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TRIPEPTIDE A ACTIVITE IMMUNOSTIMULANTE CARACTERISTIQUESCHIMIQUES
EMI1.1
POIDS MOLECULAIRE : 431, 52 20 ROTATION OPTIQUE : (d) 20 = 5, 13. (c = 1, acide acetique) D ANALYSE HPLC : Le tripeptide a été analysé par HPLC par appariement d'ions en utilisant les conditions de séparation décrites ci-après.
Eluant: NaH2PO4 0.05 M pH 4, 3 + SDS 5 x 10-4 M, MeOH; 50:50.
Débit : 1 mJ/min.
Détection: 225 nm Volume d'injection : 20 mcl Echantillon : 2 mcg Colonne : u Bondapack C18 (eaux), 300 x 3, 9 mm On utilise l'appareillage suivant : Chromatographe à liquide : SERIES 4 (Perkin Elmer) Clapets d'injection : Reodyne mod. 7125-075 à boucle de 20 l
EMI1.2
Detecteur : Spectrophotometre LC 95 (Per kin E1mer) Intégrateur de calcul : Data station 3600 (Perkin Elmer) La figure représente le profil HPLC du tripeptide.
RESISTANCE AU MILIEU GASTRIQUE SIMULE IN VITRO Le tripeptide résiste au milieu gastrique simulé in vitro. Dans cette étude, le suc gastrique simulé USP XXI C1 + pepsine) a été utilise pendant 5 heures à 37'C.
SYNTHESE
EMI1.3
4 Z (C1) ODe & Z < C1) OBe .]' Boc-Lys-Glu-OBe (1) Z (Cl) I On a ajouté du Boc-Lys (0, 1 mole) dissous dans du chlorure de méthylène
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et refroidi à O' CX a de la N-Methylmorpholine (0, 1 mole).
La solution a été refroidie a-J5*C + l et du chloroformiate d'iso- butyl (0, 1 mol. ) a été ajouté avec agitation, en maintenant la tempe- rature à -15. C. Après agitation du mélange réactionnel à cette température pendant 15 minutes, une solution prérefroidie de p-tosylate d'acide
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dibenzyl-glutamique (0, 1 mole) et de N-methylmorpholine (NMM) (0. 1 mole) dans dt. t dimethyl formamide a été ajoutée lentement et le melange
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réactionnel a été maintenu pendant une nuit sous agitation. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite. et le résidu a 6t6 repris dans
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l'acetate d'éthyle.
L'acetate d'éthyle a été lav ä l'eau, ä l'acide chlorhydrique, dans une solution aqueuse de bicarbonate de soude ä 5% et ä l'eau. 11 a été seche sur du sulfate de sodium, et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit obtenu est un sirop. Système TLC CHC13 : MeOH : HOAc (90 : 8 : 2). t\treté 95% : Rendement 80%.
Le produit 11} a été débloqué avec un mélange de chlorure de nnethyj. ene et d'acide tri-fluoroacétique à. 50% (1 : 1.) à. raison de 10 ml par gramme pendant une demi-heure. 11 a été évaporé sous pression réduite, triture à l'éther, filtre, lavé A l'éther et séché sous vide.
Rendement 98%
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Z (Cl) OBe t Le TFA-Lys-Glu-OBe a été neutralisé avec NMM et couplé ä Z3-Arg dans
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un mélange de dimethyl formamide et de tétrahydrofuranne, en utilisant de la NMM et du chloroformiate d'isobutyle, puis a subi le même traitement qu'en (1).
Rendement 60%. Système TLC CHC13:MeOH (92:8). Une tache importante. Le tripeptide mentionné ci-dessus a été hydrogéné dans un mélange d'acide acétique, cl'eau et de méthanol en presence de pd/c jusqu'à réaction complète.
L1 a été séparé du catalyseur par filtration, et le filtrat a été mis a
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évaporer soi-is vide.
Le produit, un tripeptide, a été purifié par distribution à contre-courant en utilisant le système N-butanol: acide acétique : eau ( ; J : 1 : 5). Rendement 50%. Système TLC butanol : acide acetique : eau : pyridine (32 : 6 : 22 : 20). Une tache importante. HPLC 97%.
ACTIVISTES BIOLOGIQUES.
I.A. INDUCTION IN VITRO DE L'ANTIGENE IHY 1. 2
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! jt cpt. ci. te d) Arg-Lys-G. t. n lésigné ega. Lement ci-après par. L'abt'eviaH. on ELS1) ä induire in vitro la différenciation des precursors de cellules T de souris en marqueurs de cellules T pour lymphocytes a été contrôlée en mettant en évidence l'induction de l'antigene de membrane Thy 1, 2.
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MATERIEL ET METHODES
SOURIS : On a utilisé des souris athymiques (nu/nu) âgées de 8 semaines élevées dans un milieu C3H/He et maintenues dans des conditions particulières exemptes de germes pathogènes.
