DE3712090C2 - - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Tripeptid Arg-Lys-Glu und dessen pharmazeutisch annehmbare Salze sowie ein dieses enthaltende Arzneimittel gemäß den Patentansprüchen. Das Arnei­ mittel weist insbesondere immunostimulierende Aktivität auf.

Das vorliegende Tripeptid eignet sich insbesondere als Arzneimittel zur therapeutischen Verwendung bei Krankheiten, die durch primären und sekundären Mangel des Immunsystems gekennzeichnet sind. Es ist befähigt, seine immunostimulierende Aktivität sowohl nach parenteraler wie nach oraler Verabreichung auszuüben.

Pharmazeutisch annehmbare Salze des vorliegenden Tripeptids sind insbesondere das Acetat, Trifluoracetat, Hydrochlorid und Sulfat.

Aus der US-PS 44 28 938 war zwar bereits ein ähnliches Tripeptid, nämlich Arg-Lys-Asp bekannt, demgegenüber sich jedoch das vorliegende Tripeptid durch eine signifikant bessere Aktivität hinsichtlich der IL-2-Produktion, der BCGF-Produktion und der Zellzyklusaktivität auszeichnet.

Im folgenden werden die Synthese des Tripeptids, seine chemischen Merkmale sowie seine biologischen Eigenschaften beschrie­ ben.

Herstellung von Arg-Lys-Glu

Die zur Synthese verwendeten Aminosäuren Arginin, Lysin und Glutaminsäure liegen jeweils in der L-Konfiguration vor.

εZ(Cl)  εOBe

(1) Boc-Lys-Glu-OBe

(Boc = t-Butyloxycarbonyl; OBe = Benzylester; Z(Cl) = p-Chlorbenzyloxycarbonyl).

εZ(Cl)

Boc-Lys (0,1 Mol), gelöst in Methylenchlorid und auf 0°C abgekühlt, wurde zu N-Methylmorpholin (0,1 Mol) zugegeben.

Die Lösung wurde auf -15°C ± 1° abgekühlt, Isobutylchlorformiat (0,1 Mol) wurde unter Rühren zugefügt, während die Temperatur bei -15°C gehalten wurde. Nach 15-minütigem Rühren der Reaktionsmischung bei dieser Temperatur wurde eine vorgekühlte Lösung von Glutaminsäure-dibenzylester-p-toluolsulfonat (0,1 Mol) und N-Methylmorpholin (NMM) (0,1 Mol) in Dimethylformamid langsam zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatlösung wurde mit Wasser, 1N-Chlorwasserstoffsäure, Wasser, 5% Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt ist syrupös. TLC (Dünnschichtchromatographie)- System : CHCl₃ : CH₃OH : Essigsäure (90 : 8 : 2); 95% rein: Ausbeute 80%.

Das unter (1) erhaltene Produkt wurde mit 50% Trifluoressigsäure (TFA)/Methylenchlorid-Mischung (1 : 1), 10 ml/g eine halbe Stunde zur Entfernung der Schutzgruppen behandelt. Es wurde unter vermindertem Druck eingedampft, (der Rückstand) mit Ether verrieben, filtriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet; Ausbeute 98%.

εZ(Cl) εOBe

(2) Das so erhaltene TFA-Lys-Glu-OBe wurde mit NMM neutralisiert und an Z3-Arg (Z3-Arg = Arg 3 × mit Benzyloxycarbonly substituiert.) in einer Dimethylformamid-Tetrahydrofuran- Mischung unter Verwendung von NMM und Isobutyl-Chlorformiat gekuppelt und wie in (1) aufgearbeitet. Ausbeute 60%; TLC-System: CHCl₃ : CH₃OH (92 : 8); ein Hauptpunkt.

Das obige Tripeptid wurde in Essigsäure/Wasser/Methanol-Mischung in Gegenwart von Pd/C bis zur Vollständigkeit hydriert.

Es wurde vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft.

