JPH024716A - 合成ペプチドを含む細胞移動抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞付着性合成ペプチドに関し、更に詳細に
は、細胞移動の抑制に用いるその用途に関する。

フィブロネクチン、ビトロネクヂン、タイプエコラーゲ
ンなどの細胞外マトリックス成分と細胞との相互作用は
、一連の細胞表面レセプターによって仲介され、これら
レセプターがそれぞれの蛋白のアルギニン−グリシン−
アスパラギン酸（Ａｒｑ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｐ又はＲＧ
Ｄ）配列を特異的に認識することが明らかにされている
。このようなレセブーーリガンド相互作用は、細胞の秩
序正しい移動及び分化、進化中の組織、並びに正常な細
胞ＩＨＩの相互作用の維持にとって重要なものである。

Ａｒｇ−Ｇ　ｌ　’ｊ−Ａｓｐ配列を含む合成ペプチド
は、付着性蛋白と競合してそのレセプターに結合するこ
とができ、従って正常１飽あるいは腫瘍細胞がそれに対
応する基質上に結合するのを阻止することができる。

時として、正常細胞での相互作用が阻害されて、転移な
どの有害なｉ胞移仙が起こることがある。

転移プロセスは一連の複雑な工程から成り立っており、
その詳細についてはあまり知られていない。転移性の腫
瘍細胞については、腫瘍細胞が組織を区分としている細
胞外マトリックスに結合してマトリックスに浸透して行
くと考えられている。

このような細胞外マトリックスは、例えばフィブロネク
チン、アミニン、コラーゲン、プロテオグリカンなどの
高分子化合物で構成されている。細胞外マトリックスと
細胞との相互作用は細胞表面レセプターを介して起こり
、このようなレセプターはＲＧＤを含む配列を認識して
それに特異的に結合する。

望ましくない細胞が細胞外マトリックスに結合し浸透し
て行くのを抑制することのできる組成物を開発する必要
性がある。本発明は、このような必要性に答えるもので
あり、またそれに関連した各種の利点を提供するもので
ある。

発明の要旨 本発明は、細胞特に悪性細胞が細胞外膜と細胞との境界
面に接触して細胞外膜を通過して浸入するのをΔｒＱ−
ＧＪ！Ｖ−Ａｓｐ含有ペプチドを用いて抑制する方法及
びそれに用いる薬学的組成物を提供するものである。１
つの態様によれば、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−
Ａｓｐ−”ｒｈ　ｒを含有するペプチドが提供され、よ
り具体的には、ペプチドＧｌ　ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−
Ａｓｐ−Ｔ’ｈｒ−Ｐｒｏが提供され、このペプチドは
、細胞がフィブロネクチン、ビトロネクチン更にはタイ
プＩコラーゲンに結合するのを抑制することができる。

また本発明によれば、ＨＵ胞がタイプエコラーゲンに結
合するのを抑制づ′る方法及びそれに用いる薬学的組成
物が提供される。このようなペプチドは細胞環境におい
て分解しないように安定化されているのが望ましい。ペ
プチドを糖ポリマーにコンジュゲートすることによって
安定化を図ることができる。更に本発明によれば、細胞
が羊膜などの細胞外膜に浸透するのを阻止するのに必要
な上記ペプチドの憬をｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定して、細
胞の浸入特性を宙吊するアッセイ法が提供される。

図面の説明 第１図は、ＭＩＣ８浸入系を用いて腫瘍細胞の浸入に及
ぼすＡｒＣ１−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ａｓｐ含有ペプチドの効果
を示すグラフである。７２時間で低チャンバ一部に蓄積
する細胞数を用いて浸入特性を計算した。それぞれの時
点での９つの測定値から得られるデータを用いて、非抑
制コントロ−ル値１００％をセットした。平均値及び標
準偏差は、コントロールに対するＩＩ！瘍細脳細胞入特
性をパーセントで示したものである。

