WO2001058932A1 - Glycokonjugate von cytostatika - Google Patents

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WO2001058932A1
WO2001058932A1 PCT/EP2001/000793 EP0100793W WO0158932A1 WO 2001058932 A1 WO2001058932 A1 WO 2001058932A1 EP 0100793 W EP0100793 W EP 0100793W WO 0158932 A1 WO0158932 A1 WO 0158932A1
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WO
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residue
aal
formula
grouping
compounds
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PCT/EP2001/000793
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Georg Lerchen
Jörg Baumgarten
Original Assignee
Bayer Aktiengesellschaft
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/003—Peptides being substituted by heterocyclic radicals, e.g. bleomycin, phleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06147—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and His-amino acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to cytostatics which are tumor-specific by modification with carbohydrates.
  • Urea or dicarboxylic acid units as suitable spacers ensure serum stability and at the same time an intracellular effect.
  • Chemotherapy for tumor diseases is accompanied by mostly serious side effects, which can be attributed to the toxic effects of chemotherapeutic agents on proliferating cells of tissue types other than tumor tissue.
  • scientists have been dealing with the problem of improving the selectivity of active substances used for many years.
  • a widely followed approach is the synthesis of prodrugs that are more or less selective in the target tissue, for example by changing the pH (Tietze et al., For example DE-A-4 229 903), by enzymes (for example glucuronidases; Jacquesy et al. , EP-A-0 511 917; Bosslet et al., EP-A-0 595 133) or by antibody-enzyme conjugates (Bagshawe et al., WO
  • the heterocyclic amine batracylin (1) shows a good antitumor effect in various types of colon cancer (US Pat. No. 4,757,072).
  • Batracylin The Batracychn (1) fucose conjugates described in EP-A-0 501 250 disadvantageously accumulate very strongly in the liver.
  • camptothecin derivatives About 20 years later it was found that the biological activity is due to enzyme inhibition of topoisomerase I. Since then, research activities have been intensified again in order to find more tolerable and in vivo effective camptothecin derivatives.
  • Salts of A-ring and B-ring modified camptothecin derivatives and of 20-O-acyl derivatives with ionizable groups have been described to improve water solubility (Vishnuvajjala et al. US 4943579).
  • the latter prodrug concept was later also applied to modified camptothecin derivatives (Wani et al. WO 9602546).
  • cytostatics in which through a novel combination of selectively modified carbohydrates with cytostatics (for example batracylin, quinolone-a, camptothecin) via preferred spacer and linker groups, serum stability and release of the cytostatic within the tumor cells as well also a specific enrichment of the cytostatics (for example batracylin, quinolone-a, camptothecin) via preferred spacer and linker groups, serum stability and release of the cytostatic within the tumor cells as well also a specific enrichment of the cytostatics (for example batracylin, quinolone-a, camptothecin) via preferred spacer and linker groups), serum stability and release of the cytostatic within the tumor cells as well also a specific enrichment of the cytostatics (for example batracylin, quinolone-a, camptothecin) via preferred spacer and linker groups), serum stability and release of the cytostatic within the tumor cells as well also a specific enrichment of the cytostatics (
  • Cytostatic in tumor tissue is achieved.
  • the linker unit is a thiourea or triazine group.
  • WO 98/15571 describes camptothecin derivatives which have a carbohydrate-free side chain at the C20 position which, inter alia, has a thiourea group as the linker unit.
  • WO 98/51703 describes carbohydrate-modified cytostatics in which the saccharide residue and the camptothecin are linked via a unit Sp-LAN1-AN2, where L stands for a thiourea unit.
  • WO 98/14459, WO 98/14468 and WO 98/15573 describe further carbohydrate-modified camptothecin derivatives.
  • Tumor cells have numerous options for surviving treatment with cytotoxic agents, which is why there is still a need for new drugs for cancer treatment. Since the numerous mechanisms by which tumor cells can circumvent the negative effects of cytotoxic agents are still largely unknown, it is difficult to predict to what extent structural changes in known medicinal products will affect their effect on tumor cells.
  • the present invention relates to compounds of the general formula (I)
  • n 1 to 6
  • n 0 or 1
  • AAl is a direct bond or an amino acid residue in the D or L configuration, optionally protecting groups or a second grouping
  • K-Sp-L- carries, in which K, Sp, L independently of the other grouping K-Sp-L- can have the meanings given above.
  • AA2 a direct bond or an amino acid residue in the D or L configuration, which optionally carries protective groups or a second grouping K-Sp-L-, in which K, Sp, L independently of the other grouping K-Sp -L- can have the meanings given above.
  • C is a cytotoxic residue or the residue of a cytostatic or cytostatic derivative which can additionally carry a hydroxyl or amino group and is bonded to AA2 via an ester or amide group,
  • the present invention relates to compounds of the general formula (I) in which
  • B is in turn a carbohydrate residue of the general formula (II) linked via the anomeric center.
  • R 2 , R 3 , R individually or together equal to H, hydroxy, alkyloxy, carboxyalkyloxy and esters and amides derived therefrom, hydroxyalkyloxy, aminoalkyloxy, acyloxy, carboxyalkylcarbonyloxy, sulfato, phosphato, halogen, or another modified and via the anomeric center linked carbohydrate residue (II) means, wherein
  • R 2 can additionally be amino or acylamino and / or two of the radicals R 2 , R 3 , R can also together form an epoxy group,
  • the present invention relates to compounds of the formula (I) in which
  • Sp arylene which is ortho, meta or para modified with K and L and can also carry 1 to 4 further substituents which are, independently or identical, H, methyl, methoxy, hydroxyl, carboxy, methyloxycarbonyl, cyano May be nitro, halogen, sulfonyl or sulfonamide, or is a linear or branched alkylene radical,
  • K, L, m, n, AAl, AA2 and C have the same meaning as described above.
  • the present invention relates to compounds of the formula (I) in which
  • C is a nucleoside, an endiin antibiotic or a cytotoxic peptide antibiotic, a quinolone or naphthyridonecarboxylic acid or batracylin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside, methotrexate, etoposide, camptothecin,
  • K, Sp L, m, n, AAl and AA2 have the same meaning as described above.
  • the present invention relates to compounds of the formula (I) in which n is 0.
  • compounds of the formula (I) are preferred in which AAl additionally has one
  • a carbohydrate residue K should be understood to mean polyhydroxy aldehydes (aldoses) or polyhydroxy ketones (ketoses) as well as higher molecular weight compounds which can be converted into such compounds by hydrolysis.
  • monosaccharides i.e. monomeric polyhydroxy aldehydes or polyhydroxy ketones, or ohgosaccharides, i.e. dimers to decamers (disaccharides, trisaccharides, etc.
  • polyhydroxy aldehydes or polyhydroxy ketones examples include pentoses and hexoses such as e.g. B. ribose, xylose, arabinose, glucose, mannose, galactose, gulose,
  • the carbohydrates can be in the D or L form. L-fucose and D-galactose are particularly preferred.
  • the carbohydrate residues K can be unsubstituted or modified regioselectively. With regioselective modification, the substitution of one or more hydroxyl groups of the carbohydrate residue by alkyloxy, carboxyalkyloxy and esters and amides derived therefrom, such as the corresponding C ⁇ , should. 6 alkyl esters or C 6 mono or dialkyl amides, hydroxyalkyloxy,
  • Carbohydrate residue to be substituted can also be replaced by hydrogen and in this way the carbohydrate residue can be converted into a so-called deoxy sugar residue.
  • the regioselective modification of the carbohydrate residue K by converting one or more hydroxy groups into a C 6 alkoxy residue such as methoxy, ethoxy, propoxy or butoxy, into a hydroxyalkoxy residue such as hydroxyethoxy, into a carboxyalkoxy residue or an ester or amide derivative is particularly preferred thereof such as, for example, carboxymethoxy, methylcarbonylmethoxy, aminocarbonylmethoxy, methylaminocarbonylmethoxy,
  • Ci-C ö -Alky according to the invention comprises methyl, ethyl, n- and i-propyl, n-, i-, sec- and tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl.
  • (CrC 6 ) alkoxy represents a straight-chain or branched alkoxy radical with 1 to
  • a straight-chain or branched alkoxy radical is preferred with 1 to 4 carbon atoms. Examples include: methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, tert-butoxy, n-pentoxy and n-hexoxy.
  • a straight-chain or branched alkoxy radical having 1 to 3 carbon atoms is particularly preferred.
  • (-C-C 6 ) alkoxycarbonyl stands for a straight-chain or branched alkoxycarbonyl radical having 1 to 6 carbon atoms.
  • a straight-chain or branched alkoxycarbonyl radical having 1 to 4 carbon atoms is preferred. Examples include: methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, n-propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl and tert-butoxycarbonyl.
  • a straight-chain or branched alkoxycarbonyl radical having 1 to 3 carbon atoms is particularly preferred.
  • (-C-C 6 ) -acyl is within the scope of the invention for a straight-chain or branched acyl radical having 1 to 6 carbon atoms.
  • a straight-chain or branched acyl radical having 1 to 6 carbon atoms examples include: acetyl, ethylcarbonyl, propylcarbonyl, isopropylcarbonyl, butylcarbonyl, isobutylcarbonyl, pentylcarbonyl and hexylcarbonyl.
  • a straight-chain or branched acyl radical having 1 to 4 carbon atoms is preferred. Acetyl and ethylcarbonyl are particularly preferred.
  • carbohydrate residue K can also be regioselectively modified or unsubstituted independently of the primary carbohydrate residue as described above. According to the invention, these further carbohydrate residues are always linked to the primary carbohydrate residue via their anomeric center.
  • the compound can be specifically addressed to tumor cells and thereby experiences an increased tissue selectivity and effect.
  • the carbohydrate residue K is bound to the rest of the molecule via a spacer group Sp.
  • Sp can be an optionally substituted alkylene (also referred to as alkanediyl) or arylene.
  • a is preferred C 2 -C 8 alkanediyl radical, ie a straight-chain or branched alkanediyl radical having 2 to 8 carbon atoms.
  • arylene stands for an aromatic hydrocarbon radical with 6 to 10 carbon atoms in the cyclic skeleton.
  • examples include 1,4-phenylene, 1,3-phenylene, 1,2-phenylene or naphthylene.
  • the alkanediyl or arylene spacer can moreover be substituted one or more times, preferably up to four times, with one or more radicals from the
  • the linker group L is a unit of the formula
  • n 1 to 6
  • n 0 or 1
  • n is 0 (ie L is a urea unit), or in which n is 1 and m is an integer from 1 to 4 (ie L is malonic acid, succinic acid, glutaric acid or Adipic acid unit).
  • the linker group L can be linked to the cytotoxic residue either directly or via one or two amino acid groups AA1 and AA2.
  • amino acid residues AA1 and AA2 can be present independently of one another in the D or L configuration and, if appropriate, a second grouping
  • the amino acid residue AA1 can be linked to L both via the ⁇ -amino group and optionally via side chain amino or hydroxy functions or also via both functions. If AA1 carries further functional groups, these can be unblocked or protected with protective groups known to the person skilled in the art (ie organic residues with which certain functional groups of a mol containing several active centers can be temporarily protected against the attack of reagents) (cf. e.g. Kocienski, Protecting Groups, Stuttgart,
  • Protecting groups in the context of the invention are the usual amino protecting groups used in peptide chemistry. These preferably include: benzyloxycarbonyl, 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, 4-nitrobenzyloxycarbonyl, 2-nitrobenzyloxycarbonyl, 2-nitro-4,5-dimethoxybenzyloxy- carbonyl, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl (Boc), allyloxycarbonyl, vinyloxycarbonyl, 3,4,5-trimethoxybenzyloxycarbonyl, phthaloyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, 2,2,2-trichloro-tert-butoxycarbonyl, menthyloxycarbonyl , 4-nitrophenoxycarbonyl, fluorenyl-9
  • the amino acid residue AN2 can be linked to AA1 both via the ⁇ -amino group and optionally via side chain amino or hydroxy functions or also via both functions. If AA2 carries further functional groups, these can be unblocked or protected with protective groups known to the person skilled in the art and already described above for AA1.
