DE69821783T2

DE69821783T2 - Polymere verbindungen von camptothecin

Info

Publication number: DE69821783T2
Application number: DE69821783T
Authority: DE
Inventors: Francesco Angelucci; Fabrizio Orzi; Gabriele Fachin; Valeria Caiolfa; Moreno Zamai; Antonino Suarato
Original assignee: Pharmacia Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2018-09-23
Also published as: DE69821783D1; AR013535A1; EA200000376A1; BG104355A; ZA988923B; HUP0003690A2; PL339574A1; BR9815236A; DK1019090T3; TW564178B; EA002030B1; ES2216317T3; MY116287A; AU9627398A; CN1154512C; US6328953B1; NZ503879A; HK1032005A1; ATE259662T1; AU749321B2

Description

Die Erfindung betrifft Polymerkonjugate von 20-O-[Glycyl-aminoacyl-glycyl]camptothecinen. In unserer WO 95/10304 werden Konjugate von Camptothecinen beschrieben und beansprucht, die über einen Peptidyl-Spacer an ein Polymer gebunden sind. Wir haben nun gefunden, dass die Konjugate, in denen der Spacer ein Glycyl-aminoacyl-glycyl ist, außergewöhnlich wertvoll als Antitumormittel sind und bemerkenswerte Antitumoraktivität und verringerte Toxizität im Vergleich zu dem freien Arzneimittel aufweisen.
Die vorliegende Erfindung liefert insbesondere Polymerkonjugate der Formel (1), die aus

(i) 85 bis 97 Mol.% N-(2-Hydroxypropyl)methacryloylamideinheiten, die durch Formel (3) wiedergegeben werden,
(ii) 3 bis 15 Mol.% 20-O-(N-Methacryloyl-glycyl-aminoacyl-glycyl)camptothecineinheiten, die durch Formel (4) wiedergegeben werden,
wobei n 2 bis 8 ist, -[O-CPT] den Rest eines Camptothecins mit der Formel (2) wiedergibt:
das an der C-20-Position gebunden ist und wobei jeder von R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅, die gleich oder unterschiedlich sind, Wasserstoff, lineares oder verzweigtes C₁- bis C₁₂-Alkyl, Nitro, Amino, (CH₂)_aNR₆R₇, in der a 0 bis 4 beträgt und R₆ und R₇ Wasserstoff sind, oder einer von R₆ oder R₇ Wasserstoff und der andere von R₆ oder R₇ C₁- bis C₆-Alkyl ist, oder NR₆R₇ einen Piperazin- oder N-Alkylpiperazinring, der gegebenenfalls mit linearem oder verzweigtem C₁- bis C₆-Alkyl substituiert ist, oder Piperidinring wiedergibt, (CH₂)_aNHCOR₈, in dem a wie oben definiert und R₈ lineares oder verzweigtes C₁- bis C₈-Alkyl oder eine Gruppe NR₆R₇ wie oben ist, Hydroxy oder O-CO-R₈ ist, in der R₈ wie oben definiert ist oder einen 1-Piperidinring oder 1,4'-Bipiperidin wiedergibt, oder R₂ und R₃ zusammengenommen den Rest O-(CH₂)_b-O wiedergeben, in dem b 1 oder 2 ist, oder R₄ und R₅ den Rest (CH₂)_m wiedergeben, in dem m 2 bis 4 beträgt, oder den Rest CH₂-O-CH₂ oder CH₂NHCH₂ wiedergeben, und
(iii) 0 bis 12 Mol.% N-Methacryloyl-glycin oder N-(2-Hydroxypropyl)methacryloyl-glycinamideinheiten bestehen, die durch Formel (5) wiedergegeben werden:
wobei [Z] eine Hydroxygruppe oder einen Rest der Formel -NH-CH₂-CH(OH)-CH₃ wiedergibt.

Die Polymerkonjugate der Formel (1) können als MAG-CPT(s) bezeichnet werden und können auch wie folgt wiedergegeben werden: [(3)]_x; [(4)]_y; [(5)]_z, wobei (3), (4) und (5) Einheiten mit den oben definierten Formeln sind, und x 85 bis 97 Mol.% ist, y 3 bis 15 Mol.% ist und z 0 bis 12 Mol.% ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen sind jene, in denen -[OCPT] in Formel (4) ein Rest eines Camptothecins mit der Formel (2) ausgewählt aus:

– Camptothecin [2a: R₁ = R₂ = R₃ = R₄ = R₅ = H]
– 9-Aminocamptothecin [2b: R₁ = R₂ = R₃ = R₅ = H, R₄ = NH₂]
– 9-Nitrocamptothecin [2c: R₁ = R₂ = R₃ = R₅ = H, R₄ = NO₂]
– 7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin [2d: R₁ = R₂ = R₄ = H, R₃ = OH, R₅ = CH₂CH₃]
– 7-Ethyl-10-[1,4'-bipiperidinyl]carbonyloxycamptothecin [2e: R₁ = R₂ = R₄ = H, R₃ = OCO-[1,4'-bipiperidinyl], R₅ = CH₂CH₃]
– 7-Methylendimethylamino-10-hydroxycamptothecin [2f: R₁ = R₂ = R₄ = H, R₃ = OH, R₅ = CH₂N(CH₃)₂] und
– 7-[Methylen-(4'-methylpiperazino)]-9,10-ethylendioxycamptothecin [2g: R₁ = R₄ = H, R₂, R₃ = OCH₂CH₂-O, R₅ = Methylen-(4'-methylpiperazino)]