第２図は、羊膜に侵入する腫瘍細胞を示す写真である。

細胞を蛍光色素でラベル化し、Ｇｌｙ−ＡｒＣＩ−Ｇ　
ｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ｇｊ！ｕ−８ｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＥ
ＳＰ、写真Ａ）あるいは、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｙ−
Ａｓｐ−ＴｈｒＰｒｏ　（ＧＲＧＤＴＰ、写真Ｂ）の存
在下で７２時間羊膜に侵入させた。侵入中の細胞の位匠
を、羊膜を切り出して蛍光顕微鏡で調べた。羊膜の基底
膜表面（上の矢印）及び低部間質表面（下の矢印）を示
した。

梵１１１１の詳細な記述 本発明は、Ａｒａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｐ含有ペプチドに
より、細胞外膜を通って細胞が侵入するのを抑制ザる方
法及びそれに用いる薬学的組成物に関する。この抑制効
果は濃度依存性を有し、毒性をボさず、またマｌ〜リツ
クス付着性レセプターとペプチドとの相互作用及び細胞
の侵入特性とペプチドとの相互作用と関連している。本
明細書においては、全てのペプチドを、例えばＵ、Ｓ、
Ｐａｔ、Ｎｏ、　４　。

５７８．０７９に詳細に記載されているように、３文字
略号もしくは１文字記号で表わす。

細胞が羊膜などの膜を通って移動するためには、一連の
工程を経る必要がある。最初に、ｍ胞は基底膜に結合し
なければならない。この工程は１ｎｖｉｖｏ及びｉｎ　
ｖｉｔｒｏ侵入系で重要な工程である。アミノ酸配列Ａ
ｒｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｐを含有するペプチドは、腫瘍
細胞が基底膜に結合するのをほんのわずかしか抑制する
ことができず、細胞が一旦基底膜に結合した後では細胞
を基底膜から離すことはできない。次いで、細胞は、膜
の間質部分に浸透してそこを通過しなければならない。

間質部分は、羊膜の場合には膜の厚さの約４１５に相当
する。ＡｒＧ−Ｇｊ２Ｖ−Ａｓｐ含有ペプチドハ、侵入
工程のこのステップを抑制すると考えられる。

この考えは、細胞外マトリックスは付着性蛋白フィブロ
ネクチンとタイプ１］ラーゲンを含んでおり、これらに
細胞が結合するのをＡｒｑ−ＧｌｙＡｓｐ含有ペプチド
が抑制しその抑制効果が最も大ぎいと言う事実と符合し
ている。

本発明は、腫瘍細胞の膜侵入を抑制するのに特に有効な
特定のＡｒ（７−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを提供す
るものである。このようなペプチドとしては、アミノ酸
配列Ａｒｑ−Ｇｌｙ−△ｓｐＴ　ｈ　ｒを含むペプチド
、より特定的にはアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ１〕ｒＯを含むペプチドが挙げられる
。このようなペプチドは、細胞の膜侵入を抑制する能力
が損なわれず、更には天然ペプチドと同一とならない限
り、そのアミン末端もしくはカルボキシ末端に他の秤々
のアミノ酸あるいは化学分子部分が結合していてもよい
。

本発明で用いる合成ペプチドの長さは、その溶解性によ
って制限を受ける。即ち、アミノ酸残基約３０個以上に
なるとペプチドの溶解性が減少して、本発明に用いるこ
とができなくなる。ペプチドのアミノ酸の数は約３０個
未満が好ましく、４−１０個がより好ましく、５−８個
が更に好ましい。

これらのペプチドは、細胞内あるいはｉｎ　ｖｉｖ。

において早く分解されず又は除去されないにうに安定化
されているのが望ましい。このような安定化番よ、ペプ
チドを、糖ポリマー好ましくはデキス１−ランなどの有
機ポリマーにコンジュゲートすることによって達成でき
る。かかるポリマーの分子量は、得られるコンジュゲー
トの寿命が所望の寿命どなるような範囲で選択され、分
子量が大きくなればなるほどコンジュゲートの半減期は
長くなる。