  • AN1 and AA2 preferably represent in particular the naturally occurring ⁇ -amino acids, but also include their homologs, isomers and derivatives.
  • Enantiomers can be mentioned as examples of isomers.
  • Derivatives can be, for example, amino acids provided with protective groups.
  • AAl and AA2 can occur in the L or in the D configuration or as a mixture of D and L forms.
  • AAl particularly preferably stands for an amino acid with a basic side chain.
  • AA2 particularly preferably stands for an amino acid with a sterically demanding or non-polar side chain.
  • Amino acids with "sterically demanding” side chains are understood to mean those amino acids whose side chain has a branch in the ⁇ or ⁇ position; valine and isoleucine or leucine may be mentioned as examples.
  • amino acids with non-polar side chains are: alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine.
  • Typical examples of amino acids with basic side chains are: lysine, arginine, histidine, ornithine, diaminobutyric acid.
  • a side chain K-Sp-L-AN1-AN2 described above when linked to a cytotoxic residue, is able to introduce it more selectively into the tumor tissue, where it can develop its cytotoxic effect.
  • the principle according to the invention described here is widely applicable to cytotoxic and cytostatic compounds. Cytotoxicity means the property of substances to inactivate or kill other cells.
  • a cytotoxic residue is understood to mean a group which is linked to the unit K-Sp-L and which, at least after the release from the molecule, has a cytotoxic effect.
  • cytotoxic or cytostatic compounds such as the rest of a nucleoside, one, in the released state
  • C can be, for example, batracylin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside, methotrexate, etoposide, camptothecin, daunomycin, doxorubicin, taxol, vinblastine, vincristine, dynemicin, calicheamycin, esperamycin, quercetin, suramin, erbstatin, cyclophosphine melamine, cyclophosphine melamine, mitocatin melamine, cyclophosphine melamine Bleomycin, staurosporine or another antineoplastic active ingredient.
  • C Batracylin, methotrexate, quinolone-a, etoposide, melphalan, taxol, camptothecin, daunomycin or doxorubicin or a quinolone or ⁇ aphthyridoncarboxylic acid is preferred.
  • the cytostatic is linked to AA2 via amino or hydroxy functions.
  • R b for hydroxy, alkoxy with 1 to 3 carbon atoms, nitromethyl
  • R c represents hydrogen or methyl or can also form a bridge together with R g ,
  • R d for hydrogen, CH 3 , CH 2 F or CH 2 ,
  • X 1 for hydrogen, halogen or nitro
  • X 2 for hydrogen, halogen, amino, hydroxy, methoxy, mercapto, methyl, halomethyl or vinyl
  • Y is N or CR e , wherein
  • R represents hydrogen, methyl or formyl
  • D represents N or CR g , wherein
  • R g stands for hydrogen, halogen, CF 3 , OCH 3 , OCHF 2 or CH 3 or together with R c a bridge of the structure - * O-CH 2 -, - * NH-CH 2 -, - * N (CH 3 ) - CH 2 -, - * N (C 2 H 5 ) -CH 2 -, - * N (C 3 H 5 ) -CH 2 - or - * S-CH 2 -, which is marked with * Atom is linked to the carbon atom of D,
  • R h represents O-, - NR k , CH 2 -O- or ⁇ H 2 ⁇ N "R , where
  • R represents hydrogen or methyl
  • R 1 represents hydrogen, -CC 3 - alkyl or cyclopropyl.
  • R for hydroxy, alkoxy with 1 to 2 carbon atoms
  • R c represents hydrogen, methyl or together with R g can form a bridge described there,
  • X 1 for fluorine
  • X rl for hydrogen or amino
  • R e represents hydrogen, fluorine, chlorine, CF 3 , OCH 3 , OCHF 2 , or C ⁇ CH or together with R a is a bridge of the structure - * O-CH 2 -CH-CH 3 or - * O-CH 2 -NR f ,
  • R, f 1 denotes methyl
  • R g represents hydrogen, fluorine, chlorine, CF 3 , OCH 3 or CH 3 or also together with R c a bridge of the structure - * O-CH 2 -, - * NH-CH 2 -, - * N (CH 3 ) -CH 2 - or - * S-CH 2 -, where the atom marked with * is linked to the carbon atom of D and
  • R k represents hydrogen or methyl
  • R 1 represents hydrogen or methyl.
  • C is particularly preferably camptothecin or a camptothecin derivative such as 9-aminocamptothecin.
  • the compounds according to the invention can be in the form of their salts.
  • salts with organic or inorganic acids may be mentioned here.
  • These salts can be prepared by reacting the free compounds of the formula (I) with organic or inorganic acids.
  • preferred acids here are hydrohalic acids, such as e.g. hydrochloric acid and hydrobromic acid, especially hydrochloric acid, also phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, mono- and bifunctional carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids, e.g.
  • sulfonic acids such as e.g. p-Toluenesulfonic acid, 1,5-naphthalenedisulfonic acid or camphorsulfonic acid in question.
  • the compounds according to the invention can be present in stereoisomeric forms, for example as enantiomers or diastereomers, or as mixtures thereof, for example as a racemate.
  • the invention relates both to the pure stereoisomers and to their mixtures. If necessary, the stereoisomer mixtures can be separated into the stereoisomerically uniform constituents in a known manner, for example by chromatography or by crystallization processes.
  • the present invention further relates to a process for the preparation of the compounds of the formula (I), comprising the reaction of a compound of the formula
  • esters such as, for example, methyl
  • Ethyl or p-nitrophenyl esters can be used.
  • the chloroformic acid p-nitrophenyl ester is preferred according to the invention.
  • the reaction of the compound of the formula K-Sp-NH 2 with the chloroformate can be carried out under various pressure and temperature conditions, for example from 0.5 to 2 bar and preferably under atmospheric pressure, or from -30 to + 100 ° C. and preferably -10 to + 80 ° C, in suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water
  • Tetrahydrofuran (THF), dioxane / water or THF / dichloromethane at room temperature or under ice cooling and normal pressure is preferred.
  • the reaction in tetrahydrofuran at room temperature and normal pressure is particularly preferred.
  • the compounds are used in an equimolar amount or the chloroformic acid ester in a slight excess compared to the compound K-Sp-NH 2 .
  • the base is used either in equimolar amounts or in (for example a two-fold) excess.
  • the reaction is usually complete after a few (approx. 5-45) minutes.
  • This reaction is carried out in the presence of a base.
  • bases suitable according to the invention are triethylamine, ethyldiisopropylamine, pyridine, N, N-dimethylaminopyridine or other bases conventionally used in such steps.
  • the compound of formula K-Sp-NH 2 can also be reacted with an alkanedicarboxylic acid or a dicarboxyl derivative thereof in the presence of a base in an organic solvent.
  • This reaction can be carried out at various pressure and temperature ratios, for example from 0.5 to 2 bar and preferably under normal pressure, or from -30 to + 100 ° C. and preferably from -10 to + 80 ° C., in suitable solvents such as dimethylformamide (DMF). Tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • DMF dimethylformamide
  • THF Tetrahydrofuran
  • dichloromethane dichloromethane
  • chloroform lower alcohols
  • acetonitrile dioxane
  • reaction in dimethylformamide (DMF), dichloromethane, tetrahydrofuran (THF), dioxane / water or THF / dichloromethane at room temperature or under ice cooling and normal pressure are preferred.
  • the reaction in DMF at room temperature and normal pressure is particularly preferred.
  • the compounds are used in equimolar amounts or the chloroformate in a slight excess compared to the compound K-Sp-NH.
  • the base is used either in equimolar amounts or in (for example a two-fold) excess.
  • the reaction is usually complete after a few (approx. 5-45) minutes.
  • This reaction is also carried out in the presence of a base.
  • bases suitable according to the invention are triethylamine, ethyldiisopropylamine, pyridine, N, N-dimethylaminopyridine or other bases conventionally used in such steps.
  • the intermediate product obtained from one of these reactions is then reacted with the compound of the formula AA1-AA2-C in the presence of a base to give the compound of the formula (I).
  • bases suitable according to the invention are triethylamine, ethyldiisopropylamine, pyridine, N, N-dimethylaminopyridine or other bases conventionally used in such steps.
  • the Ver- Bonds are used equimolar or the compound AA1-AA2-C in a slight excess compared to the compound K-Sp-NH.
  • the base is used either in equimolar amounts or in (for example a two-fold) excess.
  • This reaction can be carried out under suitable pressure and temperature conditions, for example 0.5 to 2 bar and preferably under normal pressure, or -30 to + 100 ° C. and preferably -10 to + 80 ° C. in suitable solvents such as dimethylformamide (DMF ), Tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide (DMF ), Tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide (DMF ), Tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • DMF dimethylformamide
  • THF t
  • the reaction in DMF or THF at room temperature and normal pressure is particularly preferred. If necessary, the reaction can be accelerated using ultrasound or can be carried out with better yields.
  • the reaction may take from 30 minutes to several, e.g. 16 hours.
  • the free carboxyl function of the latter may be necessary Activate connection.
  • the coupling reagents known in peptide chemistry such as those found in Jakubke / Jeschkeit, come for activating the carboxyl group: amino acids, peptides, proteins; Verlag Chemie 1982 or Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993).
  • N-carboxylic acid anhydrides, acid chlorides or mixed anhydrides are preferred.
  • adducts with carbodiimides for example N, N'-diethyl, N, N'-diisopropyl, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-, is also suitable for activating the carboxyl group.
  • ethyl carbodiimide hydrochloride N-cyclohexyl-N '- (2-morpholinoethyl) carbodiimide-metho-p-toluenesulfonate or carbonyl compounds such as carbonyldiimidazole, or 1,2-oxazolium compounds such as 2-ethyl-5-phenyl-l, 2-oxazolium-3-sulfate or 2-tert-butyl-5-methyl-isoxazolium perchlorate, or acylamino compounds such as 2-ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l, 2-dihy- droquinoline, or propanephosphonic anhydride, or isobutylchloroform, or benzotriazolyloxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, 1-hydroxybenzotriazole or N-hydroxysuccinimide ester.
  • 1,2-oxazolium compounds
  • Example 2 20 (S) -20-O- ⁇ N ⁇ - [4- (3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy) phenylcarbamoyl] -L-valyl ⁇ camptothecin
  • N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride added and stirred for 30 min.
  • compound III 100 mg, 0.14 mmol
  • 48 mg of ethyldiisopropylamine are added and the mixture is stirred for a further 16 h at room temperature.
  • dichloromethane is added to the residue and the mixture is stirred for 15 min. Then it is filtered off and the organic
  • Example 5 20 (S) -20-O- ⁇ N ⁇ - [4- (3-O- (methoxycarbonyl-methyl) -ß-L-fucopyranosyloxy) -phenylcarbamoyl] -L-histidyl-L-valyl ⁇ ⁇ camptothecin
  • the preparation was carried out in analogy to Example 1 starting from the starting compounds III and VII.
  • the purification was carried out by flash chromatography [dichloromethane / methanol / ammonia 17% 15: 1: 0.1] at the free base stage.
  • Example 7 20 (S) -20-O- ⁇ N ⁇ -r4- ( ⁇ -D-galactopyranosyloxy) phenylcarbamoyl1-L-histidyl-L-valyl ⁇ -camptothecin, hydrochloride
  • the preparation was carried out in analogy to Example 1, starting from the starting compounds II and VIII.
  • the purification was carried out at the free base stage by flash chromatography [dichloromethane / methanol / ammonia 17% 15: 4: 0.5-> 15: 6 : 0,6].
  • Example 8 20 (S) -20-O- ⁇ N ⁇ - [4- (3-O-Methyl- ⁇ -L-fucopyranosyloxy) phenylcarbamoyl] -L-asparaginyl-L-valyl ⁇ -camptothecin
  • the preparation was carried out in analogy to Example 1, starting from the starting compounds V and I.