Die Polymerkonjugate der Formel (1) enthalten vorzugsweise die durch die Formel (3) wiedergegebenen N-(2-Hydro xypropyl)methacryloylamideinheiten in einem Anteil von 90% oder mehr; insbesondere 90%. Das Konjugat kann auch 3 bis 10 Mol.% der durch Formel (4) wiedergegebenen Einheiten enthalten, insbesondere 10 Mol.% dieser Einheiten. Vorzugsweise enthält das Konjugat der Formel (1) keine Reste der Formel (5), d. h. z ist Null. Der Gehalt an aktivem Camptothecinderivat der Formel (2) in dem Konjugat der Formel (1) kann 2 bis 15% (Gew./Gew.) betragen, insbesondere 10% (Gew./Gew.).
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann nach einem Verfahren (hier als Weg I bezeichnet) durchgeführt werden, das die Umsetzung von 20-O-(Aminoacyl-glycyl)camptothecinderivat der Formel (6) NH₂-(CH₂)_n-CO-Gly-[OCPT] (6),in der n und [OCPT] wie oben definiert sind, mit einem Polymer (B), das im Wesentlichen aus
85 bis 97 Mol.% N-(2-Hydroxypropyl)methacryloylamideinheiten, die durch Formel (3) wie oben definiert wiedergegeben werden, und
3 bis 15 Mol.% N-Methacryloyl-glycylderivateinheiten besteht, die durch Formel (7) wiedergegeben werden,
wobei [Y] der Rest eines aktiven Esters, vorzugsweise p-Nitrophenylester, oder eine Hydroxygruppe ist,
und gegebenenfalls Verdrängen der verbleibenden aktiven Estergruppen durch 1-Amino-2-propanol umfasst.
Die Kondensation des Derivats der Formel (6) mit dem Polymer der Formel (B) wird unter Bedingungen durchgeführt, un ter denen die Beschaffenheit der Bindung zwischen Camptothecin und dem Aminoacyl-glycyl-Spacer sowie diejenige des Konjugats erhalten bleiben kann.
Polymere der Formel (B), die aus N-(2-Hydroxypropyl)methacryloylamideinheiten der Formel (3) und N-Methacryloyl-glycin-Einheiten der Formel (7) bestehen, werden durch Copolymerisation von N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid mit N-Methacryloyl-glycin oder aktiven N-Methacryloyl-glycin-esterderivaten hergestellt, wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben ist. Der Rest [Y] kann eine Phenoxygruppe wiedergeben, die an dem Phenylring durch eine oder mehrere elektronenziehende Gruppen substituiert ist, wie Nitro oder Halogen. Der Rest [Y] steht vorzugsweise für p-Nitrophenoxy.
Reaktionen zwischen (6) und (B) zur Bildung von Polymer-Arzneimittel-Konjugat der Formel (1) der vorliegenden Erfindung können in der Regel bei einer Temperatur von 15 bis 30°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, für 15 Stunden durchgeführt werden; dann kann die Aminolyse der verbleibenden aktiven Estergruppen in Gegenwart von 1-Amino-2-propanol bei Raumtemperatur für 0,5 bis 1 Stunde durchgeführt werden. Das Konjugat wird geeigneterweise mit Ethylacetat ausgefällt, in Ethanol gelöst und wieder mit Ethylacetat ausgefällt.
Das Polymer (B), bei dem [Y] den Rest eines aktiven Esters wiedergibt, das in einer Konzentration von 15% (Gewicht/Volumen) in trockenem Dimethylsulfoxid bereitgestellt wird, wird mit 20-O-(Aminoacyl-glycyl)camptothecinderivat (6), 3% Gewicht/Volumen), bei Raumtemperatur 15 Stunden behandelt. Dann wird 1-Amino-2-propanol, 0,1% (Gewicht/Volumen), zugefügt und die Reaktionsmischung eine Stunde auf Raumtemperatur gehalten. Das Polymer-Arzneimittel-Konjugat, MAG-CPTs, kann mit Ethylacetat ausgefällt, aufgefangen, mit Ethylacetat gewaschen, dann mit absolutem Ethanol in einer Konzentration von 10% (Gewicht/Volumen) aufgelöst und erneut mit Ethylacetat ausgefällt werden, um die erfindungsgemäßen Konjugate der Formel (1) zu ergeben.
Der Gehalt des erfindungsgemäßen Polymerkonjugats an Camptothecin wird mit HPLC oder Extinktionsspektroskopieanalyse ermittelt.
Die Verbindungen der Formel (1) können auch nach einem Verfahren (hier als Weg II bezeichnet) hergestellt werden, das die Polymerisation zwischen N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid der Formel (8)
und 20-O-[Methacryloyl-glycyl-(aminoacyl)glycyl]camptothecinderivaten der Formel (9)
wobei n und [OCPT] wie oben definiert sind, unter Bedingungen umfasst, die in der Lage sind, die Beschaffenheit der Bindung zwischen Camptothecin und dem Spacer Glycyl-aminoacyl-glycyl sowie diejenige des Konjugats aufrechtzuerhalten.
Die Reaktion zwischen (8) und (9) kann in der Regel bei einer Temperatur von 50 bis 70°C, vorzugsweise 60°C, 6 bis 24 Stunden, vorzugsweise 15 Stunden, in aprotischem Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, und in Gegenwart von Katalysator, wie 2,2'-Azobisisobutyronitril, durchgeführt werden. Das Konjugat wird mit Ethylacetat ausgefällt, in Ethanol gelöst und erneut mit Ethylacetat ausgefällt.
N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (8), das in einer Konzentration von 22% (Gewicht/Volumen) bereitgestellt wird, und 20-O-[Methacryloyl-glycin-(6-aminohexanoyl)-glycyl]camptothecinderivat (9) in einer Konzentration von 6% (Gewicht/Volumen) in trockenem Dimethylsulfoxid werden beispielsweise unter Stickstoff auf 60°C erwärmt, und dann wird 2,2'-Azobisisobutyronitril in einer Konzentration von 1,3% (Gewicht/Volumen) zugegeben. Die Mischung wird 24 Stunden unter Rühren gehalten. Danach wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt, und das Konjugat wird geeigneterweise mit Ethylacetat ausgefällt, in Ethanol gelöst und erneut mit Ethylacetat ausgefällt, um erfindungsgemäßes Konjugat der Formel (1) zu ergeben.