Das Tripeptid-Produkt wurde durch Gegenstromverteilung unter Verwendung des N-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 5)-Systems gereinigt. Ausbeute 50%; TLC-System : Butanol : Essigsäure : Wasser : Pyridin (32 : 6 : 22 : 20); ein Hauptpunkt; HPLC (Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie) 97%.
Molekulargewicht 431,52;Optische Drehung: [α] = 5,13 (c = 1, Essigsäure).
Zur HPLC-Analyse:
Das Tripeptid wurde mit Hilfe von Ionenpaar-HPLC (ion-pairing HPLC) analysiert gemäß den im folgenden beschriebenen Trennungsbedingungen:
Elutionsmittel: NaH₂PO₄ 0,05 M; pH 4,3 + SDS (Natriumdodecylsulfat) 5 × 10^-4 M, CH₃OH; 50 : 50.
Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Wellenlänge der Detektion: 225 nm.
Injektionsvolumen: 20 µl.
Probe: 20 µg.
Säule: µ Bondapack C18 (Waters), 300 × 3,9 mm.

Folgende Apparaturen wurden verwendet:
Flüssigkeitschromatograph: SERIES 4 (Perkin Elmer).
Injektionsventil: Reodyne mod. 7125-075, mit einer 20 µl- Schleife.
Detektor: Spektrophotometer LC 95 (Perkin Elmer).
Rechen-Integrator: Data Station 3600 (Perkin Elmer).

Fig. 1 zeigt das HPLC-Profil des Tripeptids.

Das Tripeptid ist gegenüber der in vitro simulierten gastrischen Umgebung (Magenraum) resistent. In dieser Untersuchung wurde der simulierte gastrische (Magen) Saft USP XXI (USP XXI = United States Pharmacology XXI) (HCl + Pepsin) bei 37°C während 5 Stunden verwendet.

Biologische Aktivitäten 1.A. In vitro-Induktion von THY-1,2-Antigen

Die Fähigkeit von Arg-Lys-Glu in vitro die Differenzierung (Entwicklung) von Maus-T-Zellen-Vorläufern in Lymphocyten expremierende T-Zellen-Marker hervorzurufen, wurde durch Nachweisen der Induzierung von Thy-1,2-Membranantigen untersucht.
Material und Verfahren:
Es wurden 8 Wochen alte Mäuse (nu/nu) (= nackt) mit fehlender oder mangelhaft ausgebildeter Thymusdrüse, welche auf einem C3H/He-Untergrund, der unter speziellen pathogenfreien Bedingungen gehalten wurde, aufgezogen worden waren, verwendet.
Herstellung der Zellen:
Die Mäuse wurden durch zerivikale Dislokation getötet. Die Milzen wurden aseptisch entfernt und mit Pinzetten in HBSS (Hank's balanced salt solution; Gibco Ltd., Paisley, Schottland) fein zerkleinert. Die gewaschenen und in 199 Medium (Gibco Ltd.), ergänzt durch 1% BSA (Bovin-Serum-Albumim; Boehringer Mannheim) und Gentamycin (100 µg/ml), erneut suspendierten Zellen wurden 45 Minuten lang in äquilibrierten Nylonwollesäulen gemäß dem Verfahren von Julius et al. (Eur. J. Immunol. 3, 645, 1973) inkubiert.

Die ausfließenden Zellpopulationen angereichert mit Vorläufer-T- Zellen wurden in der biologischen Prüfung (Bioassay) verwendet.
Die biologische Prüfung wurde wie folgt durchgeführt (Induction Bioassay):
0,5 × 10⁶ ausfließende Zellen in 0,1 ml Medium wurden bei 37°C 18 Stunden lang mit 0,1 ml Tripeptid oder mit Medium alleine inkubiert. Die Kulturen wurden doppelt angesetzt. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen mit 0,87% Ammoniumchloridlösung gewaschen, um die roten Blutkörperchen zu lysieren und dann mit HBSS. Die Induktion (Auslösung der Bildung) von Membran-Thy 1,2-Antigen wurde durch den direkten Immunofluoreszenz- Versuch bestimmt.
Direkte Immunofluoreszenz:
Die Zellen wurden bei 4°C 20 Minuten lang mit mit Fluoreszein konjugiertem monoklonalem Antikörper (Bio-Yeda) bei einer Verdünnung von 1 : 200 inkubiert. Die Mischung wurde bei 300 g 5 Minuten lang zentrifugiert, zweimal in HBSS gewaschen und dann zur Zählung am Fluoreszenz-Mikroskop (Leitz Orthoplan) suspendiert. Der Unterschied in Prozenten von fluoreszierenden Zellen zwischen Kulturen mit und ohne Tripeptid ergab die induzierende (auslösende) Aktivität des Produkts.

