DE69518857T2

DE69518857T2 - Pyridin- und pyrazindicarbonsäurederivate als zellwachstumsregulatoren

Info

Publication number: DE69518857T2
Application number: DE69518857T
Authority: DE
Inventors: Alan Cuthbertson; Peter Fischer; Michael Hartmann; Johann Hiebl; Mette Husbyn; Hermann Kollmann; Peter Kremminger; Franz Rovenszky; Jessie Sandosham
Original assignee: Nycomed Imaging AS
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2001-04-26
Anticipated expiration: 2015-12-21
Also published as: EP0799208B1; DE69518857D1; US6124298A; GB9425730D0; ATE196290T1; US5972926A; EP0799208A1; WO1996019457A1; ES2150021T3; AU4268696A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pyridin- oder Pyrazin- Verbindungen und deren Verwendung zur Regulierung der Hämatopoese, insbesondere zur Stimulierung der Hämatopoese und zur Behandlung von bakteriellen, viralen und fungalen Erkrankungen.
Der Säugetierkörper enthält Zellen sehr unterschiedlicher Strukturen und Funktionen und die Differnzierungs- und Entwicklungs- Mechanismen waren Gegenstand zahlreicher Studien. Es ist bekannt, dass bei Zellsystemen mit einem kontinuierlichen Lebenszyklus an diesem Mechanismus im Allgemeinen ein Reservoir pluripotenter Stammzellen beteiligt ist, die sich teilen und das System stetig mit neuen Zellen versorgen. Während die Stammzellen ursprünglich homogen sind, werden sie bald nach Abzweigung aus dem "Reservoir" auf die eine oder die andere Morphologie festgelegt und entwickeln sich später zu den benötigten funktionalen Zellen.
Ein Beispiel eines solchen Stammzellsystems ist das hämatopoetische System im Knochenmark.
Die Beeinflussung oder Kontrolle der Teilung von Stammzellen weist ein großes therapeutisches Potential auf und es richtet sich weiter viel Forschungsarbeit auf die Aufklärung des beteiligten Mechanismus und die verantwortlichen chemischen Botenstoffe. Bis heute wurden mehrere Biomoleküle gefunden, die entweder durch Stimulierung oder durch Hemmung eines Schritts innerhalb des Prozesses eine Rolle bei der Zellproduktion und -differenzierung spielen. Die Myelopoese wurde unter diesem Gesichtspunkt besonders ausführlich untersucht und zu den Molekülen, die an deren Kontrolle beteiligt sind, zählen: Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF) z. B. Granulozyten Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Macrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-Macrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Multilinien Kolonie-stimulierender Faktor (multi-CSF; IL-3) [siehe Metcalf, Science 229: 16, 1985], Interleukin II (IL-II) [siehe Paul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7521, 1990], Lactoferrin [siehe Broxmeyer et al., Blood Cells 11: 429, 1986], Prostaglandine [siehe Pelus et al., J. Immuno. 140: 479, 1988], saures Ferritin (H-Untereinheit) [siehe Broxmeyer et al., Blood 68: 1257, 1986], Interferone- (α-, β- und γ-) [siehe Pelus et al., supra. und Broxmeyer et al., J. Immuno. 131: 1300, 1983], Tumornekrose Faktoren (α- und β-) [siehe Broxmeyer et al., J. Immunol. 136: 4487, 1986], transformierender Wachstumsfaktor-β [siehe Ottmann et al., J. Immunol. 140: 2661, 1988] und Activin und Inhibin [siehe Brokmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 779, 1989].
Außerdem fand man heraus, dass das hämoregulatorische Pentapeptid (pEEDCK) selektiv die Proliferation myelopoetischer Zellen hemmt [siehe Paukovits et al., Z. Naturforsch. 37: 1297, 1982] und man fand heraus, dass andere Peptide, die einer eingegrenzten allgemeinen Formel entsprechen, eine bei der Hämatopoese ähnlich hemmende Wirkung zeigen [siehe EP-A-112 656 und WO 90/02753]. Die Oxidation des Peptid-Monomers führt zu dimeren Molekülen, die durch eine Cysteinbrücke verbunden sind und man fand auch heraus, dass diese dimeren Moleküle die Myelopoese stimulieren [siehe Laerum et al., Exp. Hematol. 16: 274, 1988]. Das (pEEDCK)2-Dimer und andere ähnliche Verbindungen sind in der WO-A-88/03535 offenbart.
Es besteht jedoch ein ständiger Bedarf an Verbindungen, die die Zellproliferation, insbesondere die Hämatopoese in einem brauchbaren Ausmaß in vivo regulieren können. In diesem Zusammenhang sollte erwähnt werden, dass die selektive Stimulierung einzelner Zelltypen von besonderer klinischer Bedeutung ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte neue Pyridin- und Pyrazin-enthaltende Verbindungen, die die Fähigkeit zur Regulierung, insbesondere zur Stimulierung der Hämatopoese aufweisen. Einerseits betrifft die Erfindung Verbindungen der Formel I:
worin
R¹ für eine Gruppe
oder -G-D steht;
einer der Reste R², R³ und R&sup4; für eine Gruppe gemäß der vorstehenden Definition für R¹ steht, die gleich oder verschieden von R¹ sein kann, und die verbleibenden zwei Reste R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe stehen;
oder R¹ und R² zusammen eine -CONH-W-NHCO- Gruppe bilden, und R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe stehen;
oder R³ und R&sup4; zusammen mit den dazwischenliegenden Ringkohlenstoffatomen einen aromatischen Ring bilden, und R¹ und R² jeweils für
oder -G-D stehen;
Z für -N- oder -CH- steht;
A für -CO- oder -CH&sub2;- steht;
G für cis- oder trans- -CH=CH- oder eine Gruppe der Formel
steht, worin X für -O-, -S-, -NH- oder -CH&sub2;- steht;
D für eine Gruppe -CR&sup5;R&sup6;R&sup7; oder -CR&sup8;[(CH&sub2;)l-X']&sub2; steht, worin
R&sup5; für -H oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe steht, die gegebenenfalls durch eine Hydroxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, Carboxy-, Phenyl- oder Hydroxyphenylgruppe substituiert ist;
R&sup6; für -H oder -CH&sub3; steht;
R&sup7; für -CO&sub2;R&sup9; oder -CONR&sup9;R&sup9; steht;
R&sup8; für -H oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe steht, die gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist;
X' für -OH, -NH&sub2;, -CO&sub2;R&sup9; oder -CONR&sup9;R&sup9; steht;
jedes R&sup9; unabhängig voneinander für -H oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe steht;
l 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist;