Die Erfindung liefert auch 20-O-Acylamino-glycyl-camptothecinderivate (6) wie oben definiert und deren Salzderivate. Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung von 20-O-(Aminoacyl-glycyl)camptothecinderivaten (6), bei dem der Rest der Formel (2) wie oben definiert mit einem N-geschützten Aminoacyl-glycyl-Derivat der Formel (10) R₉-HN-(CH₂)_n-CO-Gly-[P] (10)kondensiert wird, wobei n wie oben definiert ist, R₉ eine Amino-Schutzgruppe wiedergibt, wie Boc, FMOC, Triphenylsilyl, Diphenylmethylen oder Triphenylmethyl, und [P] ein Rest eines aktivierten Esters ist, wie o-Nitrophenoxy oder N-Hydroxysuccinimid, um eine Verbindung zu ergeben, die durch Formel (11) R₉-NH-(CH₂)_n-CO-Gly-[OCPT] (11)wiedergegeben wird, wobei n, [OCPT] und R₉ wie oben definiert sind, und die N-Schutzgruppe aus der resultierenden Verbindung entfernt wird.
Die Herstellung der Verbindungen der Formel (10) erfolgt nach Standard-Syntheseverfahren, die literaturbekannt sind. Geeignete N-geschützte Aminoacylderivate der Formel (10) schließen ein: 6-N-(Triphenylmethyl)hexanoyl-glycyl-p-nitrophenylester (10a), 6-N-(tert.-Butoxycarbonyl)hexanoyl-glycyl-p-nitrophenylester (10b).
Somit kann beispielsweise Camptothecin (2a) mit einem molaren Überschuss, beispielsweise bis zu einem fünffachen molaren Überschuss oder mehr, insbesondere 2 Moläquivalent eines N-geschützten Aminoacylderivats der Formel 10, in wasserfreiem Lösungsmittel, wie trockenem Dimethylsulfoxid, in Gegenwart von 4-Dimethylaminoppyridin umgesetzt werden.
Die Reaktion kann in der Regel in 8 bis 48 Stunden bewirkt werden. Die Reaktion wird in der Regel bei einer Temperatur von 15 bis 40°C durchgeführt. Die temporär aminogeschützte Gruppe R₉ wird durch ein geeignetes Entschützungsmittel entfernt, um das 20-O-(Aminoacyl-glycyl)camptothecin der Formel (6a) zu ergeben. Entschützen kann daher durch Säurebehandlung, wie Behandlung mit 1,5 N wässriger Salzsäure in Essigsäure oder 90% wässriger Trifluoressigsäure, für eine bis 6 Stunden bei einer Temperatur von 10 bis 30°C erreicht werden, vorzugsweise zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Die Erfindung liefert auch 20-O-[Methacryloyl-glycyl-(aminoacyl)-glycyl]camptothecinderivate (9) wie oben definiert und ein Verfahren zu deren Herstellung, bei dem Camptothecinderivate der Formel (6) wie oben definiert, mit N-Methacryloyl-glycyl der Formel (7')
kondensiert werden, wobei [Y'] eine Abgangsgruppe ist. Somit wird beispielsweise 20-O-[Aminoacyl-glycyl]camptothecin (6a), das in einer Konzentration von 25% (Gewicht/Volumen) in trockenem Dimethylsulfoxid bereitgestellt wird, mit N-(Methacryloyl-glycyl)-p-nitrophenylester (7'), [Y' = p-Nitrophenol), 13% (Gewicht/Volumen), in Gegenwart von äquivalenter Menge Base, wie Triethylamin, für 15 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Das fertige Derivat wird durch Ausfällen isoliert und durch Chromatographie gereinigt.
Die Verbindungen der Formel (8) und das Polymer (B) sind bekannt oder können nach bekannten Syntheseverfahren hergestellt werden.
Alle der Camptothecinderivate der Formel (2) sind bekannt, siehe beispielsweise Medicinal Research Reviews, Band 17, Nr. 4, 367 bis 425, 1997, oder können nach wohl bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die polymergebundenen Konjugate der Formel (1) haben ein Molekulargewicht im Bereich von 5 000 bis 45 000, vorzugsweise 18 000 bis 35 000. Polymer-Arzneimittel-Konjugate der Formel (1) sind wasserlöslich und zeigen ausgeprägte Antitumoraktivität und verringerte Toxizität, verglichen mit dem freien Camptothecin.
ANTITUMORAKTIVITÄT
Verbindung A1 wurde an menschlichem Kolonkarzinom (HT29), das in Nacktmäuse transplantiert worden war, im Vergleich mit dem freien Arzneimittel (2a) durch den intravenösen Weg getestet. A1 erwies sich als nicht toxisch und ergab > 95% Tumorinhibierung in allen getesteten Dosen mit einer außer gewöhnlich hohen Anzahl tumorfreier Tiere am Ende des Experiments (90 Tage), Tabelle 1. Verbindung A2, die in dem gleichen Modell im Vergleich zu freiem 7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin (2d) getestet wurde, erwies sich ebenfalls als aktiv und nicht toxisch und ergab 98% Tumorinhibierung in der höchsten getesteten Dosis von 40 mg/kg (Tabelle 2).
Verbindung A1 wurde auch mittels des intravenösen Wegs an einer breiten Palette anderer menschlicher Tumormodelle getestet: A2780 Eierstockkarzinom, MX1 Brustkrebs, A549 nicht-kleinzelliges (NSC)-Lungenkarzinom und M14 Melanom. Verbindung A1 war aktiver in Bezug auf das entsprechende freie Camptothecin (2a) und ergab eine große Anzahl geheilter Tiere.
Die Aktivität gegen MX1 Brustkrebs, A2780 Eierstockkrebs und M14 Melanom im Vergleich mit freiem Camptothecin wird jeweils in Tabelle 3, 4 und 5 wiedergegeben. Verbindung A1 war sehr aktiv gegen diese Tumormodelle, für die vollständige Inhibierung des Tumorwachstums mit insgesamt 7/7 und 8/8 geheilten Mäusen nach wiederholter IV-Verabreichung des Arzneimittels entweder mit 15 oder mit 20 mg/kg in dem Schema q4dx6 beobachtet wurde. Verbindung A1 erwies sich auch als wirksam gegen NSC-Lungenkarzinom in 20 mg/kg (IV q4dx6) mit TI% 94 und bemerkenswerter Verzögerung des Tumorwachstums von 70 Tagen, die bei anderen brauchbaren Chemotherapeutika niemals beobachtet wurde (Tabelle 6).
Tabelle 1: Antitumoraktivität von A1 an menschlichem Kolonkarzinom (HT29) im Vergleich mit (2a), Behandlung IV q4dx6
Tumorfragmente wurden subkutan implantiert. Die Behandlung begann, wenn der Tumor tastbar war.

