KR20200053158A - 약물-결합 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

약물-결합 화합물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20200053158A
KR20200053158A KR1020180136400A KR20180136400A KR20200053158A KR 20200053158 A KR20200053158 A KR 20200053158A KR 1020180136400 A KR1020180136400 A KR 1020180136400A KR 20180136400 A KR20180136400 A KR 20180136400A KR 20200053158 A KR20200053158 A KR 20200053158A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cpt
pharmaceutically acceptable
cancer
compound
aminohexanoyl
Prior art date
Application number
KR1020180136400A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102162351B1 (ko
Inventor
임정균
팔타룬쿠마
Original Assignee
순천향대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 순천향대학교 산학협력단 filed Critical 순천향대학교 산학협력단
Priority to KR1020180136400A priority Critical patent/KR102162351B1/ko
Priority to US16/677,212 priority patent/US11464864B2/en
Publication of KR20200053158A publication Critical patent/KR20200053158A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102162351B1 publication Critical patent/KR102162351B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

본 발명은 단당류에 캄토테신(Camptothecin; CPT) 또는 CPT 유도체, 및 구아니딘이 결합된 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 상기 CPT-결합 화합물을 통해 CPT 약물의 용해도 및 세포투과성을 향상시켜 목적하는 세포로 CPT를 효과적으로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 낮은 용량의 CPT로도 암, 특히 대장암을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

약물-결합 화합물 및 이의 용도{DRUG-CONJUGATED COMPOUND AND USES THEREOF}
본 발명은 약물-결합 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 단당류에 캄토테신(Camptothecin; CPT) 약물 및 구아니딘을 결합시켜, CPT의 세포투과성을 향상시킨 CPT-결합 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
캄토테신(Camptothecin; CPT)은 캄토테카 아큐미나타(Camptotheca acuminata) 나무로부터 추출된 알칼로이드로, DNA 토포이소머라아제 I(TOPO I)의 억제를 통해 작용하는 강력한 항종양 및 항생물질로 알려져 있다. 그러나, 이러한 효과에도 불구하고, CPT는 낮은 용해도 및 가역적 가수분해 성질 등으로 인해 암 치료제로서의 제형 제조 및 적용이 제한되었다.
이를 극복하기 위해 CPT의 특성이 개선된 이리노테칸(irinotecan) 및 토포테칸(topotecan) 등 다양한 CPT 유도체가 개발되었지만, 이들 역시 낮은 세포투과성 등으로 인해 약물을 효과적으로 전달하기에는 어려움이 있다.
이에 따라, 상기와 같은 CPT 또는 CPT 유도체들의 한계를 극복하기 위한 약물 전달계로서, 캄토테신을 함유하는 리포좀 캡슐(한국등록특허 10-0711315) 및 세포침투성 펩티드(CPP)를 결합시킨 접합체(한국등록특허 10-1394768) 등 CPT의 전달을 위한 다양한 방법들이 제안되었다.
그러나, 현재까지 제안된 CPT 전달 방법들 중 어느 것도 충분한 임상 치료 효과를 나타내지는 못했으며, 이에 따라 CPT를 효과적으로 전달할 수 있으면서도 안정성 및 효능이 강화된 약물 전달 기술의 개발이 필요하다.
한국등록특허 10-0711315(2007.04.18) 한국등록특허 10-1394768(2014.05.07)
이에 대해, 본 발명자들은 CPT의 낮은 용해도 및 세포투과성 저하 등의 문제점을 해결하고자, CPT-결합 화합물을 개발하였으며, 구체적으로 단당류에 CPT 또는CPT 유도체, 및 구아니딘을 결합한 CPT-결합 화합물 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단당류에 CPT 또는 CPT 유도체, 및 구아니딘이 결합된 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 환원된 단당류에 CPT(또는 CPT 유도체)와 구아니딘을 결합시킨 것으로, 상기 CPT-결합 화합물을 통해 CPT 약물의 용해도 및 세포투과성을 향상시켜 목적하는 세포로 CPT를 효과적으로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 낮은 용량의 CPT로도 암, 특히 대장암을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 일 실시예에 따른 CPT-결합 화합물과 CPT 단독의 세포 흡수 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 여기서, a 및 d는 형광 이미지를 나타내며, b 및 e는 DIC 이미지를 나타내고, c 및 f는 상기 형광 이미지와 DIC 이미지를 조합한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 일 실시예에 따른 CPT-결합 화합물의 세포 내 국소화 정도를 확인한 것이다.
도 3은 일 실시예에 따른 CPT-결합 화합물의 조직생체분포 정도를 확인한 것이다. 이때, 노출 시간은 a 및 b에서 9,000 ms, c 및 d에서 2,000 ms, e 및 f에서 2500 ms, g 및 h에서 2,000 ms, i 및 j에서 7,000 ms, k 및 l에서 1,500 ms로 하였다.
도 4는 일 실시예에 따른 CPT-결합 화합물과 CPT 단독의 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 여기서, a는 SW480 세포에서의 세포독성 결과를 나타낸 것이며, b는 HT-29 세포에서의 세포독성 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 일 실시예에 따른 CPT-결합 화합물의 세포 내 국소화 정도를 확인한 것이다.
본 발명의 일 측면은 환원된 단당류에 CPT 또는 CPT 유도체, 및 구아니딘이 결합된 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "결합"은, 분자들이 단결함으로써 근접성이 유지되도록 하는 공유성, 이온성, 또는 소수성 상호작용을 의미하며, 구체적으로 공유 결합된 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단당류는 글루코스, 솔비톨, 프룩토스, 만노스, 갈락토스 및 리보스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 환원된 단당류는 바람직하게는 솔비톨일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CPT 유도체는 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 실라테칸(silatecan), 코시테칸(cositecan), 엑사테칸(exatecan), 루토테칸(lurtotecan), 지마테칸(gimatecan), 벨로테칸(belotecan) 및 루비테칸(rubitecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CPT 또는 CPT 유도체는 링커를 통해 결합될 수 있으며, 상기 링커는 하기 화학식을 가질 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
Figure pat00001
여기서, m은 3 내지 8의 정수일 수 있으며, 바람직하게 상기 m은 5의 정수일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 구아니딘은 링커를 통해 결합될 수 있으며, 상기 링커는 하기 화학식을 가질 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
Figure pat00002
여기서, l 및 k는 각각 3 내지 8의 정수일 수 있으며, 바람직하게 상기 l 및 k는 각각 5의 정수일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 식에서, R1은 하기 화학식 2로 표시되며,
[화학식 2]
Figure pat00004
R2 내지 R5는 하기 화학식 3으로 표시되고,
[화학식 3]
Figure pat00005
상기 n, m, l 및 k는 각각 3 내지 8의 정수일 수 있으며, 바람직하게 상기 n, m, l 및 k는 각각 5의 정수일 수 있다.
