KR100711315B1

KR100711315B1 - 리포좀 캄프토테신 제제

Info

Publication number: KR100711315B1
Application number: KR1020007002701A
Authority: KR
Inventors: 모이니한카렌루이스; 에머슨데이비드로이드; 수-밍 치앙; 닝 후
Original assignee: 오에스아이 파마슈티컬스, 인코포레이티드
Priority date: 1997-09-16
Filing date: 1998-09-15
Publication date: 2007-04-27
Also published as: KR20010030599A; WO1999013816A3; EP1037610A4; AU9387798A; NZ503293A; BR9812316A; EP1037610A1; JP2003510239A; AU751439B2; CA2303366A1; WO1999013816A2

Abstract

리포좀 캡슐화 캄프토테신 제제가 제공된다. 리포좀 제제는 항 종양제로서, 개선된 약물동력학성, 강화된 효능을 지니며, 유리약물 및 토포테칸에 비하여 증가된 치료지수를 제공한다. 제제는 하나 이상의 인지질 및 캄프토테신 또는 그 유사체를 포함하는 리포좀을 내포한다.

리포좀 캄프토테신 제제

Description

리포좀 캄프토테신 제제 {LIPOSOMAL CAMPTOTHECIN FORMULATIONS}

본 발명은 생화학 및 의학 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 신규의 리포좀 제제 및 그 제제의 제조방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 캄프토테신(camptothecin) 및 그 유사체를 함유하는 리포좀 제제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이와같은 제제의 제조 및 이용방법에 관한 것이다.

캄프토테신은 최초에, 중국에서 자생하는 캄프토테카 아쿰미나타 (Camptotheca accuminata) 나무의 껍질로 부터 유리된 5각 고리형 식물 알카로이드이다(월(Wall)등, J. Am. Chem. Soc., 94: 388(1966)). 그 약물은 퀴놀린, 피롤리딘, 알파-피리돈을 첨합하고 있는 하나의 접합고리와 6개의 멤버로 구성된 하나의 락톤 고리를 함유하고 있다. 자연발생 형태의 캄프토테신은 광학활성을 지니는데, "S"배열에 있는 락톤고리의 위치 20에 비대칭 탄소원자가 있다. 캄프토테신 및 수많은 그들 유사체(이하 캄프토테신이라한다)는, 시험관 및 생체내 양방에서 이들 화합물에 의하여 제시되는 강력한 항-종양활성때문에, 현재 집중-적인 연구대상의 초점이 되고 있다. (예를들면, 기오바넬라(Giovanella)등, Science 246: 1046-1048 (1989)). 캄프토테신의 세포독성 효과도 항 바이러스, 항 플라스모듐 및 항-헤모편모균(haemoflagellate) 제제로서의 그 용도가 개발되었다(프리엘(Priel)등, 미국특허 제5,622,959호; 프리엘등, 미국특허 제5,422,344호; 애틀라스(Atlas) , WO 9611005호; 월(Wall)등, 미국특허 제5,614,529호; 샤피로(Shapiro)등, 미국특허 제5,496,830호; 파아디(Pardee), WO 9404160호).

캄프토테신 약물은, 위상이성질화 효소(topoisomerase)Ⅰ에 결합하여 가역적으로 그 작용을 억제함으로써, 항-종양효과를 나타내는 것으로 믿어진다. 이 효소는 증식세포에서의 DNA 및 RNA 합성에 필요한데, 여기서 이 효소는 이들 공정중에 형성하는 초코일(supercoiled) DNA 구조의 이완을 촉진시킨다. 위상이성화 효소Ⅰ의 억제작용 결과, 핵산의 생합성이 강력하게 억제되어 DNA 파열 및 세포사망을 초래하게 된다.

캄프토테신의 인상적인 항종양성에도 불구하고, 캄프토테신의 사용에는 많은 문제점을 내포하게 된다. 첫째, 일부 캄프토테신은 수용액에 대하여 극히 불용성이어서, 약물의 비경구적 투약을 불확실하게 한다. 둘째, 락톤고리는 혈장의 pH에서 가수분해되기가 용이하여, 위상이성화 활성을 현저하게 저하시키게 되는 카르복시화물 형태의 약물을 초래하게 된다(파스베르그(Fassberg) 및 스텔라(Stella)(1992) J. Pharm. Sci, 81(7): 676-689; 미(Mi)등, (1995) Biochemistry 34(42): 13722- 13728페이지; 포토메실(Potmesil)(1994) Cancer Res. 54: 1431-1439 페이지; 슬리켄마이어(Slichenmyer)등,(1993) J. Nate. Cancer Inst. 85: 271-291 페이지; 작셀(Jaxel)등(1989) Cancer Res. 49: 5077-5082 페이지). 또한, 카르복시화물 형태는 독성이 강하여, 때때로 위장 독성, 골수억제 및 출혈 방광염을 유도하게 된다. 생물학적으로 활성인 락톤형태도 독성이 있다.

이와같은 용도상의 제한때문에, 수용성이 증가되고, 독성이 감소되며 가수분해에 대한 저항성이 증가된 반합성 캄프토테신 유도체의 합성에 많은 노력을 하여왔다. 두가지 예로는, 전이난소암종의 구제치료에 승인된 토포테칸(topotecan, Hycamtin^TM)(킹스버리(Kingsbury)등, J. Med. Chem. 34: 98(1991); 보엠(Boehm)등, 유럽특허출원 제321,122호) 및 결장암의 구제치료에 승인된 이리노테칸(irinotecan , 미야사카(Miyasaka)등, 미국특허 제4,604,463호)이 있다. 캄프토테신의 기타 유도체 및 이들 유도체를 이용하는 항 종양치료 방법이 월(Wall)등(미국특허 제5,340,817호); 월등(미국특허 제5,364,858호); 월등(미국특허 제5,244,903호); 월(미국특허 제5,180,722호); 월등(미국특허 제5,227,380호); 월등(미국특허 제5,049,668호); 와니(Wani)등 (미국특허 제5,122,606호); 기오바넬라등(미국특허 제5,552,154호); 월등(미국특허 제5,401,707호); 월등(미국특허 제5,122,526호); 존슨(Johnson)등 (WO 9311770호); 존슨등(WO 9214471호)에 기재되어 있다.

최근, 루지오(Luzzio)등 (미국특허 제5,559,235호)은 수성매체에서 적당히 가용성이면서, 시험관에서 위상이성질화 효소Ⅰ 활성과 생체내에서 항종양활성을 유지하는 캄프토테신 유도체를 개시하였다. 이 화합물, 7-(4-메틸피페라지노메틸렌 )-10, 11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신 디히드로클로라이드(GI147211C 또는 루토테칸(lurtotecan)으로도 알려짐)는 캄프토테신보다 전반적으로 독성이 적으며, 종양세포 세포독성 시험에 있어서 토포테칸보다 5 ∼ 10배 강력하다(에머슨(Emerson) 등, (1995) Cancer Research 55: 603 ∼ 609페이지). GI14721C의 임상시험 제제로 부터 나온 몇가지 안정성 샘플이, 물약병내의 잔류량의 황산염때문에 황산염- GI147211C 침전물을 함유하는 것으로 보고되어 있다(통(Tong)등, (1996) PDA Journal of Pharmacetical Science and Technology 50(50): 326-329페이지). 실용적이며 효율적인 치료방법으로서, 이 화합물을 개선된 치료지수를 제공하는 방식으로 투여하는 것이 요망된다.

화합물을 리포좀 또는 미셀과 같은 지질 응집체, 즉 구조물에 포장함으로써, 불용성, 가수분해성 화합물이 임상적 조건에서 투여될 수도 있다. 리포좀은 광범위한 약물에 대하여 생리학적으로 양립가능하며 생분해성인 운반 시스템인 것으로 알려져 있다. 또한 수성매체에서의 용매화가 요구되지않기 때문에, 단독의 유리된 약물보다 불용성 화합물이 보다 농축되고 용이하게 투여되는 약물상태로 작용부위에 운발될 수 있다.

버케(Burke)(미국특허 제5,552,156호)는 리포좀-회합 캄프토테신을 개시하고 있는데, 여기서 캄프토테신의 락톤 고리가 지질 2중층의 아실 사슬로 삽입되는 것으로 측정된다. 락톤고리는 리포좀의 내부의 수성 환경으로 부터 효율적으로 제거되어, 가수분해로 부터 보호된다. 버케는 또한, 리포좀막에 대하여 친화성이 낮은 캄프토테신 유도체가 가수분해를 당함이 없이 수성의 내부에 잔류할 수 있도록, 내부 리포좀 구역의 pH가 어떻게 저하될 수 있는지를 설명하고 있다. 제제의 안정성을 나타내는 생체내 시험은 수행되지 않았다.

콘스탄티나이드스(Constantinides)등 (WO 95/08986호)은 지질 2중층에 첨합된 80% 이상의 약물을 지니는 리포좀내의 캄프토테신 및 그 구조적으로 관련된 유사체의 제제를 개시하고 있다. 계란(egg) 포스파티딜콜린, 계란 포스파티딜글리세롤, 캄프토테신 제제에 대하여 약물동력학적 조사가 수행되었다. 리포좀은 다층판이며 캄프토테신은 수동적으로 포착되었다. 유리된 약물과 비교하였을 때, 리포좀 제제의 투여 후 4시간에 걸쳐서 캄프토테신의 증가된 플라스마량이 관측되었다. AUC의 증가가 약 4배 높은 정도에 지나지 않았으나, 리포좀 대 유리 캄프토테신으로 부터, 보다 넓은 플라스마 농도-시간곡선하의 면적(AUC)이 얻어졌다.

소포 및 리포좀에 첨합된 캄프토테신이 슬레이터(Slater)등 (WO 9426253호) 및 카스토(Castor)등 (WO 9615774호)에도 기재되어 있다.