TI%: (Tumorinhibierung %) wurde am 37. Tag berechnet.
ΔTGD: Tumorwachstumsverzögerung der behandelten Tiere – Tumorwachstumsverzögerung der Kontrolltiere.

Tabelle 2: Antitumoraktivität von A2 an menschlichem Kolonkarzinom (HT29) im Vergleich mit (2d)
Tumorfragmente wurden subkutan implantiert. Die Behandlung begann, wenn der Tumor tastbar war.

Tabelle 3: Antitumoraktivität von A1 an menschlichem Eierstockkarzinom MX1 im Vergleich mit Camptothecin (2a)
Tumorfragmente wurden subkutan implantiert. Die Behandlung begann, wenn der Tumor tastbar war. Dosen werden als Camptothecin-Äquivalente ausgedrückt.

TI%: Die Inhibierung des Tumorwachstums eine Woche nach der letzten Behandlung.
Toxizität: Anzahl der infolge der Toxizität gestorbenen Mäuse/Gesamtanzahl der Mäuse
ΔTGD: Tumorwachstumsverzögerung der behandelten Tiere – Tumorwachstumsverzögerung der Kontrolltiere.
Tumorfreie: geheilte Mäuse am 90. Tag nach Tumorimplantat.

Tabelle 4: Antitumoraktivität von A1 gegen A2780, menschlicher Eierstockkrebs, im Vergleich mit Camptothecin (2a)
Tumorfragmente wurden subkutan implantiert. Die Behandlung begann, wenn der Tumor tastbar war.
Dosen sind als Camptothecin-Äquivalente angegeben.

Tabelle 5: Antitumoraktivität von A1 gegen menschliches Melanom M14 im Vergleich mit Camptothecin (2a)
Tumorfragmente wurden subkutan implantiert. Die Behandlung begann, wenn der Tumor tastbar war.
Dosen sind als Camptothecin-Äquivalente angegeben.

Tabelle 6: Antitumoraktivität von A1 gegen menschliches NSC-Lungenkarzinom, A549, im Vergleich mit Camptothecin (2a)
Tumorfragmente wurden subkutan implantiert. Die Behandlung begann, wenn der Tumor tastbar war.
Dosen sind als Camptothecin-Äquivalente angegeben.

