NL8700826A - Tripeptide met immunostimulerende werking. - Google Patents

Description

- 1 -

Tripeptide met immunostimulerende werking.

De uitvinding heeft betrekking op een tripeptide met immunostimulerende werking, dat bestaat uit L-Arg (arginine), L-Lys (lysine) en L-Glu (glutaminezuur) en de volgende structuur bezit: 5 Arg-Lys-Glu.

Het tripeptide kan worden gebruikt als geneesmiddel bij ziektes, die gekenmerkt zijn door deficiëntie van het immuunsysteem.

Het tripeptide is in staat tot het uitoefenen 10 van een immunostimulerende werking zowel na parenterale als orale toediening.

De uitvinding heeft tevens betrekking op farmaceutisch aanvaardbare zouten van het tripeptide, zoals acetaat, trifluoracetaat, hydrochloride, sulfaat.

15 In het onderstaande worden de eigenschappen en de synthese van het tripeptide nader toegelicht, en wordt de werking ervan aan de hand van proeven beschreven.

CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN

Molecuulgewicht: 431,52 — —20 20 Optische rotatie: / oc_/ = 5,13 (c = 1, azijnzuur) HPLC analyse:

Het tripeptide is geanalyseerd met behulp van ionen-parend HPLC volgens de hier beschreven scheidings- condities; 25 Eluent: NaH2P04 0,05 M pH 4,3 + SDS 5 x 10“4 M, MeOH; 50 : 50.

Volumestroomsnelheid: 1 ml/min Detectie: 225 nm Injectievolume: 20 μΐ 30 Monster: 20 pg

Kolom: u Bondapack C18 (waters), 300 x 3,9 mm

De volgende instrumentatie werd gebruikt:

Vloeistofchromatograaf: SERIES 4 (Perkin Elmer)

Injecteur: Reodyne mod.7125-075, met een 20 μΐ loop 35 Detector: spectrofotometer LC 95 (Perkin Elmer) 870982ο - 2 -

Computerintegrator: Data Station 3600 (Perkin Elmer)

In de tekening is het HPLC profiel getoond van het tripeptide.

BESTENDIGHEID TEGEN EEN IN VITRO GESIMULEERD 5 MAAGMILIEU

Het tripeptide is bestendig tegen in vitro gesimuleerd maagmilieu. Bij dit onderzoek werd gesimuleerd maagzuur USP XXI (HC1 + pepsine) gebruikt bij 37°C gedurende 5 uur.

10 SYNTHESE

Z(C1) OBe

Boc-Lys-Glu-OBe (1) Z(C1)

Boc-Lys (0,1 mol) opgelost in methyleenchloride 15 en gekoeld tot 0°C werd toegevoegd aan N-methylmorfoline (0/1 mol).

De oplossing werd gekoeld tot -15°C ±1, isobutyl-chloroformaat (0r1 mol) werd toegevoegd onder roeren, terwijl de temperatuur werd gehouden op -15°C. Na het 20 roeren van het reactiemengsel gedurende 15 minuten op deze temperatuur werd een voorgekoelde oplossing van glutamine-zuur-dibenzylester-p-tosylaat (0,1 mol) en N-methylmorfoline (NMM) (0,1 mol) in dimethylformamide langzaam toegevoegd en werd het reactiemengsel gedurende de 25 nacht geroerd. De oplosmiddelen werden verwijderd onder verminderde druk en het residu werd opgenomen in ethylacetaat. Het ethylacetaat werd gewassen met water, 1N-hydrochloorzuur, water, 5% natriumbicarbonaatoplossing en water. Het werd gedroogd over natriumsulfaat en het 30 oplosmiddel werd verwijderd onder verminderde druk. Het produkt was een stroop. TLC systeem CHCl3:MeOH:HOAc (90:8:2). 95% zuiver: opbrengst 80%.

(1) werd gedeblokkeerd met 50% trifluorazijnzuur-methyleenchloridemengsel (1:1), 10 ml per gram (gedurende 35 een half uur.

Het werd verdampt onder gereduceerde druk, getri-tureerd met ether, gefiltreerd, gewassen met ether en gedroogd in vacuum.

8700826 - 3 -

Opbrengst 98%.

Z(C1) OBe

Het TFA-Lys-Glu-OBe werd geneutraliseerd met NMM en gekoppeld aan Z3-Arg in dimethylformaide-tetra-5 hydrofuranmengsel onder gebruik making van NMM en iso- butylchloroformaat en opgewerkt zoals in (1).

Opbrengst 60%. TLC systeem CHC13:MeOH (92,:8).

Eén hoofdstip.