  • the purification was carried out by flash chromatography [dichloromethane / methanol / ammonia 17% 15: 1: 0.1].
  • the human colon cell lines SW 480 and HT 29 (ATCC No. CCL 228 and HBT
  • mice melanoma cell line B16F10 (CRL 6475) and the mouse melanoma cell line B16F10 (CRL 6475) were grown in Roux dishes in RPMI 1640 medium with the addition of 10% FCS. It was then trypsinized and taken up in RPMI plus 10% FCS to a cell number of 50,000 cells / ml for SW 480 and HT 29 and 20,000 cells for B16F10. 100 ul cell suspension / well were placed in a 96 microwave plate and 1 day at 37 ° C in
  • the cytotoxic effect is given in Table 1 as the IC50 value for the SW 480 and HT 29 and B16F10 cell lines:
  • Bone marrow cells were rinsed from the mouse femur. 10 ⁇ cells were in McCoy 5A medium (0.3% agar) together with recombinant murine GM-CSF (Genzyme; stem cell colonization) and the substances (10 "4 to 100 ⁇ g / ml) at 37 ° C and 7 %> CO2 incubated 7 days later the colonies ( ⁇ 50 cells) and clusters (17-50 cells) were counted.
  • McCoy 5A medium 0.3% agar
  • recombinant murine GM-CSF Genzyme; stem cell colonization
  • HT-29 tumor cells (200,000 cells / ml) were grown in RPMI 1640 medium with the addition of 10% FCS for 24 hours. Aqueous solutions of the glycoconjugates in concentrations of 10 ⁇ M are added and incubated for 24 hours. The supernatant is then diluted with the same volume of methanol and then centrifuged. 50 ⁇ l of the resulting solution are injected into the HPLC and analyzed using the above method. The measured area percentages of the glycoconjugate are compared with those of the released active ingredient.
  • 3% free camptothecin is detected in the compound from Example 1 after 24 h (0% at time 0 h), while the starting glycoconjugate has decreased from 91.5 to 87.6 area percent in the same period.
  • Example 2 the compound from Example 2 is cleaved very quickly to camptothecin in the cell supernatant.
  • Athymic nude mice (NMRI nu / nu strain) were used for all in vivo experiments to investigate the inhibition of tumor growth.
  • the selected tumors were developed by serial passage in nude mice.
  • the human origin of the tumor was proven by isoenzymatic and immunohistochemical methods.
  • the tumor was implanted subcutaneously in both flanks of 6 to 8 week old nu / nu nude mice.
  • the treatment was started depending on the doubling time as soon as the tumors had reached a diameter of 5-7 mm.
  • the mice were randomized to the treatment group and the control group (5 mice per group with 8-10 evaluable tumors). The individual tumors in the control group all grew progressively.
  • the size of the tumors was measured in two dimensions using a slide gauge.
  • the tumor volume which correlates well with the cell number, was then used for all evaluations.
  • the volume was calculated according to the formula "length x width x width / 2" ([a x b ⁇ ] / 2, a and b stand for two diameters arranged at right angles).
  • the relative tumor volume (RTV) values were calculated for each individual tumor by dividing the tumor size on day X by the tumor size on day 0 (at the time of randomization). The mean values of the RTV were then used for the further evaluation. The final measurement was the inhibition of the tumor volume (relative tumor volume of the test group / control group x 100, T / C in%>).
  • the compounds were administered intravenously (i.V.), intraperitoneally (i.p.), orally (p.o.) or subcutaneously (s.c).
  • the compound from Example 1 was examined in vivo in the nude mouse model on the subcutaneously growing melanoma tumor MEXF 989 after six intravenous doses on days 1-3 and 15-17. With a dose of 16 mg / kg / day, a significant inhibition of tumor growth was achieved with an optimal T / C value of 22.5%, with no toxicity being observed.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Cytostatika, die durch Modifikation mit Kohlenhydraten tumorspezifischer sind. Harnstoff- oder Dicarbonsäureeinheiten als geeignete Spacer gewährleisten die Serumstabilität und gleichzeitig intrazelluläre Wirkung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die Formel (I): K - Sp- L - AA1 - AA2 - C, worin K ein unsubstituierter oder regioselektiv modifizierter Kohlenhydratrest, Sp ein gegebenenfalls substituiertes Arylen oder Alkylen, L eine Gruppe der Formel (a), AA1 eine direkte Bindung oder ein Aminosäure-Rest in der D- oder L-Konfiguration, der gegebenenfalls Schutzgruppen oder eine zweite Gruppierung K-Sp-L- trägt, in der K, Sp, L unabhängig von der anderen Gruppierung K-Sp-L- die oben angegebenen Bedeutungen haben können, AA2 eine direkte Bindung oder ein Aminosäure-Rest in der D- oder L-Konfiguration, der gegebenenfalls Schutzgruppen oder eine zweite Gruppierung K-Sp-L- trägt, in der K, Sp, L unabhängig von der anderen Gruppierung K-Sp-L- die oben angegebenen Bedeutungen haben können, und C ein cytotoxischer Rest oder der Rest eines Cytostatikums oder Cytostatikumderivats, der zusätzlich eine Hydroxy- oder Aminogruppe tragen kann, bedeutet.

Description

GLYCOKONJUGATE VON CYTOSTATIKA
Die vorliegende Erfindung betrifft Cytostatika, die durch Modifikation mit Kohlenhydraten tumorspezifisch sind. Harnstoff- oder Dicarbonsäureeinheiten als geeignete Spacer gewährleisten die Serumstabilität und gleichzeitig intrazelluläre Wirkung.
Die Chemotherapie bei Tumorerkrankungen ist begleitet von meist schwerwiegenden Nebenwirkungen, welche auf die toxische Wirkung von Chemotherapeutika auf proliferierende Zellen anderer Gewebearten als Tumorgewebe zurückzuführen sind. Seit vielen Jahren beschäftigen sich Wissenschaftler mit dem Problem der Verbesserung der Selektivität von eingesetzten Wirkstoffen. Ein vielfach verfolgter Ansatz ist die Synthese von Prodrugs, die mehr oder weniger selektiv im Zielgewebe beispielsweise durch Veränderung des pH-Wertes (Tietze et al., z.B. DE-A-4 229 903), durch Enzyme (z.B. Glucuronidasen; Jacquesy et al., EP-A-0 511 917; Bosslet et al., EP-A-0 595 133) oder durch Antikörper-Enzym-Konjugate (Bagshawe et al., WO
88/07378; Senter et al., US-4 975 278; Bosslet et al., EP-A-0 595 133) freigesetzt werden. Problematisch bei diesen Ansätzen ist unter anderem die mangelnde Stabilität der Konjugate in anderen Geweben und Organen, und insbesondere die ubiquitäre Wirkstoffverteilung, die sich an die extrazelluläre Wirkstofffreisetzung im Tumorgewebe anschließt.
Das ausgeprägte Lektinmuster auf Tumorzelloberflächen (Gabius; Onkologie 12, (1989), 175) eröffnet die prinzipielle Möglichkeit, durch Anknüpfen entsprechender Kohlenhydratbausteine an Cytostatika diese gezielt an Tumorzellen zu adressieren. Eingeschränkt wird diese Perspektive dadurch, daß auch in anderen Geweben, insbesondere in der Leber, Lektine mit ähnlichen Kohlenhydratspezifitäten (Galactose, Lactosej Mannose, N-Acetyl-glucosamin, Fucose etc.) vorkommen (Ashwell et al., Annu.Rev.Biochem. 46 (1982), 531; Stahl et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74 (1977), 1521; Hill et al, J.Biol.Chem. 262 (1986), 7433; Jansen et al., J.Biol.Chem. 266 (1991), 3343). Demzufolge muß mit einer deutlichen Anreicherung von wirk- stoffhaltigen Glycokonjugaten in der Leber und anderen lektinreichen Organen gerechnet werden, wenn bei diesem Ansatz Kohlenhydrate ohne besondere, eine Selektivität gegenüber Tumorgewebe begründende Modifizierung verwendet werden.
Das heterocyclische Amin Batracylin (1) zeigt in verschiedenen Darrnkrebs- Modellen eine gute Antitumorwirkung (US-4 757 072).
Figure imgf000003_0001
(1)
Peptidkonjugate von (1) mit guter In-vitro- Wirkung und günstigeren Löslichkeits- eigenschaften (US-4 180 343) sind im Tierversuch schlechter verträglich als freies
Batracylin. Die in EP-A-0 501 250 beschriebenen Fucose-Konjugate von Batracychn (1) reichern sich nachteiligerweise sehr stark in der Leber an.
Das Chinolon-a (2) 7-[(3a-R,S, 4-R,S, 7a-S,R)-4-Amino-l,3,3a,4,7,7a-hexahydro- iso-indol-2-yl]-8-chlor- 1 -cyclopropyl-6-fluor- 1 ,4-dihydro-4-oxo-3-chinolincarbon- säure zeigt neben seiner hervorragenden antibakteriellen Aktivität auch eine sehr gute Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Tumorzellinien (EP-A-0 520 240, JP-4 253 973). Dem stehen jedoch erhebliche toxikologische Probleme gegenüber (z.B. Geno- toxizität, Knochenmarks-Toxizität, hohe akute Toxizität in vivo etc.).
Figure imgf000003_0002
(2) (Chinolon-a) 20(S)-Camptothecin ist ein pentacyclisches Alkaloid, das 1966 von Wall et al. isoliert wurde (J.Am.Chem.Soc. 88, 3888 (1966)). Es besitzt ein hohes Antitumor- Wirkpotential in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Tests. Leider scheiterte jedoch die Realisierung des vielversprechenden Potentials in der klinischen Untersuchungsphase an Toxizitäts- und Löslichkeitsproblemen.
Durch Öffnung des E-Ring-Lactons und Bildung des Natriumsalzes wurde eine wasserlösliche Verbindung erhalten, die in einem pH-abhängigen Gleichgewicht mit der ringgeschlossenen Form steht. Klinische Studien führten auch hier bisher nicht zum Erfolg.
Figure imgf000004_0001
Etwa 20 Jahre später wurde gefunden, daß die biologische Aktivität auf eine Enzyminhibition der Topoisomerase I zurückzuführen ist. Seither wurden die Forschungsaktivitäten wieder verstärkt, um verträglichere und in-vivo wirksame Camptothecin- Derivate zu finden.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit wurden Salze von A-Ring- und B-Ring- modifizierten Camptothecin-Derivaten sowie von 20-O-Acyl-Derivaten mit ionisierbaren Gruppen beschrieben (Vishnuvajjala et al. US 4943579). Letzteres Prodrug- Konzept wurde später auch auf modifizierte Camptothecin-Derivate übertragen (Wani et al. WO 9602546). Die beschriebenen 20-O-Acyl-Prodrugs haben allerdings in-vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und werden sehr schnell zum Grundkörper gespalten. In der WO 96/31532 sind kohlenhydratmodifizierte Cytostatika beschrieben, bei denen durch eine neuartige Verknüpfung von selektiv modifizierten Kohlenhydraten mit Cytostatika (beispielsweise Batracylin, Chinolon-a, Camptothecin) über bevorzugte Spacer- und Linkergruppen sowohl eine Serumstabilität und Freisetzung des Cytostatikums innerhalb der Tumorzellen als auch eine spezifische Anreicherung des
Cytostatikums in Tumorgewebe erreicht wird. In dieser Schrift sind aber nur kohlenhydratmodifizierte Cytostatika beschrieben, bei denen die Linkereinheit eine Thio- harnstoff- oder Triazingruppe ist.
In der WO 98/15571 sind Camptothecinderivate beschrieben, die eine kohlenhydrat- freie Seitenkette an der C20-Position aufweisen, welche unter anderem eine Thio- harnstoffgruppe als Linkereinheit aufweist.
In der WO 98/51703 sind kohlenhydratmodifizierte Cytostatika beschrieben, bei denen der Saccharidrest und das Camptothecin über eine Einheit Sp-LAN1-AN2 verknüpft sind, wobei L für eine Thioharnstoffeinheit steht.