本発明の細胞侵入の抑制方法は、１１１胞培養を行なう
際に細胞の架橋を防止するのに用いることができる。

更に本発明によれば、特定細胞の侵入特性もしくは浸入
性インデックスを定量するための１ｎＶｉｔｒＯアツセ
イ法が提供される。このアッセイ系は、羊膜などの細胞
外膜で分離された２つのチャンバー、即ち接種チャンバ
ーとターゲットチャンバーとを用いる。このいずれのチ
ャンバーも、細胞を維持するために適当な生育培地を含
ｌυでいる。

悪性細胞であることが疑われる１１１胞を、それが膜に
結合して浸透するに十分な時間接種チャンバー中に置く
。その後、いずれかのチャンバーあるいは両者のチャン
バーから生育培地を採取して、そこに存在する細胞を測
定する。ターゲットチャンバー中に細胞が存在すること
によって、細胞が膜から侵入できることが判る。

細胞が有する侵入性の程度を定量するために、Ａｒｏ−
ｃ＋、ｇｙ−△ｓｐ含有侵入抑制ペプチドの濃度を上昇
させながら接種チャンバーに加えて上記のアッセイを繰
返すことができる。このようなペプチドは、細胞をチャ
ンバーに加えると同時に加えることもでき、また好まし
くは、細胞が膜の間質部分に浸透して通りぬける特定の
時期にチャンバーに加えることもできる。特定の細胞が
侵入するのを抑制するのに必要なペプチドの濃度は、そ
の細胞の侵入性に関係しており、これによって侵入性イ
ンデックスが得られる。

本発明のアッセイ法は、腫瘍細胞の特性を評価するのに
有用であり、アッセイ法により得られる情報は、治療１
１５１１Ｉの決定、その追跡及び治療後の経過を知るの
に用いることができる。

Ａｒ（Ｊ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ａｓｐ含有ペプチド、Ｗに、生
体内で早く分解しないように安定化された該ペプチドは
、腫瘍１１１ｍが結合組織マトリックスに侵入するのを
阻止するのに有用である。生理学的に許容し得る担体と
ともに細胞の侵入を抑制するのに十分な吊でＡｒＣＪ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを提供する場合には、該ペ
プチドは腫瘍細胞の転移を阻止するのに用いることがで
きる。

本発明の合成ペプチドは、局所的に、あるいは静脈内、
腹腔内、皮肉などの非経口投与により投与することがで
きる。投与は通常の製剤の形態で投与することができ、
かかる製剤としては、例えば公知の溶液剤、乳化剤など
が挙げられる。これらの製剤には、必要に応じて、生理
学的に許容し得る担体、賦形剤、安定化剤などを含有さ
せることができる。このような製剤は、公知の方法によ
って製剤化することができる。

本発明の合成ペプチドの投与量は、投与対象者の症状、
体用、年令、投与ルートなどによって変動し得るが、通
常、生体中の合成ペプチドの濃度が１０ＩＭ〜１０ｍＭ
となるような投与量である。

以下に示す実施例により本発明をより明確に説明する。

しかしながらこれら実施例は本発明の範囲を限定するも
のではない。

実施例■ 合成ペプチドの調製 ペプチド自動シンセサイザー（モデル４３０Ａ：Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂ１０３ｙＳｔｅ１３．　ｒｏｓｔｅｒ　Ｃ
１ｔＶ　、　　（Ａ　）を用いて、製造業者の指針に従
ってペプチドを合成し、Ｂｉｏｑｅｌ　　ＴＳＫ　　５
Ｐ−５−ＰＷカチオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　　（
Ａ　）を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。

適当な場合には、以下のようにして環化させた。

合成ペプチド６１１１１４９を、あらかじめボイルし冷
却させた水４１に溶解した。ペプチドを加える直前に、
この水を４５分間窒素でバブルした。ペプチドを溶解し
た侵、黄色が５分間持続するようになるまで、シアン化
鉄カリウム Ｋ　　［Ｆｅ（ＣＮ）６］の０．１μ！？／ｆｆ１ｅ水
溶液を攪拌しながら滴下した（約５ｍ）。この操作期間
中は、Ｎ＋−１４ＯＨを加えてｐＨ値を７．０に維持し
た。次いで溶液を減圧下に２０時間放置し、そのＩ！凍
結乾燥した。環化した物質を５ｅｐｈａｄｅｘ　（：。