상기 화학식 1에서, R1이 상기 화학식 2으로 표시되는 경우, R2 내지 R5는 상기 화학식 3으로 표시될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서, R1 내지 R5가 상기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시될 수 있다. 이때, 상기 R1 내지 R5는 중 1개 이상은 화학식 3으로 표시되며, 3개 이상은 화학식 3으로 표시될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, CPT-결합 화합물은 1-O-[20-O-(N-숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라-O-(N-{비스-[3-(N',N''-비스-(tert-부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6-O-(6-아미노헥사노일)-D-솔비톨일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CPT-결합 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 무기산 또는 유기산에 의해 형성되는 산부가염의 형태일 수 있다. 상기 무기산은 염산, 황산, 인산, 질산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 젖산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 퓨마르산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 벤조산, 아스코르브산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-히드록시에탄설폰산 및 캄포르산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
바람직하게는, 상기 CPT-결합 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 염산에 의해 형성되는 산부가염의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CPT-결합 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 1-O-[20-O-(N-숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라-O-(N-{비스-[3-(N',N''-비스-(tert-부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6-O-(6-아미노헥사노일)-D-솔비톨·8HCl; 또는 1-O-[20-O-(N-숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라-O-(N-{비스-[3-(N',N''-비스-(tert-부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6-O-(6-아미노헥사노일)-D-솔비톨·9HCl일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체 및 이들의 혼합물의 형태를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 암은 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암, 두경부암, 위암, 방광암, 비호지킨 림프종암, 흑색종, 백혈병, 신경모세포종 및 아교모세포종으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 조건 하에 다양한 암을 치료하는 데 적합하다. 이러한 관점에서, 본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 치료학적 및 예방적 의미 모두를 포함한다. 따라서, 상기 약학 조성물은 암의 초기 단계 또는 전이를 포함하여 상당히 암이 진행된 이후에도 사용될 수 있다. 특히, 용어 “치료”는 암세포 증식 속도의 감소, 암세포의 파괴, 암의 질량 또는 크기 감소, 암전이 감소, 암의 진행 지연 및 완전한 암 억제, 생존률 향상 또는 임의의 기타 적절한 임상적 종점을 의미한다.
상기 약학 조성물은 혈관 내 투여될 수 있으며, 정맥 내 투여되는 것이 바람직하다. 상기 약학 조성물의 의약 제제 형태로서는 동결건조 제제인 것이 바람직하며, 사용 시에 희석하여 주사 용액을 제조할 수 있는 주사액 제제 또는 그대로 투여 가능한 희석 용액 제제 등일 수 있다.
상기 약학 조성물은 CPT의 화학적 안정성 및 CPT-결합 화합물의 형성 안정성을 고려하여 동결건조 제제인 것이 바람직하다.
상기 약학 조성물이 투여되는 경우에, 통상적으로 물, 생리식염수, 5% 포도당 또는 만니톨 수용액, 수용성 유기 용매(예를 들어, 글리세롤, 에탄올, 디메틸설폭시드, N-메틸피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 클레모포어 등의 단일 용매 또는 이들의 혼합 용매) 등을 사용하여 상기 의약 제제의 용액으로 사용될 수 있다.
상기 의약 제제에는 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 첨가제로는 결합제, 활택제, 붕해제, 용제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 보존제, 무통화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있다.
상기 동결건조 제제의 경우, 상기 CPT-결합 화합물을 임의의 첨가제와 함께 수용액으로 제조할 수 있다. 이후, 상기 수용액의 pH를 조절하여 여과멸균을 실시한 후, 용기에 나누어 주입하고 동결건조하여 동결건조 제제를 제조할 수 있다. 이때, pH 조절제를 사용하여 pH를 조절하거나 유효성분 자체로 pH 조절을 실시할 수도 있다.
상기 주사액 제제의 경우, 상기 CPT-결합 화합물을 임의의 당류 첨가제와 함께 수용액으로 제조할 수 있다. 이후, pH를 조절하여 여과멸균을 실시한 후, 용기에 나누어 주입하여 주사액 제제를 제조할 수 있다. pH의 조절에는 pH 조절제를 사용하거나 유효성분 자체로 pH 조절을 실시할 수도 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 성별, 연령, 생리적 상태, 병태 등에 따라 변경될 수 있으며, 비경구적으로 통상 성인 1일당 0.01 mg/m2 내지 500 mg/m2(체표면적), 바람직하게는 0.1 mg/m2 내지 250 mg/m2을 투여할 수 있다. 주사에 의한 투여는 정맥, 동맥, 환부(종양부) 등에 실시될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예
재료 및 방법
S-(+)-캄토테신, 플루오레신-5-이소티오시아네이트(FITC-I), 트리에틸아민(Et3N), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 디이소프로필에틸아민(DIPEA) 및 트리플루오로아세트산(TFA)을 Sigma-Aldrich Korea에서 구입하였다. 사용전 모든 용매를 표준방법으로 정제하고 건조시켰다. NMR 구조 분석을 Bruker ASPECT 300 기기를 사용하여, 1H NMR에 대해서 300 MHz 및 13C NMR에 대해서 75 MHz으로 수행하였다. 1H NMR에 대해 내부표준으로 사용되는 테트라메틸실란(TMS) 또는 산화중수소(D2O)에 대한 백만분율(ppm)로 화학 시프트를 기록하였다. 질량 스펙트라를 고속원자폭격법(fast atom bombardment, FAB)을 사용하여 수득하였다. 고분자량 화합물인 MALDI-TOF 데이터의 분석 결과를 Biomolecular Diversity Core Facility(POSTECH)에서 Micromass M@DI로 수득하였다. 중압액체크로마토그래피(MPLC)를 Fluka 100 C8-반전상 실리카겔을 갖는 CombiFlash RF+ Lumen UV로 수행하였다. 분석(analytical) RP-HPLC 및 예비(preparative) RP-HPLC를 Agilent 1220 Infinity LC Chemstation으로 수행하였다.