In der WO 98/14459, WO 98/14468 und der WO 98/15573 sind weitere kohlenhydratmodifizierte Camptothecinderivate beschrieben.
Tumorzellen besitzen zahlreiche Möglichkeiten, eine Behandlung mit cytotoxischen Mitteln zu überstehen, weshalb nach wie vor Bedarf nach neuen Arzneimitteln zur Krebsbehandlung besteht. Da die zahlreichen Mechanismen, über die Tumorzellen die negativen Einflüsse von cytotoxischen Mitteln umgehen können, noch weit- gehend nicht aufgeklärt sind, kann man schwer Vorhersagen darüber machen, inwieweit sich strukturelle Veränderungen bei bekannten Arzneimitteln hinsichtlich ihrer Wirkung auf Tumorzellen auswirken.
Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere kohlenhydratmodifizierte Cytostatika zur Behandlung von Krebserkrankungen bereitzustellen. Überraschend wurde nun gefunden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine hohe Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Tumorzelllinien aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
K - Sp- L - AAl - AA2 - C (I)
mit
K = unsubstituierter oder regioselektiv modifizierter Kohlenhydratrest
Sp = gegebenenfalls substituiertes Arylen oder Alkylen
Figure imgf000006_0001
wobei
m eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet
n 0 oder 1 bedeutet
wobei die Verknüpfung zu Sp über die NH-Gruppe erfolgt.
AAl eine direkte Bindung oder ein Aminosäure-Rest in der D- oder L-Konfigura- tion, der gegebenenfalls Schutzgruppen oder eine zweite Gruppierung
K-Sp-L- trägt, in der K, Sp, L unabhängig von der anderen Gruppierung K-Sp-L- die oben angegebenen Bedeutungen haben können. AA2 eine direkte Bindung oder ein Aminosäure-Rest in der D- oder L-Konfigura- tion, der gegebenenfalls Schutzgruppen oder eine zweite Gruppierung K-Sp-L- trägt, in der K, Sp, L unabhängig von der anderen Gruppierung K-Sp-L- die oben angegebenen Bedeutungen haben können.
C ein cytotoxischer Rest oder der Rest eines Cytostatikums oder Cytostatikum- derivats ist, der zusätzlich eine Hydroxy- oder Aminogruppe tragen kann und über eine Ester- oder Amidgruppe an AA2 gebunden ist,
und deren Isomere und Salze.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der allgemeinen Formel (I), bei denen
K Kohlenhydratrest mit der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000007_0001
wobei
Methyl, Hydroxymethyl, Carboxy sowie davon abgeleitete Ester und Amide, Alkoxymethyl, Acyloxymethyl oder Carboxyalkyloxymethyl sowie davon abgeleitete Ester und Amide oder CH2-B bedeutet,
wobei
B wiederum ein über das anomere Zentrum verknüpfter Kohlenhydratrest der allgemeinen Formel (II) ist. R2, R3, R einzeln oder zusammen gleich H, Hydroxy, Alkyloxy, Carboxy- alkyloxy sowie davon abgeleitete Ester und Amide, Hydroxyalkyloxy, Aminoalkyloxy, Acyloxy, Carboxyalkylcarbonyloxy, Sulfato, Phosphato, Halogen, oder ein weiterer modifizierter und über das anomere Zentrum verknüpfter Kohlenhydratrest (II) bedeutet, wobei
R2 zusätzlich auch Amino oder Acylamino sein kann und/oder zwei der Reste R2, R3, R auch zusammen eine Epoxygruppe bilden können,
und Sp, L, m, n, AAl, AA2 und C die gleiche Bedeutung wie vorstehend beschrieben haben.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I), bei denen
Sp Arylen, das ortho-, meta- oder para-ständig mit K und L modifiziert ist und darüber hinaus noch 1 bis 4 weitere Substituenten tragen kann, die unabhängig oder gleich H, Methyl, Methoxy, Hydroxy, Carboxy, Methyloxy- carbonyl, Cyano, Nitro, Halogen, Sulfonyl oder Sulfonamid sein können, oder ein linearer oder verzweigter Alkylen-Rest ist,
und K, L, m, n, AAl, AA2 und C die gleiche Bedeutung wie vorstehend beschrieben haben.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I), bei denen
C ein Nucleosid, ein Endiin- Antibiotikum oder ein cytotoxisches Peptidantibio- tikum, eine Chinolon- oder Naphthyridoncarbonsäure oder Batracylin, 5- Fluorouracil, Cytosinarabinosid, Methotrexat, Etoposid, Camptothecin,
Daunomycin, Doxorubicin, Taxol, Vinblastin, Vincristin, Dynemicin, Calicheamycin, Esperamycin, Quercetin, Suramin, Erbstatin, Cyclophospha- mid, Mitomycin C, Melphalan, Cisplatin, Bleomycin, Staurosporin oder ein anderer antineoplastisch aktiver Wirkstoff sein kann, der zusätzlich eine Hydroxy- oder Aminogruppe tragen kann und über eine Ester- oder Amid- gruppe an AA2 gebunden ist,
und K, Sp L, m, n, AAl und AA2 die gleiche Bedeutung wie vorstehend beschrieben haben.
Insbesondere bevorzugt sind hierbei Verbindungen, bei denen C für einen Campto- thecinrest oder den Rest eines Campto hecinderivats steht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I), bei denen n gleich 0 ist. Insbesondere sind hierbei Verbindungen der Formel (I) bevorzugt, bei denen zusätzlich AAl eine
Direktbindung ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen unter einem Kohlenhydratrest K Polyhy- droxyaldehyde (Aldosen) oder Polyhydroxyketone (Ketosen) sowie höhermolekulare Verbindungen, die sich durch Hydrolyse in solche Verbindungen überfuhren lassen, verstanden werden. Insbesondere sollen unter diesem Begriff Monosaccharide, d.h. monomere Polyhydroxyaldehyde oder Polyhydroxyketone, oder Ohgosaccharide, d.h. dimere bis decamere (Disaccharide, Trisaccharide usw.) Polyhydroxyaldehyde oder Polyhydroxyketone, verstanden werden. Beispielhaft seien Pentosen und Hexosen wie z. B. Ribose, Xylose, Arabinose, Glucose, Mannose, Galactose, Gulose,
Fructose, Sorbose, Fucose und Rhamnose genannt. Als Beispiele für Ohgosaccharide seien Disaccharide wie Saccharose, Lactose und Maltose genannt. Erfindungsgemäß können die Kohlenhydrate in der D- oder L-Form vorliegen. Insbesondere bevorzugt sind L-Fucose und D-Galactose. Die Kohlenhydratreste K können erfindungsgemäß unsubstituiert oder regioselektiv modifiziert sein. Unter regioselektiver Modifizierung soll hierbei die Substitution einer oder mehrerer Hydroxy gruppen des Kohlenhydratrestes durch Alkyloxy, Carb- oxyalkyloxy sowie davon abgeleitete Ester und Amide wie beispielsweise die ent- sprechenden Cι.6-Alkylester oder Cι-6-Mono- oder Dialkylamide, Hydroxyalkyloxy,
Aminoalkyloxy, Acyloxy, Carboxyalkylcarbonyloxy, Sulfato, Phosphato, Halogen oder gegebenenfalls Amino oder Acylamino verstanden werden. Weiterhin können zwei der Reste R , R3, 4 auch zusammen eine Epoxygruppe bilden. Zudem können eine oder mehrere Hydroxygruppen des Kohlenhydratrestes durch einen weiteren, ebenfalls entsprechend modifizierten und über das anomere Zentrum verknüpften
Kohlenhydratrest substituiert sein. Es können aber auch eine oder mehrere Hydroxygruppen des Kohlenhydratrestes durch Wasserstoff ersetzt und auf diese Weise der Kohlenhydratrest in einen sogenannten Desoxyzuckerrest überführt sein.
Besonders bevorzugt ist hierbei die regioselektive Modifizierung des Kohlenhydratrestes K durch Überführung einer oder mehrerer Hydroxygruppen in einen Cι_6- Alkoxyrest wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy oder Butoxy, in einen Hy- droxyalkoxyrest wie beispielsweise Hydroxyethoxy, in einen Carboxyalkoxyrest oder ein Ester- oder Amidderivat davon wie beispielsweise Carboxymethoxy, Methylcarbonylmethoxy, Aminocarbonylmethoxy, Methylaminocarbonylmethoxy,
Ethylaminocarbonylmethoxy, Propylaminocarbonylmethoxy, Butylaminocarbonyl- methoxy, in einen Carboxyalkylrest oder ein Ester- oder Amidderivat davon wie beispielsweise Methylcarbonyloxymethyl, in eine Carboxygruppe oder ein Ester- oder Amidderivat davon wie beispielsweise Carboxyethyloxycarbonyl, in einen Halogen- rest wie beispielsweise Cl oder Br oder in einen Sulfatrest.
Ci-Cö-Alky] umfaßt erfindungsgemäß Methyl, Ethyl, n- und i-Propyl, n-, i-, sek.- und tert.-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl.
(CrC6)-Alkoxy steht für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis
6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methoxy, Ethoxy, n- Propoxy, Isopropoxy, tert.Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy. Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen.
(Cι-C6)-Alkoxycarbonyl steht für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, Isopropoxy- carbonyl und tert.Butoxycarbonyl. Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen.
(Cι-C6)-Acyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Acylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Acetyl, Ethylcarbonyl, Propylcarbonyl, Isopropylcarbonyl, Butylcarbonyl, Isobutyl- carbonyl, Pentylcarbonyl und Hexylcarbonyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt sind Acetyl und Ethylcarbonyl.
Sind eine oder mehrere Hydroxygruppen des Kohlenhydratrests K durch Kohlenhy- dratreste substituiert, so können diese unabhängig vom primären Kohlenhydratrest ebenfalls wie vorstehend beschrieben regioselektiv modifiziert oder unsubstituiert sein. Diese weiteren Kohlenhydratreste sind erfindungsgemäß immer über ihr anomeres Zentrum mit dem primären Kohlenhydratrest verknüpft.
Durch diese regioselektive Modifizierung kann die Verbindung spezifisch an Tumorzellen adressiert werden und erfährt dadurch eine erhöhte Gewebeselektivität und Wirkung.
Der Kohlenhydratrest K ist über eine Spacergruppe Sp an den Rest des Moleküls ge- bunden. Erfindungsgemäß kann Sp ein gegebenenfalls substituiertes Alkylen (auch als Alkandiyl bezeichnet) oder Arylen sein. Bevorzugt ist erfindungsgemäß ein C2-C8- Alkandiylrest, d.h. ein geradkettiger oder verzweigter Alkandiylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkandiylrest mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Ethylen, Propylen, Propan-1,2- diyl, Propan-2,2-diyl, Butan-l,3-diyl, Butan-2,4-diyl, Pentan-2,4-diyl, 2-Methyl- pentan-2,4-diyl. Arylen steht erfindungsgemäß für einen aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen im cyclischen Gerüst. Beispielsweise seien 1,4-Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,2-Phenylen oder Naphthylen genannt. Der Alkandiyl- oder Arylenspacer kann darüber hinaus noch ein- oder mehrfach, vor- zugsweise bis zu vierfach substituiert sein mit einem oder mehreren Resten aus der
Gruppe, bestehend aus H, Methyl, Methoxy, Hydroxy, Carboxy, Methyloxycarbonyl, Cyano, Nitro, Halogen, Sulfonyl oder Sulfonamid.
Die Linkergruppe L ist erfindungsgemäß eine Einheit der Formel
Figure imgf000012_0001
wobei
m eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet
n 0 oder 1 bedeutet
wobei die Verknüpfung zu Sp über die NH-Gruppe erfolgt.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind Verbindungen, bei denen n 0 ist (d.h. L eine Harn- stoffeinheit ist), oder bei denen n gleich 1 und m eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeutet (d.h. L ist eine Malonsäure-, Bernsteinsäure-, Glutarsäure- oder Adipinsäure- einheit). Die Linkergruppe L kann entweder direkt oder über eine oder zwei Aminosäuregruppen AAl und AA2 mit dem cytotoxischen Rest verknüpft sein.