１５カラム（１，８Ｘ１２０ｃｍ＞に通して過剰のに３
　　［Ｆｅ　（ＣＮ）６　］を除いた。ｔ＋ａｔｅｒｓ
Ｂｏｎｄａｐａｋ　　Ｔ　　ＣＩＢカラム＜３Ｘ３０ａ
：　１０μｍバッキング）　　（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５
ｏｃ、、旧１ｆｏｒｄ、　ＨＡ）を用いた逆相ＨＰＬＣ
によりペプチドを精製した。

ペプチドをバッファーＡ（２Ｏｎ＋Ｈ？［！アンモニウ
ム１１７．５＞のカラムに付し、６０％アセトニトリル
と４０％バッファーＡからなる勾配で溶出した。０１８
カラムから得られる主要ピーク中には回収ペプチドの９
０％が含まれており、それは環化ペプチドモノマーであ
るとｌｉ［定された。その理由は、環化ペプチドモノマ
ーの場合に予想される時間、カラム中に保持されており
、また非環化物質及びペプチドポリマーがこの主要ピー
クからよく分離出来たためである。

テスト用に以下に示すペプチドを合成した。

Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−５ｅｒ−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−Ｐｅｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−５
ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＡｌａＧｌｙ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒ。

Ｈｅｎｄｒｉｘ　　ｅｔ　　ａｌ、　（１９８５）　Ｃ
ｌ１ｎ、　　Ｅｘｐ）１ｅｔａｓｔａｓｉｓ３　：　２
２１−２２３に記載された膜浸入カルチャーシステム（
ＭＩＣ８）の改良法を用いて腫瘍細胞の侵入性を測定し
た。この文献の記載を本明ＩＢ書に引用する。使用した
セルラインは、Ａ３７５Ｐ及びＡ３７５Ｍと命名された
２つのヒトメラノーマセルラインであり、これらの由来
及び転移特性はにｏｚｌｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｔ、、　
　（１９８４）　Ｊ。

Ｎ、Ｃ，Ｌ、７２　：　９１３に記載されている。また
、ａｏｏｄｍａｎとＮｅｗｏｒｅｃｎ（１９８５）　Ｅ
ＭＢＯ４：　２７６９に記載されたヒト多形膠芽腫セル
ライン（ＲｕＧｌｉ　）を用いた。コントロール細胞と
して、非侵入性の線維芽ｍ胞を用いた。全ての細胞は、
加熱不活性化１０％胎児ウシ血清（ＴｉｓｓｕｅＣｕｌ
ｔｕｒｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｔｕｌａｒｅ、
ＣＡ）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ　）を
添加したＤＭＥ（Ｇｉｂｃｏ、　Ｃｈａｇｒｉｎ　Ｆａ
ｌｌｓ、　Ｏｌ−１）中で培養した。

Ｃａ＋＋及びＭｑ＋＋を欠イタＰＢＳ中（７）２１１Ｍ
ＥＤＴＡを用いて培養皿から細胞を採取して全てのアッ
セイ用に供した。２％胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で
４８時間、細胞（５Ｘ１０４〜１Ｘ１０　個）を０，２
５μＣｉ　／ｅｆｔ１４Ｃ−チミジン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＨＡ）　
テラベル化し、次いで以下に示したようにして調製した
ｖｒｃｓチャンバーの上部に接種した。

出産時の新鮮なヒト胎盤を入手し、請書の近くの部分か
ら羊膜を取った。滅菌Ｐ　Ｂ　Ｓ　、　Ｆｕｎｇｉ−ｚ
ｏｎｅ／ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎ
ｅ。