Ergebnisse

Wie in der Tabelle gezeigt, induziert das Tripeptid das Erscheinen von Marker-Thy-1,2 an unreifen T-Zellen mit einer optimalen Empfindlichkeit bei 1 µg/ml. Die Kurve des Dosis- Empfindlichkeits-Verhältnisses ist glockenförmig, da sowohl niedrigere als auch höhere Konzentrationen des Peptids eine kleinere Induzierung hervorrufen.

1.B. In-vivo-Induktion von THY-1,2-Antigen

ELS1* wurde an 4 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, nach denen den Mäusen 24 Stunden Ruhe gewährt wurde. Dann wurden die Milzen entfernt, die Zellen wurden durch Fluoreszenz auf Expression von Thy 1,2-Antigen untersucht. Den Kontrollmäusen wurde Medium 199 (M 199) gegeben, dem Medium, in welchem das Arzneimittel gelöst wurde. Die Mäuse hatten ein durchschnittliches Gewicht von etwa 24 g.

Ergebnisse

Die Daten zeigen, daß das Tripeptid Arg-Lys-Glu fähig ist, die Reifung der Splenocyten sowohl nach oraler wie nach intraperitonealer Verabreichung zu induzieren.

Die optimale Dosis beträgt 2110 µg/kg, während mit höheren Dosen eine Plateau-Empfindlichkeit beobachtet wird.

2. In-vitro-Stimulation der Lymphokin-Erzeugung

Material und Verfahren
Herstellung von menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen (PBMC).
Peripheres Blut wird von gesunden freiwilligen Versuchspersonen durch Venenpunktion erhalten. Die roten Blutkörperchen werden von den weißen Blutkörperchen auf Ficoll-Hipaque-Gradienten abgetrennt. Die Crusta phlogistica bzw. der Leukozytenfilm (PBMC) wird entfernt und gewaschen und die Zellen werden in einer Menge von 1 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640, welches mit 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin und 1% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS, 56°C, 30 min) ergänzt ist, erneut suspendiert.
Herstellung des Wachstumsfaktors
PBMC in einer Menge von 1 × 10⁶ Zellen/ml in 1% Hitze-inaktiviertem FCS wird mit oder ohne Phytohämagglutinin (PHA) bei einer 0,75%igen Konzentration (Vol/Vol) inkubiert. Das zu untersuchende Peptid wird in einer Konzentration von 1 µg/ml geeigneten Kulturen zugefügt. Die Inkubationsdauer beträgt 18 bis 24 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre. Die Kulturen werden dann durch 0,22 mM/Filter filtriert und die Überstände auf Anwesenheit von Wachstumsfaktoren untersucht.
Messung der Wachstumsfaktoren in den Überständen

A. Versuchs-Zellen

Die B-Zellen, welche verwendet werden, um die Anwesenheit von B-Zell-Wachstumsfaktor (BCGF) zu prüfen, sind Langzeit-kultivierte Zellinien, gehalten auf BCGF und sind EBV (Ebbstein-Barr- virus)-negativ. Diese Zellen werden in Serum-freiem Medium unter Verwendung von Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemikalien) gezüchtet und sprechen nicht auf IL-2 (Interleukin-2) an.

Die T-Zellen, welche verwendet werden, um auf die Anwesenheit von IL-2 zu prüfen, werden frisch isoliert. Sie werden zuerst mit PHA (0,75%) angeregt und in Kultur wenigstens 10 Tage vor der Verwendung gehalten (um den Hintergrund zu vermindern und ihre Abhängigkeit von IL-2 zu begründen).

B. Herstellung von Versuchszellen zur Verwendung in der Prüfung (Assay)

• 1. Die B-Zellen werden gewöhnlich 4 Tage nach der letzten Fütterung mit BCGF verwendet. Sie werden viermal in RPMI 1640 gewaschen, um jegliches zurückgebliebene BCGF zu entfernen und auf eine Konzentration von 15 × 10⁴ Zellen/ml in RPMI 1640 und Nutridoma (bei 1% Endkonzentration) eingestellt.
• 2. T-Zellen werden vier Tage nach der letzten Fütterung mit IL-2 verwendet. Sie werden viermal gewaschen und auf 50 × 10⁴ Zellen/ml in RPMI 1640 mit 5% FCS eingestellt.