제조예 1. 20- O -[N-( tert -부톡시카보닐)-6-아미노헥사노일] 캄토테신 (1)
무수 DMF 중 (S)-(+)-캄토테신(40 mg, 0.11 mmol) 용액에 6-tert-부톡시카보닐-아미노헥사노익산(51 mg, 0.22 mmol), EDC(46 mg, 0.24 mmol) 및 DMAP(7 mg, 0.055 mmol)를 실온에서 아르곤 분위기하에 첨가하고 밤새 교반하였다. 반응된 혼합물을 물(20 ml)로 희석시킨 후, 에틸아세테이트(20 ml)로 3회 추출하였다. 상기 추출물을 0.1 M 염산(30 ml) 및 증류수(30 ml)를 이용하여 연속적으로 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고 진공하에서 농축시켰다. 미정제 잔여물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 : MeOH = 25 : 1)로 정제하여 연노란색 고체의 표제 화합물 (1)(63 mg, 98%)을 수득하였다.
mp 154℃, Rf 0.38 (CH2Cl2 : MeOH = 20 : 1); 1H NMR (CDCl3): δ 0.91 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.38-1.49 (m, 13H), 1.64-1.68 (m, 2H), 2.10-2.36 (m, 2H), 2.49 (td, J = 2.5, 7.3 Hz, 2H), 3.04-3.08 (m, 2H), 4.75 (br s, 1H, NH), 5.26 (s, 2H), 5.39 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.65 (d, J = 17.2 Hz), 7.22 (s, 1H), 7.65-7.68 (m, 1H), 7.80-7.83 (m, 1H), 7.92 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.39 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3): δ 7.7, 24.4, 26.2, 28.5, 29.8, 31.9, 33.8, 40.4, 50.1, 67.2, 75.9, 96.3, 120.5, 128.2, 128.3, 128.4, 12.5, 130.9, 131.6, 146.1, 146.2, 148.8, 152.4, 156.1, 157.6, 167.7, 172.7; MS (FAB) m/z calcd. for C31H36N3O7 562.25, found 562.37 [M+H]+.
제조예 2. 20- O -(6-아미노헥사노일)캄토테신 트리플루오로아세트산 염 (2)
20% TFA-CH2Cl2(2 ml) 중 상기 제조예 1에서 제조한 화합물 (1) 용액(61 mg, 0.108 mmol)을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 감압하에서 용액을 증발시킨 후, 잔여물을 디에틸에테르(20 ml)로 분쇄하였다. 수득한 고체를 여과하고, CH2Cl2(20 ml)로 세척한 후 진공하에서 건조시켜 추가의 정제를 필요로 하지 않는 표제 화합물 (2)의 TFA 염(49 mg, 79%)을 수득하였다.
mp 214℃, 1H NMR (CD3OD): δ 1.04 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.42-1.52 (m, 2H), 1.62-1.78 (m, 4H), 2.14-2.28 (m, 2H), 2.59-2.65 (m, 2H), 2.90 (t, J =7.6 Hz, 2H), 5.32 (s, 2H), 5.47 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 5.61 (d, J = 16.8 Hz), 7.36 (s, 1H), 7.68-7.74 (m, 1H), 7.85-7.90 (m, 1H), 8.07 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.64 (s, 1H); 13C NMR (CD3OD): δ 8.0, 25.1, 26.6, 28.2, 32.0, 34.2, 40.5, 51.4, 67.7, 77.5, 97.7, 120.5, 129.1, 129.6, 129.8, 130.7, 131.9, 133.3, 147.4, 148.4, 149.4, 153.3, 158.9, 169.6, 173.8; MS (FAB) m/z calcd. for C26H28N3O5 462.20, found 462.36 [M+H]+.
제조예 3. 20- O -( N -숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신 (3)
무수 DMF(2 ml) 중 상기 제조예 2에서 제조한 화합물 (2) 용액(30 mg, 0.052 mmol)에 숙신산 무수물(7.8 mg, 0.078 mmol), DMAP(3.1 mg, 0.026 mmol) 및 피리딘(12.7 ml, 0.156 mmol)을 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 아르곤 분위기하에 12시간 동안 교반하였다. 반응된 혼합물을 증류수(20 ml)로 희석시킨 후, 에틸아세테이트(20 ml)로 3회 추출하였다. 상기 추출물을 0.1 M 염산(30 ml) 및 증류수(30 ml)를 이용하여 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 진공하에서 농축시켰다. 미정제 잔여물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 : MeOH = 10 : 1)로 정제하여 연노란색 고체의 표제 화합물 (3)(28 mg, 95%)을 수득하였다.
mp 162℃, Rf 0.36 (CH2Cl2 : MeOH = 10 : 1), 1H NMR (CDCl3 + CD3OD): δ 1.0 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.38-1.54 (m, 4H), 1.62-1.71 (m, 2H), 2.11-2.28 (m, 2H), 2.37-2.59 (m, 6H), 3.13 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 5.31 (s, 2H), 5.40 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 5.63 (d, J = 17.1, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.66-7.71 (m, 1H), 7.82-7.87 (m, 1H), 7.99-8.01 (m, 1H), 8.15-8.18 (m, 1H), 8.54 (s, 1H). 13C NMR (d6-DMSO): δ 7.5, 24.1, 25.7, 28.7, 30.2, 31.8, 32.2, 33.1, 38.1, 50.2, 75.6, 94.6, 118.8, 127.7, 128.5, 128.9, 129.7, 130.4, 131.6, 145.4, 146.0, 147.8, 152.2, 152.3, 156.5, 162.3, 167.2, 171.9, 172.0; MS (FAB) m/z calcd. for C30H32N3O8 562.22, found 562.37 [M+H]+.