E für -H, -OH oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl steht;
oder D und E jeweils für eine Gruppe -(CH&sub2;)k-X' oder -(CH&sub2;)k-CO&sub2;R¹&sup0; stehen, worin k eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, X' die oben angegebene Bedeutung hat und R¹&sup0; für eine C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Aralkylgruppe steht;
oder D und E zusammen mit dem dazwischenliegenden Stickstoffatom eine heterocyclische Gruppe der Formel
bilden, worin jedes m unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 1 bis 3 steht;
Y für -O-, -NH-, -S-, -SO- oder -SO&sub2;- steht;
W für eine geradkettige oder verzweigte C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylengruppe steht, die durch eine oder mehrere -O- oder -NH-Gruppen unterbrochen sein kann und die eine oder mehrere OH-, NH&sub2;- oder Carboxylgruppen tragen kann, oder die eine oder mehrere Carbonylgruppen neben gegebenenfalls unterbrechenden -NH-Gruppen tragen kann, wie eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylengruppe, -CH&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-O-CH&sub2;-, -CH(COR¹¹)-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub6;-CH(COR¹¹)- oder -CH(CH&sub2;OH)-CO-V-CO-CH(CH&sub2;OH)-;
worin jedes R¹¹ unabhängig voneinander für -OH oder -NH&sub2; steht; und
V für -NH-(CH&sub2;)&sub2;-CONH-(C&sub6;H&sub4;)-NHCO-(CH&sub2;)&sub2;-NH-, -NH-CH&sub2;-CONH-CH&sub2;-(C&sub6;H&sub4;)-CH&sub2;-NHCO-CH&sub2;-NH- oder -NH-CH(CH&sub2;CO&sub2;H)-CO-NH-CHR¹²-(CH&sub2;)&sub4;-CHR¹²-NH-CO-CH(CH&sub2;CO&sub2;H)-NH- steht, worin R¹² für -CO-NH-CH(CO&sub2;H)-(CH&sub2;)&sub4;-NH&sub2; steht,
und deren physiologisch verträgliche Salze.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind solche Verbindungen der Formel I, worin R¹ und R² jeweils für
oder -G-D stehen.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel I sind solche, worin Z für -N- steht; R¹ und R² für
stehen; und R³ und R&sup4; für -H stehen.
Ganz besonders bevorzugte Verbindungen sind:
Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di[D-Ser-OH]:
N,N,N',N'-Tetrakis(2-hydroxyethyl)pyrazin-2,3-dicarboxamid:
N,N'-Bis(1,3-dihydroxyprop-2-yl)pyrazin-2,3-dicarboxamid:
Diese ganz besonders bevorzugten Verbindungen haben besonders vorteilhafte Eigenschaften gemeinsam, wie ein geringes Molekulargewicht, einen semipeptidischen oder nicht-peptidischen Charakter und minimale oder keine Chiralität. Man kann folglich erwarten, dass sich diese Verbindungen sowohl einfacher und kostengünstiger herstellen lassen und dass sie metabolisch weniger labil und der oralen Verabreichung zugänglicher sind als andere bekannte Stimulatoren des hämatopoetischen Systems, die im Allgemeinen Polypeptide sind.
Eine weitere besonders bevorzugte Verbindung der Formel I ist
Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(L-Ser)/(D-Ser)]-(Asp)&sub2;- Dasa-(Lys-OH)&sub2;.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind bei der Regulierung, insbesondere bei der Stimulierung der Hämatopoese von Nutzen. Die Verbindungen können beispielsweise bei der Stimulierung der Myelopoese in Patienten verwendet werden, die an einer verminderten myelopoetischen Aktivität, umfassend Knochenmarksschädigung, Agranulozytose und aplastische Anämie, leiden. Hierzu zählt die Behandlung von Patienten, die eine verminderte Knochenmarksfunktion aufgrund immunsuppressiver Behandlung zur Unterdrückung von Gewebereaktionen, z. B. bei Knochenmarkstransplantationschirurgie, haben.
Die Verbindungen können ebenfalls zur Förderung rascher Regeneration des Knochenmarks nach cytostatischer Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie bei neoplastischen und viralen Erkrankungen verwendet werden.
Überdies können die neuen Verbindungen im Fall von Patienten, die ernste Infektionen aufgrund einer fehlenden Immunantwort nach einem Knochenmarksversagen haben, von besonderer Bedeutung sein.
Eine weitere klinische Anwendung wird in Kombination mit bekannten Peptidmonomeren, wie mit denen, die in der EP-A-0359338, der WO-A-93/10807 und der WO-A-93/24524 beschrieben wurden, die selektive Stimulierung oder Hemmung der Aktivität hämatopoetischer Zellen, beispielsweise Knochenmarkszellen, sein. Eine solche Verwendung der neuen Verbindungen induziert alternierende Peaks hoher und niedriger Aktivität in den Knochenmarkszellen hervor und steigert so den natürlichen zirkulären Rhythmus der Hämatopoese. Auf diese Weise kann die cytostatische Therapie zu Zeitpunkten niedriger Knochenmarksaktivität erfolgen und vermindert somit das Risiko der Knochenmarksschädigung, während die Regeneration durch den nachfolgenden Aktivitätspeak unterstützt wird.
Eine weitere klinische Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Behandlung von bakteriellen, fungalen oder viralen Erkrankungen, die durch hämatopoetische Störungen wie Candida und Herpes, verursacht werden.
Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Induktion einer stimulierenden Wirkung oral oder durch Injektion im Dosierungsbereich von 0,001 bis 100 mg, beispielsweise 1 bis 5 mg, pro 70 kg Körpergewicht pro Tag an Patienten verabreicht werden. Falls sie intravenös oder subcutan verabreicht werden, kann die Dosis im Bereich von 1 bis 10 mg pro 70 kg Körpergewicht pro Tag, beispielsweise etwa 6 mg über bis zu 10 Tage hinweg liegen.
Eine nasale, topicale (transdermale) oder rektale Verabreichung ist natürlich ebenfalls möglich. Prinzipiell ist das Erreichen einer Konzentration der Verbindung von etwa 10&supmin;¹³ M bis 10&supmin;&sup5; M in der extrazellulären Flüssigkeit des Patienten wünschenswert.