발명의 요약

본 발명은 캄프토테신 및 그 구조적으로 관련된 유사체의 리포좀 제제 및 그 제조방법을 제공한다. 리포좀 제제는 유리된 약물에 비교할 때, 개선된 약물동력학성, 항종양제로서 강화된 효능을 지니고 있으며, 개선된 치료지수를 제공한다. 상기 제제는 하나 이상의 인지질 및 캄프토테신 또는 그들 유사체(앞으로 종합적으로 "캄프토테신"이라 칭한다)를 포함하는 리포좀을 내포한다. 하나의 구체예에서, 제제는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 부형제(여기서 부형제는 황산염 또는 시트르산염이다) 및 캄프토테신(여기서 캄프토테신의 일부는 부형제의 존재하에 리포좀의 수성내부에 침전될 수 있다)을 포함하는 리포좀을 내포한다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 캄프토테신은 GI147211이다. 또한 본 명세서에 기재된 제제는 저장시 안정하다.

도면의 간단한 설명

제 1도는 다양한 반대이온 부형제를 지닌 GI147211의 침전을 나타낸다.

제 2도는 비교효능을 위하여 제조된 2개의 대표적 리포좀 GI147211 롯트에서의 안정성을 나타낸다.

제 3A-3D도는 리포좀 GI147211 세포독성 대 GI147211 및 토포테칸(TP)을 나타낸다. ³H-티미딘 첨합(CPM)대 농도[ng/㎖] 값으로 기재된 GI147211 C, 리포좀 GI147211 및 TP에 의한 A)ES-2(난소암종), B)KB(구인두암종), C)SKON-3(난소암종), 및 D)KBV(구인두암종, 빈크리스틴 저항 표현형) 종양 세포증식. 각 데이타 셋트에 대하여 계산된 IC⁵⁰ 값(ng/㎖)이 각 판넬 그라프의 하단에 제시된다. ■= GI147211C , ◆ = 리포좀 GI147211, 및 ▼= TP.

제 4A-4D도는 리포좀 GI147211 세포독성 대 GI147211 및 공(empty) 리포좀을 나타낸다. ³H-티미딘 첨합(CPM)대 농도[ng/㎖] 값으로 기재된 GI147211 C, 리포좀 GI147211 및 공 리포좀에 의한 A) A549(폐암종), B) Du-145(전립선암종), C) KB(구인두암종), 및 D) LOX(흑색종) 종양세포 증식. 각 데이타 셋트에 대하여 계산된 IC⁵⁰ 값(ng/㎖)이 각 판넬 그라프의 하단에 제시된다. 모든 종양세포 형태는 인체를 기원으로 한다. ■= GI147211C, ▲= 리포좀 GI147211 (롯트#ALM 993-028), 및 ▼= 공리포좀.

제 5도는 스프라규-다울리(Spraque-Dawley) 쥐(rat)에서 수행된, 리포좀 GI147211 샘플을 함유하는 HSPC 및 DSPC의 약물 동력학적 비교를 나타낸다. 제제의 특징은 표 7을 참조할 것.

제 6도는 스프라규-다울리 쥐에서 수행된, 유리(free)된 약물 및 리포좀 GI147211(ALM 993-030)의 약물동력학적 비교이다. 제제의 특징은 표 7을 참조할 것.

제 7도는 iv, ip 또는 피하루트를 통한 생쥐에의 투여에 의하여 제시된 유리 약물 및 리포좀 GI147211 (1㎎/㎏)의 약물 동력학적 비교를 나타낸다(n=3, 공동 데이타(pooled data)).

제 8도는 최종 완충액에 염화암모늄의 첨가가 있거나 또는 없이 리포좀 GI147211 (시트르산)에 대한 지질 가수분해속도를 나타낸다.

리포좀에 캡슐화된 캄프토테신을 포함하는 제제 및 그 제조방법이 제공된다. 본 제제는 항종양 또는 항 바이러스제를 포함하는 의약용도를 갖고 있다. 또한, 리포좀 제제는 유리된 약물에 비하여 개선된 약물동력학성, 항종양제로서 강화된 효능을 지니며 개선된 치료지수를 제공한다. 제제는 하나 이상의 인지질 및 캄프토테신을 포함하는 리포좀을 내포한다. 또한 본 발명은 리포좀 제제내에 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 유사체와 같은 스테롤을 임의로 내포하도록 구성된다. 하나의 구체예에서, 제제는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 부형제(여기서 부형제는 황산염 또는 시트르산염이다) 및 캄프토테신을 포함하는 리포좀을 내포한다. 하나의 구체예에서, 캄프토테신의 일부는 부형제에 의하여 리포좀의 수성내부에 침전될 수도 있다. 또한 본 명세서에 기재된 제제는 저장시 안정하다. 하나의 구체예에서, 리포좀은 크기가 200nm이하, 가장 바람직하게는 100nm이하인 단층막 소포인데, 여기서 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)이며, 2:1 몰비로 콜레스테롤을 내포하고, 캄프토테신은 GI147211이다. 바람직한 구체예에서, 리포좀은 크기가 200nm이하, 가장 바람직하게는 100nm이하인데, 여기서 인지질은 수소화 콩(soy) 포스파티딜콜린(HSPC)으로서, 2:1 몰비로 콜레스테롤을 내포하며, 캄프토테신은 GI147211이다. 바람직한 구체예에서, 지질:캄프토테신의 몰비는 5:1∼ 100:1, 좀더 바람직하게는 10:1∼40:1 및 가장 바람직하게는 15:1∼25:1이다(지질은 인지질 및 콜레스테롤 양방을 포함한다). 또한 본 발명의 리포좀 제제는 유리된 약물 및 캄프토테신의 기타 리포좀 제제에 비하여 개선된 안정성을 지닌다.

본 명세서에서 사용된 바와같이, "리포좀"이라는 용어는 미국특허 제4,753, 788호에 기재된 바와같은 단층막 소포 또는 다층막 소포를 가르키는데, 상기 문헌의 내용을 여기서 참고로 인용한다.

"단층막 소포"라고도 불리우는 "단층막 리포좀"은, 단일의 폐쇄된 수성 구획을 한정하는 하나의 지질 2중층막을 포함하는 구형소포이다. 2중층막은 내부층 및 외부층(소엽)인 지질의 2개층으로 구성된다. 지질분자의 외부층은 외부 수성계를 향하고 있는 친수성 머리부와, 리포좀의 내부를 항하여 하방을 가리키고 있는 소수 성 꼬리부로 배열되어 있다. 지질의 내부층은 외부층 바로 밑에 놓여 있고, 지질은 리포좀의 수성 내부와 대면하는 머리부와 지질의 외부층의 꼬리를 향하는 꼬리부로 배열된다.

"다중막 소포"라고도 하는 "다중막 리포좀"은 하나 이상의 지질 2중층막으로 구성되는데, 이 막은 하나 이상의 폐쇄된 수성 구획을 한정한다. 막은 동심원형태로 배열되어, 상이한 막들은, 마치 양파와 같이, 수성 구획으로 분리된다.

본 명세서에서 사용된 "캡슐화" 및 "포착된(entrapped)"이라는 용어는 캄프토테신이 리포좀에 첨합되거나 또는 리포좀과 회합되는 것을 의미한다. 캄프토테신은 지질 2중층과 회합되거나, 리포좀의 수성 내부에 존재하거나 또는 양방 모두가 가능할 수도 있다. 하나의 구체예에서, 캡슐화된 캄프토테신의 일부는 리포좀의 내부에 침전된 염의 형태를 취한다. 약물은 리포좀의 내부에 스스로 침전할 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 "부형제", "반대이온(counterion)" 및 "반대이온 부형제"는 약물적재를 개시 또는 용이하게 할 수 있으며, 리포좀의 수성 내부에 캄프토테신의 침전을 개시 또는 촉진도 할 수도 있는 물질을 가르킨다. 이것만에 국한되는 것은 아니나, 부형제의 예에는 염화물, 아세트산염, 락토비온산염, 포름산염과 같은 1가 음이온; 아스파르트산염, 숙신산염 및 황산염과 같은 2가 음이온; 및 시트르산염 및 인산염과 같은 3가 음이온의 산, 나트륨 또는 암모늄 형태가 포함된다. 바람직한 부형제는 시트르산염 및 황산염이다.

"캄프토테신"이라는 용어는 캄프토테신 및 항종양활성을 나타내는 임의의 및 모든 관련 유사체 또는 그 유도체를 의미한다. 캄프토테신 약물은 일반적으로 동일한 코아 고리(core ring) 시스템을 갖는다. 많은 캄프토테신에서 다양한 변형 또는 치환체가 발견되는데, 바람직하게는 이와같은 변형체 또는 치환체는 고리 A 및 B에서 발견된다. 캄프토테신 약물은 아래에 표시된 바와같이 락톤 및 카르복시화물 형태로 존재할 수 있는 유사한 구조를 일반적으로 갖고 있다. 본 명세서에서 사용된 바와같이, 캄프토테신은 락톤 및 카르복시화물 형태 양방을 가르킨다.

삭제

캄프토테신 약물의 몇가지 예가 표 1에 제시된다.

기타 캄프토테신 약물은 아래와 같은 구조를 갖는다:

n은 1∼4일 수 있는데, 여기서 R₁이 Cl이면, 약물은 9-클로로-10,11-메틸렌디옥시캄프토테신; R₁이 NH₂이면, 약물은 9-아미노-10,11-메틸렌디옥시캄프토테신; 및 R₁이 H이면, 약물은 10,11-메틸렌디옥시캄프토테신이다.

캄프토테신 GI147211C, (7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11 에틸렌디옥시- 20(S)-캄프토테신 디히드로클로라이드)는 다음과 같은 구조를 갖는다:

GI147211C에서의 "C"는 디히드로클로라이드 염을 가르키며, GI147211X의 "X"는 유리 염기를 가르킨다.