제조예 4. 20- O -[6-(플루오레시닐-5-티오우레이도)-헥사노일) 캄토테신 (4)
DMF(1 ml) 중 상기 제조예 3에서 제조한 화합물 (3) 용액(15.6 mg, 0.027 mmol)에 Et3N(0.17 ml, 0.90 mmol) 및 FITC-I(17.60 mg, 0.041 mmol)를 첨가하였다. 어두운 곳에서 12시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 45℃에서 톨루엔으로 공비혼합(azeotrope)하였다. 농축된 용액을 SiO2 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 예비 TLC를 수행하여 끈적한 노란색 오일의 표제 화합물 (4)(19 mg, 84%)를 수득하였다.
Rf 0.42 (CH2Cl2 : MeOH = 10 : 1 + AcOH (0.1%)); 1H NMR (CDCl3 + MeOD): δ 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 1.15-1.92 (m, 6H), 2.05-2.38 (m, 2H), 2.39-2.63 (m, 2H), 3.51-3.60 (m, 2H), 5.30 (s, 2H), 5.53 (dd, J = 60, 17.1 Hz, 2H), 6.43-6.84 (m, 6H), 7.10 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.70 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.83 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.85 (s, 2H), 7.86-8.00 (m, 1H), 8.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H); HR-MS (FAB) m/z calcd. for C47H39N4O10S 851.2387, found 851.2382 [M+H]+.
제조예 5. 1- O -트리틸-2,3,4,5-테트라- O -( N -{비스-[3-( N ', N ''-비스-( tert -부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-D-솔비톨 (5)
솔비톨을 골격으로 8개의 구아니딘기를 갖는 양이온성 화합물을 한국등록특허 10-0699279의 실시예 1에 기재된 방식을 참조하여 제조하였다. 구체적으로, 한국등록특허 10-0699279에 기재된 제조예 1과 같이 보호된 D-글루코스로부터 보호기를 갖는 솔비톨을 제조하고, 제조예 6과 같이 제조된 N,N'-다이-Boc-구아니딘기를 갖는 아미노카프로산 유도체를 사용하여, 실시예 1과 같이 8개의 구아니딘기를 갖는 화합물을 제조하였다.
제조예 6. 1- O -[ N -( tert -부톡시카보닐)-6-아미노헥사노일]-2,3,4,5-테트라- O -( N -{비스-[3-( N ', N ''-비스-( tert -부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6- O -트리틸-D-솔비톨 (6)
상기 제조예 5의 화합물 (5)(250 mg, 0.076 mmol)를 6-tert-부톡시카보닐-아미노헥사노익산(35.4 mg, 0.152 mmol), EDC(29 mg, 0.152 mmol) 및 DMAP(2 mg, 0.015 mmol)와 무수 CH2Cl2(20 ml)에 용해시켰다. 반응된 혼합물을 실온에서 N2 분위기하에 2일 동안 교반시켰다. 증류수를 첨가하여 반응을 종료시키고, 용액을 CH2Cl2로 추출하였다. 상기 추출물을 포화 NaHCO3 용액으로 세척한 다음에 브라인으로 세척한 후 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 유기상을 진공하에서 농축시키고 잔여물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (6)(250 mg, 93%)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 1.51-1.77 (m, 191H), 2.28-2.35 (m, 10H), 2.54-2.61 (m, 24H), 3.08-3.11 (m, 2H), 3.43 (br s, 16H), 3.60-4.41 (m, 4H), 4.81-5.62 (m, 4H), 7.24-7.42 (m, 15H), 8.51 (s, 8H), 11.5 (s, 8H); MALDI-TOF-MS: m/z calcd. for C172H292N29O45 3484.14, found 3484.23 [M+H]+.
제조예 7. 1- O -[ N -(tert-부톡시카보닐)-6-아미노헥사노일]-2,3,4,5-테트라- O -( N -{비스-[3-( N ', N ''-비스-( tert -부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-D-솔비톨 (7)
플래시 실리카 겔 컬럼 하부에 1% Et3N을 함유하는 헥산을 충전한 다음에 컬럼 상부에 1% TFA을 함유하는 헥산을 충전한 후, 바다 모래층을 그 사이에 배치하였다. 상기 제조예 6에서 제조한 화합물 (6)(240 mg, 0.068 mmol)을 CH2Cl2에 용해시켰다. 용액을 컬럼상에 로딩하고, CH2Cl2 중 MeOH의 농도를 증가시키면서 용출시켜 무색의 포말성(foamy) 고체의 표제 화합물 (7)(120 mg, 54%)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 1.26-1.69 (m, 175H), 1.91-2.04 (m, 16H), 2.33 (br s, 10H), 2.86-3.22 (m, 26H), 3.47 (br s, 16H), 3.70-4.51 (m, 4H), 4.65-5.53 (m, 4H), 8.51 (s, 8H), 11.45 (s, 8H); 13C NMR (CDCl3): δ 24.4, 26.2, 27.9, 28.2, 33.8, 38.5, 40.3, 50.4, 53.1, 79.2, 83.2, 153.0, 156.5, 163.3, 170.5, 172.5, 172.7; MALDI-TOF-MS: m/z calcd. for C153H278N29O45 3242.03, found 3242.15 [M+H]+.
제조예 8. 1- O -[20- O -( N -숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라- O -( N -{비스-[3-( N ', N ''-비스-( tert -부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6- O -[ N -(tert-부톡시카보닐)-6-아미노헥사노일]-D-솔비톨 (8)
상기 제조예 7에서 제조한 화합물 (7)(100 mg, 0.030 mmol)을 상기 제조예 3의 화합물 (3)(34 mg, 0.060 mmol), EDC(11.5 mg, 0.060 mmol) 및 DMAP(1.0 mg, 0.006 mmol)와 함께 무수 CH2Cl2(20 ml)에 용해시켰다. 반응된 혼합물을 실온에서 N2 분위기하에 2일 동안 교반시켰다. 상기 혼합물에 증류수를 첨가한 후, CH2Cl2로 용액을 추출하였다. 상기 추출물을 포화 NaHCO3 용액으로 세척한 다음에 브라인으로 세척한 후 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 유기층을 진공하에서 농축시키고 잔여물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (8)(60 mg, 52%)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3): δ 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.25-1.77 (m, 197H), 2.00-2.84 (m, 42H), 3.08-3.20 (m, 4H), 3.44-3.46 (m, 16H), 3.65-4.5 (m, 4H), 4.87-5.70 (m, 8H), 7.21 (s, 1H), 7.67 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.50 (s, 8H), 11.47 (s, 8H); 13C NMR (CDCl3): δ 8.7, 21.3, 24.7, 25.9, 27.1, 28.2, 28.5, 31.9, 33.7, 34.0, 39.3, 45.9, 50.1, 51.4, 52.9, 53.6, 53.7, 67.2, 79.3, 83.1, 96.1, 128.2, 128.4, 128.7, 129.6, 130.9, 131.5, 146.1, 146.4, 149.0, 152.5, 153.2, 156.3, 157.5, 163.7, 172.8; MALDI-TOF-MS: m/z calcd. for C183H307N32O52 3785.23, found 3785.29 [M+H]+.