Gemäß eines weiteren Gegenstands der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereit gestellt, die als aktiven Inhaltsstoff eine oder mehrere wie vorstehend beschriebene Verbindungen der Formel I oder deren physiologisch verträgliche Salze in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten umfassen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können beispielsweise in einer zur oralen, nasalen, parenteralen oder rektalen Verabreichung geeigneten Form vorliegen.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch" umfasst auch veterinäre erfindungsgemäße Anwendungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in den gewöhnlichen pharmakologischen Darreichungsformen vorliegen wie Tabletten, beschichtete Tabletten, Nasalsprays, Lösungen, Emulsionen, Puder, Kapseln oder Darreichungsformen mit verzögerter Wirkstofffreisetzung. Es können sowohl übliche pharmazeutische als auch gebräuchliche Herstellungsverfahren zur Herstellung dieser Dosierungsformen verwendet werden. Tabletten können beispielsweise durch Vermischen des aktiven Inhaltsstoffs oder der Inhaltsstoffe mit bekannten Exzipienten, beispielsweise Verdünnungsmitteln wie Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Lactose, Desintegrantien wie Weizenstärke oder Alginsäure, Bindemitteln wie Stärke oder Gelatine, Gleitmitteln wie Magnesiumstearat oder Talkum und/oder Mitteln zur verzögerten Freisetzung wie Carboxypolymethylen, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylacetat hergestellt werden.
Falls erwünscht, können die Tabletten aus mehreren Schichten bestehen. Beschichtete Tabletten können durch die Beschichtung von Kernen mit Mitteln, wie sie üblicherweise für Tablettenbeschichtungen verwendet werden, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon oder Shellack, Gummi arabicum, Talkum, Titandioxid oder Zucker, hergestellt werden, die man in einer ähnlichen Weise wie die Tabletten erhält. Um eine verzögerte Freisetzung zu erzielen oder Unver träglichkeiten zu vermeiden, kann auch der Kern aus mehreren Schichten bestehen. Die Tablettenbeschichtung kann ebenfalls aus mehreren Schichten bestehen um eine verzögerte Freisetzung zu bewirken, wobei in diesem Fall die vorstehend für Tabletten erwähnten Exzipienten verwendet werden können.
Injektionslösungen können in üblicher Art und Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Zugabe von Konservierungsmitteln wie p-Hydroxybenzoaten oder Stabilisatoren wie EDTA. Die Lösungen werden dann in Injektionsgefäße oder Ampullen gefüllt.
Nasalsprays können ähnlich in wässriger Lösung formuliert und in Spraybehälter gefüllt werden, entweder mit einem Aerosol-Treibmittel oder ausgestattet mit Vorrichtungen zur manuellen Druckerzeugung. Kapseln, die einen oder mehrere aktive Inhaltsstoffe enthalten, können beispielsweise durch Vermischen der aktiven Inhaltsstoffe mit inerten Trägern wie Lactose oder Sorbitol und durch Einfüllen des Gemischs in. Gelatinekapseln hergestellt werden.
Geeignete Suppositorien können beispielsweise durch Vermischen des aktiven Inhaltsstoffs oder Kombinationen aktiver Inhaltsstoffe mit den für diesen Zweck vorgesehenen üblichen Trägern wie natürliche Fette oder Polyethylenglycol oder deren Abkömmlinge hergestellt werden.
Dosierungseinheiten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, enthalten vorzugsweise 0,1 bis 10 mg, z. B. 1 bis 5 mg der Verbindung der Formel I oder deren Salzes.
Die vorliegende Erfindung stellt somit Verbindungen der Formel I und Zusammensetzungen davon zur Verwendung bei der Regulation der Hämatopoese bereit. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Regulation der Hämatopoese. Die Hemmung und Stimulierung der Knochenmarksregeneration sind von besonderem Interesse.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Regulierung der Hämatopoese, insbesondere der Myelopoese, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge einer wie vorstehend definierten pharmazeutischen Zusammensetzung an eine Person umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, wobei das Verfahren jeweils einen der folgenden Schritte umfasst:
(a) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für
steht, worin A für -CO steht)
Umsetzung der entsprechenden Pydridin- oder Pyrazin-2,3-, -2,5- oder -2,6-dicarbonsäuren, -ester oder eines aktivierten Derivats davon, mit einer Gruppe der Formel II
(worin D und E die oben angegebene Bedeutung haben);
(b) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für
steht, worin A für -CH&sub2;- steht)
Umsetzung des entsprechenden Pyridin- oder Pyrazin-2,3-, 2,5- oder 2,6-bis(chlormethyl)derivats mit einer Gruppe der oben angegebenen Formel II;
(c) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für -G-D steht, worin G für cis- oder trans- -CH=CH- steht) Umsetzung des entsprechenden Pyridin- oder Pyrazin-2,3-, -2,5- oder -2,6-dialdehyds mit einem Phosphorylid der Formel III
wobei ein solcher Pyridin- oder Pyrazindialdehyd geeigneterweise aus den entsprechenden Dicarbonsäuren, Disäurederivaten, Dialkoholen, Diacetalen, etc. erhältlich ist.
(d) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für -G-D steht, worin G für eine Gruppe der Formel
steht)
Umsetzung der entsprechenden Pyridin- oder Pyrazin-2,3-, -2,5- oder -2,6-Dicarbonsäuren oder eines aktivierten Derivats davon wie Iminoester, Nitrile etc., mit einer Gruppe der Formel IV
(worin X und D die oben angegebene Bedeutung haben), worauf gegebenenfalls eine Oxidation folgt;
(e) (zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R¹ und R² zusammen eine -CO-NH-W-NH-CO-Gruppe bilden, worin W die oben angegebene Bedeutung hat) Umsetzung eines Diamins der Formel H&sub2;N-W-NH&sub2; mit einer Pyridin- oder Pyrazin-2,3-dicarbonsäure oder einem aktivierten Derivat davon oder einem 2,3-Carbonsäureanhydrid;
(f) (zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R³ und R&sup4; zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden) Verwendung einer bicyclischen aromatischen Verbindung, wie Chinolin-2,3-dicarbonsäure oder ihres Anhydrids, in den Verfahren (a) oder (d);
(g) Umwandlung einer gemäß einem der Schritte (a) bis (c) hergestellten Verbindung der Formel I in ein Salz davon;
(h) Auflösung einer chiralen Verbindung der Formel I in ihre Isomere.
Bei den oben beschriebenen Reaktionen kann jede vorhandene Gruppe, wie Hydroxyl, Carboxyl, Amino etc. gegebenenfalls während der Reaktion durch gewöhnliche Schutzgruppen geschützt werden, die nach der Reaktion wieder abgespalten werden.
