Trifluoressigsaure (50 ml) versetzt und die resultierende Losung für 30 min bei Raumtemperatur gerührt Nach Einengen im Vakuum wird das Produkt mit Methanol ruckdestilhert und anschließend aus Dichlor- 98/15573 25
methan durch Zugabe von Diethylether ausgefallt Der Niederschlag wird abfiltriert (4,8 g, 90%) [DC Acetonitπl/Wasser 20 1 Rf = 0, 1]
l.l.e) 20(S)-20-O-{[Nα,NF-bis-tert-BHtoxycarbonyl-lysyl]-fN'-(πuorenyI-9- methoxycarbonyl)-Iysyl|-alanyl}-camptothecin 141 mg (0,41 mmol) Nα,NF'-bis-tert-Butoxycarbonyl-lysιn und 83 mg 1-Hydroxy- lH-benzotriazol Hydrat werden in 20 ml Dimethylformamid gelost Nach Zugabe von 94 mg N-Ethyl-N'-(dιmethylamιnopropyl)-carbodiimιd Hydrochlorid rührt man für lh bei Raumtemperatur Anschließend setzt man eine Losung aus Verbindung 1 1 d (300 mg, 0,34 mmol) in 3 ml Dimethylformamid und 58 μl Ethyl-diiso- propylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 30 min bei Raumtemperatur
Nach Einengen im Vakuum wird der Ruckstand mit Wasser digeriert und abgesaugt Das Produkt wird in DMF aufgenommen und mit Diethylether gefallt Man erhalt 338 mg (91 %) der Zielverbindung [DC Acetonitril/Wasser 10 1 Rj- - 0,65]
1.1.0 20(S)-20-O-{LysyI-[Nf-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-IysyI]-alanyl]- camptothecin, Bis-Trifluoracetat:
Bei 336 mg (0,306 mmol) der Verbindung 1 1 e werden mit 5 ml Trifluoressigsaure in 30 ml Dichlormethan in Analogie zu Beispiel 1 1 d die Boc-Schutz- gruppen entfernt Ausb 338 mg (98%)
l.l.g) 20(S)-20-O-{Nα,Nf-bis-[O-(3-O-MethyI-ß-L-fucopyranosyl)-4-hydroxy- phenylamino-thiocarbonyl]-lysyl-N -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl- a!anyl}-camptothecin
Eine Losung von 104 mg (0,368 mmol) p-Aminophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyra- nosid (Beispiel I 1) in Dioxan/Wasser 2 1 (15 ml) wird unter Ruhren mit Thio- phosgen (59μl, 0,77mmol) versetzt Nach 10 nun versetzt man mit 3 Äquivalenten
Ethyl-diisopropylamin, engt anschließend im Vakuum ein und trocknet den Ruckstand für lh im Olpumpenvakuum Das erhaltene Isothiocyanat wird in 50 ml absolutem Dimethylformamid gelost und mit 337 g (0,3 mmol) von Verbindung 1 1 f sowie 205 μl Ethyl-dnsopropylamin versetzt Man rührt für 16 h bei Raumtempe- ratur, engt dann im Vakuum ein und reinigt durch Flash-Chromatographie [Acetonitril/Wasser 50 1] Man erhalt 247 mg (54%) des Zielproduktes [DC Aceto- nitπl/Wasser 10 1 Rf = 0,46] 1.1) 20(S)-20-O-{Nα,NF-bis-[O-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyl)-4-hydroxy- phenylamino-thiocarbonyI]-lysyI-lysyl-alanyl}-camptothecin, Hydrochlorid
245 mg (0,161mmol) der Verbindung 1 1 g werden mit 0,5 ml Piperidin in 10 ml DMF 30 min bei Raumtemperatur umgesetzt Man engt ein, digeriert den Ruckstand mit Dichlormethan und destilliert das Losungsmittel nochmals im Vakuum ab Man nimmt den Ruckstand erneut in Dichlormethan/Methanol auf und fallt das Produkt mit Diethylether aus Man erhalt 185 mg (88%) der aminodeblockierten Verbindung. [DC Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 1 0,2 Rt^=0,24] Diese wird in Wasser suspendiert und mit einem Äquivalent einer 0,1N HCl-Losung in das Hydrochlorid überfuhrt Aus der wäßrigen Losung wird durch Gefriertrocknung die Zielverbindung erhalten
Beispiel 1.2:
20(S)-20-O-{Nα,NF-bis-[O-(3-O-MethyI-ß-L-fucopyranosyl)-4-hydroxy- phenylamino-thiocarbonyl]-lysyI-lysyl-valinyl}-camptothecin, Hydrochlorid
Figure imgf000028_0001
Die Synthese dieser Verbindung erfolgt völlig analog zur oben beschriebenen Synthese der Verbindung 1 1 Lediglich im ersten Reaktionsschritt wird an Stelle von N-(tert-Butoxycarbonyl)-alanin-N-carbonsaureanhydridN-(tert-Butoxycarbonyl)- valin-N-carbonsäureanhydrid mit 20-(S)-Camptothecin umgesetzt. Rf der Zielverbindung: 0,25 [Acetonitril/Wasser/Eisessig 5' 1 :0,2]

Claims

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- 28 -
Patentansprüche
Verbindungen der Formel (I)
Figure imgf000030_0001
worin
M für ein Peptid mit 3 bis 7 Aminosäurebausteinen steht, das über die α-Aminogruppe und/oder über Amino- und/oder Hydroxygruppen der Seitenketten mit 1 bis n' gleichen oder voneinander verschiedenen Gruppierungen
-L-Sp-K
verknüpft ist, wobei weitere funktionelle Gruppen des Peptids gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können und
(-L-Sp-K)n für n gleiche oder voneinander verschiedene Gruppierungen -L-Sp-K steht,
wobei
eine Zahl von 1 bis n' bedeutet und n' der maximalen Anzahl möglicher Anknüpfungsstellen von M entspricht,
für eine Gruppe der Formeln
R
O O
II
,C.