Die Aminosäure-Reste AAl und AA2 können unabhängig voneinander in der D- oder L-Konfiguration vorliegen und gegebenenfalls eine zweite Gruppierung
K-Sp-L- tragen, in der K, Sp, L unabhängig von der anderen Gruppierung K-Sp-L- die oben angegebenen Bedeutungen haben können.
Der Aminosäurerest AAl kann sowohl über die α-Aminogruppe als auch gegebenen- falls über Seitenketten-amino- oder -hydroxyfunktionen oder auch über beide Funktionen mit L verknüpft sein. Falls AAl weitere funktionelle Gruppen trägt, so können diese deblockiert oder mit dem Fachmann bekannten Schutzgruppen (d.h. organische Reste, mit denen bestimmte funktionelle Gruppen eines mehrere aktive Zentren enthaltenden Mol. vorübergehend gegen den Angriff von Reagenzien geschützt werden können) geschützt vorliegen (vgl. z.B. Kocienski, Protecting Groups, Stuttgart,
Thieme 1994). Schutzgruppen im Rahmen der Erfindung sind die üblichen in der Peptid-Chemie verwendeten Aminoschutzgruppen. Hierzu gehören bevorzugt: Benzyloxycarbonyl, 3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxy- carbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 4-Nitro- benzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxy- carbonyl, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl (Boc), Allyloxy- carbonyl, Vinyloxycarbonyl, 3,4,5-Trimethoxybenzyloxycarbonyl, Phthaloyl, 2,2,2- Trichlorethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlor-tert-butoxycarbonyl, Menthyloxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-methoxycarbonyl (Fmoc), Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, 2,2,2-Trifluoracetyl, 2,2,2-Tri- chloracetyl, Benzoyl, Benzyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Phthalimido, Isovaleroyl oder Benzyloxymethylen, 4-Nitrobenzyl, 2,4-Dinitrobenzyl, 4-Nitrophenyl oder 2-Nitrophenylsulfenyl. Besonders bevorzugt sind die Fmoc- Gruppe und die Boc-Gruppe. Die Abspaltung von Schutzgruppen in entsprechenden Reaktionsschritten kann zum Beispiel durch Säure- oder Base-Einwirkung, hydrogenolytisch oder auf andere Weise reduktiv erfolgen.
Der Aminosäurerest AN2 kann sowohl über die α-Aminogruppe als auch gegebenenfalls über Seitenketten-amino- oder -hydroxyfunktionen oder auch über beide Funktionen mit AAl verknüpft sein. Falls AA2 weitere funktionelle Gruppen trägt, so können diese deblockiert oder mit dem Fachmann bekannten, bereits vorstehend bei AAl beschriebenen Schutzgruppen geschützt vorliegen.
Erfmdungsgemäß bevorzugt stehen ANl und AA2 insbesondere für die in der Natur vorkommenden α- Aminosäuren, umfasst darüber hinaus aber auch deren Homologe, Isomere und Derivate. Als Beispiel für Isomere können Enantiomere genannt werden. Derivate können beispielsweise mit Schutzgruppen versehene Aminosäuren sein.
AAl und AA2 können in der L- oder in der D-Konfiguration auftreten oder auch als Gemisch von D- und L-Form. Besonders bevorzugt steht AAl für eine Aminosäure mit basischer Seitenkette. Besonders bevorzugt steht AA2 für eine Aminosäure mit sterisch anspruchsvoller bzw. unpolarer Seitenkette.
Unter Aminosäuren mit „sterisch anspruchsvollen" Seitenketten werden solche Aminosäuren verstanden, deren Seitenkette in der ß- oder γ-Position eine Verzweigung aufweist; als Beispiele seien Valin und Isoleucin bzw. Leucin genannt.
Als typische Beispiele für Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten seien genannt: Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenylalanin, Methionin.
Als typische Beispiele für Aminosäure mit basischen Seitenketten seien genannt: Lysin, Arginin, Histidin, Ornithin, Diaminobuttersäure. Eine derartige vorstehend beschriebene Seitenkette K-Sp-L-AN1-AN2 ist bei Verknüpfung mit einem cytotoxischen Rest in der Lage, diesen selektiver in das Tumorgewebe einzubringen, wo er seine cytotoxische Wirkung entfalten kann. Das hier beschriebene erfindungsgemäße Prinzip ist breit auf cytotoxische und cytostatische Verbindungen anwendbar. Unter Cytotoxizität wird die Eigenschaft von Substanzen verstanden, andere Zellen zu inaktivieren oder abzutöten. Erfindungsgemäß wird unter einem cytotoxischen Rest ein mit der Einheit K-Sp-L- verknüpfte Gruppe verstanden, die zumindest nach der Freisetzung aus dem Molekül cytotoxische Wirkung zeigt. Dabei handelt es sich um im freigesetzten Zustand bekannte cytotoxische oder cytostatische Verbindungen wie beispielsweise den Rest eines Νucleosids, eines
Endiin- Antibiotikums oder eines cytotoxisches Peptidantibiotikums z.B. aus der Klasse der Dolastatine oder eine Chinolon- oder Νaphthyridoncarbonsäure sein. C kann beispielsweise Batracylin, 5-Fluorouracil, Cytosinarabinosid, Methotrexat, Etoposid, Camptothecin, Daunomycin, Doxorubicin, Taxol, Vinblastin, Vincristin, Dynemicin, Calicheamycin, Esperamycin, Quercetin, Suramin, Erbstatin, Cyclo- phosphamid, Mitomycin C, Melphalan, Cisplatin, Bleomycin, Staurosporin oder ein anderer antineoplastisch aktiver Wirkstoff sein. Bevorzugt ist C Batracylin, Methotrexat, Chinolon-a, Etoposid, Melphalan, Taxol, Camptothecin, Daunomycin oder Doxorubicin oder eine Chinolon- oder Νaphthyridoncarbonsäure.
Das Cytostatikum ist über Amino- oder Hydroxyfunktionen mit AA2 verknüpft.
Die vorstehend genannten, erfindungsgemäß geeigneten Chinolon- oder Νaphthyri- doncarbonsäurebausteine C lassen sich durch die allgemeine Struktur der Formel (III) darstellen,
T-Q (III)
in welcher
einen Rest der Formeln
Figure imgf000016_0001
bedeutet, worin
Ra für gegebenenfalls durch Halogen oder Hydroxy ein- oder zweifach substituiertes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Vinyl, gegebenenfalls durch 1 oder 2 Fluoratome substituiertes Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Bicyclo[l.l.l]pent-l-yl, 1,1-Dimethylpropargyl, 3-Oxetanyl, Methoxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino, gegebenenfalls durch Halogen, Amino oder Hydroxy ein- oder zweifach substituiertes Phenyl steht oder auch gemeinsam mit Re eine dort beschriebene Brücke bilden kann,
Rb für Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Nitromethyl,
Rc für Wasserstoff oder Methyl steht oder auch gemeinsam mit Rg eine dort beschriebene Brücke bilden kann,
Rd für Wasserstoff, CH3, CH2F oder =CH2,
X1 für Wasserstoff, Halogen oder Nitro, X2 für Wasserstoff, Halogen, Amino, Hydroxy, Methoxy, Mercapto, Methyl, Halogenmethyl oder Vinyl,
Y für N oder C-Re steht, worin
Re für Wasserstoff, Halogen, CF3, OCH3, OCHF2, CH3, CN, CH=CH2 oder C≡≡CH steht oder auch gemeinsam mit Ra eine Brücke der Struktur - O-CH2- CH-CH3, -*S-CH2-CH2-, -*S-CH2-CH-CH3, -*CH2-CH2-CH-CH3 oder -*O- f *
CH -N-R , wobei das mit markierte Atom mit dem Kohlenstoffatom von Y verknüpft ist und worin
R Wasserstoff, Methyl oder Formyl bedeutet,
bilden kann, und
D für N oder C-Rg steht, worin
Rg für Wasserstoff, Halogen, CF3, OCH3, OCHF2 oder CH3 steht oder auch gemeinsam mit Rc eine Brücke der Struktur -*O-CH2-, -*NH-CH2-, -*N(CH3)- CH2-, -*N(C2H5)-CH2-, -*N(C3H5)-CH2- oder -*S-CH2- bilden kann, wobei das mit * markierte Atom mit dem Kohlenstoffatom von D verknüpft ist,
1 , 2 oder 3 und
T einen Rest der Formel
Figure imgf000017_0001
bedeutet, worin
Rh für O-, - N-Rk , CH2-O- oder ~ H2 ~~ N"R steht, wobei
R für Wasserstoff oder Methyl und
R1 für Wasserstoff, Cι-C3- Alkyl oder Cyclopropyl steht.
Besonders bevorzugt sind hierbei Verbindungen der Formel (III), in welcher
Q einen Rest der Form el
Figure imgf000018_0001
bedeutet, worin
Ra für gegebenenfalls durch 1 Fluoratom substituiertes Alkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls durch 1 Fluoratom substituiertes
Cyclopropyl, gegebenenfalls durch Fluor ein- oder zweifach substituiertes Phenyl,
R für Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen,
Rc für Wasserstoff, Methyl steht oder zusammen mit Rg eine dort beschriebene Brücke bilden kann,
X1 für Fluor, X rl für Wasserstoff oder Amino,
für N oder C-Re steht, worin
Re für Wasserstoff, Fluor, Chlor, CF3, OCH3, OCHF2, oder C≡CH steht oder auch gemeinsam mit Ra eine Brücke der Struktur -*O-CH2-CH-CH3 oder -*O-CH2-N-Rf,
wobei das mit markierte Atom mit dem Kohlenstoffatom von Y verknüpft ist und worin
R , f1 Methyl bedeutet,
bilden kann,
für N oder C-Rg steht, worin
Rg für Wasserstoff, Fluor, Chlor, CF3, OCH3 oder CH3 steht oder auch gemeinsam mit Rc eine Brücke der Struktur -*O-CH2-, -*NH-CH2-, -*N(CH3)-CH2- oder -*S-CH2- bilden kann, wobei das mit * markierte Atom mit dem Kohlenstoffatom von D verknüpft ist und
einen Rest der Formel
Figure imgf000019_0001
bedeutet, worin Rh für — N-R steht, worin
Rk für Wasserstoff oder Methyl steht,
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt steht C für Camptothecin oder ein Camptothecinderivat wie 9-Aminocamptothecin.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form ihrer Salze vorliegen. Im allgemeinen seien hier Salze mit organischen oder anorganischen Säuren genannt. Diese Salze können durch Umsetzung der freien Verbindungen der Formel (I) mit organischen oder anorganischen Säuren hergestellt werden. Als Säuren kommen hier- bei erfindungsgemäß vorzugsweise Halogenwasserstoffsäuren, wie z.B. die Chlorwasserstoffsäure und die Bromwasserstoffsäure, insbesondere die Chlorwasserstoffsäure, ferner Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, mono- und bifunktionelle Carbonsäuren und Hydroxycarbonsäuren, wie z.B. Essigsäure, Trifluoressigsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Oxalsäure, Gluconsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Salizylsäure, Sorbinsäure und Milchsäure sowie Sulfon- säuren, wie z.B. p-Toluolsulfonsäure, 1,5-Naphthalindisulfonsäure oder Campher- sulfonsäure in Frage.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, beispiels- weise als Enantiomere oder Diastereomere, oder als deren Gemische, beispielsweise als Racemat, vorliegen. Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Stereoisomere als auch deren Gemische. Die Stereoisomerengemische können, falls erforderlich, in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile getrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie oder durch Kristallisationsverfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), umfassend die Umsetzung einer Verbindung der Formel
K-Sp-NH2
wobei
K und Sp die vorstehend beschriebene Bedeutung haben, mit
a) einem Chlorameisensäureester in Gegenwart einer Base in einem organischen
Lösungsmittel
oder
b) einer Alkandicarbonsäure oder einem Dicarboxylderivat davon in Gegenwart einer Base in einem organischen Lösungsmittel
und die anschließende Umsetzung mit einer Verbindung der Formel
AA1-AA2-C
wobei
AAl, AA2 und C die vorstehend beschriebene Bedeutung haben,
in Gegenwart einer Base in einem organischen Lösungsmittel. Die Darstellung von Verbindungen K-Sp-NH2 ist beispielsweise in der WO 96/31532 (Beispiele 1 bis 18) beschrieben, deren diesbezüglicher Inhalt hiermit in Bezug genommen ist.