Gegebenenfalls wird somit der letzte Schritt der Synthese von Verbindungen der Formel I die Abspaltung der Schutzgruppen eines vollständig oder teilweise geschützten Derivats einer Verbindung der Formel I sein und solche Verfahren sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Geeignete Hydroxy-Schutzgruppen umfassen Trimethylsilyl, Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl und Benzyl.
Carboxyl-Schutzgruppen, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise Trimethylsilyl, Methyl, Ethyl, tert.-Butyl und Benzyl.
Geeignete Aminoschutzgruppen umfassen 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc-), t-Butoxycarbonyl (Boc-) und Carbobenzoxy.
Die anschließende Abspaltung aller verwendeten Schutzgruppen kann mittels bekannter geeigneter Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise wird eine tert.-Butyl oder tert.-Butyloxycarbonylgruppe vorzugsweise durch Behandlung mit einer Säure wie Trifluoressigsäure oder Salzsäure, gegebenenfalls unter Verwendung eines Lösungsmittels wie Methylenchlorid, abgespalten.
Die Reaktion des Schrittes (a) wird üblicherweise in einem Lösungsmittel oder einem Gemisch von Lösungsmitteln wie Ethanol, Methylenchlorid oder Dimethylformamid durchgeführt.
Die Carbonylgruppen werden im Allgemeinen in eine aktivierte Form überführt, beispielsweise durch Reaktion mit einem aktivierenden Mittel wie PyBOP (Benzotriazol-1-yloxy-tris-pyrrolodinophosphonium-Hexafluorphosphat) oder einem Diimid-Reagenz wie DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) oder DIC (Diisopropylcarbodiimid) in Gegenwart einer Base wie N-Methylmorpholin. Es kann auch ein Diester, z. B. Di-C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylester verwendet werden.
Im Falle der Herstellung der 2,3-disubstituierten Pyridin- oder Pyrazin-Verbindungen können anstelle der 2,3-Dicarboxylsäuren oder -ester die entsprechenden Anhydride in Schritt (a) als Ausgangsstoff verwendet werden. Das Amin, das man mit dem Dicarboxylsäurederivat umsetzt, kann während der Acylierungsreaktion an eine feste Phase gebunden sein.
In der Reaktion des Schrittes (c) kann die Verbindung der Formel III durch Behandlung eines Phosphoniumsalzes, wie Triphenylphosphoniumchlorid, mit einer Base, wie BuLi, hergestellt werden, wobei das Phosphoniumsalz üblicherweise aus dem Phosphin und einem Alkylhalid hergestellt wird.
Wie oben erwähnt, können die Verbindungen der Formel I in ihre geometrischen und optischen Isomere aufgetrennt werden. So können beispielsweise cis-/trans-Gemische in ihre cis- und, trans-Isomere aufgetrennt werden und solche Verbindungen, die zumindest ein optisch aktives Kohlenstoffatom aufweisen, können in ihre Enantiomere aufgetrennt werden.
So können beispielsweise die erhaltenen cis-/trans-Gemische durch Chromatographie in die cis- und trans-Isomere aufgetrennt werden und die Verbindungen der Formel I, die in Racematform auftreten, können durch bekannte Verfahren, z. B. durch Chromatographie, in deren Diastereomere aufgetrennt werden, die, falls sie in Racematform anfallen, anschließend z. B. durch chirale Chromatographie, in die Enantiomere aufgetrennt werden können.
Die biologische Aktivität der Verbindungen der Formel I wird im nachfolgenden Test gezeigt.
Die aus dem Knochenmark der Maus stammende Stroma-Zelllinie C6.4, die keine nachweisbare HSF-Aktivität konstitutiv hervorbringt, wurde über 4 Tage bis zur Konfluens kultiviert. Die Zellen wurden dann gewaschen und das Medium durch frisches, serumfreies Medium ersetzt. Die untenstehenden Verbindungen 1 bis 6 (1 ug/ml) wurden dann hinzugefügt und nach 24-stündiger Inkubation wurden die Kulturüberstände über eine Filtervorrichtung mit einer Ausschlußgröße von 30 kDa zur Beseitigung bekannter Kolonie-stimulierender Faktoren (CSF) hohen Molekulargewichts filtriert. Die Knochen markszellen der Maus wurden in Anwesenheit suboptimaler Konzentrationen von Granulozyten-Makrophagen-(GM)-CSF (20 U/ml) kultiviert (7,5 · 10&sup4; Zellen im Medium, das 15% fötales Kälberserum und 0,3% Agar enthielt). Es wurden dann Verdünnungsreihen der gefilterten C6.4-Zellüberstände hinzugefügt und die Agarplatten wurden 7 bis 8 Tage bei 37~C unter 5% CO&sub2; inkubiert. Kolonien von proliferierenden Knochenmarkszellen wurden unter Verwendung eines Mikroskops gezählt. Die HSF-Einheiten wurden wie folgt errechnet: [(Koloniezahl in der Probe)-(Koloniezahl in -ve Kontrolle)/Verdünnungsfaktor des C6.4-Zellüberstands des Filtrats].
Verbindung HSF Einheiten/ml
1 Pyrazin-2,3-dicarboxyldi[D-Ser-OH] 1,9 · 10&sup6;
2 N,N,N',N'-Tetrakis(2-hydroxyethyl)pyrazin- 2,3-dicarboxamid 2,2 · 10&sup6;
3 N,N'-Bis(1,3-dihydroxyprop-2-yl)pyrazin- 2,3-dicarboxamid 8,7 · 10&sup6;
4 Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(L-Ser)/(D-Ser)]- (Asp)&sub2;-Dasa-(Lys-OH)&sub2; 5,2 · 10&sup5;
Positivkontrolle a 1,5 · 10&sup6;
Negativkontrolle b 0
* Hämatopoetisch stimulierender Faktor
a) Das Peptid (Glp-Glu-Asp)&sub2;-L,L-2,6-diaminosuberyl(Lys-OH)&sub2; wurde verwendet:
Die Kapazität des Peptids, die Myelopoese durch Stimulierung der Cytokin-Produktion von Stroma-Zellen zu verstärken, wurde sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt: L. M. Pelus et al., Exp. Hematol. 22: 239-247, 1994.
b) Keine Zugabe einer Verbindung zu den C6.4-Zellen jedoch ein entsprechendes Volumen des Verdünnungsmittels (Phosphat-gepufferte Salzlösung).
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung.
In allen folgenden Beispielen sind die Abkürzungen für Aminosäuren konventionsgemäß (siehe Eur. J. Biochem. 138: 9-37, 1984). Falls nicht anders angezeigt, stehen die Aminosäuren für L-Aminosäuren.
Die folgenden Abkürzungen werden in den nachfolgenden Beispielen verwendet:
Dasa = L,L-2,7-Diaminosuberic acid
DCC = Dicyclohexylcarbodümid
DIC = Diisopropylcarbodümid
DMF = N,N-Dimethylformamid
DMSO = Dimethylsulfoxid
FAB-MS = Fast atom bombardment-Massenspektrometrie
Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol
NMM = N-Methylmorpholin
NMR = Kernmagnetische Resonanz-Spektroskopie
PyBOP = Benzotriazol-1-yloxy-tris-pyrrolidin- phosphonium-Hexafluorophosphat

Beispiel 1

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-(D-Ser-OH)/(L-Ser-OH)
Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (0,26 g, 1,6 mmol), PyBOP (1,6 g, 3,2 mmol), HOBt (0,43 g, 3,2 mmol) und NMM (0,53 ml, 4,7 mmol) gelöst in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml), ließ man 5 min reagieren. Eine Lösung von H-Ser(But)-OMe, HCl (1 g, 4,7 mmol) und NMM (0,53 ml, 4,7 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) wurde dann hinzugefügt und das gesamte Gemisch wurde über Nacht gerührt. Die Lösung wurde dann nacheinander mit 5% aq. NaHcO&sub3; und Salzlösung extrahiert, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei man einen öligen Rückstand von Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-[Ser(But)-OMe], TLC Rf = 0,72 (90 : 10 : 0,5 : 1 CHCl&sub3;/MeOH/AcOH/H&sub2;O) erhielt.
Dieser Stoff (ca. 1,6 mmol) wurde in MeOH (20 ml) gelöst und 2 M aq. NaOH (3,2 ml, 6,4 mmol) wurden hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt bis die TLC nach 1,5 h die vollständige Methylesterhydrolyse anzeigte (Rf = lediglich 0,28). Die Lösung wurde zur Entfernung von MeOH eingeengt. Sie wurde dann mit Wasser verdünnt und mit 6 M aq. HCl auf pH 2 angesäuert. Das Präzipitat wurde in CHCl&sub3; extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und bis zur Trockene eingedampft. Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-[Ser(But)-OH] (0,8 g, 87%) wurde als Öl erhalten. Die analytische RP-HPLC- und FAB-MS-Analyse zeigte, dass ein Gemisch aus zwei Diastereomeren vorlag. Eins von diesen (tR = 18,5 min, Vydac 218TP54, 4,6 · 25 mm, 1 ml/min, 5 bis 50% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min) war optisch aktiv (nach Isolierung durchRP-HPLC und t-Butylether- Entschützung) und bestand aus einem Gemisch aus D/D-Ser- und L/L-Ser-Enantiomeren von Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-[Ser(But)-OH] (chromatographisch identisch mit den echten Stoffen, siehe unten). Das andere (tR = 19,8 min) war meso-Pyrazin-2,3-dicarboxyldi-[Ser(But)-OH], das bis zur Homogenität durch präparative RP- HPLC gereinigt wurde. Nach Lyophilisation wurde der Rückstand 30 min mit einem 1 : 1-Gemisch aus CF&sub3;COOH und CH&sub2;Cl&sub2; behandelt. Diese Lösung wurde bis zur Trockene eingedampft, der Rückstand wurde aus wässriger Lösung lyophilisiert und man erhielt nach präparativer RP-HPLC (Gradientenelution 0 bis 6% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH auf einer C&sub1;&sub8;-Säule) reines meso-Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-[Ser- OH]. (NMR-Spektren übereinstimmend mit der Struktur). [α]D = 0 (c 1, DMF).
FAB-MS [M+H]&spplus; = 343, C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub4;N&sub4;O&sub8; = 342,26.

Beispiel 2

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-(D-Ser-OH)
Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (1 g, 6 mmol) wurde mit DIC (0,93 ml, 6 mmol) in DMF (15 ml) 10 min aktiviert, um das Anhydrzid in situ herzustellen. Eine Lösung aus H-D-Ser(But)-OBut·HCl (1,7 g, 6,6 mmol) und NMM (0,69, ml, 6,6 mmol) in DMF (10 ml) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde 4 h gerührt. Ein zweiter Teil H-D-Ser(But)-OBut·HCl und NMM in DMF (dieselben Mengen wie oben) wurde dann 10 min durch Zugabe von HOBt (0,81 g, 6 mmol) und DIC (0,93 ml, 6 mmol) voraktiviert. Diese Lösung wurde dann zu dem oben stehendem Gemisch hinzugegeben und über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde wieder in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst mit 5% aq. NaHCO&sub3; ausgeschüttelt, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft. Das erhaltene Öl wurde auf Silicagel (70 : 25 : 5 Hexan/EtOAc/AcOH) chromatographisch aufgetrennt und die Fraktionen, die reines Pyrazin-2,3-dicarboxyldi[D-Ser-(But)-OBut] enthielten wurden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wurde 30 min mit mit CF&sub3;COOH, das 5% H&sub2;O enthielt, behandelt, eingedampft, wieder in Wasser gelöst und lyophilisiert. Nach einer präparativen RP-HPLC-Trennung erhielt man reines Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di[D-Ser-OH] (350 mg, 17%).
[α]D = -17 (c 1, DMF).
¹H-NMR (300 MHz, DMSO): δ = 3,75-3,8 (m, 4H, C &sub2;), 4,46-4,49 (m, 2H, Cα ), 8,65 (d, J = 9 Hz, 2H, 2H, CON ), 8,82 (s, 2H, aromatische C ), 12,8 (breites s, 2H, COO ).
¹³C-NMR (75 MHz, DMSO): δ = 55,05 ( αH), 61,71 ( H&sub2;), 145,14, 146,0 (aromatisches H), 164,26 ( ONH), 171,86 ( OOH).
FAB-MS [M+H]&spplus; = 343, C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub4;N&sub4;O&sub8; = 342,26.

Beispiel 3

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-(L-Ser-OH)
Diese Verbindung wurde analog dem Pyrazin-2,3-dicarboxylatdi-[D-Ser-OH]-Isomer aus Beispiel 2 aus H-L-Ser(But)-OBut·HCl hergestellt. Sie wies zum Isomer aus Beispiel 2 identische analytische Daten auf, mit Ausnahme der optischen Drehung: [α]D = +17 (c 1, DMF).

Beispiel 4

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-(D-Ser-NH&sub2;)
Fmoc-geschütztes Rinkamid AM-Harz (1 g, 0,49 mmol; Novablochem AG Läufelfingen, Schweiz; siehe H. Rink, Tetrahedron Lett. 28 (1987), 3787-3790) wurde mit DMF gewaschen und die Schutzgruppe mit 20% Piperidin/DMF entfernt. Nach wiederholtem Waschen mit DMF, wurden Fmoc-D-Ser(But)-OH (776 mg, 2 mmol), PyBOP (1,05 g, 2 mmol), HOBt (306 mg, 2 mmol) und Pri&sub2;NEt (0,61 ml, 3 mmol) in DMF (5 ml) zum Harz hinzugefügt und man ließ über Nacht unter Bewegung des Reaktionsgefäßes reagieren. Das Harz wurde erneut Fmoc entschützt und gewaschen bevor Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (27 mg, 0,16 mmol) mit denselben Mengen von PyBOP, HOBt und Pri&sub2;NEt in ähnlicher Weise angekuppelt wurde. Das Harz wurde dann nacheinander mit DMF und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und 2 h mit CF&sub3;COOH/H&sub2;O/1,2-Ethandiol (90 : 5 : 5 v/v/v) behandelt. Der Rückstand des Harzes wurde abfiltriert und das Filtrat wurde eingedampft. Das Peptid-Rohprodukt wurde durch Präzipitation mit Et&sub2;O erhalten. Dieses wurde getrocknet, wieder in H&sub2;O gelöst und chromatographisch aufgetrennt (Vydac 218TP1022, 22 · 250 mm, 5 ml/min, isokratische Elution 0,1% aq. CF&sub3;COOH). Geeignete Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt, lyophilisiert und man erhielt die reine Titelverbindung.
Analytische RP-HPLC: tR = 3,7 min (Vydac 218TP54, 4,6 · 250 mm, 1 ml/min, 0 bis 20% MeCN in 0,1% ag. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm).
FAB-MS [M+H]&spplus; = 341,1, C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub6;N&sub6;O&sub6; = 340,30.