제조예 9. 1- O -[20- O -( N -숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라- O -( N -{비스-[3-( N ', N ''-비스-( tert -부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6- O -(6-아미노헥사노일)-D-솔비톨·9HCl (9)
상기 제조예 8에서 제조한 화합물 (8)(60 mg, 0.016 mmol)을 HCl(g)로 포화된 에틸아세테이트(10 ml)와 실온에서 진공하에 2일 동안 교반시켰다. 생성된 침전물을 헥산으로 3회 이상 세척하고 진공하에서 건조시켰다. 생성물을 증류수에 용해시키고, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 실린지 필터로 여과시킨 후, 동결건조하여 미정제 생성물을 수득하였다. 상기 미정제 생성물을 예비 RP-HPLC(GRACEVYDAC, C-18)(2.0 ml min-1, 10 : 90 = CH3CN: H2O, 220 nm)로 정제하여 흰색의 포말성 고체의 표제 화합물 (9)(HCl 염)(35 mg, 92%)를 수득하였다.
1H NMR (D2O + MeOD): δ 1.08 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.27-1.42 (m, 12H), 1.67-1.69 (m, 22H), 2.05-2.08 (m, 14H), 2.26-2.54 (m, 14H), 2.72 (m, 2H), 3.01 (m, 2H), 3.25-3.33 (m, 46H), 3.57 (m, 2H), 4.01-4.52 (m, 4H), 4.53-5.70 (m, 8H), 6.75-8.41 (m, 6H); 13C NMR (D2O + MeOD): δ 8.5, 23.9, 24.4, 25.1, 26.7, 27.1, 27.9, 29.5, 30.7, 31.5, 32.1, 33.3, 34.7, 39.7, 40.5, 40.7, 51.7, 54.5, 55.4, 68.2, 77.9, 99.0, 120.1, 129.1, 129.6, 132.7, 134.1, 149.1, 152.5, 154.5, 158.3, 159.2, 171.6, 176.1; MALDI-TOF-MS: m/z calcd. for C98H171N32O18 2084.34, found 2084.39 [M+H]+; analytical HPLC (GRACEVYDAC C-18): tR = 2.72 min (flow rate = 1 ml min-1, UV 220 nm, CH3CN : H2O = 70 : 30).
제조예 10. 1- O -[20- O -( N -숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라- O -( N -{비스-[3- N ', N ''-비스-( tert -부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6- O -[6-(플루오레시닐-5-티오우레이도)-헥사노일]-D-솔비톨·8HCl (10)
DMF(2 mL) 중 상기 제조예 9에서 제조한 화합물 (9) 용액(10 mg, 0.004 mmol)에 디이소프로필에틸아민(0.015 ml, 0.083 mmol) 및 플루오레신-5-이소티오시아네이트(2 mg, 0.005 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 어두운 곳에서 24시간 동안 교반한 후, 톨루엔으로 공비제거(azeotropic removal)하여 감압하에 45℃에서 반복적으로 농축시켰다. 잔여물을 MeOH에 용해시키고, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 실린지 필터로 여과시키고, 생성된 용액을 증발시켰다. 미정제 생성물을 MPLC(C8 column) 및 예비 RP-HPLC(GRACEVYDAC, MONOMER C-18)(2.0 ml min -1 , 10% CH3CN in H2O, 220 nm)로 연속적으로 정제하여 끈적한 주황색 고체의 표제 화합물 (10)(6 mg, 52%)을 수득하였다.
1H NMR (MeOD): δ 1.04 (t, J = 7.2 Hz), 1.38-1.42 (m, 12H), 1.69 (m, 22H), 2.01-2.04 (m, 14H), 2.39-2.69 (m, 16H), 3.07-3.13 (m, 50H), 3.72-4.51 (m, 4H), 4.54-5.65 (m, 8H), 6.61-6.65 (m, 2H), 6.70 (s, 2H), 6.83-6.87 (m, 2H), 7.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.71-7.76 (m, 2H), 7.87 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.32 (m, 1H), 8.69 (s, 1H); 13C NMR (MeOD): δ 8.6, 25.6, 25.9, 27.8, 30.0, 30.4, 32.2, 32.6, 35.1, 37.2, 40.4, 44.0, 52.2, 54.9, 68.3, 98.3, 104.2, 120.1, 129.7, 130.3, 131.4, 132.5, 149.3, 159.2, 174.2; MALDI-TOF-MS: m/z calcd. for C119H181N33O23S 2472.37, found 2472.51[M]+; analytical HPLC (GRACEVYDAC C-18): tR = 2.30 min (flow rate = 1 ml min-1, UV 220 nm, CH3CN : H2O = 70 : 30), purity 98+%.
실시예 1. 링커 또는 플루오레신이 결합된 캄토테신의 합성
[화학반응식 1]
Figure pat00006
캄토테신에 링커 또는 플루오레신을 결합하는 방법을 상기 화학반응식 1에 도시하였다. 먼저, 링커를 갖는 CPT 유도체를 합성하였다. CPT의 C20-하이드록실기를 EDC 및 DMAP의 존재하에 Boc-아미노헥사노익산에 결합시켜 화합물 (1)을 수득하였다. 이어서, Boc 보호기를 CH2Cl2 중 10% TFA로 제거하여 추가의 정제를 필요로 하지 않는 상기 화합물 (2)를 수득하였다. 상기 화합물 (2)를 DMF 중 숙신산 무수물, DMAP 및 피리딘으로 처리하여 화합물 (3)을 수득하였고, 이를 CPT-결합 화합물의 전구체로 사용하였다. 하기 실시예 2의 CPT-결합 화합물 및 블랭크 화합물(즉, FITC만이 결합된 CPT) 사이의 전달 효율성을 비교하기 위해, 상기 화합물 (2)를 DMF 중 FITC-1 및 트리에틸아민으로 처리하여 이소티오시아네이트 결합을 통해 플루오레신이 혼입된 블랭크 화합물인 화합물 (4)를 형성하였다(반응식 1).