Die Darstellung von Verbindungen AA1-AA2-C ist ebenfalls beispielsweise in der WO 96/31532 (Beispiele 1 bis 18) beschrieben, deren diesbezüglicher Inhalt hiermit in Bezug genommen ist.
Als Chlorameisensäureester können beliebige Ester wie beispielsweise Metyhl-,
Ethyl- oder p-Nitrophenylester verwendet werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Chlorameisensäure-p-nitrophenylester.
Die Umsetzung der Verbindung der Formel K-Sp-NH2 mit dem Chlorameisensäure- ester kann bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, beispielsweise 0,5 bis 2 bar und vorzugsweise unter Normaldruck, bzw. -30 bis +100°C und vorzugsweise -10 bis + 80°C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Aceto- nitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan,
Tetrahydrofuran (THF), Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei Raumtemperatur oder unter Eiskühlung und Normaldruck bevorzugt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Umsetzung in Tetrahydrofuran bei Raumtemperatur und Normaldruck. Die Verbindungen werden dabei äquimolar bzw. der Chlorameisen- säureester in leichtem Uberschuss gegenüber der Verbindung K-Sp-NH2 eingesetzt.
Die Base wird entweder äquimolar oder im (beispielsweise zweifachem) Uberschuss eingesetzt. Die Reaktion ist in der Regel nach wenigen (ca. 5-45) Minuten abgeschlossen.
Diese Reaktion wird in Gegenwart einer Base durchgeführt. Als Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Basen seien Triethylamin, Ethyl-diisopropylamin, Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin oder andere in derartigen Schritten herkömmlich verwendete Basen genannt.
Wahlweise kann die Verbindung der Formel K-Sp-NH2 auch mit einer Alkandi- carbonsäure oder einem Dicarboxylderivat davon in Gegenwart einer Base in einem organischen Lösungsmittel umgesetzt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist hierbei die Verwendung des entsprechenden Dicarbonsäureanhydrids. Diese Umsetzung kann bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, beispielsweise 0,5 bis 2 bar und vorzugsweise unter Normaldruck, bzw. -30 bis +100°C und vorzugsweise -10 bis + 80°C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan, Tetrahydrofuran (THF), Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei Raumtem- peratur oder unter Eiskühlung und Normaldruck bevorzugt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Umsetzung in DMF bei Raumtemperatur und Normaldruck. Die Verbindungen werden dabei äquimolar bzw. der Chlorameisensäureester in leichtem Uberschuss gegenüber der Verbindung K-Sp-NH eingesetzt. Die Base wird entweder äquimolar oder im (beispielsweise zweifachem) Uberschuss eingesetzt. Die Reaktion ist in der Regel nach wenigen (ca. 5-45) Minuten abgeschlossen.
Auch diese Reaktion wird in Gegenwart einer Base durchgeführt. Als Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Basen seien Triethylamin, Ethyl-diisopropylamin, Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin oder andere in derartigen Schritten herkömm- lieh verwendete Basen genannt.
Das aus einer dieser Reaktionen erhaltene Zwischenprodukt wird anschließend mit der Verbindung der Formel AA1-AA2-C in Gegenwart einer Base zur Verbindung der Formel (I) umgesetzt. Als Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Basen seien Triethylamin, Ethyl-diisopropylamin, Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin oder andere in derartigen Schritten herkömmlich verwendete Basen genannt. Die Ver- bindungen werden dabei äquimolar bzw. die Verbindung AA1-AA2-C in leichtem Uberschuss gegenüber der Verbindung K-Sp-NH eingesetzt. Die Base wird entweder äquimolar oder im (beispielsweise zweifachem) Uberschuss eingesetzt. Diese Umsetzung kann bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, beispiels- weise 0,5 bis 2 bar und vorzugsweise unter Normaldruck, bzw. -30 bis +100°C und vorzugsweise -10 bis + 80°C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in Dimethylformamid (DMF), Dichlor- methan, Tetrahydrofuran (THF), Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei
Raumtemperatur oder unter Eiskühlung und Normaldruck bevorzugt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Umsetzung in DMF oder THF bei Raumtemperatur und Normaldruck. Gegebenenfalls kann die Reaktion unter Anwendung von Ultraschall beschleunigt beziehungsweise unter Erzielung besserer Ausbeuten durchge- führt werden. Die Reaktion kann zwischen 30 Minuten bis zu mehreren, beispielsweise 16 Stunden benötigen.
Im Fall der Umsetzung der Verbindung der Formel AA1-AA2-C mit einer Verbindung, die aus der Reaktion von K-Sp-NH2 mit einer Alkandicarbonsäure oder einem Derivat davon erhalten wurde, kann es notwendig sein, die freie Carboxyl- funktion der letzteren Verbindung zu aktivieren. Für die Aktivierung der Carboxyl- gruppe kommen die in der Peptidchemie bekannten Kupplungsreagenzien wie sie z.B. in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993) beschrieben sind, in Frage. Bevorzugt sind bei- spielsweise N-Carbonsäureanhydride, Säurechloride oder gemischte Anhydride.
Weiterhin geeignet zur Aktivierung der Carboxylgruppe ist die Bildung von Addukten mit Carbodiimiden z.B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclo- hexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat oder Car- bonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1 ,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-isoxazolium- perchlorat, oder Acylamino Verbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2-dihy- drochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroform, oder Benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat, 1-Hy- droxybenzotriazol- oder N-Hydroxysuccinimidester.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von nicht einschränkenden Beispielen und Vergleichsbeispielen veranschaulicht.
Beispiele
N) Ausgangsverbindungen
I) p-Aminophenyl-3 -O-methyl-ß-L-fucopyranosid :
Figure imgf000026_0001
I. a) p-Nitrophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyranosid:
20 g (70 mmol) p-Νitrophenyl-ß-L-fucopyranosid (Herstellung vgl. WO 96/31532) in 1 1 absol. Methanol werden mit 26,13 g (105 mmol) Dibutylzinnoxid versetzt und 23 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird eingeengt, der Rückstand getrocknet und dann in 1 1 DMF aufgenommen. Nach Zugabe von 35 ml Methyliodid wird der Ansatz 16 h bei 70°C gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Die Suspension wird filtriert, die verbleibende Lösung erneut eingeengt und einer Flash-Chromatographie an Kieselgel (Dichlormethan/Methanol 99:1) unterzogen. Nach Einengen erhält man 17,4 g (83%) des Zielproduktes.
I) p-Aminophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyranosid:
8,7 g (29 mmol) p-Nitrophenyl-3-O-methyl-ß-L-fucopyranosid aus Bsp. Ia) werden in 1,2 1 Methanol gelöst und nach Zusatz von Palladium auf Aktivkohle in einer Wasserstoffatmosphäre bei geringem Überdruck hydriert. Nach Abfiltrieren des
Katalysators, Fällen mit Ether und Waschen des Rückstandes mit Methanol wird das Zielprodukt in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhält 7,4 g (95%). [DC: Dichlormethan/Methanol 9:1 R = 0,3]. II) 20(S)-20-O-L-Valyl-camptothecin, Trifluoracetat:
Il.a) 20(S)-20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-valyl] -camptothecin:
Eine Suspension von 40 g (115 mmol) 20(S)-Camptothecin in 2 1 absolutem Dichlormethan wird unter Rühren mit 56 g (230 mmol) N-(tert-Butoxy-carbonyl)-L-valin-N- carbonsäureanhydrid sowie 4 g 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 4 Tagen Rühren unter Rückfluß in einer Argonatmosphäre hat Camptothecin abreagiert. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand mit 500 ml Methyl- tert.butyl-ether versetzt. Nach 20 min Rühren werden 750 ml Petrolether hinzugefügt und abfiltriert. Der Filterrückstand wird im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 61,5 g (97 %) der Zielverbindung. [DC: Acetonitril/Wasser 20:1 Rf = 0,35].
II) 20(S)-20-O-L-Valyl-camptothecin, Trifluoracetat:
Eine Lösung von Verbindung Il.a (61 g, 111 mmol) in 1,7 1 Dichlormethan wird auf 5°C abgekühlt, mit 350 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt und dann für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit 1 1 Methyl-tert.butyl-ether ausgefällt und 10min gerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert. Das Rohprodukt wird nochmals in 950 ml Methanol gelöst, filtriert und die Lösung dann mit 3,5 1 Methyl-tert.butyl-ether gefällt. Der Niederschlag wird erneut abfiltriert und mit Methyl-tert.butyl-ether gewaschen. Der Prozess wird ggf. nochmals wiederholt. Ausb.: 38,6 g (60 %) [DC: Acetonitril/Wasser 20:1 Rf = 0,38].
III) 20(S)-20-O- {L-Histidyl-L-valyl} -camptothecin, Bis-Trifluoracetat:
III. a) 20(S)-20-O-[N -(tert-Butoxycarbonyl)-L-histidyl-L-valyl]-camptothecin:
6,28 g (24,6 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-histidin und 5 g 1 -Hydroxy- 1H benzotriazol Hydrat werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf 0°C abgekühlt. Nach Zugabe von 5,64 g N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)- carbodiimid Hydrochlorid rührt man für 30 min bei 0°C. Anschließend setzt man Verbindung II (11,5 g, 20,5 mmol) und 8,5 ml Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum wird der Rückstand in 1 1 Dichlormethan aufgenommen und dreimal mit 500 ml Wasser extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wird aus Dichlormethan mit Methyl-tert.butyl-ether gefällt und mit Methyl-tert.butyl-ether gewaschen. Man erhält 12,8 g (91 %) der Zielver- bindung. [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf = 0,33].
III) 20(S)-20-O-(L-Histidyl-L-valyl)-camptothecin, Bis-Trifluoracetat:
12,8 g (18,7 mmol) der Verbindung IILa werden in 180 ml Dichlormethan aufge- nommen und bei 5°C mit 90 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt. Die resultierende Lösung wird für 30 min gerührt und dabei auf Raumtemperatur aufwärmen lassen. Anschließend wird eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen auf ein kleines Volumen im Vakuum wird das Produkt durch Zugabe von Methyl-tert.butyl-ether ausgefällt und noch 30 min gerührt. Der Rückstand wird abfiltriert und nach Trocknen im Vakuum erhält man 12,9 g (85 %) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf- 0,25]. rV) 20(S)-20-O-{Nε-rFluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-valyl}- camptothecin, Trifluoracetat:
IVa) 20(S)-20-O-[Na-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9~methoxycarbonyl)-L- lysyl-L-valyl] -camptothecin:
22 g (47 mmol) Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-Nε-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-L- lysin und 9,5 g (70 mmol) 1 -Hydroxy- lH-benzotriazol Hydrat werden in 800 ml Dimethylformamid gelöst und auf 0°C abgekühlt. Nach Zugabe von 10,8 g (56 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid rührt man für 1 h bei
0°C. Anschließend setzt man Verbindung II (21,85 g, 39 mmol) und 24,3 ml Ethyl- diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum gibt man 1,5 1 Wasser zu dem Rückstand und rührt 15 min. Der entstehende Feststoff wird ab filtriert, mit Wasser gewaschen und anschließend in 800 ml Dichlormethan aufgenommen. Nach Trocknung wird die organische Phase auf 150 ml eingeengt und mit 2 1 Methyl-tert.butyl-ether gefällt. Der Rückstand wird abfiltriert und getrocknet. Man erhält 28,4 g (81%) des Zielproduktes. [DC: Aceto- nitril Rf= 0,47].