５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｉｒｖｉｎｅ、　　（Ａ　）
更にＰＢＳで数回りシス後、Ｇｅｈｌｓｅｎと１ｌｅｎ
ｄｒｉｘ　、　　（１９８７）Ｐ＋ｇｍｅｎｔ　Ｃａ１
ｌ　１　：　１６−２１　、　Ｆｉす、１に記載されて
いるようにＭＩＣＳチャンバーに合うように羊膜を切り
取った。次いで、ＭＩＣ８装置のトッププレートとボト
ムプレートの間に、上皮表面がトッププレー１・側に向
くように羊膜をはさｌυだ。ねじを締め、次いで、メス
で余分な膜の部分を切り取った。羊膜をチャンバーにセ
ットする前に、底のウェル（ターゲットウェル）には、
１０％胎児ウシ血清を含む滅菌ＤＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ
　）を満たした。新たに調製した０、２５Ｍ水酸化アン
モニウム（Ｎｌ−１４０１−（）で５分間室温で処理し
、次いでＰＢＳでよく洗浄して羊膜の上皮を除いた。但
し、基底膜とその下にあるコラーゲン間質は残っていた
。この方法によって、宿主細胞の障害なしで、細胞と細
胞外マトリックスとの相互作用を調べることができる。

ラベル化細胞を、終濃度１．０Ｘ１０５／ｍ１で、ＭＩ
ＣＳチャンバーの上部もしくは接種チャンバー中の血清
含有ＤＭＥＭ中に加え、５％ＣＯ２及び９５％空気雰囲
気中で３７℃で湿気を帯びたインキュベーター中に置い
た。露出した基底膜表面を、０．２５Ｍシュクロースを
含むパーコールグラジェント中の浮遊密度１．０４９９
／ｉｆ！の密度マーカービーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌｓＰｉＳＣａｔａＷａｌ
／、　ＮＪ）とともに１時間インキュベートすることに
よって、全ての羊膜についてその漏出性を細胞接種前に
注意深く調べた。それぞれのセルラインの細胞と同じ密
度として測定される着色されたビーズがＭＩＣ８の底の
ウェル中に検出されｌこ場合には、膜のその部分は使用
しなかった。

基底膜及びその下のコラーゲン間質に侵入できる細胞の
数を、２４時間後及び７２時間後にそれぞれＭ［ＣＳチ
ャンバーのわきの部分から実験の進行を妨げることなく
底のウェル中の培地（１，１ｄ）を採取することによっ
て測定した。

それぞれのウェルからサンプリングした後には、新たな
培地をウェルに加えて元通りにした。このようにして、
各種のインターバルで同様の実験を行なって、腫瘍細胞
の侵入性を調べた。下のウェルから得た全てのサンプル
中の１４０−チミジンラベル化細胞をペレット化し、次
いでシンデレージョンバイアルに入れた。次いで、採取
した１４Ｃ。

ラベル化細胞を１Ｎ　　Ｎａ０１−１　０．５ｍｌ！ｒ
破壊した。１００ＩｉＡ氷酢酸のアリコートをそれぞれ
のバイアルに加えて化学ルミネセンスを妨ぎ、ＡＣＳシ
ンチレーションカクテル（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐｏ
ｒａ目ｏｎ　、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　ｌｌｅｉｇｈｔ
ｓ、　ＩＬ　）　１０ｍｉを加えた後、シンチレーショ
ンカランクー（Ｂｅｃｋｌａｎ　ｌｎｓｔｒｏｍｅｎｔ
ｓ　）を用いて放射活性を測定した。

ペプチドについて調べるため、７％ＣＯ２−空気雰囲気
中で３７℃でインキュベーションした後にペプチドを加
え、その後２４時間経過後に、チＡ７ンバーの上部と下
部の培地を新たなペプチド含イ４培地と交換した。ペプ
チドを加えた後、特定の時間経過侵に、上部と下部のチ
ャンバーから培地を採取し、膜を新鮮な培地で洗浄し、
この培地と洗浄フラクションとを遠心して、（ｑられる
細胞ベレット中のａ胞数を、液体シンチレーションによ
り放射活性を計測して求めた。膜を通過した細胞のトー
タル数は、先のサンプリングから得られた値に下部チャ
ンバー値を加えることにへよって得られた。いくつかの
実験では、非ラベル化細胞を用いて、細胞をヘモサイト
メーターでカウントした。