C. Prüfungsverfahren

• 1. Langzeit-kultivierte B-Zellen werden mit verschiedenen Konzentrationen von Überstand von PBMC-Kulturen in 96 Flachboden- Mikrotiterplatten inkubiert. Jede Quelle (well) bzw. Einbuchtung hat ein Gesamtvolumen von 200 µl, bestehend aus 100 µl B-Zellen (15 × 10³ Zellen) und 100 µl Überstand. Es wird die Wirksamkeit der B-Zellen untersucht, indem sie mit verschiedenen Konzentrationen gereinigten BCGF (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.) inkubiert werden.
  Die Kulturen werden 24 Stunden lang inkubiert, wonach 1 µCi [³H-Tdr] hinzugefügt und dann zusätzlich 12 Stunden inkubiert wird. Die Kulturen werden dann geerntet und in einem Scintillationszähler gezählt.
• 2. Die T-Zellen werden in flachbodigen-Quellen (Einbuchtungen) inkubiert. Das Gesamtvolumen in jeder Quelle beträgt 200 µl, welches 50 × 10³ T-Zellen/Quelle beinhaltet.
  Die Inkubationsdauer beträgt 72 Stunden, welche 12 Stunden Markierungsdauer mit [³H-Tdr] beinhalten.

Ergebnisse Wachstumsfaktor-Erzeugung

Versuch 1

BCGF Aktivität (C. P. M.=Zerfälle/Minute)

TCGF Aktivität (C. P. M.)

Versuch 2

BCGF Aktivität (C. P. M.)

TCGF Aktivität (C. P. M.)

1. Wirkung auf die RNA-Synthese

Die Wirkung von ELS1 auf die RNA-Synthese in menschlichen T-Zellen, wie durch Einverleibung (Markierung) von ³H-Uridin beobachtet; Zerfälle pro Minute (CPM). Nach 24 Stunden Inkubation erhaltene Ergebnisse.

T 3732    (T = T-Zellen)
T + PHA 20752

2. Wirkung auf die DNA-Synthese

Die Wirkung von ELS1 auf die DNA-Synthese in menschlichen T-Zellen, wie durch Einverleibung von ³H-Thymidin beobachtet; Zerfälle pro Minute (CPM). Nach 3 Tagen Inkubation erhaltene Ergebnisse.

T 154
T + PHA 6076

3. In-vitro-Vermehrung der Zellzahl

Das Tripeptid, welches entweder Kulturen von T-Lymphocyten oder Mischungen von T- und B-Lymphocyten jeden vierten Tag in einer Konzentration von 5 µg/ml während einer Zeitdauer von 30 Tagen zugegeben wurde, ist fähig, die Zellzahl mit einem Maximum von +50%, bezogen auf Kontroll-Kulturen, zu erhöhen, wobei zwischen Tag 10 und Tag 15 des Versuchs beobachtet wurde.

Toxikologische Untersuchungen

Akute Toxizität
Untersuchungen der akuten Toxizität, durchgeführt an Mäusen und Ratten, haben gezeigt, daß das Tripeptid bis zu einer Dosis von 1000 mg/kg intramuskulär (i. m.) gänzlich frei von toxischen Wirkungen ist.
Toleranz
Untersuchungen an Kaninchen und Mäusen haben gezeigt, daß das Produkt bei einer intravenösen (i. v.) bzw. intraperitonealen (i. p.) Dosis von 100 mg/kg keinerlei hämodynamischen Änderungen und Verhaltenswirkungen verursacht.
Insbesondere zeigt die durch Pentobarbital hervorgerufene Schlafzeit nur einen leichten Anstieg.
Allergie hervorrufende Aktivität
Das Produkt zeigt am Meerschweinchen bei einer intramuskulären (i. m.) Dosis von 100 mg/kg keinerlei Sensibilisierungs-Phänomene.