IV) 20(S)-20-O-{Nε-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-valyl}- camptothecin, Trifluoracetat:
Die Verbindung IVa (27,89 g, 31 mmol) wird in 600 ml Dichlormethan aufgenommen, auf 5°C abgekühlt und mit 200 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt. Die resultierende Lösung wird auf Raumtemperatur aufwärmen lassen und 2 h gerührt. Nach Einengen auf ein kleines Volumen im Vakuum wird das Produkt durch Zugabe von Methyl-tert.butyl-ether ausgefällt und getrocknet. Man erhält 26 g (92 %) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,54]. V) 20(S)-20-O- {L-Asparaginyl-L-valyl} -camptothecin, Trifluoracetat:
V. a) 20(S)-20-O-[N -(tert-Butoxycarbonyl)-L-asparaginyl-L-valylj -camptothecin:
413,6 mg (1,78 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-asparigin und 361 mg 1-Hydroxy-
1H benzotriazol Hydrat werden in Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf 0°C abgekühlt. Nach Zugabe von 410 mg N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodi- imid Hydrochlorid rührt man für 30 min bei 0°C. Anschließend setzt man Verbindung II (1 g, 1,78 mmol) und 690 mg Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum wird der
Rückstand mit Wasser verrührt und das Rohprodukt durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt [Dichlormethari/Methanol/Axnmoiak 17%ig 15:0,5:0,05 ->15: 1 :0,1. Entsprechende Fraktionen werden gesammelt und das Lösungsmittel i.vac. emtfernt. Man erhält 740mg (63%) der Zielverbindung. [DC: Aceto- nitril/Wasser 10:1 Rf = 0,33].
V) 20(S)-20-O-(L- Asparaginyl-L-valyl)-camptothecin, Trifluoracetat:
Die tert.-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe wird in Analogie zu Beispiel III entfernt. Man erhält 732 mg (97 %) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig
5:1 :0,2 Rf = 0,36].
Folgende Kohlenhydratbausteine wurden in Analogie zu Beispiel I durch Hydro- genolyse der entsprechenden z.T. kommerziell erhältlichen p-Nitrophenyl-glycoside gewonnen: VI) p-Aminophenyl-α-L-rhamnopyranosid
Figure imgf000031_0001
VII) p-Aminophenyl-3-O-(methoxycarbonyl-methyl)-ß-L-fucopyranosid
Figure imgf000031_0002
Die Synthese des entsprechenen p-Nitrophenyl-fücosids ist in Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 3681 beschrieben.
VIII) p-Aminophenyl-ß-D-galactopyranosid
Figure imgf000031_0003
B) Nusführungsbeispiele
Beispiel 1) 20(S)-20-O- {Ν -[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)- phenylcarbamoyl]-L-histidyl-L-valyl} -camptothecin, Hydrochlorid
Figure imgf000032_0001
la) 20(S)-20-O-{Na-[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl]-L- histidyl-L-valyl}-camptothecin:
45 mg (0,22 mmol) Chlorameisensäure-p-nitrophenylester und 48 mg Ethyl-diisopropylamin werden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst und anschließend mit 50 mg (0,19 mmol) der Verbindung I, die zuvor in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst wurde, versetzt. Nach 5 min Rühren bei Raumtemperatur setzt man 130 mg (0,19 mmol) der Verbindung III und weitere 72 mg (0,56 mmol) Ethyl-diisopropylamin zu und behandelt die Mischung 30 min im Ultraschallbad bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Acetonitril/Wasser 10:1 gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan/ Methanol mit Diethylether gefallt. Nach Trocknung im Hochvakuum erhält man 52 mg (32,4 %) der Zielverbindung. [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf = 0,15] [FAB-MS: m/z = 880 (M + H+)].
1) 20(S)-20-O-{Na-[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl]-L- histidyl-L-valyl} -camptothecin, Hydrochlorid
48 mg (0,05 mmol) werden in 10 ml Dioxan/Wasser 1 :1 gelöst und mit 545 μl einer 0,1 N Salzsäurelösung versetzt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert. Der Rückstand wird aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether gefällt. Nach Trocknung im Hochvakuum erhält man 52 mg (32,4%) der Zielverbindung. [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf = 0,15].
Beispiel 2) 20(S)-20-O-{Nα-[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)- phenylcarbamoyl]-L-valyl}-camptothecin
Figure imgf000033_0001
^CH,
90 mg (0,45 mmol) Chlorameisensäure-p-nitrophenylester und 77 mg Ethyl-diisopropylamin werden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst und anschließend mit 80 mg (0,3 mmol) der Verbindung I, die zuvor in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst wurde, versetzt. Nach 5 min Rühren bei Raumtemperatur setzt man 107 mg (0,19 mmol) der Verbindung II und weitere 77 mg (0,59 mmol) Ethyl-diisopropylamin zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand mit Wasser verrührt und anschließend abfiltriert. Daraufhin wird der Rückstand noch zweimal aus Dichlormethan/ Methanol mit Diethylether gefällt. Nach Trocknung im Hochvakuum erhält man 104 mg (70,7%) der Zielverbindung. [DC: Dichlormethan/Methano Ammoniak 17%ig 15:2:0,2 Rf- 0,48] [FAB-MS: m/z = (M + H+)].
Beispiel 3) 20(S)-20-O- {N -[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)- phenylcarbamoyl]-L-lysyl-L-valyl| -camptothecin, Hydrochlorid
CIH
Figure imgf000034_0001
3a) 20(S)-20-O-{Na-[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl]- Nε-[fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-]-L-lysyl-L-valyl}-camptothecin:
45 mg (0,22 mmol) Chlorameisensäure-p-nitrophenylester und 38 mg Ethyl-diisopropylamin werden in 8 ml Tetrahydrofuran gelöst und anschließend mit 40 mg (0,15 mmol) der Verbindung I, die zuvor in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst wurde, versetzt. Nach 5 min Rühren bei Raumtemperatur setzt man 114 mg (0,13 mmol) der Verbindung IV und weitere 48,5 mg (0,56 mmol) Ethyl-diisopropylamin zu und behandelt die Mischung 2h im Ultraschallbad bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an
I
Kieselgel mit Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,1 gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan/ Methanol mit Diethylether gefällt. Nach Trocknung im Hochvakuum erhält man 54 mg (40 %) der Zielverbindung. [DC: : Dichlormethan/Methanol/ Ammoniak 17%ig 15:2:0,2 Rf=
0,42].
3b) 20(S)-20-O-{Na-[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl]-L- lysyl-L-valyl} -camptothecin
50 mg (0,05 mmol) der Verbindung 3 a) werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und anschließend mit 500 μl (0,15 mmol) Piperidin versetzt. Man läßt 30 min bei Raumtemperatur rühren und engt ein. Der Rückstand wird zweimal aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether gefällt. Nach Trocknung im Hochvakuum erhält man 33 mg (83%) der Zielverbindung. [DC: Acetonitril Wasser/Eisessig 5:1 :0,2 Rf =
0,17].
3) 20(S)-20-O-{Na-[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl]-L- lysyl-L-valyl}-camptothecin, Hydrochlorid
30 mg (0,04 mmol) werden in 5 ml Dioxan/Wasser 1 :1 gelöst und mit 320 μl einer 0,1 N Salzsäurelösung versetzt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert. Nach Trocknung im Hochvakuum erhält man 31 mg (99 %) der Zielverbindung. [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf = 0,15]. [ESI-MS: m/z = 870 = (M + H+)]. Beispiel 4) 20(S)-20-O-{N-[3-(4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)- . phenylcarbamoyl)-propionyl]-L-histidyl-L-valyl}-camptothecin, Hydrochlorid
Figure imgf000036_0001
4a) 3-[4-(3-0-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl]-propionsäure
100 mg (0,37mmol) des Edukts I werden in 5 ml Dimethylformamid zusammen mit 52 mg Bernsteinsäureanhydrid und 10 mg Dimethylaminopyridin gelöst und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Man engt ein und fällt den Rückstand aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether und trocknet im Hochvakuum. Man erhält 95 mg (69 %) der Zielverbindung, die ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt wird. [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf= 0,22]. 4b) 20(S)-20-O-{Na-[3-(4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl)- propionyl] -L-histidyl-L-valyl} -camptothecin
50 mg (0,12 mmol) der Verbindung 4a) werden in 15ml DMF gelöst und bei 0°C werden 25 mg (0,18 mmol) 1 -Hydroxy- IH-benzotriazol Hydrat und 28 mg
(0,15 mmol) N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid hinzugefügt und 30 min gerührt. Anschließend setzt man Verbindung III (100 mg, 0,14 mmol) und 48 mg Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum gibt man Dichlormethan zu dem Rückstand und rührt 15 min. Anschließend wird ab filtriert und die organische
Phase eingeengt. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Dichlormethan Methanol/ Ammioniak 17%ig 15:2:0,2 als Eluent gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, eingeengt und der Rückstand dann aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether gefällt. Der Rückstand wird abfiltriert und getrocknet. Man erhält 69 mg (60%) des Zielproduktes. [DC: Dichlormethan/Methanol Ammoniak 17%ig 15:4:0,5 Rf = 0,5].
4) 20(S)-20-O-{Na-[3-(4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl)- propionyl] -L-histidyl-L-valyl} -camptothecin, Hydrochlorid
59 mg (0,06 mmol) der Verbindung 4b) werden in 5 ml Dioxan/Wasser 1:1 gelöst und mit 630 μl einer 0,1 N Salzsäurelösung versetzt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert. Nach Trocknung im Hochvakuum erhält man 60 mg (98%) der Ziel- Verbindung. [DC: Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17%ig 15:4:0,5 Rf = 0,5]. Beispiel 5 20(S)-20-O-{Nα-[4-(3-O-(methoxycarbonyl-methyl)-ß-L- fucopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl] -L-histidyl-L-valyl} ■ camptothecin
Figure imgf000038_0001
Die Darstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1 ausgehend von den Ausgangsverbindungen III und VII. Die Reinigung erfolgte durch Flash- Chromatographie [Dichlormethan/Methanol/ Ammoniak 17%ig 15:1:0,1] auf der Stufe der freien Base.
Ausbeute: 11% über 2 Stufen. [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf= 0,24] [ESI-MS: m/z = 938 (M + H+)]. Beispiel 6 20(S)-20-O-{N -[4-(α-L-rhamnopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl]-L- histidyl-L-valyl } -camptothecin, Hydrochlorid
Figure imgf000039_0001
Die Darstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1 ausgehend von den Aus- gangsverbindungen II und VI. Die Reinigung erfolgte auf der Stufe der freien Base durch Flash-Chromatographie [Dichlormethan/Methanol/ Ammoniak 17%ig
15:2:0,2].
Ausbeute: 50%> über 3 Stufen. [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1 :0,2 Rf= 0,32]
[ESI-MS: m/z = 866 (M + H+)].
Beispiel 7 20(S)-20-O-{Nα-r4-(ß-D-Galactopyranosyloxy)-phenylcarbamoyl1-L- histidyl-L-valyl} -camptothecin, Hydrochlorid
Figure imgf000040_0001
Die Darstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1 ausgehend von den Ausgangsverbindungen II und VIII. Die Reinigung erfolgte auf der Stufe der freien Base durch Flash-Chromatographie [Dichlormethan/Methanol/ Ammoniak 17%ig 15:4:0,5-> 15:6:0,6].
Ausbeute: 16%> über 3 Stufen. [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1 :0,2 Rf- 0,23] [ESI-MS: m/z = 882 (M + H ].
Beispiel 8 20(S)-20-O-{Nα-[4-(3-O-Methyl-ß-L-fucopyranosyloxy)- phenylcarbamoyl]-L-asparaginyl-L-valyl}-camptothecin
Figure imgf000041_0001
Die Darstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1 ausgehend von den Ausgangsverbindungen V und I. Die Reinigung erfolgte durch Flash-Chromatographie [Dichlormethan/Methanol/ Ammoniak 17%ig 15:1:0,1].