Beispiel 5

Pyridin-2,3-dicarboxyl-di-(D-Ser-OH)
Diese Verbindung wurde analog zur Pyrazin-2,3-dicarboxyldi-[D-Ser-OH]-Verbindung aus Beispiel 2 aus Chinolinanhydrid hergestellt. Das Chinolyl-di-[D-Ser(But)-OBut]-Zwischenprodukt zeigte ein mit der vorhergesagten Struktur übereinstimmendes NMR-Spektrum und RP-HPLC: tR = 16,1 min (Vydac 218TP54, 4,6 · 250 mm, 1 ml/min, 50 bis 80% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min). Das Chinolyl-di-[D-Ser-OH]-Endprodukt wies eine Reinheit von 90% auf (RP-HPLC tR = 6,1 min 0 bis 12% MeCN über 20 min, λ = 215 nm). MALDI-TOF-MS [M+H]&spplus; = 342,3, [M+Na]&spplus; = 364,3, C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub5;N&sub3;O&sub8; = 341,28.

Beispiel 6

Pyrazin-2,5-dicarboxyl-di-(D-Ser-OH)
Diese Verbindung wurde aus Pyrazin-2,5-dicarbonsäure und H-D Ser(But)-OBut in einer der Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-[D-Ser- OH]-Verbindung aus Beispiel 2 analogen Weise synthetisiert. Das Zwischenprodukt Pyrazin-2,5-dicarboxyl-di-[D-Ser(But)-OBut] zeigte folgendes ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz): δ = 1,11 (s, 18H, CH&sub2;OC(C &sub3;)3), 1,42 (s, 18H, C(O)OC(C &sub3;)&sub3;), 3,63-3,83 (dm, 4H; Cβ&sub2;), 4,60 (m, 2H, Cα ), 8,54 (d, 2H, CON ), 9,27 (s, 2H, Ar- ). Nach Entfernen der t-Butyl-Schutzgruppen durch CF&sub3;COOH-Behandlung, erhielt man die reine Titelverbindung. Analytische RP-HPLC: tR = 12,5 min (Vydac 218TP54, 4,6 · 250 mm, 1 ml/min, 0 bis 20% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm).

Beispiel 7

N,N'-bis-(1,3-dihydroxy-2-methylprop-2-yl)pyrazin- 2,3-dicarboxamid
Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (34 mg, 0,2 mmol), PyBOP (229 mg, 0,44 mmol), HOBt (60 mg, 0,44 mmol) und NMM (0,7 ml, 0,64 mmol) wurden in DMF (2 ml) gelöst und 10 min zur Reaktion belassen. Dann wurde 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (46 mg, 0,44 mmol) hinzugefügt und über Nacht weitergerührt. Das gesamte Reaktionsgemisch wurde dann auf einer RP-HPLC Säule (Vydac 218TP1022, 22 · 250 mm, 10 ml/min, 0 bis 15% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 40 min) fraktioniert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, erneut chromatographiert, lyophilisiert und ergaben die reine Titelverbindung. Alternativ dazu wurde die Titelverbindung wie folgt hergestellt: Dimethylpyrazin-2,3-dicarboxylat (1,5 g, 7,7 mmol) und 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (1,6 g, 15,4 mmol) in absolutem Ethanol (5 ml) wurden 4 h unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann abgekühlt und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde über eine Flash-Silicagelsäule mit CHCl&sub3;/MeOH (4 : 1) als Eluens chromatographiert. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und die reine Titelverbindung (2,2 g, 85%) nach Umkristallisation aus Isopropanol/Hexan erhalten.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ = 1,06 (s, 6H, 2 · Me), 3,48 (d, J = 6,3 Hz, 8H, 4 · CH&sub2;), 4,29 (t, J = 6,3 Hz, 4H, 4 · -OH), 7,64 (s, 2H, 2 · NH), 8,38 (s, 2H, 2 · CH).
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl&sub3;): δ = 164,26 (CO), 145,54 (C-2,3), 143,59 (C-5,6), 65,30 (CH&sub2;), 58,66 (Cq), 18,13 (Me).
Analytische RP-HPLC: tR = 12,28 min (Vydac 218TP54, 4,6 · 250 mm, 1 ml/min, 0 bis 10% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm)
FAB-MS [M+H]&spplus; = 343, C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub2;N&sub4;O&sub6; = 342,35.

Beispiel 8

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(Gly-OH)/(D-Ser-OH)]
Zur Beseitigung der Schutzgruppen wurde Fmoc-Gly-[TentaGel S Trityl Harz] (1 g, 0,26 mmol; Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Deutschland) mit DMF gewaschen und mit 20% Piperidin/DMF (2 · 10 ml, jeweils 3 min) behandelt. Das Harz wurde erneut mit DMF gewaschen, abtropfen gelassen und dann 2 h mit einem voraktivierten (10 min) 1 Gemisch aus Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (336 mg, 2 mmol) und DIC (155 ul, 1 mmol) in DMF (5 ml) (-ve Kaiser Ninhydrintest zu diesem Zeitpunkt) umgesetzt. PyBOP (520 mg, 1 mmol), HOBt (135 mg, 1 mmol) und NMM (155 ul, 1,5 mmol) in DMF (5 ml) wurden zum Harz hinzugefügt, nach wenigen Minuten folgten H-D-Ser(But)-OBut (254 mg, 1 mmol) und NMM (110 ul, 1 mmol) in DMF (5 ml). Das Peptidyl- Harz-Gemisch wurde mit einem Strom N&sub2; über Nacht bewegt. Das Harz wurde dann mit DMF und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und man ließ es abtropfen.
Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(Gly-OH)/(D-Ser(But)-OBut)] wurde vom Syntheseharz durch 2-ständige Bewegung in einer Lösung (50 ml) aus 10 : 10 : 1 AcOH/CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH abgetrennt. Die Lösung wurde dann abfiltriert und das Harz mit weiterem reinen CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden am Rotationsverdampfer eingedampft und das Produkt durch Zugabe von Et&sub2;O und Abkühlen ausgefällt. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet. Ein Aliquot würde wieder in H&sub2;O/MeCN gelöst und über eine RP-HPLC Säule (Vydac 218TP1022, 22 · 250 mm, 10 ml/min, 5 bis 50% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 50 min) chromatographisch getrennt. Geeignete Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und lyophilisiert. Das NMR-Spektrum des Produktes, Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(Gly- OH)/D-Ser(But)-OBut)], stimmte mit der vorhergesagten Struktur überein und es wies eine Reinheit von > 99% auf (tR = 21,6 min, Vydac 218TP54, 4,6 · 250 mm, 1 ml/min, 5 bis 50% MeCN in O,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm).
Dieses Material wurde durch 1-ständige Behandlung mit einem Überschuß CF&sub3;COOH, das 2% H&sub2;O enthielt, entschütztt. Die Lösung wurde eingedampft und Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(Gly-OH)/(D-Ser-OH)] wurde durch Zugabe von Et&sub2;O ausgefällt. Das Produkt wurde getrocknet und aus H&sub2;O lyophilisiert. Analytische RP-HPLC: tR = 4,7 min, > 99% Reinheit (Vydac 218TP54, 4,6 · 250 mm, 1 ml/min, 0 bis 12% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm)
FAB-MS [M+H]&spplus; = 313,2, C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub7; = 312,24.

Beispiel 9

N,N'-(But-1,4-yl)pyrazin-2,3-dicarboxamid
Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (1 g, 6 mmol) wurde mit DIC (0,93 ml, 6 mmol) in DMF (20 ml) behandelt, um das Anhydrid in situ herzustellen. Nach 10 min wurde die Lösung mit DMF auf 50 ml verdünnt und 1,4-Diaminobutan (0,53 g, 6 mmol) in DMF (10 ml) wurde im Laufe von 5 min tropfenweise hinzugefügt. Bald beobachtete man die Präzipitation eines Feststoffs. Eine Lösung aus PyBOP (3,38 g, 6,5 mmol), HOBt (6,5 mmol) und NMM (1 ml, 9,8 mmol) in DMF (10 ml) wurde hergestellt und langsam zu der oben genannten Suspension zugegeben (unter weiterem Verdünnen auf 90 ml mit DMF). Nach 2-stündigem Rühren war die Auflösung vollständig. DMF wurde dann im Ölpumpenvakuum entfernt und die erhaltene Paste wurde in CHCl&sub3;/MeOH (3 : 1, v/v) wieder aufgelöst und über eine Silicagel Chromatographie-Säule filtriert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Etwas restliches HOBt wurde folgendermaßen entfernt: das getrocknete Rohprodukt wurde in 0,1% wässr. CF&sub3;COOH aufgenommen und mehrere Male mit Et&sub2;O extrahiert. Die wässrige Phase wurde dann lyophilisiert, das Produkt wurde durch RP-HPLC (Vydac 218TP1022, 22 · 250 mm, 10 ml/min, 0 bis 10% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 40 min) chromatographisch getrennt und ergab die reine Titelverbindung, deren NMR-Spektrum mit der vorhergesagten Struktur übereinstimmte. Analytische RP-HPLC: tR = 12,06 min (Vydac 218TP54, 4,6 · 25 mm, 1 ml/min, 0 bis 20% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm).

Beispiel 10

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(L-Ser)/(D-Ser)]-(Asp)&sub2;- Dasa-(Lys-OH)&sub2;
(a) [Fmoc-Asp(OBut)]&sub2;-Dasa-[Lys(Boc)]&sub2;-SASRIN-Harz
Fmoc-Lys(Boc)-SASRIN-Harz (5 g, 0,6 mmol/g) wurde mit DMF gewaschen und dann 15 min mit 20% Piperidin in DMF behandelt, um die Fmoc-Gruppen zu entfernen. Nach wiederholtem Waschen mit DMF, wurde Fmoc&sub2;-Dasa-(OH)&sub2; (648 mg, 1 mmol) im Laufe von 10 h mit. Hilfe von DCC (1,03 g, 5 mmol) und HOBt (765 mg, 5 mmol) in DMF an das entschützte Harz gekoppelt. Nach dem Waschen wurde ein weiterer Kupplungscyclus (1 h) mit ähnlichen Mengen DCC und HOBt durchgeführt um noch verbliebene freie Dasa-carboxylgruppen an das Harz-gebundene Lys zu koppeln. Das Dipeptidyl-Harz wurde dann mit 30% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 20 min) und DMF gewaschen. Unbehandelte Lys Aminogruppen wurden durch 1-stündige Reaktion mit 10% Ac&sub2;O/DMF (2 · 50 ml) geschützt. Nach erneuter Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wurde im Laufe von 2 h mit Fmoc-Asp(OBut)-OPfp (5,78 g, 10 mmol) und HOBt (1,53 g, 10 mmol) acyliert. Das Endprodukt wurde mit DMF, CH&sub2;Cl&sub2; und Et&sub2;O gewaschen bevor es im Vakuum getrocknet wurde. Das Peptidyl-Harz enthielt nach spektrophotometrischer Analyse der Fmoc-Freisetzung aus einem aliquoten Teil des Harzes 0,36 mmol/g Aminogruppen (Dibenzofulven-Piperidin-Addukt, &epsi;&sub2;&sub6;&sub7; = 18,98, &epsi;&sub3;&sub0;&sub1; = 8,550, R. Frank, R. Döring, Tetrahedron, 1988, 44: 6031-6040).
(b) Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(L-Ser)/(D-Ser)]-(Asp)&sub2;-Dasa-(Lys-OH)&sub2;
Ein Aliquot des [Fmoc-Asp(OBut)]&sub2;-Dasa-[Lys(Boc)]&sub2;-SASRIN-Harzes (167 mg/ 0,06 mmol) wurde mit 20% Piperidin/DMF Fmoc-entschützt und es wurde mit DMF gewaschen. Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(D-Ser- OH)/(L-Ser-OH)] (18 mg, 0,05 mmol) wurde dann mit PyBOP (78 mg, 0,15 mmol), HOBt (20 mg, 0,15 mmol) und NMM (25 ul, 0,225 mmol) in DMF aktiviert und das Gemisch wurde dem entschützten Harz zugefügt. Dies ließ man über Nacht durch Bewegung des Reaktionsgemischs durch einen N&sub2;-Strom reagieren. Das Harz wurde nacheinander mit DMF, CH&sub2;Cl&sub2; und Et&sub2;O gewaschen bevor man es im Vakuum trocknete. Es wurde dann 1 h mit CF&sub3;COOH, das 5% H&sub2;O enthielt, behandelt. Der Harzrückstand wurde abfiltriert, das Filtrat wurde eingedampft und das Peptid-Rohprodukt wurde durch Hinzufügen von Et&sub2;O ausgefällt. Das getrocknete Peptid-Material wurde erneut in H&sub2;O gelöst und mittels semi-präparativer RP-HPLC und shallow Gradientenelution mit MeCN-Gradienten in 0,1% wässr. CF&sub3;COOH auf einer C&sub1;&sub8;-Säule fraktioniert. Geeignete Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt, aufkonzentriert und erneut bis zur Homogenität chromatographiert. Das analytisch richtige Produkt zeigte in der analytischen RP-HPLC: tR = 11,34 min (Vydac 218TP54, 1 ml/min, 0 bis 20% MeCN in 0,1% äq. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm); co-Chromatographie einer Probe von Pyrazin-2,3-dicarboxyl-(L-Ser)&sub2;-(Asp)&sub2;-Dasa-(Lys-OH)&sub2; das in ähnlicher Weise hergestellt wurde zeigte tR = 11,67 min für das di-L-Ser-Isomer. FAB-MS [M+H]&spplus; = 997, C&sub4;&sub0;H&sub6;&sub0;N&sub1;&sub2;O&sub1;&sub8; = 996,98.