Somit sind die erfindungsgemäßen Verbindungen brauchbar zur Behandlung von Leukämie und soliden Tumoren, wie Kolon-, Kolonrektal-, Magen-, Eierstock-, Brust-, Prostata-, Lungen-, Nieren- und auch Melanomtumoren. Ein Mensch kann daher mit einem Verfahren behandelt werden, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polymerkonjugats an denselben umfasst. Der Zustand des menschlichen Patienten kann so gebessert werden. Der vorgesehene Dosisbereich hängt von dem Verabreichungswege und dem Alter, Gewicht und Zustand des behandelten Patienten ab. Die Polymerkonjugate der Formel (1) werden in der Regel auf parenteralem Wege verabreicht, beispielsweise intramuskulär, intravenös oder durch Bolusinfusion. Ein geeigneter Dosisbereich ist 1 bis 1000 mg Camptothecin-Äquivalent pro m² Körperoberfläche, beispielsweise 10 bis 100 mg/m².
Das Polymerkonjugat (1) kann zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden. In der Regel werden sie zur parenteralen Verabreichung formuliert, beispielsweise durch Auflösen in Wasser zur Injektion oder physiologischer Salzlösung.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung
BEISPIEL 1
Herstellung von N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycyl-p-nitrophenylester (10a: n = 5, R₉ = Boc, P = p-Nitrophenol]
Glycinethylesterhydrochlorid (9,55 g, 68,4 mmol), gelöst in Dimethylformamid (100 ml), wurde mit Triethylamin (9,5 ml, 68,4 mmol) und danach N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-p-nitrophenylester (19 g, 54 mmol) zugegeben, das nach dem gleichen Verfahren hergestellt war, wie in unserer EP-A-0 673 258 beschrieben ist. Die Reaktionsmischung wurde zwei Stunden auf Raumtemperatur gehalten, dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat (300 ml) aufgelöst und nacheinander mit kalter wässriger 1 N Salzsäure (3 × 200 ml), Wasser (100 ml), 5% wässriger Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 200 ml) und Wasser (2 × 200 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde aus Ethylether kristallisiert, um N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycylethylester zu ergeben (15 g, DC an Kieselgelplatte F₂₅₄ (Merck), Eluieren mit System-Ethylether, R_f = 0,3), der mit Ethanol (150 ml) suspendiert und unter Rühren mit 1 N wässrigem Natriumhydroxid (48 ml, 48 mmol) behandelt wurde. Nach einer Stunde wurde der Reaktion 1 N wässrige Salzsäure (48 ml, 48 mmol) zugegeben und unter vermindertem Druck destilliert. Der Rückstand wurde in trockenem Tetrahydrofuran (200 ml) suspendiert, p-Nitrophenol (6,53 g, 47 mmol) zugegeben, auf 0°C abgekühlt und danach eine Lösung von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (9,7 g, 47 mmol) in Tetrahydrofuran (100 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen über Nacht stehen gelassen, dann auf einem gesinterten Glastrichter filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde aus Ethylether kristallisiert, um 17,5 g der Titelverbindung (10a) zu ergeben. DC an Kieselgelplatte F₂₅₄ (Merck), wobei das System mit Methylenchlorid/Methanol (95/5, Volumen/Volumen) eluiert wurde, R_f = 0,34.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO) δ:
1,34 (s, 9H, t-Bu), 1,0 bis 1,7 [m, 6H, NH-CH₂-(CH ₂)₃-CH₂-CO); 2,15 (t, J = 7,2 Hz, 2H, NH-(CH₂)₄-CH ₂-CO); 2,85 [q, J = 6,5 Hz, 2H, NH-CH ₂-(CH₂)₄-CO]; 4,11 (d, J = 5,5 Hz, 2H, CONHCH ₂COO); 6,70 [bs, 1H, NH-(CH₂)₅-CO]; 7,40 (m, 2H, aromatische 2,6-H); 8,30 (m, 2H, aromatische 3,5-H); 8,43 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH₂COOH.
BEISPIEL 2
Herstellung von 20-O-[(N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycyl]camptothecin [11a: n = 5, R₉ = t-Boc, OCPT = (2a)]
Camptothecin (2a; 3,4 g, 10 mmol, das mit Dimethylsulfoxid (50 ml) suspendiert war, wurde mit N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycyl-p-nitrophenylester (10a; 6,3 g, 15 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (2,4 g, 20 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden stehen gelassen, und dann wurde eine aliquote Zugabemenge von N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycyl-p-nitrophenylester (6,3 g, 15 mmol) zugegeben. Nach 48 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit Methylenchlorid (500 ml) verdünnt und mit 0,2 N wässriger Salzsäure (2 × 250 ml) und Wasser (2 × 250 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Methylenchlorid (100 ml) aufgelöst, Ethylether (500 ml) zugegeben und bei 0°C über Nacht gehalten, um 5 g der Titelverbindung (11a) in fester Form zu ergeben. DC an Kieselgelplatte F₂₅₄ (Merck), wobei das System mit Methylenchlorid/Methanol (95/5, Volumen/Volumen) eluiert wurde, R_f = 0,44.