更に、羊膜に部分的に侵入して完全には侵入していない
細胞数も測定した。放射活性をカウントする前に、羊膜
を組織ソルビライザ−（Ａｍｅｒｓｈａｎ＋Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ　、　Ａｒ１１ｎａｔｏｎ　ｌｌｅｉｇｈ
ｔｓ、ＩＬ）中で処理した。

羊膜に接種したＡ３７５ＭＩ胞の７−９％、Ａ３７５Ｐ
細胞の３−５％、及びＲＬＪＧＩＩＩｍ胞の７−１２％
が７２時間で羊膜を通過した。ＡｒｑＧＩｙ−Ａｓｐ含
有ペプチドを存在させることによって、これら全てのセ
ルラインで著しい細胞の侵入減少が観察された。侵入の
抑制は測定した全ての時間で観察されたが、７２時間目
が最も顕著であった。このため、７２時間目を次の実験
で調べた。いくつかのＡｒ（Ｊ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ａｓｐ含
有ペプチド及びコントロールペプチドを用いて、Ａ３７
５Ｍ及びＲｕＧｊ！　ｉｌ［Ｉ胞にツイテテストシた結
果を第１図に示した。このデータから判るように、それ
ぞれのＡｒＣ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドが侵入を
抑制し、他方、アスパラギン酸がグルタミン酸に置換し
た］ン１−〇−ルベブチドは細胞結合アッセイでは不活
性であり、侵入の抑制効果を示さなかった。２番目のグ
リシンがＤ−アラニンに置換されたヘキサペプチドも活
性を示さなかった。

第１図に示した結果から、Ａｒｇ−ＧＩｙ−Ａ’３ｐ含
有付着性蛋白及びそのレセプターが、腫瘍細胞の侵入に
１つの役割を果していることが判る。抑制の程度差は、
配列に関係している。

Ｇｌｙ−八ｒ’　Ｑ　−Ａ　Ｓ　ｐ−Ｓ　ｅ　ｒ　−Ｐ
　ｒ　Ｏ及びＧ４！Ｖ−Ａｒｇ−ＧＩ　Ｖ−Ａｓｐ−Ａ
ＳｎＰｒｏとは異なって、Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉ
　ｙ　−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒペプチドはフィブロネク
チン及びビトロネクチンと同様にタイプ１コラーゲンに
細胞が結合するのを抑制し、ＭＩＣ３系でのテストでも
最も強い活性を示した。このことは、タイプ１コラーゲ
ンが侵入プロセスにおいである役割りを果していること
を示している。ＧｌｙＡｒＧ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−３
ｅｒ−ＰｒＯはフィブロネクチンにｌ胞が結合するのを
抑制するが、ビトロネクチンに結合するのを抑制せず、
またＧｌｙ−Ａｒｑ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒ
ｏと同様の活性を示す。一方、その環化ペプチドは主に
ビトロネクチンへの結合を抑制するが侵入を抑制する作
用は有していない。

実施例■ 浸入中の細胞の位置の視　化 羊膜に侵入中の細胞を視覚化するために、蛍光ラベル化
１１１ｉ１を実施例■と同様にしてＭＩＣＳチ′Ｓチン
バーの羊膜に接種した。ラベル化細胞は、非ラベル化細
胞と同様に効果的にｔ〉入し、Ｇｌｙ−Δｒｇ−Ｑｌ　
ｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏペプチドがこの浸入を抑制
した。羊膜の断面を蛍光顕微鏡で調べて［１１１の位置
を探した。コントロールペプチドであるＧ　Ｉ　Ｖ−Ａ
ｒｇ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏペプチドを
用いた実験では、羊膜に侵入中の各段階の細胞が観察さ
れたく第２Ａ図）が、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＧＪ！Ｖ−Ａｓ
ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏペプチドを用いた実験では１００個
以上の断面を調べても羊膜の間質中にある１１［１１１
１は観察されなかった。この場合、細胞は基底膜表面あ
るいはその直ぐ下に位置していた（第２８図）。