실시예 2. CPT-결합 화합물의 합성
[화학반응식 2]
Figure pat00007
단당류를 기반으로 하는 화합물 말단에 링커를 통해 다수의 구아니딘이 결합되고, 현미경 분석을 위해 한쪽 말단에 형광 프로브가 결합되며, 다른 말단에는 전달대상물(cargo)로서 CPT를 갖도록 설계하여 CPT가 결합된 화합물을 합성하였다.
상기 단당류로서는 α-D-글루코스를 선형 구조로 환원시켜 환원된 단당류인 솔비톨을 형성하였으며, 상기 솔비톨에 대해 트리틸화 및 아실화하여 화합물 (5)를 형성하였다. 상기 화합물 (5)는 Boc-보호된 비스-구아니딘과 4개의 분지형 측쇄를 가지며, 이로써 총 8개의 Boc-보호된 구아니딘을 제공한다.
형광 프로브를 부착하기 위해, Boc-아미노헥사노익산을 링커로 사용하여 DMF 중 EDC 및 DMAP와 함께 교반하여 상기 화합물 (5)에 결합시켜 화합물 (6)을 형성하였다. 컬럼 하부에 1% Et3N을 함유하는 헥산 및 상부에 1% TFA를 함유하는 헥산으로 충전된 플래쉬 SiO2 컬럼을 통해 CH2Cl2/MeOH 혼합물의 용출 구배로 다수의 Boc기의 존재하에 상기 화합물 (6) 내 트리틸기를 선택적으로 제거하였다. 생성된 화합물 (7)을 DMF 중 EDC 및 DMAP와 함께 교반하여 CPT 유도체인 화합물 (3)과 결합시켜 적당한 수율로 화합물 (8)을 수득하였다. CPT 및 링커를 에스테르 결합하여 공유결합시켰으며, 이로써 상기 화합물 (8)은 세포 흡수 후 가수분해되어 가용화물(payload)을 방출시킬 수 있다.
상기 화합물 (8)의 모든 Boc기를 HCl로 포화된 에틸아세테이트로 제거하여 화합물 (9)를 제조하였고, 예비 HPLC로 정제하였다. 이를 통해, 모든 구아니딘 잔기가 구아니디늄 클로라이드 염으로 전환되어 수용액에 대한 높은 용해도를 보였다. CPT-결합 화합물인 화합물 (9)를 생물학적 분석을 위한 모델 기질로 사용하였다. 또한, 형광 프로브 부착을 위해 화합물 (9)를 DMF 중 FITC-I 및 DIPEA로 처리하여 형광 프로브가 부착된 화합물 (10)을 수득하였다. 미정제 생성물을 C-8 역상 컬럼을 갖는 MPLC로 정제하고, 예비 HPLC로 재정제하여 98% 이상의 순도로 화합물 (10)을 수득하였다(반응식 2).
실험예 1. 세포배양
DMEM(High glucose Dulbecco's modified Eagle's medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640, DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7.4), 소태아혈청(FBS) 및 트립신/EDTA를 GibcoTM 및 Thermo Fischer Scientific에서 수득하였다. 미토트랙커(Mitotracker) 및 라이소트랙커(Lysotracker)를 Invitrogen Inc(USA)로부터 수득하였다. 3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 Sigma-Aldrich Korea에서 구입하였다. Milli-Q 정제수(18.2 MΩ)를 사용하여 모든 용액을 제조하였다. HeLa 세포를 37℃에서 습윤 5% CO2 환경하에 DMEM와 페니실린이 함유된 10%(v/v) FBS로 배양하였다. SW480 세포 및 HT-29 세포의 경우, RMPI 1640 배지를 사용하였다.
실험예 2. 세포 흡수 확인
공초점 현미경을 이용하여 상기 실시예 2의 CPT-결합 화합물(화합물 (10)) 및 상기 화합물 (4)(FITC만이 결합된 CPT)가 세포막을 통과하여 세포 내로 전위할 수 있는지에 대한 세포 흡수 효과를 비교하였다.
HeLa 세포(웰당 1 x 105 세포)를 35 mm 커버글래스 바텀 디쉬(SPL Ltd., Korea)에 시딩(seeding)하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS(x1)로 세척한 후, 각각 10 M의 화합물 (4) 또는 화합물 (10)을 함유하는 무혈청 DMEM(1% v/v DMSO) 2 ml로 처리하였다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 차가운 PBS로 3회 세척하여 내재화(internalize)되지 않은 시료를 제거하였다. 살아있는 HeLA 세포를 오일 침지 렌즈(NA 1.30, 40x)가 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Olympus Fluoview FV1000)으로 조사하였다. FITC는 아르곤 레이저로 488 nm에서 여기되었고, 형광은 500 내지 530 nm 방출 밴드 필터로 관찰되었다. 미토트랙커 및 라이소트랙커는 HeNe 레이저로 543 mm에서 여기되었고, 형광은 600 내지 700 nm 방출 필터로 관찰되었다. 각각의 분석을 3회 반복 수행하였다.
