DE3826595A1

DE3826595A1 - Tripeptide, die als immunostimulantien sowie bei der verhuetung von metastasen nuetzlich sind

Info

Publication number: DE3826595A1
Application number: DE3826595A
Authority: DE
Inventors: Brunetto Brunetti; Marco Prada
Original assignee: Ellem Industria Farmaceutica SpA
Current assignee: Ellem Industria Farmaceutica SpA
Priority date: 1987-08-04
Filing date: 1988-08-04
Publication date: 1989-02-16
Anticipated expiration: 2008-08-05
Also published as: IE60870B1; GR1000339B; US4929601A; GB8818447D0; SE8802790D0; FR2621317B1; CH678059A5; FR2621317A1; JPS6463593A; ATA195788A; GB2207922A; SE8802790L; BE1003227A3; GB2207922B; IT1222437B; GR880100509A; DE3826595C2; IT8721575A0; NL8801932A; IE882366L

Description

Es ist bekannt, daß die Wechselwirkung zwischen Tumor zellen und der extrazellularen Matrix, verursacht oder begünstigt durch Fibronectin, durch die intravenöse Ver abreichung des synthetischen Pentapeptids Gly-Arg-Gly- Asp-Ser, dessen Sequenz die gleiche ist wie diejenige des zellbindenden Sitzes von Fibronectin (M. J. Humphries et al., Science 233, 467, 1986), inhibiert wird.

Ruoslahti und Pierschbacher (Cell 44, 517, 1986) haben die Hypothese vorgeschlagen, daß die biologische Aktivi tät dieses Pentapeptids der Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp, die darin enthalten ist, zugeordnet werden könnte, ohne jedoch die Aktivität des letzteren zu testen.

Lam et al. (J. Biol. Chem. 262, 947, 1987) haben statt dessen gezeigt, daß Arg-Gly-Asp in der Lage ist, sich an einige Blutplättchenoberflächen-Glycoproteine zu binden, und so eine mögliche biologische Wirkung dieses Tripep tids als Inhibitor der Blutplättchen-Adhäsionsreaktionen nahelegt.

Ausgehend von der Kenntnis, die sich aus dem oben erwähnten Stand der Technik ergibt, hat die Anmelderin einige Tripeptide, die zu der allgemeinen Formel X-Gly-Y gehören, worin X=L-Arg oder D-Arg und Y=L-Asp oder D-Asp, synthetisiert und dann deren Wirksamkeit in Versuchstests der antimetastatischen Aktivität ausgewertet.

Die Ergebnisse bestätigen ihre Wirksamkeit als anti metastatische Mittel, haben jedoch auch überraschender weise ihre ausgeprägte immunostimulierende Wirkung ge zeigt, die auf der Grundlage der vorhandenen Kenntnisse nicht vorhersehbar war.

Dieser immunostimulierende Effekt wurde in vitro in ex perimentellen Mäuse- sowie in menschlichen Modellen beob achtet und besteht sowohl in einer Reifung unreifer T-Lymphozyten als auch in einer Steigerung der T-Zellen funktion.

Ein ähnliches immunostimulierendes Verhalten wurde für die Tripeptide Arg-Lys-Glu (US-Anmeldung 0 35 045 vom 6. April 1987), Arg-Ala-Arg (US-Patentanmeldung 0 35 044W vom 6. April 1987) und Arg-Lys-Asp (europäische Patent anmeldung 67 425 vom 22. Dezember 1982) beschrieben.

Außerdem zeigten die Tripeptide, welche nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, Stabilität in simulier tem Magensaft: Auf Basis desjenigen, was im Falle der Peptide Arg-Lys-Glu und Arg-Ala-Arg beobachtet worden war, deren Stabilität in simulierter Magenumgebung an die Aktivität nach oraler Verabreichung an Tiere ge koppelt war, ist es möglich, den Tripeptiden, die Gegen stand der vorliegenden Erfindung bilden, eine immunosti mulierende Aktivität nach oraler, abgesehen von der par enteralen, Verabreichung zuzuschreiben.