Het bovengenoemde tripeptide werd gehydrogeneerd 10 in azijnzuur-water-methanolmengsel in aanwezigheid van pd/c tot aan completering van de reactie. Het werd gefiltreerd van de katalysator en het filtraat werd verdampt in vacuum.

Het produkt, tripeptide, werd gezuiverd door 15 tegenstroomdistributie onder gebruik making van het systeem N-butanol: azijnzuur: water (4:1:5)

Opbrengst 50%. TLC systeem butanol: azijnzuur: water: pyridine (32:6:22:20). Eén hoofdstip. HPLC 97%.

BIOLOGISCHE WERKINGEN

20 IA. INDUCTIE VAN THY 1.2 ANTIGEEN IN VITRO

De capaciteit van Arg-Lys-Glu om in vitro de differentiatie te induceren van T-celprecursoren van muizen in lymfocyten aangevende T-celmerkers werd onderzocht door de inductie van Thy 1.2 membraanantigeen 25 aan te tonen.

MATERIAAL EN METHODEN

Muizen: men gebruikte 8 weken oude athymische (nu/nu) muizen, gefokt op C3H/He achtergrond, gehouden onder specifieke pathogeen-vrije condities.

30 PREPARATIE VAN DE CELLEN: De muizen werden gedood door cervicale dislocatie. De milten werden aseptisch verwijderd en fijn gemaakt met pincetten in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) (Gibco Ltd, Paisley, Schotland). Men incubeerde splenocyten, gewassen 35 en geresuspendeerd in 199 medium (Giboc Ltd), gesupple-menteerd met 1% BSA (Boehringer Mannheim) en gentamycine (100^g/ml) gedurende 45 minuten in in evenwicht gebrachte nylonwolkolommen volgens de methode van Julius e.a.

(Eur.J.Immunol. 3, 645, 1973). De effluentcelpopulaties, 40 verrijkt met precursor T cellen, werden gebruikt in de 8700326 - 4 - bioproeven.

INDUCTIEBIOPROEF: 0,5 x 106 effluentcellen in 0,1 ml medium werden geincubeerd bij 37°C gedurende 18 uur met 0,1 ml tripeptide of medium alleen. De kweken 5 werden gedaan in duplicaat. Aan het einde van de incubatie werden de cellen gewassen met 0,87% ammoniumchloride, teneinde lyse te veroorzaken van rode cellen, en vervolgens met HBSS.

De inductie van membraan Thy 1.2 antigeen werd 10 bepaald door een directe immunofluorescentieproef.

DIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE: de cellen werden geincubeerd bij 4°C gedurende 20 minuten met fluorescine-geconjugeerd monoclonaal antilichaam (Bio-Yeda) bij 1:200 verdunning. Het mengsel werd gecentrifugeerd bij 15 300 g gedurende 5 minuten, tweemaal gewassen in HBSS

en vervolgens gesuspendeerd voor tellen aan de fluor-escentiemicroscoop (Leitz Orthoplan). Het verschil in percentages fluorescerende cellen tussen de kweken met en zonder tripeptide gaf de inducerende werking van het 20 produkt..

RESULTATEN

Zoals getoond in de tabel induceert het tripeptide het verschijnen van de merker Thy 1.2 aan onrijpe T cellen met een optimale responsie bij 1 μg/ml.

25 De dosis-responsierelatiekromme is klokvormig, aangezien zowel hogere als lagere concentraties van het peptide een kleinere inductie veroorzaken.

PEPTIDE _% THY 1.2+CELLEN_ CONCENTRATIE (uq/ml) GEMIDDELD ± S.F. VERSCHIL_ 30 0 11+1,6 0,0001 19+1,2 +8 0,001 34 + 3,3 +23 0,01 44 ± 3,1 +33 0,1 50+1,2 +39 35 1 54 ±5,0 +43 10 45 ± 4,9 +34 20 40 + 1,2 +29 50 28 ± 4,5 +17 100 21+1,7 +10 40 200 16+ 2,4 + 5 87 0 01X6 - 5 - - IB IN VIVO INDUCTIE VAN THY 1.2 ANTIGEEN ELS1 werd toegediend op 4 opeenvolgende dagen, waarna men de muizen liet rusten gedurende 24 uur, en vervolgens werden de milten weggenomen en de cellen 5 onderzocht voor aangeven van het Thy 1.2 antigeen door fluorescentie. Aan de controlemuizen gaf men Medium 199 (M 199), het medium, waarin het geneesmiddel was opgelost.

De muizen hadden een gemiddeld gewicht van ongeveer* 24 g.

10 RESULTATEN

% THY 1.2+ CELLEN_

Oraal i.p.