살아있는 세포 내에서의 세포 흡수를 표지된 형광을 통해 육안으로 확인한 결과, 화합물 (10)을 처리한 세포의 세포질에서 주로 강한 녹색 형광이 나타난 것을 확인하였다. 이를 통해, 화합물 (10)이 세포막을 투과하여 세포질로 확산될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 상기 화합물 (10)과는 달리, 상기 화합물 (4)에서는 세포 내 형광이 확인되지 않았다. 결과적으로, 상기 화합물 (10)이 CPT를 세포 내 효과적으로 전달할 수 있으며, CPT-결합 화합물 내 다수의 구아니딘이 세포막 투과성을 부여하는데 필수적이라는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 화합물 (10)은 수동 확산 또는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포로 진입할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
실험예 3. 세포 내 국소화 확인
HeLa 세포를 화합물 (10)과 특정 소기관 마커(미토트랙커 및 라이소트랙커)로 동시에 염색하였다. 살아있는 HeLa 세포를 초기 30분 동안 화합물 (10)(10 m)으로 처리한 후, 미토콘드리아 마커인 미토트랙커(100 nM, Invitrogen)로 30분 동안 처리하였다. 화합물 (10) 및 미토트랙커 형광 모두에서 동시-국소화(co-localization)가 현저하게 관찰되었으며(도 2의 a), 화합물 (10)이 미토콘드리아에 대해 높은 친화성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
이와는 대조적으로, 리소좀 마커인 라이소트랙커(200 nM, Invitrogen)를 HeLa 세포에 처리할 경우, 동시-국소화는 관찰되지 않았다(도 2의 b). 화살표로 각 형광 신호의 강도를 표시하여 동시-국소화 정도를 나타내었다(도 2의 오른쪽).
또한, 10 μM의 화합물 (10)을 처리하여 세포 내 국소화를 확인한 결과, 미토콘드리아에 대한 세포 내 국소화를 나타내는 것을 확인하였다. 한편, 더 높은 농도인 20 μM의 화합물 (10)과 HeLa 세포를 30분 동안 배양하였을 때의 공초점 현미경 이미지를 확인한 결과, 핵 내부에서도 형광을 확인할 수 있었다. 이를 통해 특정 농도 이상일 때 CPT-결합 화합물이 핵 내부에 존재할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 CPT-결합 화합물이 핵 내부까지 도달함으로써 목적하는 CPT의 약물 효과를 달성할 수 있다.
실험예 4. 조직생체분포(Tissue biodistribution) 확인
상기 CPT-결합 화합물인 화합물 (10)을 복강내 주입(ip)한 경우, 마우스에서의 조직분포를 관찰하였다. 상기 화합물 (10)(HCl 염, 93.4 mg kg-1)을 멸균수에 용해시키고, 8주된 생쥐(C57BL/6)에 주입하였다. 30분 후, 마우스에 PBS(pH 7.4) 중 파라포름알데히드(4%)를 관류시키고 주요 기관(뇌, 심장, 신장, 간, 폐 및 비장)을 수거하여 수크로즈 용액(PBS 중 0.5 M)으로 밤새 배양하였다. 조직을 동결보호제(cryoprotectant)에서 동결시키고 15 m 절편으로 절단하였다. 건조 후, 각 절편을 유리 슬라이드에 옮기고 Triton X-100으로 15분 동안 처리하였다. 형광 현미경(Axioplan 2)을 통해 관찰한 결과, CPT-결합 화합물은 주로 신장, 폐, 비장에서 관찰되었으며, 뇌에서도 관찰되는 것으로 나타났다(도 3).
실험예 5. 세포독성 측정
MTT 분석을 통해 CPT-결합 화합물(화합물 (9))과 CPT 단독의 세포독성을 비교하였다. 이때, 형광 프로브에 의해 유도될 수 있는 불필요한 효과를 방지하기 위해 FITC를 포함하지 않는 CPT-결합 화합물인 화합물 (9)를 사용하였다.
SW480 세포 및 HT-29 세포(웰 당 4.5 x 103 세포)를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 후, 배지를 무혈청 RMPT 1640으로 바꾸고, 추가의 24시간 이후에 세포를 화합물 (9) 또는 CPT로 각각 다른 농도(1.28, 6.4, 32 nM, 0.16, 0.8, 4, 20, 100 M)에서 처리하였다. 처리된 세포를 48시간 동안 배양하고, 차가운 PBS로 세척한 후, 배지로 MTT에 4시간 동안 노출시켰다. 배지를 DMSO로 바꾸고, 용해된 포르마잔 염료를 500 nm에서의 흡광도로 측정하여 정량하였다. 대조군으로서 비-처리 세포를 동일한 방식으로 측정하였다.
그 결과, 화합물 (9)는 CPT보다 세포생존력이 감소하여 대장암 세포주에 대한 약물 효능이 훨씬 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. SW480 세포에서의 CPT 및 화합물 (9)의 IC50 값은 각각 1.53 M 및 0.54 M인 반면, HT-29 세포에서의 IC50 값은 각각 0.99 M 및 0.57 M이었다. 상기 결과를 통해, 화합물 (9)가 CPT 단독보다 효율적으로 세포로 침투할 수 있어 세포 내에서의 약물 효능을 향상시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
항암 효과를 갖는 것으로 알려진 CPT의 약물 전달 문제를 개선하기 위해, 세포 내재화에 필수적인 8개의 구아니딘을 포함하는 CPT-결합 화합물을 설계하고 합성하였다(화합물 (9) 및 화합물 (10)). 그 결과, 공초점 현미경을 통해 상기 CPT-결합 화합물이 HeLa 세포 내로 급속하게 내재화되고 미토콘드리아를 표적으로 한다는 것을 확인할 수 있었으며, 신장, 폐 및 비장에 특이성을 보이는 것으로 나타났다. 또한, 상기 CPT-결합 화합물의 세포독성을 MTT 분석으로 정량화한 결과, SW480 세포 및 HT-29 세포에서 상기 CPT-결합 화합물의 IC50 값이 CPT 보다 훨씬 낮게 나타나, CPT-결합 화합물의 약물 효능이 세포 내재화 이후에도 잘 유지된다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 환원된 단당류에 캄토테신(Camptothecin; CPT) 또는 CPT 유도체, 및 구아니딘이 결합된 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단당류는 글루코스, 솔비톨, 프룩토스, 만노스, 갈락토스 및 리보스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CPT 유도체는 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 실라테칸(silatecan), 코시테칸(cositecan), 엑사테칸(exatecan), 루토테칸(lurtotecan), 지마테칸(gimatecan), 벨로테칸(belotecan) 및 루비테칸(rubitecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CPT 또는 CPT 유도체는 링커를 통해 결합되는 것인, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 구아니딘은 링커를 통해 결합되는 것인, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 1로 표시되는, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00008

    상기 식에서,
    R1은 하기 화학식 2로 표시되며,
    [화학식 2]
    Figure pat00009

    R2 내지 R5는 하기 화학식 3으로 표시되고,
    [화학식 3]
    Figure pat00010

    상기 n, m, l 및 k는 각각 3 내지 8의 정수이다.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 CPT-결합 화합물은 1-O-[20-O-(N-숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라-O-(N-{비스-[3-(N',N''-비스-(tert-부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6-O-(6-아미노헥사노일)-D-솔비톨인, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 CPT-결합 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 황산, 인산, 질산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 무기산에 의해 형성되는 산부가염의 형태인, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 CPT-결합 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 1-O-[20-O-(N-숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라-O-(N-{비스-[3-(N',N''-비스-(tert-부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6-O-(6-아미노헥사노일)-D-솔비톨·8HCl; 또는
    1-O-[20-O-(N-숙시닐-6-아미노헥사노일)캄토테신]-2,3,4,5-테트라-O-(N-{비스-[3-(N',N''-비스-(tert-부톡시카보닐)-구아니디노)-프로필]}-6-아미노헥사노일)-6-O-(6-아미노헥사노일)-D-솔비톨·9HCl인, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염이 거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체 및 이들의 혼합물의 형태를 갖는, CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  11. 제1항에 따른 CPT-결합 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암, 두경부암, 위암, 방광암, 비호지킨 림프종암, 흑색종, 백혈병, 신경모세포종 및 아교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암 치료용 약학 조성물.