BEISPIEL 3
Herstellung von 20-O-(6-Aminohexanoyl-glycyl)camptothecin [6a: n = 5, OCPT = (2a)]
20-O-[(N-tert.-Butyloxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycyl]camptothecin (11a; 5 g) wurde mit 90% wässriger Trifluoressigsäure (40 ml) eine Stunde behandelt, dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Ethylether (300 ml) trituriert und abfiltriert. Der Feststoff wurde in Methanol (200 ml) gelöst, unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen (50 ml) reduziert, Ethylether (300 ml) zugegeben. Der Niederschlag wurde aufgefangen, um 3,9 g der Titelverbindung (6a) zu ergeben.
DC an Kieselgelplatte F₂₅₄ (Merck), wobei das System mit Methylenchlorid/Methanol/Essigsäure/Wasser (80/20/7/3, Volumen/Volumen) eluiert wurde, R_f = 0,83.
BEISPIEL 4
Herstellung von 20-O-[Methacryloyl-glycyl-(6-aminohexanoyl)-glycyl]camptothecin [9a: n = 5, OCPT = (2a)]
20-O-(6-Aminohexanoyl-glycyl)camptothecintrifluoracetat (6a; 2,53 g, 4 mmol) wurde in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (10 ml) gelöst und Methacryloyl-glycyl-p-nitrophenylester (1,32 g, 5 mmol), hergestellt wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben, und Triethylamin (0,56 ml, 4 mmol) zugefügt. Nachdem über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurde die Lösung in Wasser (100 ml) gegossen und der Niederschlag aufgefangen und mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen. Das feste Material wurde an Silikagel unter Verwendung einer Mischung aus Methylenchlorid/Ethanol (95/5, Volumen/Volumen) Flash-chromatographiert, um 2,2 g der Titelverbindung (9a) zu ergeben. DC an Kieselgelplatte F₂₅₄ (Merck), wobei das System mit Methylenchlorid/Methanol (9/1, Volumen/Volumen) eluiert wurde, R_f = 0,62.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO) δ:
0,90 (t, J = 7,3 Hz, 3H, CH ₃-18); 1,1 bis 1,6 [m, 6H, NHCH₂-(CH ₂)₃-CH₂CO]; 2,0 bis 2,2 [m, 4H, CH ₂-19 + NH-(CH₂)₄-CH ₂-CO]; 2,95 (q, J = 6,3 Hz, 2H, NH-CH ₂-(CH₂)₄CO); 3,63 (d, J = 5,8 Hz, 2H, CONH-CH ₂-CONH); 3,97 (dd, J = 17,8, 5,9 Hz, 1H, CONHCH _aCH_bCOO); 4,15 (dd, J = 17,8, 5,9 Hz, 1H, CONHCH_a CH _bCOO); 5,29 (s, 2H, CH ₂-5); 5,33 [q, J = 1,6 Hz, 1H, CH₃CH=C(H _a)(H_b)]; 5,48 (s, 2H, CH ₂-17); 5,69 [m, 1H, CH₃CH=C(H_a)(H _b)]; 7,15 (s, 1H, H-14); 7,6 bis 7,9 (m, 3H, H-10 + H-11 + NH-(CH₂)₅CO]; 8,0 (t, J = 5,8 Hz, 1H, CO-NH-CH₂CONH); 8,15 (m, 2H, H-9 + H-12); 8,32 (t, J = 5,9 Hz, 1H, CO-NH-CH_aCH_bCOO); 8,69 (s, 1H, H-7).
BEISPIEL 5
Herstellung von 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-(6-aminohexanoyl-glycyl)camptothecintrifluoracetat [6b: n = 5, OCPT = (2d)]
7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin (2d, 0,8 g, 2 mmol), N-(tert.-Butoxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycin-p-nitrophenylester (10a; 2,5 g, 6 mmol) und 4-Dimethylaminopyridn wurden in trockenem Dimethylsulfoxid (30 ml) gelöst und 3 Tage unter Rühren auf Raumtemperatur gehalten. Nachdem die Reaktionsmischung in 0,1 N wässrige Salzsäure (500 ml) gegossen worden war, um einen Niederschlag zu ergeben, der aufgefangen wurde, wurde dieser dann in Methylenchlorid (300 ml) gelöst und mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit 90% wässriger Trifluoressigsäure (40 ml) drei Stunden behandelt, dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde an Silikagel unter Verwendung einer Mischung aus Methylenchlorid/Essigsäure/Methanol (100/5/20, Volumen/Volumen) als Eluierungssystem Flash-chromatographiert. Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten, wurden zusammengegeben und unter vermindertem Druck eingedampft, um 1,02 g (6b) als Trifluoressigsäuresalzderivat zu ergeben.
DC an Kieselgelplatte F₂₅₄ (Merck), Eluierungssystem Methylenchlorid/Methanol/Essigsäure/Wasser (80/20/7/3, Volumen/Volumen), R_f = 0,4.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO) δ:
0,89 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH ₃-CH₂-20); 1,1 bis 1,5 (m, 9H, NH₂-CH₂-CH ₂-CH ₂-CH ₂-CH₂ + CH ₃-CH₂-7); 1,80 (s, 3H, CH ₃-COOH); 2,10 (m, 4H, CH₃-CH ₂-20 + CH ₂-CONH); 2,53 (t, 6,8 Hz, 2H, CH ₂-NH₂); 3,06 (m, 2H, CH₃-CH ₂-7); 3,98, 4,13 (zwei dd, J = 17,6, 5,7 Hz, 2H, CONH-CH ₂-CO); 5,27 (s, 2H, CH ₂-5); 5,46 (s, 2H, CH ₂-17); 7,01 (s, 1H, H-14); 7,40 (m, 2H, H-9 + H-11); 7,99 (d, J = 9,8 Hz, 1H, H-12); 8,33 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONH-CH₂-CO).
BEISPIEL 6
Herstellung von 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-(6-aminohexanoyl-glycin)camptothecinhydrochlorid [6b: n = 5, OCPT = (2d)]
7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin (2d, 0,8 g, 2 mmol) wurde mit N-(tert.-Butoxycarbonyl)-6-aminohexanoyl-glycyl-p-nitrophenylester (10a; 2,5 g, 6 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin wie in Beispiel 5 beschrieben umgesetzt. Das aus der Reaktionsmischung durch Extraktion mit Methylenchlorid erhaltene Rohmaterial wurde in einer Mischung aus 1,5 N Salzsäure und Essigsäure (20 ml) gelöst. Nachdem die Lösung für eine Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurde sie durch Destillation auf ein kleines Volumen reduziert, und es wurde Ethylether (100 ml) zugegeben. Der Niederschlag wurde aufgefangen und mit Ethylether (2 × 50 ml) gewaschen, um 1 g der Titelverbindung (6b) als freies Aminoderivat zu ergeben.
BEISPIEL 7
Herstellung des MAG-Camptothecins über Weg I [A1: n = 5, OCPT = (2a)]
Polymervorläufer B (R₂ = p-Nitrophenyloxy, 2,58 g, der 1,16 × 10^–3 Äquivalente p-Nitrophenylesterrest enthielt), hergestellt wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben, wurde in trockenem Dimethylsulfoxid (15 ml) gelöst und 20-O-(6-Aminohexanoylglycyl)camptothecintrifluoracetat (6a; 0,63 g, 1 mmol) zugegeben, gefolgt von Triethylamin (0,14 ml, 1 mmol). Die Reaktionsmischung wurde 22 Stunden unter Rühren auf Raumtemperatur gehalten, dann wurde 2-Propanolamin (0,05 ml) zugegeben und die Mischung eine wei tere Stunde rühren gelassen. Danach wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (200 ml) ausgefällt und 30 Minuten Rühren gelassen. Danach wurde das feste Material auf einem gesinterten Glastrichter aufgefangen, mit Ethylacetat (200 ml) und Ethylether (100 ml) gewaschen und nachfolgend mit Ethanol (30 ml) aufgelöst. Die alkoholische Lösung wurde mit feuchtem DOWEX-50, sulfonische Form, (1,2 g) unter Rühren 30 Minuten behandelt und danach tropfenweise in n-Hexan (200 ml) gegeben. Der Niederschlag wurde auf einem gesinterten Glastrichter aufgefangen, mit Ethylether gewaschen und zu konstantem Gewicht getrocknet, um 2,68 g der Titelverbindung (A1) zu ergeben.
durchschnittliches Molekulargewicht (Gewichtsmittel) (M_w): 19 800. Polydispersität (M_w/M_n): 1,5
Gehalt an Camptothecin, bestimmt nach alkalischer Hydrolyse, 10% Gewicht/Gewicht.
BEISPIEL 8
Herstellung von MAG-(7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin) über Weg I [A2: n = 5, OCPT = (2d)
Polymervorläufer B (R₂ = p-Nitrophenyloxy, 2,58 g, der 1,16 × 10^–3 Äquivalente p-Nitrophenylesterrest enthielt), hergestellt wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben, wurde in trockenem Dimethylsulfoxid (15 ml) gelöst und 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-(6-aminohexanoylglycyl)camptothecintrifluoracetat (6b; 0,68 g, 1 mmol) zugegeben, gefolgt von Triethylamin (0,14 ml, 1 mmol). Die Reaktionsmischung wurde 22 Stunden unter Rühren auf Raumtemperatur gehalten, dann wurde 2-Propanolamin (0,05 ml) zugegeben und die Mischung eine weitere Stunde rühren gelassen. Danach wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (200 ml) ausgefällt und 30 Minuten rühren gelassen. Danach wurde das feste Material auf einem gesinterten Glastrichter aufgefangen, mit Ethylacetat (200 ml) und Ethylether (100 ml) gewaschen und nachfolgend mit Ethanol (30 ml) aufgelöst. Die alkoholische Lösung wurde mit feuchtem DOWEX-50, sulfonische Form, (1,2 g) unter Rühren 30 Minuten behandelt und danach tropfenweise in n-Hexan (200 ml) gegeben. Der Niederschlag wurde auf einem gesinterten Glastrichter aufgefangen, mit Ethylether gewaschen und zu konstantem Gewicht getrocknet, um 2,68 g der Titelverbindung (A2) zu ergeben.
durchschnittliches Molekulargewicht (Gewichtsmittel) (M_w): 20 500. Polydispersität (M_w/M_n): 1,87
Gehalt an 7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin, bestimmt nach alkalischer Hydrolyse, 10% Gewicht/Gewicht.
BEISPIEL 9
Herstellung von MAG-Camptothecin über Weg II [A1: n = 5, OCPT = (2a)]
20-O-[Methacryloyl-glycyl-(6-aminohexanoyl)-glycyl]camptothecin (9a: 1,26 g, 2 mmol), N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (8, 4,4 g, 31 mmol), hergestellt wie in Makromol. Chem. 178, 2159 (1977) beschrieben, und 2,2'-Azobisisobutyronitril (0,26 g, 1,6 mmol) wurden in trockenem Dimethylsulfoxid (20 ml) gelöst, unter Stickstoff auf 60°C gehalten und 24 Stunden gerührt. Danach wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und in Ethylacetat (500 ml) gegossen. Der Niederschlag wurde aufgefangen und in Ethanol (50 ml) gelöst, aus dem er durch Zugabe von Ethylacetat (500 ml) wieder ausgefällt wurde. Der Feststoff wurde aufgefangen, mit Ethylacetat/Ethylether (2 × 100 ml) gewaschen, um 5 g der Titelverbindung (A1) zu ergeben.