Controle- 3% 5% ELS1 42 μg/kg 3% 6% 15 ELS1 ' 420 ^g/kg 5% 8% ELS1 1055 μg/kg 7% 12% · ELS1 2110 μg/kg 15% ' 18% ELS1 4220 μg/kg 14% 17% ELS1 8440 μg/kg 15% 16% 20 De gegevens tonen, dat ELS1 in staat is om het rijp worden te induceren van splenocyten zowel na orale als intraparenterale toediening.

De optimale dosis is 2110 μg/kg, terwijl bij hogere doseringen een plateauresponsie wordt waargenomen.

25 2. IN VITRO STIMULATIE VAN LYMPOKINEPRODURTIE

MATERIAAL EN METHODEN

BEREIDING VAN MONONUCLEAIRE CELLEN IN MENSELIJK

PERIFEER BLOED (PBMC)

Perifeer bloed werd verkregen van gezonde vrij-30 willigers door acerpunctie. De rode bloedcellen werden gescheiden van de witte cellen op Ficoll-Hipaque gradiënten.

De stollaag (buffy coat) (PBMC) werd verwijderd en ge- 6 wassen, en de cellen werden geresuspendeerd met 1 x 10 cellen/ml in RPMI 1640, gesupplementeerd met 1% peni-35 cilline/streptomycine, 1% glutamine en 1% warmte-gein-activeerd foetaal kalfsserum (FCS, 56°C, 30 min).

BEREIDING VAN GROEIFAKTOR 6 PBMC metl x 10 cellen/ml in 1% warmte-geinacti-veerd FCS werd geincubeerd met of zonder Phytohemagglutinine 40 (PHA) met een 0,75% concentratie v/v. Het te beproeven 8700326 A ' - 6 - peptide werd toegevoegd met de concentratie van 1 μg/ml aan geschikte kweken. De incubatieperiode bedroeg 18-24 uur bij 37°C in een vochtig gemaakte atmosfeer. De kweken werden vervolgens gefiltreerd door 0,22 mM filters en 5 de supernatanten werden onderzocht op aanwezigheid van groeifaktoren.

METING VAN GROEIFAKTOREN IN SUPERNATANTEN

A. Proefcellen

De B cellen, gebruikt voor het beproeven op de 10 aanwezigheid van B celgroeifaktor (BCGP) waren lange termijn gekweekte cellijnen, gehouden op BCGF, en waren EBV negatief. Deze cellen werden gekweekt in serumvrij medium onder gebruik making van Nutridoma (Boehringer, Mannheim Biochemicals), en reageerden niet op IL-2.

15 De T cellen, gebruikt voor het beproeven op de aanwezigheid van IL-2 waren vers geïsoleerd. Zij werden initieel gestimuleerd met PHA (0,75%) en in kweek gehouden gedurende tenminste 10 dagen voorafgaand aan het gebruik (teneinde achtergrond te reduceren en hun afhankelijk-20 heid van IL-2 in te stellen).

B. Bereiding van proefcellen voor gebruik bij proef» 1. B cellen werden gewoonlijk gebruilt 4 dagen na het laatste voeden met BCGF. Zij werden viermaal 25 gewassen in RPMI 1640 voor het verwijderen van enig overblijvend BCGF en geadjusteerd tot 15 x 10^ cellen/ml in RPMI 1640 en Nutridoma (met 1% eindconcentratie).

2. T cellen werden gebruikt 4 dagen na de laatste voeding met IL-2. Zij werden viermaal gewassen en 4 30 geadjusteerd tot 50 x 10 cellen/ml in RPMI 1640 met 5%. FCS.

C. Proefprocedures 1. Op lange termijn gekweekte B cellen werden geincubeerd met verschillende concentraties supernatant 35 van PBMC kweken, in 96 vlak bodemige microtiterplaten.

Elke kuil had een totaal volume van 200 μΐ, en bevatte 3 100 μΐ B cellen (15 x 10 cellen) en 100 μΐ supernatant. Onderzocht werd de werkzaamheid van de proef B cellen door deze te incuberen met verschillende concentraties ge-40 zuiverd BCGF (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.).

8700326 « si- - 7 -

De kweken werden geincubeerd gedurende 24 uur, —3 — waarna 1 pCi / H-Tdr_/ werd toegevoegd, en vervolgens verder geincubeerd gedurende 12 uur. De kweken werden vervolgens geoogst en geteld in een scintillatieteller.

5 2. T cellen werden geincubeerd in vlak-bodemige kuiltjes. Het totale volume in elk kuiltje bedroeg 3 200 μΐ, hetgeen inhoudt 50 x 10 T cellen/kuiltje. De incubatieperiode bedroeg 72 uur, hetgeen 12 uur labelleren met / ^ H-Tdr_/ inhield.

10 RESULTATEN

1) GROEIFAKTORPRODUKTIE

EXPERIMENT 1 BCGF ACTIVITEIT (C.P.M.) % Sup.

15 Supt. van 3,05 6,25 12,5 25 50 PBL + PHA 424 1026 '1674 3172 8392 PBL + PHA + ELS1 684 1658 2863 5600 7838 TCGF ACTIVITEIT (C.P.M.) % Sup.

20 PBL + PHA 542 192 224 564 1144 PBL + PHA + ELS1 624 438 1062 1926 3296 EXPERIMENT 2 BCGF ACTIVITEIT (C.P.M.) % Sup.

25 Supt. van 3,125 6,25 12,5 25 50 PBL + PHA 1369 2187 2894 4876 8104 PBL + PHA + ELS1 1586 2837 3994 7728 10886 TCGF ACTIVITEIT (C.P.M.) % Sup.

30 PBL + PHA 1482 3146 4322 7184 9012 PBL + PHA + ELS1 1908 4424 6480 9329 11656

3. EFFECT OP RNA SYNTHESE

Het effect van ELS1 op RNA synthese in menselijke T cellen, zoals waargenomen door incorporatie van 3 35 H -uridine. Tellingen per minuut (CPM). Resultaten verkregen na 24 uur incubatie.

T 3732 T + PHA 20752 879 0 32(3 - 8 - ELS1 Concentratie uq/ml 0,1 1 10 20 T + ELS1 5336 4868 5104 5272 T + ELS1 + PHA 32729 34966 34497 31764

5 · 4·. EFFECT OP DNA SYNTHESE

Het effect van ELS1 op DNA synthese in menselijke 3 cellen zoals waargenomen door incorporatie van H-thymidine. Tellingen per minuut (CPM).

Resultaten verkregen na 3 dagen incubatie.

10 T T54 T + PHA 6076 ELS1 Concentratie ug/ml 0,1 0,1 1 J_0_ T + ELS 1 262 242 196 240 15 T + ELS1 + PHA 5908 6810 7264 9560

5. IN VITRO TOENAME VAN AANTAL CELLEN

Het tripeptide, toegevoegd aan kweken van -of T lymfocyten of mengsels van T en B lymfocyten elke vierde dag bij een concentratie van 5 pg/ml voor een periode 20 van 30 dagen, is in staat-om het cellenaantal te verhogen met een maximum van +50% ten opzichte van controlekweken, waargenomen tussen dag 10 en dag 15 van het experiment. TOXICOLOGISCHE ONDERZOEKINGEN ACUTE TOXICITEIT

25 Acute toxiciteitonderzoekingen, uitgevoerd bij muizen en ratten, hebben aangetoond, dat tot aan een dosis van 1000 mg/kg i.m. het tripeptide totaal geen toxicische effecten vertoont.

TOLERANTIE

30 Onderzoekingen aan konijnen en muizen hebben aangetoond, dat het produkt, bij de dosering van 100 mg/kg respectievelijk i.v. en i.p. geen enkele hemodynamische modificatie en effect op het gedrag vertoont. In het bijzonder vertoonde de pentobarbital-geinduceerde 35 slaaptijd slechts een geringe toename.

ALLERGIE_INDUCERENDE WERKING Het produkt induceerde bij een dosering van 100 mg/kg i.m. geen enkel sensibiliseringsverschijnsel bij cavia's.

8700826 % - 9 - *

ZOUTEN VAN HET TRIPEPTIDE

De bovengenoemde onderzoekingen werden uitgevoerd met een acetaatzout van het tripeptide; het is de deskundige evenwel goed bekend, dat overeenkomstige resultaten 5 te verkrijgen zijn bij gebruik making van andere zouten, bijvoorbeeld trifluoracetaat, hydrochloride, sulfaat.

-conclusies- 87.0 0 8 26

Claims (5)

1. Tripeptide, bestaande uit L-Arg (arginine), L-Lys (lysine) en L-Glu (glutaminezuur) en met de volgende structuur: Arg-Lys-Glu.

2. Tripeptide volgens conclusie 1, gekenmerkt door een immunostimulerende werking.

3. Tripeptide volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat het is verwerkt voor therapeutische toepassing als geneesmiddel bij ziektes, die zich ken- 10 merken door primaire en secondaire deficiëntie van het immuunsysteem.

4. Tripeptide volgens conclusie 1, gekenmerkt door het uitoefenen van een immunostimulerende werking na zowel parenterale als orale toediening.

5. Geneesmiddel volgens conclusie 3, m e t het kenmerk, dat dit farmaceutisch aanvaardbare zouten bevat van het tripeptide volgens de voorgaande conclusies, zoals acetaat, trifluoracetaat, hydrochloride, sulfaat. 8700826