캄프토테신은 "A" 및/또는 "B" 고리 치환체를 가질 수 있다. 바람직한 캄프토테신에는 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신(GI1 47211), 토포테칸 및 이리노테칸(표 1 참조)이 포함되는데, 가장 바람직한 캄프토테신 약물은 GI147211이다. 이것만에 국한되는 것은 아니나, 기타 캄프토테신에는 9-히드록시 캄프토테신, 10-아미노 캄프토테신, 9-히드록시-10-디메틸아미노메틸 캄프토테신, 20-(RS)-10,11-메틸렌디옥시 캄프토테신, 9-클로로-10,11-메틸렌디옥시-(20S)-캄프토테신, 7-에틸-10-히드록시 캄프토테신, 및 7-에틸-10-[[[4-(1-피페리디노)-1-피페리디노]카르보닐]-옥시]캄프토테신이 포함된다.

"인지질"은 임의의 인지질 또는 리포좀을 형성할 수 있는 인지질의 조합체를 가르킨다. 계란, 대두, 또는 기타 식물원으로 부터 얻어진 것을 또는 부분적 또는 전체적으로 합성된 것을 포함하는 포스파티딜콜린(PC), 또는 지질 사슬의 길이가 다양한 것 및 불포화물이 본 발명의 용도에 적합하다. 이것만에 국한되는 것은 아니나, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 수소화 콩 포스파티딜콜린(HSPC), 콩 포스파티딜콜린(콩 PC), 계란 포스파티딜콜린(계란 PC), 수소화 계란 포스파티딜콜린 (HEPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 및 디마이리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC)을 포함하는 합성, 반합성 및 천연 생성물 포스파티딜콜린이 본 발명의 용도에 적절한 포스파티딜콜린이다. 이들 모든 인지질은 시중에서 구입가능하다. 바람직한 PC는 HSPC 및 DSPC인데 가장 바람직한 것은 HSPC이다.

또한, 포스파티딜글리세롤(PG) 및 포스파트산(PA)도 본 발명의 용도에 적절한 인지질인데, 여기에는 이것만에 국한되는 것은 아니나, 디마이리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디라우릴 포스파티딜글리세롤(DLPG), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일 포스파티딜글리세롤(DSPG), 디마이리스토일 포스파티드산(DMPA), 디스테아로일 포스파티드산(DSPA), 디라우릴 포스파티드산(DLPA), 및 디팔미토일 포스파티드산(DPPA)이 포함된다. 제제에 사용할 때, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤(DSPG)이 바람직한 음전하 지질이 된다. 기타 적절한 인지질에는 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨 및 라우르, 마이리스트 스테아로일 및 팔미트산 사슬을 함유하는 포스파티드산이 포함된다. 또한 인지질을 함유하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 첨합도 본 발명에서 기도될 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 "비경구적"이라는 용어는 정맥내(IV), 근육내(IM), 피하(SubQ) 또는 복강내(IP) 투여를 의미한다.

"개선된 치료지수"라는 용어는 유리된 약물에 대하여 상대적으로 보다 높은 치료지수를 의미한다. 치료지수는 유효 투여량에 대한 50% 동물의 치사량의 비율로서 표시된다.

본 발명에 의하여, 리포좀 제제에 콜레스테롤은 임의로 내포시키는 방법이 기도된다. 콜레스테롤은 리포좀의 안정성을 개선하고 생체내에서 인지질의 지질 단백질로의 손실을 방지하는 것으로 알려져 있다.

효능이 있는 임의의 지질: 캄프토테신의 비율이 본 발명에 의하여 기도된다. 바람직한 지질: 캄프토테신의 몰비는 5:1∼100:1, 보다 바람직하게는 10:1∼40:1이다. 가장 바람직한 지질: 캄프토테신의 몰비는 15:1∼25:1이다. 바람직한 리포좀 제제는 인지질: 콜레스테롤의 몰비가 1.5:0.5∼2:1.5의 범위에 있다. 가장 바람직한 리포좀 제제는 1∼4 몰% PG가 있거나 없든 간에, 2:1 PC:콜레스테롤이다. 가장 바람직한 리포좀 크기는 100nm이하이다. 바람직한 약물의 적재효율은 약 70%이상의 캡슐화 캄프토테신 백분율이다. 캡슐화는 리포좀의 내부 수성 공간에 존재하는 분자, 막 2중층의 내외부 소엽에 존재하는 분자, 2중층의 외부소엽에 부분적으로 매몰 및 리포좀에 대하여 부분적으로 밖에 있는 분자 및 정전기 상호작용과 같은 힘에 의하여 리포좀의 표면에 회합된 분자를 포함한다.

일반적으로, 본 발명에서 구체화된 제제의 제조공정은 리포좀이 형성하는 용액의 제조로 부터 시작된다. 이와같은 작업은, 예를들면, 포스파티딜콜린, 임의로 콜레스테롤 및 임의로 포스파티딜글리세롤의 무게를 계량하고, 이들을 유기용매, 바람직하게는 클로로포름 및 메탄올의 1:1 혼합물(v/v) 또는 선택적으로는 순수한 클로로포름에 용해시킴으로써 완수된다. 이 용액은 예를들면 회전 증발기, 분무 건조기 또는 기타 수단에 의하여 증발되어 필름 또는 분말과 같은 고형 지질상을 형성하게 된다. 다음에 필름 또는 분말은 pH의 범위가 2.0∼7.4인 부형제를 함유하는 수용액으로 수화되어 리포좀 분산액을 형성한다. 수화의 목적에 바람직한 수용액은 시트르산염 또는 황산염의 산, 나트륨 또는 암모늄형태의 완충액이다. 바람직한 완충액은 >5mM, 보다 바람직하게는 50mM 시트르산(pH 2.0∼5.0), 시트르산 암모늄(pH 2.0∼5.5), 또는 황산암모늄(pH 2.0∼5.5)이다. 당 분야의 숙련자는 인산과 같은 기타 음이온산 완충액이 사용될 수 있다는 것을 알고 있다. 완충액에 분산된 지질 필름 또는 분말은, 사용되는 인지질에 따라 약 25℃∼70℃로 가열된다.

바람직하게는, 예를들면 미국특허 제4,935,171호에 기재된 바와 같은 박막 증발장치를 사용하거나 또는 진동 또는 소용돌이 혼합을 통하여, 분산액을 교반함으로써 다중막 리포좀이, 예를들면 음파처리 또는 균질기 또는 프랜치 프래스(French press)와 같은 미시유체화(microfluidization) 장치의 사용에 의하여, 지질 고형상의 수성 분산액에 전단력을 적용함으로써 단층막 소포가 형성된다. 전단력은 주입, 냉각 및 해빙, 지질로부터 세제 용액을 투석 제거하거나 또는 리포좀을 제조하는데 사용되는 기타 공지의 방법으로도 적용될 수 있다. 리포좀의 크기는, 전단력의 지속시간을 포함하여, 다양한 공지의 기술을 이용하여 조절될 수 있다. 바람직하게는, 균질장치를 사용하여 3,000∼14,000psi, 바람직하게는 10,000∼14,000psi의 압력 및 리피드의 대략적인 응집체 전이온도에서 200나노메타 이하의 직경을 갖는 단층막 소포를 형성한다.

포착되지 않은 부형제는, 투석, 크기배제칼럼 크로마토그라피(세파덱스 G-50 수지)나 또는 한외여과(100,000∼300,000 분자량 절삭)를 이용하여, 9% 수크로오스로의 완층액 교환에 의하여 리포좀 분산액으로부터 제거된다. 다음에 작은 단층막 리포좀의 각 제조물은 수산화 나트륨으로 외부 pH가 5.0∼6.5의 범위로 적정될 때 생성되는, 막전위와 같은 구배에 대하여, 약 10∼30분 동안에 GI147211 또는 기타 캄프토테신으로 능동적으로 적재된다. 약물적재기간중의 온도범위는 일반적으로 50∼70℃이며, 지질:약물 비율은 5:1∼100:1이다. 포착되지 않은 캄프토테신은, 투석, 크기배제칼럼 크로마토그라피(세파덱스 G-50 수지)나 또는 한외여과(100,000∼300,000 분자량 절삭)를 이용하여, 9% 수크로오스로의 완층액 교환에 의하여 리포좀 분산액으로부터 제거된다. 샘플은 일반적으로 아세트산 셀루로오스 또는 폴리에테르 술폰으로 구성된 0.22마이크론 필터를 통하여 55∼65℃에서 여과된다.

상술한 바와 같이, 캄프토테신은 일반적으로, 공지의 적재공정을 이용하여 예비 형성된 리포좀으로 적재된다(예를들면, 디이머(Deamer)등 BBA 274:323∼335페이지(1972), 포센(Forssen) 미국특허 제4,946,683호; 크라머(Cramer)등, BBRC 75:295∼301페이지(1977); 발리(Bally) 미국특허 제5,077,056호를 참조할 것). 적재는 pH구배 또는 암모늄 구배와 같은 구배 또는 농도 적재에 의하여 수행될 수 있다. pH구배가 이용될 경우, 약 pH 2∼3의 내부 pH로 시작하는 것이 바람직하다. 부형제는 적재공정에 있어서 반대이온인데, 리포좀의 내부에 있는 캄프토테신과 접촉하게 되면, 부형제는 캄프토테신의 상당 부분의 침전을 야기시킬 수 있다. 약물은 또한 리포좀의 내부에 스스로 침전할 수도 있다. 이와같은 침전은 캄프토테신의 락톤고리를 가수분해로 부터 보호할 수 있다. 시트르산염 또는 황산염과 같은 부형제는 캄프토테신을 침전시킬 수 있고, 구배(pH 또는 암모니아)와 함께 리포좀의 내부에서 사용되어 캄프토테신의 적재를 촉진시킬 수 있다.

pH구배에 의한 약물적재방법은 통상적으로 리포좀의 내부 수성공간의 낮은 pH를 포함하는데, 이 내부 산성은 약물적재공정기간중 불완전하게 중화된다. 이 잔류 내부 산성은 리포좀 제제물에서 화학적 불안정을 일으킬 수 있어서(예를들면 지질 가수 분해), 저장 기간을 제한시키게 된다. 이와같은 잔류 내부 산성을 제거하기 위하여, 암모늄염 또는 알킬아민과 같은 막투과성 아민이 캄프토테신의 적재후에, 잔류 내부 산성을 최소값으로 저하시키기에 충분한 양으로 첨가될 수 있다. 사용 가능한 암모늄염에는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 황산암모늄, 수산화암모늄, 아세트산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 시트르산암모늄, 숙신산암모늄, 락토비온산암모늄, 탄산암모늄, 타트르산암모늄 및 옥살산암모늄과 같은 1가 또는 다가의 반대이온을 지닌 것들이 포함된다. 막투과성인 임의의 알킬아민 화합물의 유사체 염도 사용될 수 있는데, 이들만에 국한되는 것은 아니나, 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 에티렌디아민, 및 프로필아민이 포함된다.