本発明を好ましい態様に基づいて説明したが、本発明の
範囲内で各種の改良が当業者によってなし得るものと考
えられる。従って、本発明は特許請求の範囲のみによっ
て限定されるにすぎない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、腫瘍細胞の浸入に及ぼすＡｒｇＧｌｙ−Ａｓ
ｐ含有ベブヂドの効果を示すグラフである。 第２図は、生物の形態を示す写真であり、具体的には、
羊膜に侵入する腫瘍細胞を示す写真である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有合成ペプチドを有効
   成分として含有する、細胞が細胞外膜を通して侵入する
   のを抑制するための薬学的組成物。
2. （２）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有合成ペプチドが、Ｒ
   ＿１−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ−Ｒ＿２（式中、Ｒ
   ＿１は１つもしくはそれ以上のアミノ酸、他の化学分子
   部分又は水素原子であり、ＸはＴｈｒ又は他のアミノ酸
   であり、Ｒ＿２は１つもしくはそれ以上のアミノ酸又は
   水酸基であり、但し、Ｒ＿１、Ｘ及びＲ＿２のいずれも
   が当該ペプチドの膜侵入抑制能を阻害するものではなく
   且つ当該ペプチドが天然ペプチドと同じになるようなも
   のではない）である請求項１記載の薬学的組成物。
3. （３）該ペプチドがＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
   Ｔｈｒ−Ｐｒｏである請求項２記載の薬学的組成物。
4. （４）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒを
   含有するペプチドを有効成分として含む、細胞がタイプ
   I コラーゲンに結合するのを抑制するための薬学的組
   成物。
5. （５）該ペプチドがＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
   Ｔｈｒ−Ｐｒｏである請求項４記載の薬学的組成物。
6. （６）セルラインの侵入特性を定量する方法であつて； ａ、細胞外膜によつて対応するターゲットチャンバーか
   ら分離されたいくつかのそれぞれの接種チャンバーに、
   セルラインから得た細胞サンプルを入れ、 ｂ、接種チャンバーに濃度を上昇させてＲＧＤ含有ペプ
   チドを加え、 ｃ、細胞が細胞外膜を通つて侵入するのに十分な時間、
   細胞を接種チャンバー中でインキベートし、 ｄ、それぞれのターゲットチャンバ中に存在する細胞数
   をカウントし、次いでｅ、ターゲットチャンバーに細胞
   が侵入するのを抑制するのに必要なＲＧＤ含有ペプチド
   の濃度を測定して、セルラインの侵入特性を求める、こ
   とからなる上記方法。
7. （７）細胞と細胞外膜とが接する境界領域に、Ａｒｇ−
   Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有合成ペプチドを接触せしめて、該細
   胞外膜を通して細胞が侵入するのを抑制する方法。
8. （８）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有合成ペプチドが、Ｒ
   ＿１−Ａｒｇ−Ｇ１ｙ−Ａｓｐ−Ｘ−Ｒ＿２（式中、Ｒ
   ＿１は１つもしくはそれ以上のアミノ酸、他の化学分子
   部分又は水素原子であり、ＸはＴｈｒ又は他のアミノ酸
   であり、Ｒ￥２は１つもしくはそれ以上のアミノ酸又は
   水酸基であり、但し、Ｒ＿１、Ｘ及びＲ＿２のいずれも
   が当該ペプチドの膜侵入抑制能を阻害するものではなく
   且つ当該ペプチドが天然ペプチドと同じになるようなも
   のではない）である請求項７記載の方法。
9. （９）該ペプチドがＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
   Ｔｈｒ−Ｐｒｏである請求項８記載の方法。
10. （１０）アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ
    を含有するペプチドを細胞と接触せしめて、該細胞がタ
    イプエコラーゲンに結合するのを抑制する方法。
11. （１１）ペプチドがＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
    Ｔｈｒ−Ｐｒｏである請求項１０記載の方法。