Ausbeute: 58% über 2 Stufen [DC: [Dichloπnethaιτ/Methano Aτnmoniak 17%>ig 15:3:0,3 Rf- 0,42] [ESI-MS: m/z = 857 (M + H+)].
Biologische Tests
1. Wachstumsinhibitionstest zur Bestimmung der cytotoxischen Eigenschaften:
Die humanen Dickdarmzellinien SW 480 und HT 29 (ATCC-Nr. CCL 228 und HBT
38) sowie die Maus-Melanom-Zellinie B16F10 (CRL 6475) wurden in Rouxschalen in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10 % FCS gezogen. Anschließend wurde trypsiniert und in RPMI plus 10 % FCS zu einer Zellzahl von 50.000 Zellen/ml für SW 480 und HT 29 und 20.000 Zellen für B16F10 aufgenommen. 100 μl Zell- suspension/Well wurden in eine 96 Mikrowellplatte gegeben und 1 Tag bei 37°C im
Cθ2-Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden weitere 100 μl RPMI Medium und 1 μl DMSO mit den Prüfsubstanzen zugesetzt. Das Wachstum wurde nach Tag 6 überprüft. Dazu wurde zu jedem Mikrowell 25 μl MTT-Lösung (3-(4,5-Dimethyl- thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolinbromid) mit einer Ausgangskonzentration von 5 mg/ml H2O zugesetzt. Es wurde 5 Stunden im Cθ2-Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt und 100 μl i-Propanol/Well zugesetzt. Nach 30 min Schütteln mit 100 μl H2O wurde die Extinktion bei 595 nm mit einem Multiplate Reader (Bio/Rad) 3550-UV gemessen.
Die cytotoxische Wirkung ist in der Tabelle 1 als IC50- Wert jeweils für die SW 480- und HT 29- und B16F10-Zellinie angegeben:
Tabelle 1:
Figure imgf000043_0001
2. Hämatopoetische Aktivität des Glycokonjugats im Vergleich zum zugrundeliegenden Wirkstoff:
Material und Methoden:
Knochenmarkzellen wurden aus dem Femur der Maus gespült. 10^ -Zellen wurden in McCoy 5A-Medium (0,3 % Agar) zusammen mit rekombinanten murinen GM-CSF (Genzyme; Stammzellen-Kolonienbildung) und den Substanzen (10"4 bis 100 μg/ml) bei 37°C und 7 %> CO2 inkubiert. 7 Tage später wurden die Kolonien (<50 Zellen) und Kluster (17-50 Zellen) ausgezählt.
Ergebnisse: Tabelle 2:
Hemmung der CSF-induzierten Proliferation von Knochenmarkstammzellen der Maus
Figure imgf000044_0001
3. HPLC Methode zur Bestimmung der Stabilität im Zeilüberstand von HT-29
Ausrüstung: Waters Alliance 2690; UV Detektion bei 257 nM or 356 nM Säule: LiChrospher 100, RP-18 (5μm) 250 x 4mm ; Merck 50833 mit Vorsäule
Bedingungen: Eluent A: 0.01M KH2PO4 in H2O
Eluent B : 80 % Acetonitril + 20 % Eluent A
Figure imgf000044_0002
Methode zur Bestimmung der Stabilität: HT-29 Tumorzellen (200,000 Zellen/ml) wurden in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10 % FCS 24h gezogen. Wäßrige Lösungen der Glycokonjugate in Konzentrationen von 10 μM werden hinzugefügt und 24 Stunden inkubiert. Danach wird der Überstand mit dem gleichen Volumen Methanol verdünnt und anschließend zentrifiigiert. 50 μl der resultierenden Lösung werden in die HPLC injiziert und nach obiger Methode analysiert. Die gemessenen Flächenprozente des Glycokonjugats werden mit denen von freigesetztem Wirkstoff verglichen.
Beispielsweise werden bei der Verbindung aus Beispiel 1 nach 24 h 3 % freies Camptothecin detektiert (0% beim Zeitpunkt 0 h), während das Ausgangsglyco- konjugat im gleichen Zeitraum von 91,5 auf 87,6 Flächenprozent abgenommen hat.
Im Gegensatz dazu wird die Verbindung aus Beispiel 2 im Zellüberstand sehr rasch zu Camptothecin gespalten.
4. In-vivo-Hemmung des Tumorwachstums im Nacktmaus-Modell
Material:
Für alle in-vivo-Experimente zur Untersuchung der Hemmung des Tumorwachstums wurden athymische Nacktmäuse (NMRI nu/nu-Stamm) verwendet. Die ausgewählten Tumore wurden durch serielle Passage in Nacktmäusen entwickelt. Der menschliche Ursprung des Tumors wurde durch isoenzymatische und immunohistochemische Methoden belegt.
Experimenteller Aufbau:
Der Tumor wurde subcutan in beide Flanken von 6 bis 8 Wochen alten nu/nu-Nackt- mausen implantiert. Die Behandlung wurde abhängig von der Verdopplungszeit gestartet, sobald die Tumoren einen Durchmesser von 5-7 mm erreicht hatten. Die Mäuse wurden der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe (5 Mäuse pro Gruppe mit 8 - 10 auswertbaren Tumoren) durch Randomisieren zugeteilt. Die einzelnen Tumoren der Kontrollgruppe wuchsen alle progressiv.
Die Größe der Tumoren wurde in zwei Dimensionen mittels Schieblehre vermessen. Das Tumorvolumen, das gut mit der Zellzahl korreliert, wurde anschließend für alle Auswertungen verwendet. Das Volumen wurde gemäß der Formel "Länge x Breite x Breite / 2" berechnet ([a x b^] / 2, a bzw. b stehen für zwei rechtwinklig angeordnete Durchmesser).
Die Werte des relativen Tumorvolumens (RTV) wurden für jeden einzelnen Tumor durch Dividieren der Tumorgröße am Tag X mit der Tumorgröße des Tages 0 (zum Zeitpunkt der Randomisierung) berechnet. Die mittleren Werte des RTV wurden dann für die weitere Auswertung verwendet. Die Hemmung des Tumorvolumens (relatives Tumorvolumen der Testgruppe/Kontrollgruppe x 100, T/C in %>) war der abschließende Meßwert.
Behandlung:
Die Applikation der Verbindungen erfolgte intravenös (i.V.), intraperitonial (i.p.), oral (p.o.) oder subcutan (s.c).
Die Verbindung aus Beispiel 1 wurde in vivo im Nacktmausmodell am subcutan wachsenden Melanomtumor MEXF 989 bei sechsmaliger intravenöser Gabe an Tag 1- 3 und 15-17 untersucht. Mit einer Dosis von 16 mg/kg/Tag wurde eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums mit einem optimalen T/C-Wert von 22.5 % erzielt, wobei keine Toxizität beobachtet wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
K - Sp- L - AAl - AA2 - C (I)
mit
K = unsubstituierter oder regioselektiv modifizierter Kohlenhydratrest
Sp = gegebenenfalls substituiertes Arylen oder Alkylen
L =
Figure imgf000048_0001
wobei
m eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet
n 0 oder 1 bedeutet
wobei die Verknüpfung zu Sp über die NH-Gruppe erfolgt.
AAl eine direkte Bindung oder ein Aminosäure-Rest in der D- oder L-
Konfiguration, der gegebenenfalls Schutzgruppen oder eine zweite Gruppierung K-Sp-L- trägt, in der K, Sp, L unabhängig von der anderen Gruppierung K-Sp-L- die oben angegebenen Bedeutungen haben können. AA2 eine direkte Bindung oder ein Aminosäure-Rest in der D- oder L- Konfiguration, der gegebenenfalls Schutzgruppen oder eine zweite Gruppierung K-Sp-L- trägt, in der K, Sp, L unabhängig von der anderen Gruppierung K-Sp-L- die oben angegebenen Bedeutungen haben können.
ein cytotoxischer Rest oder der Rest eines Cytostatikums oder Cyto- statikumderivats ist, der zusätzlich eine Hydroxy- oder Aminogruppe tragen kann und über eine Ester- oder Amidgruppe an AA2 gebunden ist,
und deren Isomere und Salze.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, worin
K Kohlenhydratrest mit der allgemeinen Formel (II)
Figure imgf000049_0001
wobei
A Methyl, Hydroxymethyl, Carboxy sowie davon abgeleitete Ester und Amide, Alkoxymethyl, Acyloxymethyl oder Carboxyalkyloxyrnethyl sowie davon abgeleitete Ester und Amide oder CH2-B bedeutet,
wobei
B wiederum ein über das anomere Zentrum verknüpfter Kohlenhydratrest der allgemeinen Formel (II) ist, R2, R3, R4 einzeln oder zusammen gleich H, Hydroxy, Alkyloxy, Carboxyalkyloxy sowie davon abgeleitete Ester und Amide, Hydroxyalkyloxy, Aminoalkyloxy, Acyloxy, Carboxyalkylcarbonyloxy, Sulfato, Phosphato, Halogen, oder ein weiterer modifizierter und über das anomere Zentrum verknüpfter Kohlenhydratrest (II) bedeutet, wobei R2 zusätzlich auch Amino oder Acylamino sein kann und/oder zwei der Reste R2, R3, R auch zusammen eine Epoxygruppe bilden können,
und Sp, L, m, n, AAl, AA2 und C die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 definiert haben.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 , worin
Sp Arylen, das ortho-, meta- oder para-ständig mit K und L modifiziert ist und darüber hinaus noch 1 bis 4 weitere Substituenten tragen kann, die unabhängig oder gleich H, Methyl, Methoxy, Hydroxy, Carboxy,
Methyloxycarbonyl, Cyano, Nitro, Halogen, Sulfonyl oder Sulfon- amid sein können, oder ein linearer oder verzweigter Alkylen-Rest ist,
und K, L, m, n, AAl, AA2 und C die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 definiert haben.
4. Verbindungen nach Anspruch 1, worin
C ein Nucleosid, ein Endiin-Antibiotikum oder ein cytotoxisches Peptid- antibiotikum, eine Chinolon- oder Naphthyridoncarbonsäure oder
Batracylin, 5-Fluorouracil, Cytosinarabinosid, Methotrexat, Etoposid, Camptothecin, Daunomycin, Doxorubicin, Taxol, Vinblastin,
Vincristin, Dynemicin, Calicheamycin, Esperamycin, Quercetin, Suramin, Erbstatin, Cyclophosphamid, Mitomycin C, Melphalan, Cisplatin, Bleomycin, Staurosporin oder ein anderer antineoplastisch aktiver Wirkstoff sein kann, der zusätzlich eine Hydroxy- oder Aminogruppe tragen kann und über eine Ester- oder Amidgruppe an AA2 gebunden ist,
und K, Sp L, m, n, AAl und AA2 die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 definiert haben.
5. Verbindungen nach Anspruch 4, worin
C für Camptothecin steht.
6. Verbindungen nach Anspruch 1, worin
n gleich 0 ist
und K, Sp L, m, AAl, AA2 und C die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 definiert haben.
7. Verbindungen nach Anspruch 1, worin
n gleich 0 ist
AAl eine Direktbindung ist
und K, Sp, m, AA2 und C wie in Anspruch 1 definiert sind.
8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch
1 , umfassend die Umsetzung einer Verbindung der Formel K-Sp-NH2
wobei
K und Sp die in Anspruch 1 definierte Bedeutung haben,
Figure imgf000052_0001
a) einem Chlorameisensäureester in Gegenwart einer Base in einem organischen Lösungsmittel
oder
b) einer Alkandicarbonsäure oder einem Dicarboxylderivat davon in
Gegenwart einer Base in einem organischen Lösungsmittel
und die anschließende Umsetzung mit einer Verbindung der Formel
AA1-AA2-C
wobei AAl, AA2 und C die in Anspruch 1 definierte Bedeutung haben, in Gegenwart einer Base in einem organischen Lösungsmittel.
9. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1.
10. Verwendung von Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Bekämpfung von Krebserkrankungen.
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