-NH -NH oder N ) *N steht
-NH N worin
R1 Chlor oder Hydroxyalkylamino bedeutet,
Sp für Arylen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder für Alkylen mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen steht, die jeweils gegebenenfalls substituiert sind.
K für einen Rest der Formel (II)
Figure imgf000031_0001
steht, worin
A Methyl, Hydroxymethyl, Alkoxymethyl mit bis zu 6 Kohlen- stoffatomen, Acyloxymethyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formel -CH2-B bedeutet, worin
B für einen Rest der Formel (II) steht,
R , R und R unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls durch Hydroxy substituiertes Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls durch Alkyl oder Acyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiertes Amino, Halogen, Sulfat oder eine Gruppe der Formeln
O — o O
— 0-(CH2) -C oder -(CH2) C
R o R6
bedeuten, worin
R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder
Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen stehen oder für Amino, das gegebenenfalls durch Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, stehen und
s und t unabhängig voneinander die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen können
oder
R , R und R unabhängig voneinander für einen Rest der Formel (II) stehen
oder
"5 Λ zwei der Reste R~, R" , R zusammen für eine Epoxygruppe stehen,
sowie deren Isomere, Isomerengemische und Salze.
2. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, worin M für ein Peptid steht, das über Aminofunktionen mit den Resten L verknüpft ist, über eine Acylfunküon mit dem Camptothecin-Rest verknüpft ist und dessen Aminosäurebausteine gegebenenfalls Schutzgruppen tragen können,
sowie deren Isomeren, Isomerengemische und Salze.
3. Verbindungen gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Tri-, Tetra- oder Pentapeptide handelt.
4. Verbindungen gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurebausteine des Peptids ausgewählt sind aus der Gruppe beste- hend aus Glycyl, Alanyl, Valyl, Leucyl, Lysyl, Seryl, Glutamyl, Threonyl,
Asparagyl, Isoleucyl, Diaminopropionyl, Diaminobutyryl, Histidyl, Arginyl und/oder Ornithyl.
5. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1,
worin L für eine Gruppe der Formel
O
II
Q
-NH' ^ oder ^ steht,
sowie deren Isomeren, Isomerengemische und Salze.
6. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1,
worin
Sp für Arylen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen steht, das gegebenenfalls noch ein- oder mehrfach durch Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Nitro, Cyano, Halogen, Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Halogenalkyl mit bis zu 4 Kohlen- Stoffatomen oder durch Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
sowie deren Isomere, Isomerengemische und Salze.
7. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, worin K für einen Rest der Formel (II) steht,
wobei
A Methyl, Hydroxymethyl, Methoxymethyl oder Acetoxymethyl bedeutet,
R2 Wasserstoff, Hydroxyl, Methoxy oder eine Gruppe der Formeln
Figure imgf000033_0001
bedeutet, worin
s und t unabhängig voneinander die Werte 1 oder 2 annehmen können und R und R' unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen,
oder
R2 für einen Rest der Formel (II) steht,
R3 Wasserstoff, Hydroxyl, Halogen, Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Sulfat oder eine Gruppe der Formeln
oder
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0002
bedeutet, worin
s und t unabhängig voneinander die Werte 1 oder 2 annehmen können und
R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen oder für Amino, das gegebenenfalls durch Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, stehen,
R4 Hydroxyl, Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Hydroxy substituiert ist, Amino, das gegebenenfalls durch Alkyl oder Acyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, oder eine Gruppe der Formeln
-0-(CH2)s-C
Figure imgf000034_0003
bedeutet, worin
s und t unabhängig voneinander die Werte 1 oder 2 annehmen können und R5 und R6 unabhängig voneinander für Hydroxyl oder Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen,
oder worin
R2 und R3 gemeinsam für eine Epoxygruppe stehen,
sowie deren Isomere, Isomerengemische und Salze.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel (III)
Figure imgf000035_0001
mit einer dem oben definierten Rest M entsprechenden aktivierten Carboxylkomponente Ma, die gegebenenfalls Schutzgruppen trägt, in einem geeigneten Lösungsmittel, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, nach üblichen Methoden umsetzt, gegebenenfalls mittels bekannter Methoden selektiv eine, mehrere oder alle Schutzgruppen von M abspaltet und das Produkt mit Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)
K-Sp-La (IV),
worin
K und Sp wie oben definiert sind und La für eine reaktive Vorstufe der Gruppe L steht, umsetzt, wobei gegebenenfalls die Schutzgruppen selektiv abgespalten und schrittweise noch andere Gruppen der Formel K-Sp-L- in vergleichbarer Weise eingeführt werden können,
oder daß man in vergleichbarer Weise nach üblichen Methoden einen ersten Aminosäurerest in Form der entsprechenden gegebenenfalls Schutz- gruppen tragenden aktivierten Carboxylkomponente einführt, gegebenenfalls Schutzgruppen abspaltet, weiterhin gegebenenfalls Schutzgruppen tragende Aminosäurereste entweder sukzessiv oder als Peptidbaustein anknüpft, gegebenenfalls Schutzgruppen abspaltet, wie oben angegeben Reste der Formel K-Sp-L, einführt und falls erforderlich Schutzgruppen abspaltet,
und daß man gegebenenfalls die Stereoisomere nach üblichen Methoden trennt und gegebenenfalls die Verbindungen in ihre Salze überführt.
9. Verwendung von Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1 zur Her- Stellung von Arzneimitteln.
10. Arzneimittel enthaltend eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1.
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