리포좀 제제의 치료적 용도는 유리된 형태에서 보통 독성을 지니는 약물의 운송방법을 내포하게 된다. 리포좀 제제형태에 있어서, 독성약물은 독성을 일으킬 수 있는 민감한 조직으로 부터 이탈하여, 약물이 치료적 효능을 나타낼 수 있는 선별된 영역을 표적으로 향하게 된다. 리포좀 제제는 또한 장기간에 걸쳐 약물을 서서히 방출케하는 치료적 용도로 사용되어, 강화된 약물동력학적 측면에서 약물 투여의 빈도를 감소시킬 수 있다. 또한 리포좀 제제는 정맥내 투여에 대하여 소수성 약물의 수성 분산액을 형성하는 방법을 제공할 수 있다.

리포좀 제제의 운반루트도 체내의 그들 분배에 영향을 미칠 수 있다. 동맥내 주사, 흡입제 분무, 구강활성 제제, 경피 이온영동법 또는 좌약과 같은 기타 효과적인 투여형태도 생각할 수 있지만, 리포좀 제제의 수동적 운반은 다양한 투여루트, 예를들면 비경구적인 방법과 관련된다. 각 루트는 리포좀 제제의 국부화에 있어서 차이를 발생시킨다.

본 발명은 또한, 치료적으로 유효한 양의 리포좀 캄프토테신을, 바람직하게는 포유동물의 종양에 운반함으로써, 약물 저항성 및 약물 민감성 양방의 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 캄프토테신에 대한 투여량 조정방법은 의료종사자에게 잘 알려져있기 때문에, 포유동물 및 구체적으로는 인체에 있어서 상술한 질병 또는 증상의 치료에 유효한 리포좀 캄프토테신 제제의 양은 당 분야의 숙련자에게는 자명하게 된다. 제제의 최적량 및 개별적인 투여의 간격은, 질병상태, 투여의 형태, 루트 및 부위, 및 특히 환자의 상태에 따라 자연히 결정되는데, 이와같은 최적량은 종래의 통상적인 기술로 결정된다. 치료의 최적 절차, 즉 한정된 날짜에 있어서 1일 투여 회수는 치료방법결정 시험의 종래의 절차를 이용하여 당 분야의 숙련자에 의하여 확인될 수 있다는 것도, 당 분야의 숙련자는 이해할 수 있을 것이다.

다중약물저항 암을 포함하여, 모든 암과 연관된 종양의 성장을 억제하는 방법이 본 발명에 의하여 기도된다. 상술한 리포좀 제제가 특히 유효하게 되는 암은 난소암, 소세포폐암(SCLC, Small Cell Lung Cancer), 비 소세포폐암(NSCLC), 결장직장암, 유방암 및 후두암이다. 또한 본원 명세서에 기재되고 특허청구의 범위로 하는 제제는 기존 항암치료제와 함께 사용할 수 있도록 되어있다. 예를들면, 본 발명의 제제는, 1)난소암 치료용의 탁솔(Taxol)(파클리탁셀, paclitaxel) 및 백금 복합체; 2)결장직장암 치료용의 5FU 및 류코보린 또는 레바미솔; 및 3)SCLC 치료용의 시스플라틴(cisplatin) 및 에토포시드(etoposide)와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 수 있는데, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지, 발명을 제한하려는 것이 아니다. 실시예 1은 3개의 상이한 리포좀 적재기술에 의하여 제조된 GI147211의 리포좀 제제의 약물동력학성을 기술하고 있다. 실시예 2는 구배 적재 및 리포좀 내부 산성을 제거하기 위하여 암모니아를 사용하여 제조된 GI147211의 리포좀 제제를 기술한다. 실시예 3은 GI147211 염의 침전을 기술한다. 실시예 4는 선별된 부형제를 사용하여 GI147211 염의 침전의 농도의존성을 기술한다. 실시예 5는 GI147211의 리포좀 제제의 시험관내 효능 검색 및 생체내 약물동력학성을 기술한다. 실시예 6은 유리된 약물에 비교하여 리포좀 캡슐화 GI147211의 생체내 항종양 효능을 기술한다. 실시예 7은 2개의 별개의 이종이식 모델에 있어서, GI147211, 토포테칸 및 GI147211의 리포좀 제제의 치료지수 측정을 기술한다. 실시예 8은, 동일한 독성 투여량에 있어서 유리된 GI147211에 비교하여 GI147211의 리포좀 제제의 반복 투여 효율성 연구 결과를 기술한다. 실시예 9는, KB 종양 이종이식 모델에 있어서 반복 투여 조사로, GI147211의 2개의 상이한 리포좀 제제물과 유리된 GI147211를 비교한다.

실시예 1

GI147211의 막, 수동적 및 능동적 적재 리포좀 제제의 약물동력학성.

3개의 상이한 적재기술, 즉 리포좀 2중층에 약물의 포착, 수동적 포착 및 pH구배에 의하여 생성된 막전위에 대한 능동적 적재 방법에 의하여 리포좀 GI147211 샘플이 제조되었다. 다음에 스프라규 다우리 쥐에 5㎎/㎏으로 투여된 막 포착 GI147211 리포좀과 유리된 약물의 약물동력학성이 비교되었다. 유리된 GI147211를 수동적 및 능동적으로 적재된 리포좀과 비교하기 위하여, 쥐에 1㎎/㎏으로 투여하였다.

우선, 인지질(DSPC), 콜레스테롤 및 GI147211를 약 10:1(w/w)의 지질:약물 비율로 유기용매에 공용해하여 막 적재 GI147211 리포좀이 제조되었다. 질소가스를 이용하여 용액을 건조하여 박막으로 만들어 온도를 상승시킨 후, 사용할 때 까지 감압하에서 진공 데시케이터에 저장하였다. 지질 농도가 약 50㎎/㎖ 및 GI147211 농도가 약 5㎎/㎖로 되기에 충분한 용적의 수용액, 통상적으로 9% 수크로오스 및 10mM, pH 5.4의 숙신산 나트륨으로 지질 필름이 재수화되었다. 다음에 샘플은, 용액이 외관상 반투명할 때까지 응집체 지질상 전이온도 이상에서 10∼15분간 음파처리된 후, 0.22 마이크론 필터를 통하여 여과되었다.

음성전하 지질(DSPG) 및/또는 중성전하 지질(DSPC) 및 콜레스테롤을 포함하는, 수동적 적재 GI147211 리포좀이 다음과 같이 제조되었다: 약물을 65℃에서 9% 수크로오스 및 pH 2.2의 50mM 시트르산 용액에 용해시켜, 약물의 농도가 약 90㎎/㎖로, GI147211의 수용액이 제조되었다. 지질 성분을 유기용매 시스템에 공용해시켜 지질 필름 또는 분무건조 분말을 제조한 후, 질소가스 및 온도상승으로 용액을 건조시켜서 필름 또는 분말로 만들었다. 다음에 상술한 약물 용액을 첨가하고, 혼합 및 약 65℃에서 가열하여, 지질 필름 또는 분말은 150㎎/㎖ 지질에서 약물에 대한 지질의 비율이 5:1로 가수분해되었다. 다음에 샘플은, 용액이 외관상 반투명할 때까지 응집체 지질상 전이온도 이상에서 약 10∼15분간 음파처리되었다. 미포착 GI147211는, 9% 수크로오스로 용출된 세파덱스 G-50 칼럼을 이용하여 리포좀 캡슐화 약물로 부터 분리되었다. 생성된 리포좀 GI147211 제제는 요망되는 최종 약물 농도로 농축되고, pH는 약 5.6∼5.7로 조정되었다.

능동적 적재 및 능동적 적재 / 암모니아로 제거(quenching)된 샘플은 실시예 2에서와 같이 제조되었다.

입자 크기 직경은, 중간(median) 직경이 100nm이하인, 즉 피크에서 7.7%의 분포를 지니는 쌍선(bimodal) 크기 분포의 막적재 샘플을 제외하고는, 상술한 모든 단층막 소포에 대하여 마이크로 트락 울트라파인 파티클 아날라이저(Micro Trac Ultrafine Particle Analyzer)를 이용하여 100nm 이하인 것으로 측정되었다.

표 2A에 기재된 바와 같이 리포좀 샘플에 있어서, 유리된 약물의 약물동력학성을 쥐에 5㎎/㎏으로 투여된 막 포착 약물과 비교할 때, 곡선하의 영역(AUC)에서 관측된 최소(3배)의 개선, 15분에서 측정한 최대농도(Cmax)(2.5배), 클리어런스율 (CL)에 있어서 2배 감소 및 반감기(t_1/2)에 있어서 1시간 연장되는 현상이 있었다. 표 2B는 PG가 있거나 또는 없이 제조된, 수동적 적재 리포좀 GI147211 샘플을, 쥐에 1㎎/㎏으로 투여된 유리된 약물과 비교한 결과를 나타낸다. 여기서는 리포좀 약물을 유리된 약물과 비교할 때, AUC 및 Cmax에 있어서 110∼140배 증가, 클리어런스율에서 120∼140배 감소 및 동일한 반감기를 나타낸다. 표 2B는 또한 시트르산 또는 황산암모늄에 대하여 능동적으로 적재된 리포좀 GI147211 샘플 및 적재 후 염화암모늄으로 제거된 하나의 경우에 있어서는 수동적 적재와 비교할 때 AUC 및 클리어런스율에 있어서 추가의 개선 및 감소가 있다는 것을 나타낸다. 능동적으로 적재된 GI147211 리포좀을 유리된 약물과 비교할 때, AUC에서 800∼1,200배 증가, Cmax에서 200배 증가, 클리어런스율에서 600∼1,200배 감소, 및 반감기가 추가로 2∼7시간 연장되는 것이 관측되었다. 이 조사결과는, 생체내에서 리포좀과 함께 약물의 최선이 지속시간을 달성하는데 바람직한 적재 방법은, 리포좀의 내부 수성 코어에 일부 약물을 침전시킬 수 있는 반대이온의 존재하에서의 능동적 적재라는 것을 나타내는 것이다.

실시예 2

GI147211의 리포좀 제제.

여기서 사용된 인지질 및 콜레스테롤은 아반티 폴라 리피드(Avanti Polar Lipids), 리포이드(Lipoid) 또는 시게나(Sygena)사로 부터 건조 분말로서 얻어지 며, 별도의 추가 정제작업없이 사용되었다.

하기 각 리포좀 제제물에 대하여, 상이한 반대이온 부형제의 용액이 제조되어 리포좀의 내부 수성 코어에 포착된 후, 리포좀의 외부에 수용성 캄프토테신 유도체가 첨가되고, 약물 적재를 강화하기 위하여 리포좀의 내외부 사이의 pH 또는 이온농도차에 의하여 생성된 막전위에 대하여 적재되었다.

첫째, 유기용매시스템에 지질 성분들을 공용해한 후, 질소가스 및 상승된 온도를 이용하여 용액을 건조시켜서 필름 또는 분말을 형성함으로써, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 포스파티딜글리세롤을 포함하는 다양한 인지질을 함유하는 지질 필름 또는 분무 건조 분말이 제조되었다. 표 3에 기재된 바와같은 몰비의 범위에서, 상이한 인지질 공급원(합성, 반합성, 계란, 콩), 사슬 길이(14∼18 탄소) 및 불포화도(1∼4 2중결합)가 조사되었다. 100∼150㎎/㎖의 지질농도에서 2.0∼7.4의 pH 범위에서 침전용 반대이온 용액(시트르산염, 황산염, 숙신산염, 인산염, 포름산염, 아스파르트산염 또는 락토비온산염의 산, 나트륨 또는 암모늄형태)을 함유하는 수용액으로, 각각의 지질 분말 및 필름이 수화되었다. 다음에 10,000∼14,000psi에서 균질기나 음파처리로 적용된 전단력을 이용하여 각각의 지질상 전이온도(약 40∼70℃)이상에서, 이들 혼합물로 부터 작은 단층막 리포좀 (<100nm, 마이크로 트랙 울트라파인 파티클 아날라이저를 이용한 중간 직경)이 형성되었다. 리포좀의 수성 코어에 포착되지 않은 부형제는, 일반적으로 투석, 크기배제칼럼 크로마토그라피 (세파덱스 G-50 수지) 또는 한외여과법(100KD∼300KD 분자량 절삭)을 이용하여 9% 수크로오스로 완충액을 교환함으로써 리포좀 분산액으로 부터 제거된다. 다음에 작은 단층막 리포좀의 각 제조물은, 외부 pH가 수산화나트륨이나 기타 적절한 염기로 5.0∼6.5의 범위로 적정될 때 생성되는 막전위에 대하여 약 10∼30분 동안에 능동적으로 적재된다. 약물적재 단계중의 온도범위는 지질:약물비율이 5:1∼100:1에서 일반적으로 50∼70℃가 된다. 포착되지 않은 약물은, 투석, 크기배제칼럼 크로마토그라피(세파덱스 G-50 수지) 또는 100KD∼300KD 분자량 절삭막을 이용하는 한외여과를 이용하여, 9% 수크로오스로 완충액을 교환함으로써 리포좀 분산액으로 부터 제거된다. 샘플은 아세트산 셀루로오스나 폴리에테르 술폰으로 구성되어있는 0.22 마이크론 필터를 통하여 55∼65℃에서 여과되었다. 성상확인의 결과는 하기 표 3, 4, 5 및 7에 제시된다.

본 실시예가 GI147211의 리포좀 제조물을 기술하고 있으나, 당 분야의 숙련자는 기타 캄프토테신의 리포좀 제조물도 기재된 바와같은 방법으로 제조될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

암모니아에 의한 제거

상술한 제제에 있어서, 캄프토테신 유도체 GI147211를 리포좀에 적재하기 위하여 구배법이 이용되었다. 구배방법의 구성은 리포좀의 내부 수성 공간의 낮은 pH 조건을 포함하는데, 이 내부 산성은 적재중에 불완전하게 중화될 수도 있다. 잔류하는 내부 산성은 리포좀 제조물내에서 화학적 불안정성(예를들면 지질 가수분해)을 야기시켜서 저장 기간을 제한시키게 된다. 잔류 내부산성은 다음과 같은 방법으로 소정의 리포좀 제제에서 제거된다.

HSPC:콜레스테롤의 비가 2:1로 구성되어있는 리포좀을 함유하며, 58.6㎎/㎖ 총 지질농도로 50mM의 시트르산 완충액을 캡슐화하고 있는 410㎖의 용액을 55℃로 가열하였다. 60㎖의 GI147211C 원료용액을, 55℃에서 20㎎/㎖의 농도로 리포좀 용액에 첨가하였다. 약 3㎖의 2.5M NaOH를 첨가하여 용액의 pH가 2.5에서 약4.4로 적정되었다. 다음에 pH는 1M NaOH로 주의깊게 5.8로 적정되었다. 첫번째 염기첨가로 부터 약 20분간 가열한 후, 용액을 35℃ 이하로 냉각시키고, 10mM NH₄Cl, 9% w/w 수크로오스를 함유하는 5ℓ의 pH 6.5 투석용액에 대하여 한외여과 되었다. 한외여과의 종점에서, 용액 pH가 6.5로 조정되고, 표적농도로 희석되고, 0.2㎛ 기공크기 필터를 통하여 여과되었다.

이와같이 처리된 리포좀 GI147211 샘플은 지질의 가수분해 속도가 현저히 저하되어, 비처리 샘플에 비하여 보다 화학적으로 안정된 상태를 부여한다. 액상으로서 샘플의 저장기간을 강화하기 위하여는 지질 가수분해 속도를 지속적으로 조절하여 적절하게 안정된 리포좀 샘플을 생성하는 것이 요구된다. 이것은 중성으로 부터 현저히 차이가 나는 pH 값에서 적재되는 임의의 리포좀에 대한 일반적인 사항인데, 본 경우에는 구체적으로 리포좀 GI147211 제제에 대하여 조사되었다.

제 8도는 수화에서 100mM 시트르산으로 제조되어, 지질 대 약물의 표적비율이 20:1에서 적재된 리포좀 GI147211 샘플에 대한, 촉진된 조건(25℃)의 지질 가수분해 결과를 나타낸다. 약물적재 후, 용액은 대조용액과, 염화암모늄이 첨가된 제2 샘플로 반분되었다. 염화암모늄이 첨가된 샘플에 대한 지질 가수분해 속도는 대조 시스템에 비하여 약 167배의 극적인 저하를 보였다.

암모늄에 의한 제거와 비제거 리포좀 GI147211 샘플을 비교한 약물동력학성 및 효능은 동일한 PK 및 효능특성을 나타내었다(표 2B 및 표 15 참조). 따라서, 염화암모늄은 리포좀 제제에 전혀 해로운 영향을 미치지 않고, 인지질에 대하여 개선된 화학적 안정성을 제공하는 것이다.

실시예 3

GI147211염의 침전.

수성 매체로 부터 GI147211의 침전을 유도할 수 있는 몇가지 부형제가 확인되었다. 부형제는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 염화물, 아세트산염, 락토비온산염 및 포름산염과 같은 1가 음이온; 숙신산염, 아스파르트산염 및 황산염과 같은 2가 음이온; 시트르산염 및 인산염과 같은 3가 음이온의 산, 나트륨 또는 암모늄형태가 포함된다. 각 부형제로 야기되는 침전의 상태적 정도를 평가하기 위하여, 5㎎/㎖의 GI147211가 용액이 낮은 pH(2±0.5)에서 제조되고, 상이한 반대이온이 첨가되었다. GI147211 용액 및 반대이온을 15∼20분간 방치한 후, 3600rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 유지하였다. 다음에 다음과 같은 조건으로 HPLC를 이용하여 상청액을 분석함으로써 각 샘플에 있어서 용액에 잔류하는 GI147211의 양이 평가되었다: 키스톤(Keystone)사로 부터의 C18 ODS 하이퍼실(Hypersil) 칼럼, 이동상의 30/70(v/v) 아세토니트릴/0.1% 아세트산 + 0.1% 수성 트리에틸아민 완충액, pH 3.30, 270nm에서 UV 검출, 용액에 잔류하는 가용성 분획의 농도가 5㎎/㎖의 원래의 GI147211 농도의 차이를 취하여, 침전된 GI147211의 양을 일람표로 만들었다. 5㎎/㎖의 원래 용액농도의 백분율로서 각각의 값이 표 6에 기재된다. 일부 예에서, 고농도 반대이온이 표 6에서 감지할 수 있는 것 이상의 침전을 유도한다. 시험된 반대이온 농도에서, 황산염, 시트르산염 및 숙신산염을 97% 이상의 약물을 침전시키고; 염화물 및 인산염은 82% 이상의 약물 침전을 유도하고; 포름산염 및 아스파르트산염은 55%이상의 약물 침전을 초래하며; 수크로오스 및 락토비온산염은 10% 이하의 GI147211로, 감지할 수 있을 정도의 침전을 일으키지 못한다. 침전물은, 이들 시험의 용액 pH가 약 2였을 때, 캄프토테신 유도체의 폐쇄된 락톤 고리로 구성된다. 토포테칸, 이리노테칸(CPT-11) 및 9-아미노캄프토테신과 같은 "A" 고리 치환 수용성 캄프토테신 유도체도, 상술한 반대이온의 존재하에 동일한 정도의 침전 현상을 나타낼 수 있다.

실시예 4

선별된 부형제를 사용하는 GI147211염 침전의 농도 의존도.

GI147211 침전의 농도의존성을 보다 완전히 조사하기 위하여, 실시예 3에 기재된 바와같이 5㎎/㎖의 약물용액이 제조되고, 반대이온 부형제, 황산염, 시트르산염, 인산염 및 염화물의 농도를 증가시키면서 적정되었다. GI147211 용액 및 반대이온을 15∼20분간 방치한 후, 3600rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 유리하고, 상청액은 실시예 3에 기재된 바와같이 분석되었다. 제 1도는 관련된 침전의 농도의존도를 상술한다. 황산염 및 시트르산염은 약물 침전에 있어서 가장 효능적이 며 바람직한 부형제인데, 염화물 또는 인산염보다 낮은 농도에서 용액에 잔류하는 약물의 분획을 감소시킨다. 약물의 적재율은 황산암모늄 및 시트르산에 대하여 반대이온에 따라 각각 13%(NaCl), 61%(인산염)에서 75% 및 89%로 변하였다.

별도의 조사에서, 50mM 황산암모늄의 존재하에 적재 후, 리포좀 내부의 예정농도(약 40㎎/㎖ 캄프토테신 GI147211)에서 캄프토테신 GI147211의 침전이 검사되었다. 그 결과, 단지 0.5%의 캄프토테신 GI147211만이 용액에 잔류하였는데, 필수적으로 99%의 약물이 침전되었다는 것을 나타낸다. 리포좀들의 내부에 유사한 약물의 침전현상이 예상된다. 약물의 자발적 침전도 리포좀의 내부에서 예상된다.

또한, 제 2도에 도시된 것은 시트르산염이나 황산염 반대이온을 함유하는 리포좀 캄프토테신 GI147211 샘플에 대한 안정도 점수이다. 2∼8℃에서 80∼90일간 저장 후, GI147211 손실은 황산염 또는 시트르산염 샘플에 대하여 4%인 것으로 관측되었는데, 이와같은 형태의 HPLC 분석에 대한 전형적인 정확한 값은 3%이다.

실시예 5

리포좀 GI147211 제제의 시험관내 효능검진 및 생체내 약물동력학성.

실시예 2에 기재된 바와같이 리포좀 제제가 제조되고, 샘플은 하기 표 7에 제시된 바와같이 특성화되었으며, 리포좀 GI147211의 시험관내 효능 검진 및 생체내 기능이 시험되었다.

시험관내 효능검진

GI147211 및 GI147211의 리포좀 제제를 사용하여 시험관내 효능 검진이 수행되었다. 이 시험관내 실험의 목적은 GI147211의 리포좀 캡슐화가 비 리포좀 화합물에 비하여 활성이 감소되는 결과를 초래하지 않는다는 것을 입증하기 위한 것이다. ³H-티미딘 첨합을 평가하는 표준 종양세포 기준 세포특성 분석이 수행되었다.

실험하기 약 4시간전에 종양세포가 96-웰 조직배양판(1×10⁴세포/웰)에 접종되었다. GI147211, 리포좀 GI147211 및 TP 처리물의 계열희석액(1:10 희석, 10⁵∼10^-3ng/㎖, n=8웰/희석)이 제조되어(사용직전에) 배양판을 함유하고 있는 세포에 첨가되었다. 양성 및 음성(트리스 처리된) 대조 그룹이 각 분석판상에 포함되었다. 다음에 종양세포는 0.2μCi의 [메틸-³H]티미딘으로 표지되고, 24시간 배양된 C6, U251, A673 및 B16-F1 세포를 제외하고는, 조직배양조건(37℃, 5% CO₂, 100% 상대습도)하에서 42시간 배양되었다. 다음에 세포는 용해되고, 유리 섬유 필터상에 수확되고 미첨합된 [메틸-³H]티미딘은 필터 세척으로 제거되었다. 필터는 섬광계수(scintillaing counting) 처리되고 cpm-³H/웰이 측정된다. 데이타(세포형 기준에 의한 하나의 세포형의)가 티미딘 첨합을 조절하기 위하여 정상화되고(normalize), 표준 4-매개변수 비선형 회귀식에 적용되어, 각각의 처리에 대한 IC₅₀ 값(50% 억제 농도)가 측정된다. 리포좀 GI147211, GI147211 및 토포테칸으로 처리된 세포들 사이의 IC₅₀ 측정치에 있어서의 차이에 대한 각 세포주를 시험하기 위하여, 다중 비교물(시험의 다중성에 대하여 조정하지 않음)로 분산의 서열분석(Rank Analysis of Variance)에 의하여 통계적 차이가 측정되었다. 각 처리 그룹(중간, 최소 및 최대)에 대하여, 지적된 중요성(P<0.05)과 함께 IC₅₀ 데이타가 제시된다. 데이타는 다수의 GI147211의 리포좀 제제와 관련되는 실험의 다수의 셋트로 부터 제시된다.

또한 GI147211 및 리포좀 GI147211 활성도, 시중에서 유통되는 위상이성질화효소I 억제제 토포테칸의 활성과 비교되었다. 이 실험에서 나온 데이타(표 8 및 제 3A∼3D도)는, 조사된 대부분의 종양세포주에 있어서, GI147211의 리포좀 제제 및 유리 GI147211가 토포테칸보다 현저하게 강력하다는 것을 암시한다(P<0.05, 모든 경우). 또한 몇개의 종양세포주에 대한 데이타는, GI147211의 리포좀 제제가 일부 경우에 있어서 GI147211 유리 약물보다 강력하다는 사실을 지지하고 있다(표 8에서 지적한 바와같이 P<0.05). 일람표 형태로 제시된 데이타는, 제제 제조과정중에 생성된 리포좀 GI147211의 다수의 로트를 포함하는 다수(n>100)의 세포독성실험으로 부터 나온 결과를 나타낸다. 따라서, IC₅₀ 값은 지적된 최대 및 최소치와 함께 중간값(ng/㎖)으로 제시된다. 또한 바람직한 제제를 이용하여 나온 결과와 함께 일람표 데이타의 일관성을 나타내는 대표적인 데이타가 제시된다(제 4A∼4D도). 제공된 데이타(제 4A∼4D도)는 약물이 없는 공 리포좀 소포는 납득할 만한 세포독성을 유발하지 않는데, 이것은 관측된 리포좀 GI147211의 활성이 약물 때문이지, 리포좀 성분때문이 아니라는 주장을 지지하는 것이다. 이들 데이타는 리포좀 GI147211가 유리된 GI147211에 비하여 증가된 활성을 지닌 활성적이고 유효한 화학요법제라는 사 실을 지지하고 있다.

생체내 약물동력학성 연구

정맥내 볼루스 투여에 의하여, 쥐 및 생쥐에서 다양한 GI147211의 리포좀 제제에 대한 약물동력학성 연구가 수행되었다. 아세토니트릴로 플라스마 샘플이 침전되고, 각 샘플의 상청액이, 등용매용리(isocratic elution)를 이용하고 형광을 감시하는 액상 HLPC에 의하여 분석되었다. 유사한 방법으로 표준샘플 및 품질조절 샘플이 분석되었다. 표준샘플의 선형 끼워맞춤법을 이용하는 내삽법을 기초로 하여 미지 샘플 및 품질조절샘플의 농도가 측정되었다. 각 조사에 있어서, 각 시간점에서의 평균 플라스마농도가 계산되어 약물동력학성 분석에 이용되었다. WinNonlim^TM(표준출판(Standand Edition), 버젼 1.5 GI147211, 사이언티픽 컨설팅사(Scientific Consulting, Inc.))을 이용하여 비구획분석이 수행되고 다음과 같은 매개변수가 계산되었다: 제조시간에서 외삽된 최대농도(Cmax), 제조에서 무한시간까지의 곡선하의 영역(총 AUC), 최종 상태 반감기(t1/2), 클리어런스율(Cl), 및 지속상태에서의 분포의 용적(Vss).

표 9는 몇개의 이들 연구로 부터 측정된 플라스마 약물동력학적 매개변수를 요약하고 있다. 모든 경우에 있어서 리포좀 제제는, 총 AUC에 의하여 측정된 바와같은 유사한 복용량으로 투여된 유리 약물에 비하여, 총 노출에 있어서 현저한 증가를 나타내었다. 이와같은 결과는 쥐 및 생쥐에서 수행된 조사에서 일치하였다. 능동적으로 적재된 리포좀 제제에 대한 총 AUC의 증가는 유리 약물과 비교하여 473∼1173배에 달하였다. 노출에 있어서의 대부분의 증가는, 플라스마 용적에 접근하는 리포좀 제제에 대한 지속상태에서 분포 용적의 감소에 기인하는 것이다. 이들 데이터는, 리포좀 제제가 주로 플라스마 용적내에 거주하고, 배합에 따라 3∼8시간의 최종 반감기로 투명해지는 모델을 지지하는 것이다.

2개의 리포좀 제제, NA-908-73(황산염 반대이온) 및 NA943-072B(시트로산염 반대이온)에 대하여, 플라스마 약물동력학성에 대한 투여량 의존도가 조사되었다. 양방의 조사에서 투여량 의존도는, 소정의 제제에 대하여 시험된 투여량 범위를 지나서 유사한 클리어런스율에 의하여 나타난 바와같이, 투여량의 함수로서 선형인 것으로 나타났다.

HSPC나 DSPC:콜레스테롤의 비가 2:1인 시트로산염 및 황산염 제제는 증가된 효능 데이타 및 약물동력학적 특성에서 바람직한 제제이다. 제 5도는 스파라규-다울리 쥐에 1㎎/㎏으로 투여한 후 시간의 함수로서의 플라스마 농도를 나타낸다. 약 3개월 떨어져 수행된 리포좀 GI147211 제제(NA943-072B)에 대한 조사결과는 리포좀 약물이 2∼8℃에서 3개월 이상 저장된 후에도 약물동력학성은 변화되지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, HSPC나 DSPC로 제조된 시트르산염 제제는 매우 유사한 플라스마 약물동력학성을 나타낸다. 제 6도는 스프라규-다울리 쥐에 1㎎/㎏으로 투여된 유리 약물과 비교한, 제제(2:1 HSPC:콜레스테롤, 50mM 시트르산으로 적재, NH₄Cl로 제거)의 플라스마 약물동력학성을 나타낸다. 유리 약물에 비하여 AUC는 약 978이다.

생쥐에서 GI147211 유리 약물 및 리포좀 제제 NA-908-73(제제 특징에 대한 표 7 참조)으로 투여 루트 및 대응 플라스마 약물동력학성이 조사되었다. 동물들은 정맥내(I.V), 복강내(I.P) 또는 피하투여에 의하여 1㎎/㎏이 투여되었고, 플라스마 샘플이 24시간에 걸쳐 수집되었다. 제 7도는 시간의 함수로서, 유리 약물 및 리포좀 GI147211의 플라스마 농도를 나타내며, 플라스마 약물동력학성은 표 6에 요약된다. 유리약물 및 리포좀 제제 사이의, AUC에 의하여 측정된 노출의 비교결과는 3가지 운송루트에 있어서 190∼500배의 증가를 보였다. 이 조사결과는 또한 플라스마 순환시간을 증가시키는 리포좀 GI147211 제제의 이점 및 플라스마에서 고농도를 유지하는데는 운송수단의 다른 루트도 이용될 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 6

유리 GI147211에 대한 리포좀 캡슐화 GI147211의 생체내 항종양 효능.

GI147211의 리포좀 제제의 항종양 효능이 몇개의 인체종양 이종이식 모델에서 과시되었다. 수행된 모든 조사에서, 나체 생쥐(nude mouse)의 전방 옆구리상에 이식된 피하종양이, 약물을 투여하기 전에, 200±500㎣의 설정된 크기로 성장되도록 하였다.

리포좀 배합 약물에 대한 유리 GI147211에 활성을 비교하기 위하여 생체내 효능 조사가 수행되었다. 동일하게 투여되었을 때, GI147211의 리포좀 제제가 종양성장을 저하시키는데 있어서 보다 유력하고 효과적인 것으로 나타났다(표 10). 이종이식 모델은 HT29 및 SW48 인체콜론 종양세포주, 및 KB 및 KBV 후두 종양을 포함하였다. 약물은 연속 3주동안 매주 스케줄에 따라 6 또는 9㎎/㎏으로 정맥내 투여되었다. SW48 이종이식 조사에서, 동물들은 총 2회전의 치료(6번 주사)를 받았는데 2회의 치료기간 사이에는 10일의 회복기간이 있었다. HT29 이종이식 조사에서, 12 및 14㎎/㎏ 투여 그룹이 첨가되었다. 이 실험에서, 높은 투여량의 그룹에 속하는 리포좀 GI147211 투여 동물은 단지 2번만 연속으로 약물이 투여된 반면에, 유리 GI147211 그룹은 모두 3주간 투여되었다. KB 및 KBV 양방의 조사에서, 리포좀 GI147211는 유리 약물 단독보다 효능이 있는 것으로 나타났다. 이것은 반응 및 지속기간의 크기 양방에 의하여 설명되었다. 이것은 다중 약물 저항(MDR⁺, Multiple Drug Resistant) 종양 세포주 KBV에서 특히 현저하였는데, 여기서 유리약물은 종양성장에 거의 영향이 없었으나, 리포좀 GI147211는 투여량에 의존하는 종양성장의 억제현상을 과시하였다. 2개의 결장종양 이종이식 조사에서, 초기에는 그 차이가 거의 나타나지 않았으며, 2회전의 치료후에 오직 SW48 조사에서 나타났다. HT29 조사에서, 종양반응의 차이는 보다 극적이어서, 낮은 쪽인 1㎎/㎏ 투여량의 리포좀 GI147211이, 높은 쪽인 14㎎/㎏ 투여량의 유리 GI147211 만큼 효능적이었다. SW48 및 HT29 결장종양 모델에서 동일한 투여량 및 일정에서 비교하였을 때, 리포좀 GI147211는 양방 모델에서, 유리약물에 의하여 생성된 86% 및 54%에 비하여, 95% 종양성장억제 효과를 보였다. 보다 현저한 차이는 KB 종양모델에서 나타났는데, 여기서 리포좀 GI147211는, 유리 약물의 1.64에 비하여, 7.13의 로그(log) 10 세포살해지수를 나타내었다. 또한 리포좀 GI147211가 MDR 종양모델 KBV에서 65% 종양성장억제효과를 나타낸 반면에, 유리약물은 사실상 불활성이었다. 동일한 독성수준으로 투여되었을 때도, 리포좀 GI147211는 유리약물 단독보다 여전히 효능적이었다.

실시예 7

2개의 별개 이종이식 모델에서, GI147211, 토포테칸 및 리포좀 제제의 치료지수 측정.

치료지수의 차이를 결정하기 위한 목적으로, GI147211의 리포좀 제제, GI147211 및 토포테칸의 단일 투여 독성 및 효능 시험이 수행되었다. 이들 조사에서 사용하기 위하여 구성된 종양 이중이식 모델에는 KB 후두 및 ES2 난소종양이 포함되었다. 모든 시험그룹은 10마리의 나체 생쥐로 구성되고 약물은 꼬리 정맥을 통한 단일의 정맥내 투여 볼루스 주사로 운반되었다. 토포테칸은 6∼40㎎/㎏, GI147211는 6∼30㎎/㎏, 및 리포좀 GI147211는 3∼40㎎/㎏으로 투여되었다. 치료지수는 투여후 27일째에, LD50을 ED60이나 ED80으로 나눔으로써 측정되었다. 양방의 조사에서 나온 결과는 리포좀 GI147211가 유리 GI147211보다도 치료지수에서 3∼14배 범위의 지속적인 증가를 나타내고 있었다(표 11).

실시예 8

동일한 독성투여에서 유리 GI147211에 비교한 리포좀 GI147211 반복 투여효능조사.

KB, KBV 및 ES2 종양 이종이식 모델도, 유리 GI147211에 비교한 리포좀 GI147211의 투여 효능을 몇번 반복 조사하였다. 약물은 1, 8 및 15일째에 투여되었다. 3개의 모든 모델 시스템에서, 동일한 독성수준으로 투여되었을 때, 리포좀 GI147211는 유리 GI147211에 비하여 강화된 종양성장 지연현상을 나타내었다(표 12~14).

실시예 9

KB 종양이중이식 모델에서의 반복 투여 조사에서, HSPC 대 DSPC 기준 리포좀 GI147211 제제 및 유리 GI147211의 비교.

KB 종양이중이식 모델에서 투여반응조사가 수행되었는데, 여기서 정맥내 투여후, 2개의 상이한 리포좀 GI147211의 제제가 유리 GI147211와 비교되었다. 투여 스케줄에 따른 1 및 8일째 및 2주간 휴식 후, 23 및 30일째에 동일한 과정의 치료가 반복되었다. 리포좀 GI147211 그룹의 모든 동물은 총 4회 약물 투여된 반면에 대조그룹 및 GI147211 그룹은 과잉의 종양성장때문에 단지 2회 약물 투여되었다. 결과가 표 15에 제시되는데, 여기서 2개의 리포좀 GI147211 제제 사이에는 명백한 차이가 없었으나, GI147211 그룹은 항종양제로서 현저히 효능이 적다는 것을 명백히 보여주고 있다. 시험된 2개의 리포좀 GI147211제제의 차이는 뱃치 ALM993-028에서 DSPC 대신에 HSPC가 사용되었다는 것이다(배합에 관한 상세는 표 7 참조).

본 명세서에 특허청구의 범위로 한 발명은 특정하게 예시한 구체예에 관한 것이다. 그러나, 지금까지의 기술은 본 발명을 예시화된 구체예에 국한시키려는 것 이 아니며, 당 분야의 숙련자는 상기 명세서에 기재된 본 발명의 범위 및 취지내에서 다양한 변현이 만들어질 수 있다는 것을 인식하여야 한다. 본 발명은, 첨부된 특허청구의 범위에서 규정된 바와같은 본 발명의 참된 취지 및 범위에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 균등물을 포함한다.