Claims

Polymerkonjugat, das aus (i) 85 bis 97 Mol.% N-(2-Hydroxypropyl)methacryloylamideinheiten, die durch Formel (3) wiedergegeben werden,
(ii) 3 bis 15 Mol.% 20-O-(N-Methacryloyl-glycyl-aminoacyl-glycyl)camptothecineinheiten, die durch Formel (4) wiedergegeben werden,
wobei n 2 bis 8 ist, -[O-CPT] den Rest eines Camptothecins mit der Formel (2) wiedergibt:
das an der C-20-Position gebunden ist und wobei jeder von R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅, die gleich oder unterschiedlich sind, Wasserstoff, lineares oder verzweigtes C₁- bis C₁₂-Alkyl, Nitro, Amino, (CH₂)_aNR₆R₇, in der a 0 bis 4 beträgt und R₆ und R₇ Wasserstoff sind, oder einer von R₆ oder R₇ Wasserstoff und der andere von R₆ oder R₇ C₁- bis C₆-Alkyl ist, oder NR₆R₇ einen Piperazin- oder N-Alkylpiperazinring, der gegebenenfalls mit linearem oder verzweigtem C₁- bis C₆-Alkyl substituiert ist, oder Piperidinring wiedergibt, (CH₂)_aNHCOR₈, in dem a wie oben definiert und R₈ lineares oder verzweigtes C₁- bis C₈-Alkyl oder eine Gruppe NR₆R₇ wie oben ist, Hydroxy oder O-CO-R₈ ist, in der R₈ wie oben definiert ist oder einen 1-Piperidinring oder 1,4'-Bipiperidin wiedergibt, oder R₂ und R₃ zusammengenommen den Rest O-(CH₂)_b-O wiedergeben, in dem b 1 oder 2 ist, oder R₄ und R₅ den Rest (CH₂)_m, in dem m 2 bis 4 beträgt, oder den Rest CH₂-O-CH₂ oder CH₂NHCH₂ wiedergeben, und (iii) 0 bis 12 Mol.% N-Methacryloyl-glycin oder N-(2-Hydroxypropyl)methacryloyl-glycinamideinheiten, die durch Formel (5) wiedergegeben werden:
besteht, wobei [Z] eine Hydroxygruppe oder einen Rest der Formel -NH-CH₂-CH(OH)-CH₃ wiedergibt.
Polymerkonjugat nach Anspruch 1, das die durch die Formel (3) wiedergegebenen N-(2-Hydroxypropyl)methacryloylamideinheiten in einem molaren Anteil von 90% enthält.
Polymerkonjugat nach Anspruch 1, das 10 Mol.% der durch die Formel (4) wiedergegebenen Einheiten enthält.
Polymerkonjugat nach Anspruch 1, bei dem die Einheit der Formel (5) fehlt.
Polymerkonjugat nach Anspruch 1, bei dem -[O-CPT] in Formel (4) ein Rest eines Camptothecins der Formel (2) ausgewählt aus Camptothecin, 9-Aminocamptothecin, 9-Nitrocamptothecin, 7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin, 7-Ethyl-10-[1,4'-bipiperidinyl]carbonyloxycamptothecin, 7-Methylidendimethylamino-10-hydroxycamptothecin und 7-[Methylen-(4'-methylpiperazin)]-9,10-ethylendioxycamptothecin ist.
Polymerkonjugat nach Anspruch 1, bei dem der Gehalt an aktivem Camptothecinderivat der Formel (2) 10% (Gewicht/Gewicht) beträgt.
Verfahren zur Herstellung eines Polymerkonjugats wie in Anspruch 1 definiert, bei dem ein 20-O-(Aminoacyl-glycyl)camptothecinderivat der Formel (6) NH₂-(CH₂)_n-CO-Gly-[OCPT] (6),in der n und [OCPT] wie in Anspruch 1 definiert sind, mit einem Polymer (B), das im Wesentlichen aus 85 bis 97 Mol.% N-(2-Hydroxypropyl)methacryloylamideinheiten, die durch Formel (3) wie in Anspruch 1 definiert wiedergegeben werden, und 3 bis 15 Mol.% N-Methacryloyl-glycylderivateinheiten besteht, die durch Formel (7) wiedergegeben werden
wobei [Y] der Rest eines aktiven Esters oder eine Hydroxygruppe ist, umgesetzt wird und gegebenenfalls die verbleibenden aktiven Estergruppen durch 1-Amino-2-propanol verdrängt werden.
Verfahren zur Herstellung eines Polymerkomjugats wie in Anspruch 1 definiert, das die Polymerisation zwischen N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid mit der Formel (8)
und 20-O-[Methacryloyl-glycyl-(aminoacyl)-glycyl]camptothecinderivaten der Formel (9)
wobei n und [OCPT] wie in Anspruch 1 definiert sind, unter Bedingungen umfasst, die in der Lage sind, die Art der Bindung zwischen Camptothecin und dem Spacer Glycyl-aminoacyl-glycyl sowie diejenige des Konjugats zu erhalten.
20-O-Acylamino-glycyl-camptothecinderivat der Formel (6), wie in Anspruch 7 definiert, oder ein Salz davon.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (6) wie in Anspruch 7 definiert, bei dem ein Derivat der Formel (2) wie in Anspruch 1 definiert mit einem N-geschützten Aminoacyl-glycylderivat der Formel (10) R₉-HN-(CH₂)_n-CO-Gly-[P] (10),in der n wie in Anspruch 1 definiert ist, R₉ eine Amino-Schutzgruppe wiedergibt und [P] ein Rest eines aktivierten Esters ist, kondensiert wird, um eine Verbindung zu ergeben, die durch Formel (11) R₉-NH-(CH₂)n-CO-Gly-[OCPT] (11)wiedergegeben wird, in der n und R₉ wie oben definiert sind und [OCPT] wie in Anspruch 1 definiert ist, und die N-Schutzgruppe aus der resultierenden Verbindung entfernt wird.
20-O-[Methacryloyl-glycyl-(aminoacyl)-glycyl]camptothecinderivat der Formel (9) wie in Anspruch 8 definiert, oder ein Salz davon.
Verfahren zur Herstellung eines Derivats der Formel (9) wie in Anspruch 11 definiert, bei dem ein Camptothecinderivat der Formel (6) wie in Anspruch 7 definiert mit N-Methacryloyl-glycyl der Formel (7')
umgesetzt wird, wobei [Y'] eine Abgangsgruppe ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und als aktiven Bestandteil ein Polymerkonjugat wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert oder eine Verbindung der Formel (6) oder (9) wie in den Ansprüchen 9 und 11 definiert umfasst.
Polymerkonjugat nach Anspruch 1, bei dem in dem Rest der Formel (4) n 5 ist und -[O-CPT] die Formel (2) hat, wobei R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ alle Wasserstoffatome sind, wobei der Camptothecingehalt 10% (Gewicht/Gewicht) beträgt.
Polymerkonjugat nach Anspruch 1, das erhältlich ist durch Umsetzen eines 20-O-(6-Aminohexanoyl-glycin)camptothecinderivats der Formel (6) NH₂-(CH₂)₆-CO-Gly-[OCPT] (6),wobei [O-CPT] der Rest von Camptothecin ist, mit einem Polymer (B), das im Wesentlichen aus 85 bis 97 Mol.% N-(2-Hydroxypropyl)methacryloylamideinheiten, die durch die Formel (3) wie in Anspruch 1 definiert wiedergegeben werden, und 3 bis 15 Mol.% N-Methacryloyl-glycylderivateinheiten besteht, die durch Formel (7)
wiedergegeben werden, wobei [Y] eine p-Nitrophenoxygruppe ist; und gegebenenfalls Verdrängen der verbleibenden aktiven Estergruppe durch 1-Amino-2-propanol.
Polymeres Konjugat nach Anspruch 1, das erhältlich ist durch die Polymerisation zwischen N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid der Formel (8)
und 20-O-[Methacryloyl-glycyl-(6-aminohexanoyl)-glycyl]camptothecinderivaten der Formel (9)
wobei [OCPT] der Rest von Camptothecin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und als aktiven Bestandteil ein Polymerkonjugat wie in einem der Ansprüche 14 bis 16 definiert umfasst.