Dies stellt einen bedeutenden Vorteil in der therapeuti schen Anwendung dar mit besonderer Bezugnahme auf Kinder und andere Patienten, welche die parenterale Verabrei chung nicht vertragen, und auch im Hinblick einer besseren Patientenversorgung.

Auf Basis des oben Erwähnten ergibt sich, daß diese Pro dukte sich als sehr nützlich erweisen bei der Vorbeugung bzw. Verhütung der Metastasenbildung bzw. Metastasierung bei neoplastischen Patienten nach chirurgischer Entfer nung des Tumors sowie bei der gleichzeitigen Stimulierung des Immunsystems, das sowohl durch die radiochemothera peutischen Behandlungen als auch die Operation selbst geschwächt ist: diese beiden Faktoren sind in der Tat bekanntlich immunschwächend.

Außerdem stellt die Verfügbarkeit von Medikamenten, die auf oralem Weg verabreicht werden können, für die Thera pie dieser Patienten einen anderen unzweifelhaften Vor teil dar.

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Synthese und die chemischen sowie die biologischen Eigenschaften ei ner neuen Klasse von Tripeptiden, die durch die allge meine Formel X-Gly-Y definiert sind, worin X=L-Arg oder D-Arg und Y=L-Asp oder D-Asp.

Diese Produkte werden durch die Tatsache charakterisiert, daß sie mit antimetastatischen Eigenschaften ausgestattet sind, die beim Test der experimentellen Mäusemelanom- Metastasen beobachtet werden, sowie immunostimulierender Aktivität, die in in-vitro-Tests der Mäusemilz-Lympho zyten-Reifung (Thy 1.2 Membranmarkerinduktion) und bei Bestimmungen betreffend die Aktivierung der Funktion der reifen menschlichen Lymphozyten (Wachstumsfaktorerzeugung, DNA- und RNA-Synthese nach mitogenem Stimulus, Ansteigen der Mitosen) gezeigt wird.

Außerdem zeigten in vitro-Tests, die in simulierter Ma genumgebung durchgeführt wurden, die Stabilität dieser Peptide, so daß es möglich ist, deren Aktivität auch nach oraler Verabreichung vorauszusehen.

So können die Produkte, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, dank ihrer einmaligen Kombination von antimetastatischen und immunostimulierenden Aktivitäten als Arzneimittel bei Patienten verwendet werden, welche sich der chirurgischen Tumorentfernung unterwerfen, um die Metastasenbildung zu verhindern, und gleichzeitig da zu beitragen, den Immunstatus zu verbessern.

Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 und 2 stellen die HPLC-Diagramme der Tripep tide Arg-Gly-Asp und Arg-Gly-D-Asp dar, welche nach den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurden.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verstanden, worin die folgenden Abkürzungen verwendet werden.

Arg = L-Arginin
Gly = Glycin
Asp = L-Asparaginsäure
Asx = L-Asparaginsäure, D-Asparaginsäure oder Asparagin
D-Asp = D-Asparaginsäure
Boc = Butyloxycarbonyl
N^g = Substitution am Guanoisinstickstoff von Arg.

Beispiel 1: Synthese Synthese von L-Arginyl-glycyl-L-asparaginsäure (1) Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-asparaginsäure-dibenzylester

7,1 g tert.-Butyloxycarbonyl-glycin wurden in 50 ml Ethyl acetat gelöst, auf -10 bis -15°C unter Rühren gekühlt und mit 5,6 ml N-Methylmorpholin und anschließend mit 5,18 ml Isobutylchlorformiat behandelt. Das Gemisch wurde 10 min bei -15°C gerührt. Unterdessen wurden 20,1 g L-Asparaginsäure-dibenzylester-p-tosylatsalz in 80 ml Di methylformamid gelöst, auf -10°C gekühlt und durch Zugabe von 5,6 ml N-Methylmorpholin neutralisiert. Diese Lösung wurde zu der obigen Lösung des vorgeformten, gemischten Anhydrids gegeben und das Reaktionsgemisch langsam auf Raumtemperatur unter Rühren während 3 h erwärmen gelassen.

Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 300 ml Ethylacetat verdünnt und die Lösung zweimal mit Salzlösung, danach mit 4%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser, 5%iger wäßriger Citronensäure und schließlich mit Wasser zur Neutralität gewaschen. Die organische Phase wurde getrock net (Magnesiumsulfat) und dann zu einem Öl eingedampft. Ausbeute: 20 g. Das Produkt war durch TLC (System: Chloroform/Methanol/Essigsäure, 360/32/8; R_f=0,8) homogen.

(2) Tribenzyloxycarbonyl-L-arginyl-glycyl-L-asparagin säure-dibenzylester

Das Produkt der vorhergehenden Stufe (20 g) wurde mit 50%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (125 ml) während 25 min bei Raumtemperatur behandelt und die Lö sungsmittel wurden unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde aus Toluol wiedereingedampft und dann im Vakuum getrocknet. Das entstandene Trifluor acetatsalz des Dipeptids wurde in 75 ml Dimethylformamid gelöst, auf -10°C gekühlt und durch Behandeln mit 5,6 ml N-Methylmorpholin neutralisiert. Unterdessen wurden 23,1 g Tribenzyloxycarbonyl-L-arginin durch Auflösen in 100 ml Tetrahydrofuran, Kühlen auf -10 bis -15°C und Be handeln mit 5,6 ml N-Methylmorpholin und anschließend 5,18 ml Isobutylchlorformiat, wie oben beschrieben, in das gemischte Anhydrid überführt. Die vorgekühlte Lösung des neutralisierten Dipeptids wurde zu der Lösung des gemischten Anhydrids gegeben und die Mischung 3 h gerührt, wobei langsam auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Im Ver lauf der Reaktion verfestigte sich das Gemisch und 50 ml Dimethylformamid wurden zur Erleichterung des Rührens zu gegeben. Das Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit 500 ml Ethylacetat verdünnt.

Diese Lösung wurde mit gesättigtem, wäßrigem Natriumchlo rid gewaschen, währenddessen ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser Feststoff wurde abfiltriert, mit Ethylacetat gewa schen und getrocknet und ergab das geschützte Tripeptid. Ausbeute: 25 g. Dünnschichtchromatographie (System: Chlo roform/Methanol/Essigsäure, 85/10/5) zeigte eine leichte Verunreinigung mit nichtumgesetztem Tribenzyloxycarbonyl arginin. Das Produkt (14 g) wurde daher durch Auflösen in Chloroform/Methanol (98/2) und Anwendung einer Silikagel säule (600 g) gereinigt. Die Säule wurde mit fortschrei tend steigenden Mengen an Methanol in Chloroform eluiert und ergab das reine, geschützte Tripeptid. Ausbeute: 10 g.

(3) L-Arginyl-glycyl-L-asparaginsäure

Das geschützte Tripeptid des vorhergehenden Schrittes (10 g) wurde bei 50 psi in Methanol/Essigsäure/Wasser (60/20/20, 300 ml) 72 h über 3 g 5%igem Palladium-auf- Kohle hydriert, bis die Reaktion vollständig war (TLC). Der Katalysator wurde abfiltriert, das Methanol unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand lyophi lisiert und ergab das Tripeptid als weißes Pulver. Aus beute: 3 g. Das Produkt war aufgrund von Dünnschicht chromatographie (Systeme: A=Isopropanol/Ammoniak, 1/1; B=n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin, 60/12/40/48) homogen.

Synthese von L-Arginyl-glycyl-D-asparaginsäure (1) Herstellung von Boc-β-benzyl-D-asparaginsäure-Harzen

Chlormethyliertes Polystyrol (1% vernetzt; 200-400 mesh) wurde in einen Rundkolben gegeben und in Dimethylform amid (etwa 8 bis 10 ml/g Harz) gequollen, dann mit der Boc-β-benzyl-D-asparaginsäure (1 mMol/g Harz) und an schließend mit Kaliumfluorid (2 mMol/g Harz) behandelt. Der Kolben wurde mit einem mechanischen Rührer und Kon densator ausgerüstet und unter Vakuum erhitzt, bis eine kleine Menge (5 bis 10 ml) des Lösungsmittels abdestilliert war. Die Vakuumquelle wurde entfernt und das Gemisch 16 bis 18 h auf 80 bis 100°C erhitzt. Beim Abkühlen wurde das Harz filtriert, mit Dimethylformamid, Dimethylformamid/Wasser (1/1), Wasser, Ethanol, Dichlor methan und Methanol gewaschen und dann unter Vakuum ge trocknet. Substitution (berechnet aufgrund der Gewichts zunahme) =0,6 mMol/g.

(2) Syntheseprotokoll

Eine Menge von 17,6 g Boc-β-benzyl-D-asparaginsäure-Harz wurde in ein Glasreaktionsgefäß, ausgestattet mit einem mechanischen Rührer, einer gesinterten Glasbasis und einer Vakuumquelle zum Filtrieren, gegeben. Das Harz wur de nacheinander bei Umgebungstemperatur (20-25°C) mit den folgenden Lösungsmitteln oder Reagentien behandelt:

a) Methylenchlorid
b) 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (Vol/Vol)
c) 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid während 25 min
d) Methylenchlorid (dreimal)
e) Isopropanol
f) 10% Triethylamin/Methylenchlorid (Vol/Vol) (zweimal)
g) Methylenchlorid
h) Methanol (zweimal)
i) Methylenchlorid (zweimal)

Für jede Behandlung wurde eine Kontaktzeit von 3 bis 5 min vorgesehen. Etwa 10 bis 15 ml Lösungsmittel oder Reagens-Lösungs mittelgemisch/g Harz wurde in jedem Schritt verwendet.

j) Das Harz wurde mit einer Lösung von Boc-glycin (3 Äquiv.) in Methylenchlorid gerührt und dazu wurden 3 Äquiv. Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid gege ben. Die Reaktionszeit für die Kupplung war ein Minimum von 2 bis 4 h, konnte jedoch über Nacht 16 bis 18 h durch geführt werden. Das Peptid-Harz wurde filtriert und mit Methylenchlorid, Methanol und Methylenchlorid gewaschen und auf Vollständigkeit der Kupplung mittels Ninhydrin- Reaktion geprüft. Wenn die Kupplung unvollständig war, wurde die gleiche Aminosäure unter Verwendung der halben Menge der Reagentien wiedergekuppelt.

Der Zyklus wurde für Boc-N^g-tosyl-L-arginin (in Dimethyl formamid) wiederholt. Nach Entfernung der N-endständigen Boc-Gruppe wurde das Harz-Peptid gründlich gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute an Harz-Peptid=21,0 g.

Das Peptid wurde von dem Harz gespalten und gleichzeitig durch Behandlung mit wasserfreiem, flüssigem Fluorwasser stoff (etwa 10 ml/g Harz-Peptid), enthaltend Anisol (10% Vol/Vol), während 1 h bei 0°C von den Schutzgruppen befreit. Nach Eindampfen des Fluorwasserstoffs unter vermindertem Druck wurde das rohe Peptid durch Auswaschen des Harzes mit verdünnter, wäßriger Essigsäure extrahiert und das Produkt durch Lyophilisierung isoliert. Ausbeute an rohem Peptid=3,9 g.

(3) Reinigung des rohen Peptids

Das rohe Peptid konnte durch präparative Umkehr-HPLC un ter Verwendung von C18-derivatisiertem Siliciumdioxid un ter Verwendung von beispielsweise eines Waters Prep 500- Instruments gereinigt werden. Unter Verwendung einer 5×30 cm Säule, die mit einem geeigneten, wäßrigen Puf fer, wie 0,1%ige wäßrige Trifluoressigsäure, äquilibriert war, wurde das rohe Peptid (etwa 2 g) auf die Säule ge bracht und mit einem Gradienten, enthaltend steigende Mengen an Acetonitril, eluiert. Die Fraktionen wurden durch analytische HPLC gesteuert und diejenigen, die das Produkt bei dem gewünschten Reinheitsgrad (<97%) ent hielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. Schließlich wurde das gereinigte Produkt in das gewünschte Salz durch Behandlung mit der gewünschten Salzform eines Ionenaus tauscherharzes überführt. Ausbeute an gereinigtem Peptid als Acetatsalz=2,5 g.

Beispiel 2: Chemische Charakteristika Arg-Gly-Asp

Die hier gezeigten Daten beziehen sich auf eine Einzel charge des Tripeptids und sollten nicht als einschrän kend angesehen werden.

Molekulargewicht: 346,4
Aussehen: weißes Pulver

Aminosäure-Analyse

Peptidgehalt: 78,5%
Peptid-Reinheit: 96%
Feuchtigkeit: 6,56
TLC: Isopropanol/NH₃ (1/1) Reinheit 99%, Rf=0,75
HPLC: Die Analyse wurde nach den im folgenden beschrie benen Methoden durchgeführt und das Profil ist in Fig. 1 gezeigt.

Lösungsmittel:
A = KH₂PO₄ 0,05 M
B = 60% CH₃CN + 40% A

Gradient: von 0 bis 10% B in 20 min
Säule: Ultrasphere ODS (ALtex)
Empfindlichkeit: 0,2 AUFS (Sensitivity)
Wellenlänge: 210 nm
Fließrate: 1,5 ml/min
minimale Fläche: 10.

Arg-Gly-D-Asp

Molekulargewicht: 346,4
Aussehen: weißes Pulver

Aminosäure-Analyse

Peptidgehalt: 80,5%
Peptid-Reinheit: < 98%
HPLC: Die Analyse wurde nach den im folgenden beschrie benen Verfahren durchgeführt und das Profil ist in Fig. 2 gezeigt.

Lösungsmittel:
A = NaH₂PO₄ 25 m, 50 nM NaClO₄, pH 3,0 mit H₃PO₄
B = H₂O/MeCN, 1/1

Gradient:
von 0 bis 30% B in 15 min, linear
von 30 bis 70% in 10 min, linear

Säule: Deltapack C18 (5 µm, 100 Å) 3,9 × 150 mm
Empfindlichkeit: 0,2 AUFS
Wellenlänge: 220 nm
Fließrate: 0,7 ml/min
minimale Fläche: 10.

Beispiel 3: Biologische Charakteristika Beständigkeit in simulierter Magensäure- bzw. gastrischer Umgebung in vitro

Das Tripeptid Arg-Gly-Asp zeigte sich stabil bei 37°C während 3 h in simulierter gastrischer Umgebung in vitro unter Verwendung der Lösung des simulierten Magensafts USP XXI (HCl+Pepsin).

Antimetastatische Aktivität

Das Vermögen des Tripeptids Arg-Gly-Asp zum Inhibieren der Lungenbesiedlung durch B16-BL6-Mäusemelanomzellen, die in weibliche C57Cl/6 Mäuse mit einem mittleren Körpergewicht von 20 g (10 Tiere/Gruppe) eingeimpft waren, wurde ausgewertet.

Arg-Gly-Asp wurde in einer Dosis von 3 mg/Maus durch in travenöse Injektion zusammen mit 2×10⁵ Melanomzellen verabreicht.

14 Tage später wurden die Tiere getötet, die Lungen ent nommen und nach Formalinfixierung auf Anwesenheit von Oberflächenmelanomkolonien geprüft. Eine Gruppe von Kon trolltieren war nur mit der Tumorzellsuspension behan delt worden.

Während bei den Kontrollen die mittlere Zahl der Meta stasen über 500/Maus war, war dieser Wert bei den behan delten Tieren vermindert, wo er nur 173/Maus betrug.

Durch Verabreichung von 7×10⁴ Tumorzellen war die mitt lere Anzahl an Metastasen in den Kontrolltieren 21,6 und sank auf 6,8 bei Tieren, die mit 3 mg/Maus i. v. an Arg- Gly-Asp behandelt waren (-69%).

Induktion von Thy 1.2 Antigen in Milzzellen normaler Mäuse

Das Vermögen des Tripeptids Arg-Gly-Asp, die Differenzierung der T-Zellenvorläufer in die Lymphozyten-Expressi ons-T-Zellenmarker in vitro zu induzieren, wurde durch Nachweis der Induktion von Thy 1.2 Membran-Antigen getestet.

Zellpräparation

Milzzellen normaler Mäuse wurden als Quelle der "Null"- Zellen verwendet. Die Mäuse wurden durch Entfernung des Gehirns getötet.

Die Milzen wurden aseptisch entfernt und mit Pinzetten in Hank′s ausgeglichener Salzlösung (HBSS) (Gibco Ltd., Paisley, Schottland) fein zerkleinert. Eine Suspension der einzelnen Zellen wurde durch Filtrieren durch ein feines Haarsieb erhalten. Einkernige Zellen (MNC) wurden durch Differentialzentrifugieren auf Lymphoprep (Nyegaard, Oslo, Norwegen) mit fortlaufendem Dichtegra dienten während 20 min bei 450 g isoliert.

Nach 3 Waschungen in HBSS wurden die MNC bei einer Kon zentration von 5×10⁶ Zellen/ml in 199 Medium (Gibco Ltd.), das mit 1% BSA (Cohn Fr. V. Sigma, St. Louis) er gänzt war, L-Glutamin 2 mM und 10 mcg/ml Gentamycin sulfat (Schering, Klworth, NJ, USA) (TC 199-BSA) suspen diert. Die Zellen wurden verwendet, wenn ihre Lebens fähigkeit über 95% beim Trypan Blau-Ausschlußtest war.

Thy 1.2-Antigen-Bio-Induktionsversuch

200 µl der Milz-MNC-Suspension wurden mit dem gleichen Volumen des Tripeptids, das mit TC 199-BSA-Medium zweck mäßig verdünnt war, vermischt. Die Kontrollzellen waren nur mit dem Medium TC 199-BSA behandelt worden. Alle Zellen wurden 18 h bei 37°C in feuchter Atmosphäre, enthal tend 5% CO₂, bebrütet, dann zweimal mit HBSS, enthaltend 5% Hitze-inaktiviertes neonatales Kälberserum (Gibco) (HBSSS-CS), gewaschen und schließlich in dem gleichen Me dium bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml wieder suspendiert.

Direkte Immunfluoreszenz (IF)

Die Expression von Thy 1.2-Antigen wurde durch IF analy siert unter Verwendung eines Anti-Thy 1.2-monoklonalen Antikörpers, konjugiert mit Fluorescein (Bio-Yeda, ge liefert von Technogenetics, S. Mauro Torinese, Italien) bei einer Konzentration von 2 mcg/10⁶ Zellen. Die Zellen wurden mit dem Antikörper 30 min bei 4°C bebrütet.

Nach drei Waschungen in HBSS wurden die Zellen in dem gleichen Medium wiedersuspendiert und mit einem Leitz Orthomat-Mikroskop, das mit Auflichtbeleuchtung versehen war, beobachtet. Wenigstens 300 Zellen wurden in jeder Auswertung gezählt.

Ergebnisse

Wie in der Tabelle gezeigt, ist das Tripeptid Arg-Gly-Asp in vitro bei der Induktion der Thy 1.2-Induktion bei Konzentrationen im Bereich von 1 bis 200 µg/ml aktiv, wobei die optimale Konzentration 10 mcg/ml ist.

RNA-Synthese in PHA-stimulierten humanen T-Lymphozyten in vitro

Humane T-Lymphozyten, die 24 h in vitro in Anwesen heit von 0,5% Phytohämagglutinin (PHA) und verschiedenen Konzentrationen der zu untersuchenden Tripeptide bebrü tet wurden, wurden auf RNA-Synthese (Zellaktivierung) mittels 3H-Uridin-Markierung analysiert. Die Ergebnisse, die in der folgenden Tabelle gezeigt sind, zeigen an, daß sowohl Arg-Gly-Asp als auch Arg-Gly-D-Asp in der La ge sind, PHA-induzierte humane T-Lymphozyt-Aktivität zu erhöhen.

DNA-Synthese in PHA-stimulierten humanen T-Lymphozyten in vitro

Humane T-Lymphozyten, die 72 h in vitro in Anwesenheit von 0,5% PHA und verschiedenen Konzentrationen der du untersuchenden Tripeptide bebrütet wurden, wurden auf DNA-Synthese (Zellvermehrung) mittels 3H-Thymidin-Mar kierung analysiert.

Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen an, daß sowohl Arg-Gly-Asp als auch Arg-Gly-D-Asp in der Lage sind, PHA-induzierte humane T-Lymphozyten-Vermeh rung zu erhöhen.

Wirkung auf den Zellzyklus

Humane T-Lymphozyten wurden 72 h in Anwesenheit von PHA und den zu prüfenden Tripeptiden (1 µg/ml) bebrütet. DNA wurde dann mit Propidiumjodid gefärbt und die Zellen wurden mit einem Fließcytometer (flow cytometer) analy siert.

Stimulierung der Lymphokine-Produktion in vitro

Menschliche T-Lymphozyten wurden mit PHA und mit oder ohne die zu untersuchenden Peptide 24 h (im Falle von IL-2) oder 72 h (im Falle von BCGF) bebrütet. Der Über stand wurde gesammelt, filtriert (0,2 µm) und auf die Anwesenheit von IL-2- oder BCGF-Aktivität geprüft, indem er bei verschiedenen Konzentrationen zu frischen T-Lympho zyten oder zu langzeitgezüchteten B-Zellen gegeben wurde. Die Vermehrungsaktivität dieser Zellen in Abhängigkeit von der Anwesenheit des betreffenden Wachstumsfaktors wurde durch 3H-Thymidin-Einbau ausgewertet.

Die Ergebnisse zeigen einen ausgeprägten Stimulierungs effekt der Wachstumsfaktorproduktion durch Arg-Gly-Asp, leicht niedriger als derjenige von Arg-Lys-Glu, je doch höher als der mit Arg-Lys-Asp erzeugte.

BCGF Aktivität (counts per Minute) beim Prozentsatz des Überstands

TCGF Aktivität

Stimulierung der Lymphokine in vitro durch reine mensch liche T-Lymphozyten ohne Makrophagen

Die Lymphokine-Produktion durch humane T-Lymphozyten, gereinigt durch Durchlauf auf einer Nylonwollesäule, wurde mit den gleichen Methoden wie im vorhergehenden Experiment ausgewertet.

Die T-Zellen-Reinheit war über 95%, während Makrophagen/ Monozyten sowie B-Zellen unter 1% lagen. Um den Mangel der Makrophagen zu umgehen, wurde rekombinantes IL-1 β (Genzym) in einer Konzentration von 25 Einheiten/ml zu gesetzt.

Die sowohl für IL-2 als auch für BCGF erhaltenen Ergeb nisse zeigen, daß die Wirkung von Arg-Gly-Asp vergleich bar ist mit derjenigen der anderen Referenzverbindungen, unter denen auch Thymosin-Fraktion 5, ein teilweise gereinigtes Thymus-Derivat, verwendet worden war.

Beispiel 4: Toxikologische Prüfungen Arg-Gly-Asp

Das Tripeptid Arg-Gly-Asp zeigt eine LD₅₀ höher als 1000 mg/kg i. p. bei Mäusen.

Beispiel 5: Klinische Verwendung

Die vorherigen Beispiele 3 und 4 haben gezeigt, daß die Tripeptide, welche Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, in vitro als immunostimulierende Mittel sowohl bei tierischen als auch menschlichen experimentellen Model len sowie in vivo als antimetastatische Produkte bei Laboratoriumstieren aktiv sind und darüber hinaus frei von Toxizität.

Somit kann mit gutem Grund vorhergesagt werden, daß sie zur Verhütung von Metastasenbildung bei Patienten, die einer chirurgischen Tumorentfernung unterzogen waren, klinisch nützlich sein werden und gleichzeitig die Immun abwehr des Organismus verbessern, dank ihrer immunosti mulierenden Eigenschaften.

Salze der Tripeptide

Die oben erwähnten Beispiele beziehen sich auf das Acetat salz der Tripeptide. Jedoch ist es möglich, analoge Er gebnisse mit anderen Salzen organischer und anorganischer Säuren, wie das Trifluoracetat, Hydrochlorid, Sulfat, zu erhalten.

Claims

1. Tripeptide gemäß der allgemeinen Formel X-Gly-Yworin X=L-Arg oder D-Arg und Y=L-Asp oder D-Asp, und ihre Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, wie beispielsweise Acetat, Trifluoracetat, Hydrochlorid, Sulfat.

2. Tripeptide gemäß Anspruch 1 mit den folgenden Sequenzen: Arg-Gly-Asp
D-Arg-Gly-Asp
Arg-Gly-D-Asp
D-Arg-Gly-D-Asp.

3. Tripeptide gemäß Anspruch 1, insbesondere Arg-Gly- Asp und Arg-Gly-D-Asp.

4. Verwendung der Tripeptide gemäß Anspruch 1 als an timetastatische Mittel.

5. Verwendung der Tripeptide gemäß Anspruch 1 als immunostimulierende Mittel.

6. Tripeptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit antimetastatischer und immunostimulierender Aktivität ausgestattet sind.

7. Verwendung der Tripeptide gemäß den Ansprüchen 1 und 4 zur Herstellung von Arzneimitteln, die mit anti metastatischer Aktivität nach parenteraler Verabreichung ausgestattet sind.

8. Verwendung der Tripeptide gemäß den Ansprüchen 1 und 4 zur Herstellung von Arzneimitteln, die mit anti metastatischer Aktivität nach oraler Verabreichung aus gestattet sind.

9. Pharmazeutische Präparate gemäß Anspruch 5 zur oralen Verabreichung.

10. Pharmazeutische Präparate gemäß Anspruch 5 zur parenteralen Verabreichung.

11. Verwendung der Tripeptide gemäß den Ansprüchen 1 und 5 zur Herstellung von Arzneimitteln mit immunosti mulierender Aktivität.

12. Therapeutische Verwendung von pharmazeutisch an nehmbaren Salzen oder der Tripeptide gemäß den Ansprü chen 1 und 4 bis 10 als Arzneimittel bei Patienten, die eine chirurgische Tumorentfernung hatten, um die Bildung von Metastasen zu verhüten, wobei gleichzeitig zur Ver besserung der Immunbedingungen beigetragen wird.

13. Verwendung der Tripeptide gemäß Anspruch 12 als Acetatsalze.

14. Verwendung der Tripeptide gemäß Anspruch 12 als Trifluoracetatsalze.

15. Verwendung der Tripeptide gemäß Anspruch 12 als Hydrochloridsalze.

16. Verwendung der Tripeptide gemäß Anspruch 12 als Sulfatsalze.

17. Verfahren zur Herstellung der Tripeptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Phasen eingeschlossen sind:

- Herstellung des t-Butyloxycarbonyl-Gly-Asp- dibenzylesters.
- Herstellung des Tribenzyloxycarbonyl-Arg-Gly- Asp-dibenzylesters aus der so erhaltenen Verbindung
- anschließende katalytische Hydrierung, um das Tripeptid Arg-Gly-Asp zu erhalten.

18. Verfahren zur Herstellung der Tripeptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fest phasensynthese, wie in Beispiel 1 der Beschreibung be schrieben, durchgeführt wird.