Claims

콜레스테롤;

디스테아로일 포스파티딜콜린 및 수소화 콩 포스파티딜콜린으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 일종 이상의 포스파티딜콜린;

7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신; 및

포스파티딜글리세롤을 포함하며,

포스파티딜콜린 대 콜레스테롤의 몰비가 1.5:0.5 내지 2:1.5인 리포좀.
제1항에 있어서, 포스파티딜콜린이 수소화 콩 포스파티딜콜린인 리포좀.
삭제
제1항에 있어서, 포스파티딜글리세롤이 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 디라우릴 포스파티딜글리세롤, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 및 디스테아로일 포스파티딜글리세롤로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 리포좀.
제4항에 있어서, 포스파티딜글리세롤이 디스테아로일 포스파티딜글리세롤인 리포좀.
제1항에 있어서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤의 몰비가 2:1인 리포좀.
제2항에 있어서, 수소화 콩 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤의 몰비가 2:1인 리포좀.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 리포좀이 단층막으로서, 직경이 100nm 미만인 리포좀.
제8항에 있어서, 수소화 콩 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤이 리포좀의 지질부를 구성하고, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 5:1 내지 100:1 인 리포좀.
제9항에 있어서, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 5:1 내지 40:1 인 리포좀.
제10항에 있어서, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 20:1 인 리포좀.
제1항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 반대이온을 추가로 포함하는 리포좀.
제12항에 있어서, 반대이온이 1가 음이온, 2가 음이온 및 3가 음이온의 산, 나트륨 또는 암모늄 형태인 리포좀.
제13항에 있어서, 상기 1가 음이온이 염화물, 아세트산염, 락토비온산염 또는 포름산염; 상기 2가 음이온이 아스파르트산염, 숙신산염 또는 황산염; 및 상기 3가 음이온이 시트르산염 또는 인산염인 리포좀.
제14항에 있어서, 상기 반대 이온이 시트르산염인 리포좀.
제1항에 있어서, 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤이 리포좀의 지질부를 구성하고, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 5:1 내지 100:1 인 리포좀.
제16항에 있어서, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 5:1 내지 40:1 인 리포좀.
제17항에 있어서, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 20:1 인 리포좀.
다음 a)∼e) 단계를 포함하는, 제1항의 리포좀을 제조하는 방법:

a) 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤로 구성된 지질 필름 또는 분말을 형성하는 단계;

b) 반대이온 용액을 함유하는 수성 완충액으로 상기 지질 필름 또는 분말을 수화하는 단계;

c) 수성 매체 중에서 단층막이며 100nm이하인 리포좀이 제조되도록 전단력을 적용하는 단계;

d) 수성매체에 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 첨가하는 단계; 및

e) 구배에 의하여 리포좀 속으로 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 적재시키도록, 리포좀 내부의 수성매체와 리포좀 외부의 수성매체 사이에 구배를 발생시키는 단계.
제19항에 있어서, 구배가 pH 구배인 방법.
제19항에 있어서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤의 몰비가 1.5:0.5 내지 2:1.5인 방법.
다음 a)∼e) 단계를 포함하는, 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 포함하는 리포좀을 제조하는 방법:

a) 수소화 콩 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤로 구성된 지질 필름 또는 분말을 형성하는 단계;

b) 반대이온 용액을 함유하는 수성 완충액으로 상기 지질 필름 또는 분말을 수화하는 단계;

c) 수성 매체 중에서 단층막이며 100nm이하인 리포좀이 제조되도록 전단력을 적용하는 단계;

d) 수성매체에 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 첨가하는 단계; 및

e) 구배에 의하여 리포좀 속으로 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 적재시키도록, 리포좀 내부의 수성매체와 리포좀 외부의 수성매체 사이에 구배를 발생시키는 단계.
제22항에 있어서, 수소화 콩 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤의 몰비가 1.5:0.5 내지 2:1.5인 방법.
제22항에 있어서, 포스파티딜콜린 대 콜레스테롤의 몰비가 2:1인 방법.
제22항에 있어서, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 10:1 내지 40:1 인 방법.
제25항에 있어서, 상기 지질 대 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신의 몰비가 20:1 인 방법.
제22항에 있어서, 구배가 pH 구배인 방법.
제27항에 있어서, 리포좀 내부의 수성 매체 의 pH가 리포좀 외부의 수성 매체에 비하여 낮은 방법.
제28항에 있어서, 리포좀 외부의 수성매체에 막투과성 아민을 첨가함으로써 리포좀 내부 수성매체의 pH를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 막투과성 아민이 암모늄염 및 알킬-아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제30항에 있어서, 상기 암모늄염이 1가 또는 다가의 반대이온을 갖는 방법.
제31항에 있어서, 상기 암모늄염이 황산암모늄, 수산화암모늄, 아세트산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 시트르산암모늄, 숙신산암모늄, 락토비온산암모늄, 탄산암모늄, 타르타르산암모늄 및 옥살산암모늄으로 구성되어있는 군으로부터 선택되는 방법.
제30항에 있어서, 상기 알킬-아민이 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민 및 프로필아민으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
제19항 또는 제22항에 있어서, 상기 지질 필름이 포스파티딜글리세롤을 추가로 포함하는 방법.
제34항에 있어서, 포스파티딜글리세롤이 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 디라우릴 포스파티딜글리세롤, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 및 디스테아로일 포스파티딜글리세롤로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
제35항에 있어서, 포스파티딜글리세롤이 디스테아로일 포스파티딜글리세롤인 방법.
2:1의 몰비의 수소화 콩 포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤로 이루어진 지질을 포함하여 구성되어 있으며, 지질 : 캄프토테신의 몰비가 10:1 내지 40:1이고, 리포좀이 단층막이며 지름이 100nm미만인 것을 특징으로 하는 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 캡슐화하고 있는 리포좀.
다음의 a)∼e) 단계를 포함하는, 제37항의 리포좀 제제의 제조방법:

a) 수소화 콩 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤을 2:1의 몰비로 포함하는 지질 필름 또는 분말을 형성하는 단계;

b) 반대이온 용액을 함유하는 수성 완충액으로 상기 지질 필름 또는 분말을 수화하는 단계;

c) 수성 매체 중에서 100nm 미만의 평균 크기를 가진 단층막인 리포좀이 제조되도록 전단력을 적용하는 단계;

d) 10:1 내지 40:1의 지질:캄프토테신 몰비를 가지도록 하는 양으로 수성매체에 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 첨가하는 단계; 및

e) 구배에 의하여 리포좀 속으로 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 적재시키도록, 리포좀 내부의 수성매체와 리포좀 외부의 수성매체 사이에 구배를 발생시키는 단계.
제38항에 있어서, 구배가 pH 구배인 방법.
종양의 성장을 억제하기에 유효한 양의 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 제6항, 제7항, 제9항, 제10항, 제11항, 제13항, 제14항, 제15항, 제16항, 제17항, 제18항 또는 제37항중 어느 한 항에 따른 리포좀을 포함하는 종양 성장 억제제로서 약제학적 조성물.
제40항에 있어서, 상기 종양이 약물저항성 또는 약물 민감성인 약제학적 조성물.
제41항에 있어서, 종양이 난소암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 유방암 및 후두암으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 암인 약제학적 조성물.
하기 a)∼e) 단계를 포함하는, 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 포함하는 리포좀 제제의 제조방법:

a) 수소화 콩 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤을 포함하는 지질 필름 또는 분말을 형성하는 단계;

b) 반대이온 용액을 함유하는 수성 완충액으로 지질 필름 또는 분말을 수화하는 단계;

c) 수성 완충액에 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 첨가하는 단계;

d) 구배에 의하여 리포좀 속으로 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 적재시키도록, 리포좀 내부의 수성매체와 리포좀 외부의 수성매체 사이에 구배를 발생시키는 단계; 및

e) 리포좀 내부의 수성매체의 pH가 감소되도록 막투과성 아민을 리포좀의 외부 수성매체에 첨가하는 단계.
아래의 a)∼e) 단계의 방법으로 제조된, 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 캡슐화하고 있는 리포좀:

a) 수소화 콩 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤을 포함하는 지질 필름 또는 분말을 형성하는 단계;

b) 반대이온 용액을 함유하는 수성 완충액으로 지질 필름 또는 분말을 수화하는 단계;

c) 수성 완충액에 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 첨가하는 단계;

d) 구배에 의하여 리포좀 속으로 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 적재시키도록, 리포좀 내부의 수성매체와 리포좀 외부의 수성매체 사이에 구배를 발생시키는 단계; 및

e) 리포좀의 내부 수성매체의 pH가 감소되도록 막투과성 아민을 리포좀의 외부 수성매체에 첨가하는 단계.
a) 수소화 콩 포스파티딜콜린 또는 디스테아로일포스파티딜콜린, b) 콜레스테롤, 및 c) 반대이온으로서의 시트르산염 또는 황산 염을 포함하며, a)와 b)의 비는 2:1인, 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 캡슐화하고 있는 단층막 리포좀.
제45항에 있어서, 염화암모늄을 추가로 포함하는 단층막 리포좀.
제45항에 있어서, a)가 수소화 콩 포스파티딜콜린이고, c)의 시트르산염은 50mM의 시트르산 암모늄이며, 또한 리포좀의 직경이 62 또는 63nm인 단층막 리포좀.
제45항에 있어서, a)가 수소화 콩 포스파티딜콜린이고, c)의 시트르산염은 100mM의 시트르산 암모늄인 단층막 리포좀.
제45항에 있어서, a)가 디스테아로일포스파티딜콜린이고, c)의 시트르산염은 50mM의 시트르산 암모늄이며, 또한 리포좀의 직경이 60, 63 또는 65nm인 단층막 리포좀.
제45항에 있어서, a)가 디스테아로일포스파티딜콜린이고, c)의 황산염은 황산 암모늄인 단층막 리포좀.
a) 수소화 콩 포스파티딜콜린 또는 디스테아로일포스파티딜콜린, b) 콜레스테롤, 및 c) 반대이온으로서의 시트르산염 또는 황산 염, 및 d) 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하며, a)와 b)의 비는 2:1인, 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 캡슐화하고 있는 단층막 리포좀을 포함하는 약제학적 조성물.
제51항에 있어서, 리포좀이 60, 62, 63 또는 65nm의 중간 직경을 갖는 약제학적 조성물.
일종 이상의 인지질 및 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신을 포함하는 리포좀.
제53항에 있어서, 상기 일종 이상의 인지질이 포스파티딜콜린인 리포좀.
제54항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린이, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 수소화 콩 포스파티딜콜린, 콩 포스파티딜콜린, 계란 포스파티딜콜린, 수소화 계란 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린 및 디미리스토일 포스파티딜콜린으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 것인 리포좀.
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