Die oben erwähnten Untersuchungen wurden mit Acetat-Salz des Tripeptids durchgeführt, jedoch ist es dem Stand der Technik wohl bekannt, daß ähnliche Ergebnisse unter Verwendung anderer Salze beispielsweise Trifluoracetat, Hydrochlorid oder Sulfat erhalten werden können.

Die immunopharmakologische Aktivität der Tripeptide Arg-Lys-Glu und Arg-Lys-Asp hinsichtlich ihrer Wirkung auf reife periphere menschliche T-Lymphozyten wurden in vitro untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den drei nachfolgenden Tabellen wiedergegeben. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß eine statistisch signifikante Wirkung von Arg-Lys-Glu bei beiden verwendeten Konzentrationen im Hinblick auf die Lymphokine-Produktion und die Zellteilung vorliegt. Im Gegensatz hierzu zeigt Arg-Lys-Asp bei den gleichen Konzentrationen lediglich eine geringe Tendenz in Richtung auf eine positive Reaktion bei beiden Versuchen, erreicht jedoch nicht einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontroll- bzw. Vergleichswerten.

IL-2-Produktion

Der Versuch wurde an Nylonwolle-gereinigten menschlichen T-Lymphozyten unter Zugabe von IL-1 (25 Einheiten/ml) zu der Kultur als Ersatz für den Macroophagen-Bedarf durch­ geführt.

T-Zellen (1×10⁶ Zellen/ml) wurden mit PHA (0,5% Vol./Vol.) in Gegenwart bzw. Abwesenheit der Peptide inkubiert. Die Überstände wurden nach 24 Stunden geernetet, gefiltert und im Hinblick auf die Anwesenheit von IL-2-Aktivität untersucht, indem man sie bei einer Konzentration von 12,5% zu frisch hergestellten T-Lymphozyten zusetzte. Die proliferative Aktivität dieser Zellen, die von der Anwesentheit von IL-2 abhing, wurde durch Einbau von 3H-Thymidin untersucht.

Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse belegen die stärkere Wirksamkeit von Arg-Lys-Glu im Vergleich zu Arg-Lys-Asp bei beiden Konzentrationsniveaus.

BCGF-Produktion

Der Versuch wurde an Nylonwolle-gereinigten menschlichen T-Lymphozyten unter Zusatz von IL-1 (25 Einheiten/ml) zu der Kultur als Ersatz für den Macrophagen-Bedarf durchgeführt.

T-Zellen (1×10⁶ Zellen/ml) wurden mit PHA (0,5% Vol./Vol.) in Gegenwart bzw. Abwesenheit der Peptide inkubiert. Die Überstände wurden nach 72 Stunden geerntet, filtriert und auf die Anwesenheit von BCGF-Aktivität untersucht, indem man sie bei einer Konzentration von 12,5% zu langfristigen menschlichen B-Zellinien zugab.

Die proliferative Aktivität der Zellen, die von der Anwesenheit von BCGF abhing, wurde durch Einbau von 3H-Thymidin untersucht.

Die in der Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen die stärkere Wirksamkeit von Arg-Lys-Glu im Vergleich zu Arg-Lys-Asp bei beiden Konzentrationsniveaus.

Zellzyklusanalyse

Bei einer Konzentration von 1 mcg/ml wurden menschliche T-Zellen mit einer ohne Peptide 72 Stunden inkubiert, wonach die DNA mit Propidiumjodid gefärbt und die Zellen mit einem Cytofluorographen analysiert wurden.

Wie in der Tabelle gezeigt, führt Arg-Lys-Glu zu einem statistisch signifikanten Anstieg, ausgedrückt als Prozentanteil Zellen in der mitotischen Phase, wobei anstattdessen der Prozentanteil der verbliebenen Zellen abnahm.

Arg-Lys-Asp zeigt auch einen bestimmten Trend im Hinblick auf einen Anstieg der Zellteilungen, jedoch ist das Ergebnis statistisch nicht signifikant.

Schlußfolgerung

Im Hinblick auf das immunopharmakologische Profil dieser Tripeptide und die Stimulierung von reifen menschlichen T-Zellen können wir den Schluß ziehen, daß Arg-Lys-Glu weitaus aktiver ist als Arg-Lys-Asp.

Claims (2)

1. Arg-Lys-Glu und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.

2. Arzneimittel, enthaltend das Tripepitid nach Anspruch 1.