KR1020180136400A 2018-11-08 2018-11-08 약물-결합 화합물 및 이의 용도 KR102162351B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180136400A KR102162351B1 (ko) 2018-11-08 2018-11-08 약물-결합 화합물 및 이의 용도
US16/677,212 US11464864B2 (en) 2018-11-08 2019-11-07 Drug-bound compound and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180136400A KR102162351B1 (ko) 2018-11-08 2018-11-08 약물-결합 화합물 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200053158A true KR20200053158A (ko) 2020-05-18
KR102162351B1 KR102162351B1 (ko) 2020-10-06

Family

ID=70550177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180136400A KR102162351B1 (ko) 2018-11-08 2018-11-08 약물-결합 화합물 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
US (1) US11464864B2 (ko)
KR (1) KR102162351B1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004064777A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Pro-Pharmaceuticals Inc Modified polysaccharides combination with anti-cancer drugs for enhanced treatment of cancer
KR100711315B1 (ko) 1997-09-16 2007-04-27 오에스아이 파마슈티컬스, 인코포레이티드 리포좀 캄프토테신 제제
KR20090115856A (ko) * 2007-02-01 2009-11-09 시그마타우 인두스트리에 파르마슈티케 리우니테 에스.피.에이. 캄포테신 유도체를 함유하는 약학적 조성물
KR101394768B1 (ko) 2006-03-30 2014-05-21 드라이스 파마슈티컬스 아이엔씨 캄토테신-세포 투과 펩티드 결합체 및 이를 포함하는 약학 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100711315B1 (ko) 1997-09-16 2007-04-27 오에스아이 파마슈티컬스, 인코포레이티드 리포좀 캄프토테신 제제
WO2004064777A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Pro-Pharmaceuticals Inc Modified polysaccharides combination with anti-cancer drugs for enhanced treatment of cancer
KR101394768B1 (ko) 2006-03-30 2014-05-21 드라이스 파마슈티컬스 아이엔씨 캄토테신-세포 투과 펩티드 결합체 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR20090115856A (ko) * 2007-02-01 2009-11-09 시그마타우 인두스트리에 파르마슈티케 리우니테 에스.피.에이. 캄포테신 유도체를 함유하는 약학적 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Drug. Deliv., 25(1), 153-165, 2017.12.28. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102162351B1 (ko) 2020-10-06
US20200147227A1 (en) 2020-05-14
US11464864B2 (en) 2022-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11413281B2 (en) Ternary conjugate of antitumor drug, and synthesis and application
EP3152223B1 (en) Mitomycin conjugate
CA2441484A1 (en) Molecular conjugates for use in treatment of cancer
JP2018512376A (ja) 抗体薬物コンジュゲート
CA3025931A1 (en) Antibody drug conjugates having derivatives of amatoxin as the drug
JP2010540471A (ja) ガンボギン酸グリコシド誘導体及びアナログ、並びにその製法及び応用
US10294260B2 (en) Tetracyclic anthraquinone derivatives
CZ291098B6 (cs) Cytostatika modifikovaná uhlohydráty, léčiva tyto látky obsahující a jejich pouľití
CN117731798A (zh) 抗体偶联药物、其中间体、制备方法及应用
CN106750250B (zh) 以氨基酸作为连接臂的聚乙二醇齐墩果酸衍生物及其制备方法和应用
CA2267328A1 (en) Glycoconjugates from modified camptothecin derivates (20-o-linkage)
KR20180045001A (ko) 개질된 세포독소 및 이의 치료 용도
KR101942159B1 (ko) 항암제와 디오스제닌의 컨쥬게이트, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암용 조성물
KR102162351B1 (ko) 약물-결합 화합물 및 이의 용도
WO1998015571A1 (de) Modifizierte cytostatika
Jeong et al. Preparation of a Camptothecin‐conjugated Molecular Carrier and its Cytotoxic Effect Toward Human Colorectal Carcinoma In Vitro
AU2006305169A1 (en) Preventive or therapeutic agents for pancreatic cancer, ovarian cancer, or liver cancer comprising a novel water-soluble prodrug
EP3378495B1 (en) Composition comprising novel glutamic acid derivative and block copolymer, and use thereof
CN102336904A (zh) 一种喜树碱及其衍生物的多价peg修饰物及其用途
JP7051906B2 (ja) ペクチン－ドキソルビシン共役化合物及びその調製方法と用途
CN113633780B (zh) 一种小分子偶联物及其用途
WO2001058932A1 (de) Glycokonjugate von cytostatika
CN114149392B (zh) 莪术烯含氮衍生物及其制备和应用
DE10307787A1 (de) Protein-bindende Camptothecin-Derivate
CN117427176A (zh) 一种药物偶联物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant