JPS62265300A - 免疫刺激活性を有するトリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は免疫刺激活性を有するトリペプチドに関する。

発明の概要 通常の溶液法によって合成されたトリペプチドＡｒｇ　
−Ｌｙｓ　−Ｇ　ｌｕおよびその塩は、未成熟Ｔ細胞の
成熟およびＴ細胞機能の両方に対し免疫刺激活性を示す
。

発明の詳説 く化学的特性〉 分子量：４３１．５２ 旋光度＝［α１０＝　５　、　’ｌ　３　（ｃ＝　１　
、酢酸）ＨＰＬＣ分析：以下に記載の分離条件に従い、
イオン・ベアリングＩ−（Ｐ　Ｉ、　Ｃによりトリペプ
チドを分析した。

溶離剤：　ＮａＨｔＰ０４０．０５Ｍ　ｐＦ−１４，３
＋５ＤＳ５ＸｌＯ−’Ｍ、ＭｅＯＩ＝ｌ；５０：５０流
速−１扉ｑ／分 検出・　２２５ｎｍ 注入容量：　２０μＣ 試料：２０ｕｇ カラム；Ｕボンダパック（Ｂｏｎｄａｐａｃｋ）Ｃ１８
（ウオターズ）、３（ｌｏｘ３．９ｍｍ 以下の測定法を用いた。

液体クロマトグラフィーニジリーズ（ＳＥｒ（ＩＥＳ）
４（パーキン・エルマー（Ｐ　ｅｒｋｉｎ　　Ｅ　１ｍ
ｅｒ））注入バルブ・レオダイン（Ｒｅｏｄｙｎｅ）モ
デル７【２５−０７５．２０ｕ（２ループ 検出器二分光光度計ＬＣ９５（パーキン・エルマー（Ｐ
　ｅｒｋｉｎ　　Ｅ　１ｍｅｒ））計算積分機：データ
・ステーション３６００（パーキン１エルマー） 添付の図面はトリペプチドのＨＰＬＣを示す。

イン・ビトロ模凝胃周囲に対する耐性 該トリペプチドはイン・ビトロ模擬胃周囲に耐性を示す
。この実験において、胃模擬汁ＵＳＰＸＸＩ（ＭＣＩ２
＋ペプシン）を３７℃で５時間用いた。

く合成〉 εＺ（Ｃｊ）　　５０Ｂｅ Ｂｏｃ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　Ｉｕ　−ε○Ｂｅ　　（１）
εＺ（ＣＩ２） Ｂｏａ　−Ｌｙｓ（０、１モル）を塩化メチレンに溶解
し、０℃に冷却し、Ｎ−メチルモルホリン（０，１モル
）に加えた。

溶液を−１５°Ｃ±１に冷却し、イソブチルクロロホル
メート（０，１モル）を撹拌下に一１５℃の温度に維持
しながら加えた。反応混合物をこの温度で１５分間撹拌
した後、ツメチルホルムアミド中グルタミン酸−ジベン
ジルエステル−ｐ−トルレート（０，１モル）およびＮ
−メチルモルホリン（ＮＭＭ）の予め冷却した溶液をゆ
っくり加え、反応混合物を一夜撹拌した。溶媒を減圧下
で除去し、残渣を酢酸エチル中にとった。酢酸エチルを
水、１Ｎ塩酸、５％重炭酸ナトリウム水溶液および水で
洗浄した。生成物はシロップである。ＴＬＣシステムＣ
ＨＣ（Ｌ：ＭｅＯＨ：ＨＯＡｃ（９０：８：２）。

純度９５％、収率８０％。

前記（１）を１ｇ当り５０％トリフルオロ酢酸−塩化メ
ヂレン混合物（１：１）１０ｘ１２で３０分間脱保護し
た。これを減圧下に蒸発させ、エーテルでトリチュレー
トし、濾過し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥させた
。収率９８％。

εＺ（ＣＱ）　　ε０Ｂｅ ＴＦＡ−Ｌｙｓ−−Ｇｌｕ−−ｓ　ＯＢｅ８ＮＭＭで中
和し、ジメチルホルムアミド−テトラヒドロフラン混合
物中Ｚ　３−Ａｒｇに、ＮＭＭおよびイソブチルクロロ
ホルメートを用いて結合させ、（１）と同様に処理した
。収率６０％。ＴＬＣシステムＣｌ−ＩＣＱ３：ＭｅＯ
Ｈ（９２：　８　）。１つの大きなスポット。

上記トリペプチドを酢酸−水メタノール混合物中、ｐｄ
／ｃの存在下にその完結まで水素添加さ仕た。これを触
媒から濾過し、濾液を真空下に蒸発させた。

生成物、トリペプチドをＮ−ブタノール：酢酸：収率５
０％。ＴＬＣシステム−ブタノール：酢酸；水：ピリジ
ン（３２−６：２２：２０）。１つの大きなスポット。

１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ９７％。

〈生物学的活性〉 にＡ　　ＴＨＹｌ、２抗原のイン・ビトロ誘発リンパ球
発現Ｔ細胞マーカーへのマウスＴ細胞前駆体の分化をイ
ン・ビトロで誘発するＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕの能力を
Ｔｈｙ膜抗原の誘発を立証することでテストした。

物質および方法 マウス・特定の病原菌非存在条件下に推持されたＣ３Ｈ
／Ｈｅ環境上で交配された８退会の無胸腺症（ｎｕ／ｎ
ｕ）マウスを用いた。

細胞の調製：マウスを頚部脱臼で殺した。肺臓細胞を無
菌状態で取り出し、最後にバンクの平衡塩溶液（ＨＢＳ
ＳＸギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社、パイスリー）、スコツト
ランド）中、ビンセットで細かくした。肺臓細胞を洗浄
し、１％ＢＳＡ（ボエリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびゲンタマイシ
ン１００μ９／ＩＩ（ｌを補足した１９９培地（キブコ
社）中に再＠濁させ、ノユリウス（Ｊｕｌｉｕｓ）らの
方法［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ
（Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ）　３．６
４５．１９７３］に従い平衡ナイロンウールカラム中で
４５分間インキュベートした。前駆体Ｔ細胞が富化した
流出（ｅｆ「１ｕｅｎｔ）細胞群をバイオアッセイに用
いた。

誘発バイオアッセイ・　０．ＩｍＱの培地中０．５ｘ１
０６流出細胞をＯ、Ｉ　ｍＱのトリペプチドと共にまた
は培地単独で、３７°ＣＩ８時間インキュベートした。

培養を２回行った。インキュベーションの終了時におい
て、細胞を０．８７％塩化アンモニウムで洗浄して赤血
球を溶解し、ついでＨＢＳＳで、先生した。

膜Ｔｈｙ１．２抗原の誘発は直接免疫けい先決で測定し
た。

直接免疫けい光性、細胞をフルオロレスセイン結合モノ
クロナール抗体［バイオーイエダ（Ｂ　ｉ。

−Ｙｅｄａ））と共にＩ　：２００の希釈比で、４°Ｃ
にて２０分間インキュベートした。混合物を３００９で
５分間遠心分離し、）ＩＢＳＳで２回洗浄し、ついで懸
局させて、けい光顕微鏡（ライブ・オルソブラン（Ｌ　
ｅｉｔｚ　　Ｏｒｔｈｏｐｌａｎ））で計数した。トリ
ペプチドを含む培養物と含まない培養物の間のけい先住
細胞の割合の差によって、生産物の誘発活性が得られる
。

第１表に示すように、トリペプチドはｌμｇ／ｍＱ。

における最適応答で未成熟Ｔ細胞に対するマーカー’ｒ
ｈｙｔ、２の外観を誘発する。用量一応答の相関曲線は
、該ペプチドの低濃度および高濃度の両方においてより
小さい誘発が誘導されるような、ベル形である。

結果を第１表に示す。

第１表 ペプチド　　　　　　　　　　％ＴＩＩＹ　１．２＋細
胞濃度（μｇ／ｍｌ）　　　平均＋／−９Ｅ　　　　　
差異ＯＩｔ　＋／−ｔ、ａ　　　　　　　　−０，００
０１１９＋／−１，２＋　　８０．００１　　　　　　
３４　＋／−３，３＋　２３０．０１　　　　　　４４
　＋／−３，１＋　３３０．１　　　　　５０　＋／−
１，２＋３９１　　　　　　　　５４　＋／−５，０＋
　４３１０　　　　　　　４５　＋／−４，９＋　３４
２０　　　　　　　４０　＋／−１，２，＋　２９５０
２８÷／−４５±１７ １００　　　　　　　２１　＋／−１，７＋　Ｈ２Ｏ０
１６＋／−２，４＋　　５ にＢ　　ＴＨＹｌ、２抗原のイン・ピボ誘発ＥＬＳＩを
４日間連続して投与し、この後マウスにて２４時間休息
を与え、ついで肺臓を採取し、細胞をけい先決によりＴ
ｈｙｌ、２抗原の発現について凋へた。対照マウスには
薬剤を溶解した培地１９９（Ｍ１９９）を与えた。マウ
スの平均体重は約２４ｇであった。

結果を第２表に示す。

第２表 ％　Ｔ）ＩＹ　１．２＋細胞 経口　　　　　　ｉｐ。

対照　　　　　　　　　　３％　　　　　　　　　　５
％ＥＬＳＩ　　　　　４２μｇ／ｋｇ　　　　　３％　
　　　　　　　　　６％ＥＬＳＩ　　　　４２０μｇ／
ｋｇ　　　　　５％　　　　　　　　　　８％ＥＬＳＩ
　　　１０５５μｇ／ｋｇ　　　　　７％　　　　　　
　　１２５ＥＬＳＩ　　　２１１０μｇ／ｋｇ　　　　
１５％　　　　　　　　１８％ＥＬＳＩ　　　　４２２
０　μｓ／ｋｇ　　　　　１４％　　　　　　　　　　
　１０ＥＬＳＩ　　　８４４０μｇ／ｋｇ　　　　１５
％　　　　　　　　１６％データによれば、Ｅ　Ｌ　Ｓ
　ｌ　（Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇ　Ｉｕ）は経口および
腹腔内投与の両方の後陣細胞の成熟を誘発てきることが
判明した。

最適投与１は２１１Ｏμ９／に９である一方、投与ｍを
多くすればプラト一応答が観察される。

２　リンホカイン生産物のイン・ビトロ刺激物質および
方法 ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製末梢神経を静
脈穿刺により健康な献血者から得る。赤血球を白血球か
らフィコール・ハイパキュー　（Ｆ　１ｃａｌｌ　−Ｈ
１ｐａｑｕｅ）勾配で分離する。軟層（ＰＢＭＣ）を除
去し、洗浄し、細胞をｒｌＰＭＩ１６４０中に、１×１
０６細胞／肩Ｑで再懸澗し、１％ペニンリン／ストレプ
トマイシン、１％グルタミンおよび１％熱不活化インキ
ュベート胎児ウノ血清（ＦＣ９１５６℃、３０分）を補
足する。

成長因子の調製 １％熱不活化ＦＣＳ中ＰＢＭＣ１ｘ　Ｉ　Ｏ’細胞／ｙ
Ｑを０．７５％濃度（Ｖ／Ｖ）のフィトヘムアグルチニ
ン（ＰＨＡ）を用いるかまたは用いないでインキュベー
トする。テストされろペプチドを濃度１μ９／屑σで適
当な培地に加える。インキュベーション期間は湿潤雰囲
気中、３７°Ｃで１８〜２４時間である。培養細胞を０
．２２゜ｙＭのフィルターに通してろ過し、上澄液を成
長因子の存在について調べる。

上澄液中の成長因子の測定 Ａ、テスト細胞 Ｂ細胞成長因子（ＢＣＧＦ）の存在のテストに使用され
るＢ細胞はＢＣＧＦ上に維持された長期間培養セルライ
ンであり、およびＥＢＶネガティブ（ｎｅｇａｔ　１ｖ
ｅ）である。これらの細胞を血清非含有培地の中で、ニ
ュートリドマ（Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ）（ベーリンガー・
マンハイム・バイオケミカルズ）を用いて増殖させたが
、［Ｌ−２に対し応答しない。

ＩＬ−２の存在のテストに使用されるＴ細胞を新鮮な状
態で単離する。これらを、まず０．７５％Ｐ　ＨＡて刺
激し、基底値を減少させ、かつｔＬ−２の依存性を確立
するために使用前に少なくとも１０８間培地中に推持す
る。

Ｂ　アッセイに用いるテスト細胞の調製■ＢＣＧＦの最
後の供給後４日のＢ細胞を通常使用する。これらをＲＰ
Ｍ１１６４０で４回洗浄して残存するいずれのＢＣＧＦ
をら除去し、ＲＰＭｌ１６４０およびニュートリドラ中
、１５×ＩＯ“細胞ＩＭＱに調整する（最終濃度１％）
。

■ＩＬ−２の最後の供給後・１日のＴｆ（ｌＩ胞を用い
ろ。これらを４回洗浄し、５％Ｆ’Ｃ９含有ＲＰＭ１１
６　ｌＩ　Ｏ中、５０ＸＩＯ’細胞／ＷＱ、に調製する
。

Ｃアッセイ手順 ■長期間培１１３細胞を９６平底マイクロタイター・プ
レートを用い種々の濃度の、ＰＢＭＣ培養の上澄液とイ
ンキュベートする。各ウェルは１００μσのＢ細胞（１
５ｘ１０３細胞）および１００μｇの上澄液を含み、総
容量２００μＱである。本発明者らは、本発明者らのＢ
細胞の効力について、それらを種々の濃度の精製ＢＣＧ
Ｆ（セルラー・プロダクト（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）社、バッファロー、Ｎ、Ｙ、）とインキュ
ベートすることで、調べた。

培養物を２４時間インキュベートし、この後ｌμＣｉの
Ｃ３Ｈ−Ｔ　ｄｒ］を添加し、ついで付加的に１２時間
インキュベートする。ついで、培養物を収穫し、シンチ
レーション・カウンターで計数する。

■Ｔ細胞を平底ウェル中でインキュベートする。

各ウェルの総容量は２００μＱで、５０ＸＩ０３のＴ細
胞／ウェルを含む。インキュベーション期間は１２時間
の［’Ｈ−Ｔｄｒ３のラベル化を含み、７２時間である
。

結果 成長因子生産 実験　Ｉ ＢＣＧＦ　　活性（Ｃ，Ｐ、Ｍ、） ％　上清 上Ｉｆ？３．Ｑ５　６．２５　１２．５　２５　　５０
ＰＢＬ＋ＰＩＩＡ　　　　４２４　１０２６　１６７４
　３１７２　８３９２ＰＢＬ＋ＰＩＩＡ＋ＥＬＳ１　　
６８４　　　１６５ｇ　　　　２８６３　　５６００　
　７８３１１！ＴＣＧＦ　　活性（Ｃ，Ｐ、Ｍ、） ％　上清 ＰＢＬ＋ｐＨＡ　　　　５４２　１９２　　２２４　５
６４　１１４４ＰＢＬ＋ＰＩＩＡ＋ＥＬＳ１　　６２４
　　　４３８　　　　１０６２　　１９２６　　３２９
６実験　２ ＢＣＧＦ　　活性（Ｃ，Ｐ、Ｍ、） ％　上清 上清　　　　３．１２５　６．２５　１２．５　２５　
　５０ＰＢＬ＋ＰＩＩＡ　　　　１３６９　２１ｇ７　
２８９４　４８７６　８１０４ＰＢＬ＋Ｐ）ｌＡ＋ＥＬ
ｓｌ　　　１５８６　　２８３７　　　３９９４　　７
７２８　　１０８８６ＴＣＧＦ　　活性（Ｃ，Ｐ、Ｍ、
） ％　上清 ＰＢＬ＋ＰＨＡ　　　　１４８２　３１４６　４３２２
　７１８４　９０１２ｒ’ＢＬ＋ＰＩＩＡ＋ＥＬｓｌ　
　１９０８　４４２４　　６４８０　９３２９　１１６
５６■ＲＮＡ合成に対する効果 ３Ｈ−ウリジンの取り込みによって観察されるような、
ヒトＴ細胞におけるＲＮＡ合成に対するＥＬＳ　ｌの効
果、１分当りのカウント数（ＣＰ　Ｍ）結果は２４時間
のインキュヘーソヨン後に得た。

Ｔ　　　　　　　３７３２ Ｔ＋ＰＨＡ　　２０７５２ ＥＬＳ　１度（μｇ／ｍＱ） ０．１［則　　　岨 Ｔ＋ＥＬＳｌ　　　　　５３３６　　４８６８　　５１
０４　　５２７２Ｔ＋ＥＬＳｌ＋Ｐ）ＩＡ　　３２７２
９　３４９６６　３４４９７　３１７６４■ＤＮＡ合成
に対する効果 ’Ｈ−チミノンの取り込みによって観察されるような、
ヒトＴ細胞におけるＤＮＡ合成に対するＥＬＳ　１の効
果、１分当りのカウント数（ＣＰ　Ｍ）結果は３日間の
インキュベーション後に得た。

Ｔ　　　　　　　　　１５４ Ｔ＋ＰＨＡ　　　６０７６ ＥＬＳＩ濃度Ｃｕ　９／１ｎＱ） ０．０１　　０．１　　１　　　　埠 Ｔ＋ＥＬＳ１　　　　２６２　　２４２　　１９６　　
２４０Ｔ＋ＥＬＳ１＋ＰＩＩＡ　　　５９０ｇ　　　６
８１０　　７２６４　　９５６０■細胞数のイン・ヒド
ロの増加 ３０日間、５μ９／２Ｑの濃度で４日ごと（こ′ｒリン
パ球またはＴおよびＢリンパ球の混合物のいずれかの培
地にトリペプチドを加えると、実験の第１０日と１５日
の間に観察されるように対照培地に対し、最大＋５０％
で細胞数を増加させることができる。

毒性実験 急性毒性 マウスおよびラットに対し行った急性毒性の実験によれ
ば、ｌ　ＯＯＯｙ９／ｋｇの用量（筋肉内）まで該トリ
ペプチドが毒性作用を全く示さないことが証明された。

耐性 ウサギおよびマウスに対する実験によれば、該生成物は
静脈内または腹腔内容々１００：ｎ９／に９の投与量で
、いずれの血行力学的変化および行動的効果をも引き起
こさなかった。特に、ベントハルビタールー誘発睡眠時
間は、わずかな増加だけか示された。

アレルギー誘発活性 該生成物は、ｌ　ＯＯｍｇ／　ｋｇの用量（筋肉内）で
モルモットにおいていずれの感作症状ら誘発しなかった
。

該ペプチドの塩 前記実験はトリペプチドの酢酸塩で行ったか、当該分野
では同様な結果が、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩および
硫酸塩のような他の塩を用いろことにより得ることか理
解できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のトリペプチドの高速液体クロマドグラ
フィーの測定結果を示す図である。 特許出願人　エルム・インズストリア・ファルマヂエウ
ティヵ・ソヂエタ・ベル・アヂ才一二 代　理　人　弁理士　青　山　葆　ほか１名Ｆｉｇ、１ 卯Ｖ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ で示される構造式を有するＬ−Ａｒｇ（アルギニン）、
   Ｌ−Ｌｙｓ（リジン）およびＬ−Ｇｌｕ（グルタミン酸
   ）からなるトリペプチド。 ２、免疫刺激活性を有する特許請求の範囲第１項記載の
   トリペプチド。 ３、免疫システムの一次および二次欠陥によって特徴付
   けられる疾患において薬剤として治療的用途が可能な特
   許請求の範囲第１項記載のトリペプチド。 ４、非経口および経口の両方の投与後に免疫刺激活性を
   発揮しうる特許請求の範囲第１項記載のトリペプチド。 ５、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩また
   は硫酸塩のような、特許請求の範囲第３項記載の薬剤と
   して治療的用途が可能なトリペプチドの医薬上許容され
   る塩。