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PREPARATION DES CELLULES : Les souris ont été tuées par dislocation cervicale. Les rates ont été enlevées aseptiquement et divisées finement avec des pinces dans une solution de sel équilibrée de Hank (HBBS) (Gibco Ltd., Paisley, Ecosse). Des splénocytes, laves et remis en suspension dans. le milieu 199 (Gibco Ltd.) auquel on a ajouté 1% de BSA (Boehringer
EMI3.2
Mannheim) et de la gentamycine (100 g/m1) ont été soumis à incubation pendant 45 minutes dans des colonnes ä laine de nylon équilibrées, suivant la méthode de Julius et al. (Eur. J. Immunol. 3, 645, 1973). Les populations de cellules de l'effluant enrichies avec le précurseur de cellules T ont été. utilisées pour les essais biologiques.
ESSAIS BIOLOGIQUES D'INDUCTION : On amis à incuber ä 37. pendant 18 heures 0. 5xlo cellules d'effluant dans 0. 1 ml de support, avec 0, 1 ml de tripeptide ou avec le support seul. Les cultures ont été réalisées en double. A la fin de l'incubation, les cellules ont été lavées avec du chlorure d'ammonium ä 0, 87% afin de provoquer l'hydrolyse des globules rouges, et ensuite avec le HBSS.
L'induction de l'antigène de membrane Thy 1. 2 a été déterminée par un essai direct d'immunofluorescence.
IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE : Les cellules ont été mises à incuber a 4 pendant 20 minutes avec un anti-corps monoclonal conjugué ä la fluorescéine (Bio-Yeda) avec une dilution de 1 : 200. Le melange a été centrifugé à 300 g pendant 5 minutes, lavé deux fois dans du HBSS, puis mis en suspension en vue du comptage au microscope ä fluorescence (Orthoplan Leitz). La différence des pourcentages de cellules fluorescentes entre les cultures avec et sans tripeptide a donné une indication de l'activité d'induction du produit.
RESULTATS
Comme indiqué au tableau, le tripeptide provoque l'apparition du marqueur Thy 1, 2 sur des cellules T immatures avec une réponse optimale ä 1 mcg/ml. La courbe donnant la relation entre la dose et la réponse présente
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une forme en cloche vu que les concentrations plus faibles et plus élevées du peptide donnent lieu à une induction plus faible.
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<tb>
<tb>
CONCENTRATION <SEP> % <SEP> THY <SEP> 1,2 <SEP> + <SEP> CELLULES
<tb> PEPTIDE <SEP> MOYENNE <SEP> ¯ <SEP> E.S <SEP> DIFFERENCE
<tb> (mcg:ml)
<tb> 0 <SEP> 11 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 6
<tb> 0, <SEP> 0001 <SEP> 19t <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 8
<tb> 0, <SEP> 001 <SEP> 34 <SEP> + <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> +. <SEP> 23
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 44 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 33
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> + <SEP> 39
<tb> 1 <SEP> 54 <SEP> ¯ <SEP> 5,0 <SEP> + <SEP> 43
<tb> 10 <SEP> 45 <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> + <SEP> 34
<tb> 20 <SEP> 40 <SEP> ¯ <SEP> 1,2 <SEP> + <SEP> 29
<tb> 50 <SEP> 28+4, <SEP> 5 <SEP> + <SEP> 17
<tb> 100 <SEP> 21 <SEP> ¯ <SEP> 1,7 <SEP> + <SEP> 10
<tb> 200 <SEP> 16 <SEP> ¯ <SEP> 2,4 <SEP> + <SEP> 5
<tb> ---------------------------------------
<tb>
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1, 8 INDUCTION IN VIVO DE L'ANTIGENE DE THY 1.
2
On a administré le ELS1 pendant 4 jours consécutifs, puis les souris ont été maintenues au repos pendant 24 heures ; ensuite, les rates ont été enlevées et les cellules examinées pour déterminer l'antigène de Thy 1,2 par fluorescence. Les souris de contrôle ont revu le support 199 (M
EMI4.3
199), qui est le support dans lequel le produit avait été dissous. Les souris avaient un poids moyen d'environ 24g.
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RESULTATS
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<tb>
<tb> % <SEP> DE <SEP> THY <SEP> 1,2 <SEP> + <SEP> CELLULES
<tb> Oral <SEP> i.p.
<tb>
Contrôle <SEP> 3% <SEP> 5%
<tb> ELS1 <SEP> 42 <SEP> g/kg <SEP> 3% <SEP> 6%
<tb> ELS1 <SEP> 420 <SEP> g/kg <SEP> 5% <SEP> 8%
<tb> ELS1 <SEP> 1055 <SEP> pg/kg <SEP> 7% <SEP> 12%
<tb> ELS1 <SEP> 2110 <SEP> g/kg <SEP> 15% <SEP> 18%
<tb> ELS1 <SEP> 4220 <SEP> g/kg <SEP> 14% <SEP> 17%
<tb> ELS1 <SEP> 8440 <SEP> g/kg <SEP> 15% <SEP> 16%
<tb>
Les données indiquent que le ELS1 est en mesure de provoquer la maturation de splénocytes après administration par voie orale et intra péritonéale.
Le dosage optimal est de 2110 g/kg, tandis qu'une réponse en palier est observée pour des dosages plus élevés.
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2. STIMULATION IN VITRO DE LA PRODUCTION D LYMPHC) CYTES.
MATERIEL ET METHODES PREPARATION DE CELLULES MONONUCLEAIRES DU SANG HUMAIN PERIPHERIQUE (PBMC).
Du sang périphérique est obtenu de volontaires en bonne santé par ponction veineuse. Les érythrocytes du sang sont séparés des leucocytes sur gradiants de Ficoll-Hipaque. La couenne inflammatoire (PBMC) est enlevée et lavée, et les cellules sont remises en suspension à raison de 1x106 cellules/ml dans du RPMI 1640 auquel on a ajouté 1% de pénicilline/streptomycine, 1% de glutamine et 1% de sérum fétal de veau inactivé par la chaleur (FCS, 56'C 30 min.).
PREPARATION DU FACTEUR DE CROISSANCE
Le PBMC ä 1x106 cellules/ml dans 1% de FCS inactive par la chaleur
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est mis a incuber avec ou sans Phytohémagglutinine (PHA) ä une concentration de 0. 75% v/v. Le peptide ä essayer est ajouté à la concentration de 1 pg/ml aux cultures appropriées. La période d'incubation est de 18 it 24 heures à 37'C en atmosphère humide. Les cultures sont filtrées ensuite sur des filtres de 0, 22 MM et le produit surnageant est examine pour détecter la présence de facteurs de croissance.
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MESURE DES FACTEURS DE CROISSANCE DANS LES PRODUITS SURNAGEANTS A. Cellules d'essais
Les cellules B utilisées pour détecter la présence du facteur de croissance des cellules B (BCGF) sont des lignées de cellules de culture à long terme maintenues sur BCGF et sont EBV négatives. Ces cellules sont cultivées dans un support exempt de serum en utilisant du Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemicals), et ne répondent pas au IL-2.
Les cellules T utilisées pour l'essai de detection de la presence d'IL-2 sont fraîchement isolées. Elles ont été stimulées initialement avec du PHA (0, 75%) et sont maintenues en culture pendant au moins 10 jours avant leur utilisation (afin de diminuer l'effet du milieu et d'établir leur dépendance par rapport à l'IL-2).
B. Préparation des cellules d'essai pour utiliser dans le contrôle.
1. Les cellules B sont généralement utilisées 4 jours après leur dernière alimentation avec BCGF. Elles sont lavées 4 fois dans RPMI 1640 pour éliminer toutes traces de BOGF et sont ajustées ä 15X104 cellules/ml dans RPMI 1640 et Nutridoma (à la concentration finale de 1%).
2. Les cellules T sont utilisées 4 jours après la dernière alimentation avec IL-. Elles sont lavées 4 fois et ajustées ä 50x104 cellules/ml dans le RPMI 1640 avec 5% FCS.
C. Procédures de contröle
1. Des cellules B cultivées à long terme sont mises ä incuber avec différentes concentrations du produit surnageant provenant des cultures PBMC, dans 96 plaques de micro-titrage à fond plat. Chaque cuvette a un volume total de 200 val et comporte 100 ul de cellules B (15x103 cellules) et 100 l de produit surnageant. Nous avons examiné l'efficacité de nos cellules B d'essai en les faisant incuber avec différentes concentrations de BCGF purifié (Cellular Products, Inc. Buffalo, N. Y.).
Les cultures sont mises à incuber pendant 24 heures, puis on ajoute 1 pCi de f3H-Tdrl et on effectue une incubation supplémentaire pendant 12 heures. Les cultures sont ensuite récoltées et soumises a comptage dans un compteur à scintillation.
2. Les cellules T sont mises à incuber dans des cuvettes ä fond plat. Le volume total de chaque cuvette est de 200 jjtl, ce qui comprend
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50X103 cellules T par cuvette. La periode d'incubation est de 72 heures et comprend 12 heures de marquage avec/H-Tdr/.
RESULTATS 1) PRODUCTION DU FACTEUR DE CROISSANCE EXPERIENCE 1 ACTIVITE BCGT (C.P.M.)
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<tb>
<tb> % <SEP> Produit <SEP> surnageant
<tb> Produit <SEP> surnageant <SEP> de3, <SEP> 056, <SEP> 25 <SEP> 125 <SEP> 25 <SEP> 50
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 424 <SEP> 1026 <SEP> 1674 <SEP> 3172 <SEP> 8392
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> + <SEP> ELS1 <SEP> 684 <SEP> 1658 <SEP> 2863 <SEP> 5600 <SEP> 7838
<tb> ACTIVITE <SEP> TCGF <SEP> (C.P.M.)
<tb> Produit <SEP> surnageant <SEP> de <SEP> 3,05 <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25 <SEP> 50
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 542 <SEP> 192 <SEP> 224 <SEP> 564 <SEP> 1144
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> + <SEP> ELS1'624 <SEP> 438 <SEP> 1062 <SEP> 1926 <SEP> 3296
<tb> EXPERIENCE <SEP> 2
<tb> ACTIVITE <SEP> BCGF <SEP> (C. <SEP> P.
<SEP> M.)
<tb> % <SEP> de <SEP> liquide <SEP> surnageant
<tb> Produit <SEP> surnageant <SEP> de <SEP> 3,05 <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25 <SEP> 50
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 1369 <SEP> 2187 <SEP> 2894 <SEP> 4876 <SEP> 8104
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> + <SEP> ELS1 <SEP> 1586 <SEP> 2837 <SEP> 3994 <SEP> 7728 <SEP> 10886
<tb> ACTIVITE <SEP> TCGF <SEP> (C. <SEP> P. <SEP> M.)
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 1482 <SEP> 3146 <SEP> 4322 <SEP> 7184 <SEP> 9012
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> + <SEP> ELS1 <SEP> 1908 <SEP> 4424 <SEP> 6480 <SEP> 9329 <SEP> 11656
<tb>
3. EFFET SUR LA SYNTHESE DE L'ARN EFFET DU ELS1 SUR LA SYNTHESE DE L'ARN DANS DES CELLULES T HUMAINES OBSERVE PAR INCORPORATION DE 3H-URIDINE. COMPTAGE PAR MINUTE (CPM). RESULTATS OBTENUS APRES 24 HEURES D'INCUBATION.
T 3732 T + PHA 20752
EMI7.2
<tb>
<tb> Concentration <SEP> ELS1 <SEP> g/ml
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 20
<tb> T <SEP> + <SEP> ELS1 <SEP> 5336 <SEP> 4868 <SEP> 5104 <SEP> 5272
<tb> T <SEP> + <SEP> ELS1 <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 32729 <SEP> 34966 <SEP> 34497 <SEP> 31764
<tb>
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4. EFFET SUR LA SYNTHESE DE L'ADN EFFET DU ELS1 SUR LA SYNTHESE DE L'ADN DANS DES CELLULES T HUMAINES OBSERVE PAR INCORPORATION DE 3H-THYMIDINE. COMPTAGE PAR MINUTE (CPM).
RESULTATS OBTENUS APRES 3 JOURS D'INCUBATION T 154 T + PHA 6076 Concentration ELS1 g/ml
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<tb>
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> T <SEP> + <SEP> ELS1 <SEP> 262 <SEP> 242 <SEP> 196 <SEP> 240
<tb> T <SEP> +ELS1 <SEP> +PHA <SEP> 5908 <SEP> 6810 <SEP> 7264 <SEP> 9560
<tb>
5. AUGMENTATION DU NOMBRE DE CELLULES IN VITRO
Le tripeptide ajouté aux cultures, soit de lymphocytes T soit de mélanges de lymphocytes T et B tous les quatre jours à une concentration de 5 ug/ml pendant une période de 30 jours est en mesure d'augmenter le nombre de cellules avec un maximum de + 50% par rapport aux cultures témoin, observé entre le loäme et le 15ème jour de l'experience.
ETUDES TOXICOLOGIQUES TOXICITE AIGUE
Des études de toxicité aigüe effectuées sur des souris et des rats ont montré que, jusqu'à des doses de 1000 mg/kg i. m., le tripeptide est totalement exempt d'effets toxiques.
TOLERABILITE
Des etudes sur les lapins et les souris ont montré que le produit, à la dose de 100 mg/kg respectivement i. v. et i. p. ne produit aucune modification hémodynamique et n'a pas d'effet sur le comportement. En particulier le temps d'endormissement induit par le pentobarbital ne présente qu'une légère augmentation.
ACTIVITE ALLERGENE
A la dose de 100 mg/kg i. m., le produit ne provoque aucun phénomène de sensibilisation du cobaye.
SELS DU TRIPEPTIDE
Les recherches décrites ci-dessus ont été effectuées avec un acetate du tripeptide, quoique l'on sache bien, dans l'état actuel de la technique, que des résultats semblables peuvent etre obtenus en utilisant
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d'autres sels, comme par exemple un trifluoracétate, un chlorhydrate, un sulfate.