Beispiel 11

N,N'-Bis-[(tris(hydroxymethyl)methyl]-pyrazin- 2,3-dicarboxamid
Methylpyrazin-2,3-dicarboxylat (2 g, 10,2 mmol) wurde in EtOH (5 ml) gelöst. Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (2,47 g, 20,4 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde 8 h zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen, Filtrieren, Waschen mit EtOH und Trocknen wurde die kristalline Titelverbindung (2,54 g, 66,8%) erhalten.
¹H-NMR (DMSO): δ = 8,78 (s, 2H), 8,00 (s, 2H), 4,61 (t, J = 5,8 Hz, 6H), 3,71 (d, J = 5,8 Hz, 12H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 164,68, 145,80, 144,69, 62,70, 60,09.
MS: [M+H]&spplus; = 375,5, C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub2;N&sub4;O&sub8; = 374,36.

Beispiel 12

N,N,N',N'-Tetrakis(2-hydroxyethyl)pyrazin-2,3- dicarboxamid
Methylpyrazin-2,3-dicarboxylat (2 g, 10,2 mmol) wurde in EtOH (5 ml) gelöst. Diethanolamin (2,14 g, 2-0,4 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde 5 h zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel eingedampft, der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel (CHCl&sub3;/MeOH, 8 : 2) gereinigt und ergab 1 die Titelverbindung (2,5 g, 71,4%).
¹H-NMR (DMSO): δ = 8,70(s, 2H), 4,70 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 4,67 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,54 (m, 12H), 3,32 (m, 4H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 166,65, 148,90, 143,27, 59,59, 58,33, 51,57, 48,76.
MS: [M+H]&spplus; = 343,4, C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub2;N&sub4;O&sub6; = 342,36.

Beispiel 13

N,N'-Bis(1,3-dihydroxyprop-2-yl)pyrazin-2,3- dicarboxamid
Methylpyrazin-2,3-dicarboxylat (2 g, 10,2 mmol) wurde in EtOH (5 ml) gelöst. 2-Amino-1,3-propandiol (1,86 g, 20,4 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung 4 h zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel eingedampft, der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (CHCl&sub3;/MeOH, 8 : 2) gereinigt und ergab die Titelverbindung (2 g, 62,5%).
¹H-NMR (DMSO): δ = 8,77 (s, 2H), 8,21 (d, J = 8,40 Hz, 2H), 4,61 (t, J = 5,80 Hz, 4H), 3,91 (m, 2H), 3,55 (m, 8H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 164,35, 146,28, 144,58, 59,99, 53,31.
MS: [M+H]&spplus; = 315,4 C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub8;N&sub4;O&sub6; = 314,30.

Beispiel 14

N,N'-Bis(2-hydroxyethyl)pyrazin-2,3-dicarboxamid
Methylpyrazin-2,3-dicarboxylat (2 g, 10,2 mmol) wurde in EtOH (3 ml) gelöst. Ethanolamin (1,25 g, 20,4 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung 6 h zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel eingedampft, der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (EtOAc/MeOH, 3 : 1) gereinigt und ergab die Titelverbindung (1,7 g, 65,4%).
¹H-NMR (DMSO): δ = 8,76 (s, 2H), 8,49 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 4,70 (br. s, 2H), 3,53 (t, J = 6,3 Hz, 4H), 3,33 (m, 4H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 164,66, 146,60, 144,56, 59,72, 41,83.

Beispiel 15

Pyrazin-2,3-dicarboxylmorpholindiamid
Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (1 g, 5,95 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) suspendiert. Morpholin (1,04 g, 11,9 mmol) und HOBt (2,37 g, 15 mmol) wurden hinzugefügt und die Mischung auf 0ºC abgekühlt. DCC (2,46 g 11,9 mmol) wurde dann hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde über Nacht zum Aufwärmen auf Raumtemperatur belassen. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (CHCl&sub3;/MeOH, 19 : 1) und ergab die Titelverbindung (1,43 g, 78,6%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ = 8,54 (s, 2H), 3,78 (s, 8H), 3,74 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,45 (t, J = 5,0 Hz, 4H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ = 165,28, 149,97, 142,73, 47,60, 42,51.

Beispiel 16

Benzyliminodiacetatdiamid der Pyrazin-2,3-dicarbonsäure
(a) Boc-Iminodiessigsäure
Iminoessigsäure (3 g, 22,5 mmol) wurde in einer Mischung von 2 M NaOH (25 ml), H&sub2;O (25 ml) und Dioxan (25 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und eine Lösung von Boc&sub2;O (5,46 g, 25 mmol) in Dioxan (25 ml) wurde auf, einmal hinzugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Die Lösung wurde dann auf 50 ml eingeengt und ihr pH-Wert mit 5%iger wässr. KHSO&sub4; auf 2 eingestellt. Sie wurde mit EtOac extrahiert, über MgSO&sub4; getrocknet, eingedampft und ergab dies Titelverbindung (5,07 g, 96,6%).
¹H-NMR (DMSO): δ = 3,91 (s, 2H), 3,88 (5, 2H), 1,36 (s, 9H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 171,21, 154,87, 79,68, 49,76, 49,23, 27,93.
(b) Boc-Iminodiessigsäuredibenzylester
Boc-Iminodiessigsäure (5 g, 21,44 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (5,24 g, 42,87 mol), Benzylalkohol (4,64 g, 42,9 mmol) und HOBt (6,8 g, 43 mmol) wurden in CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) gelöst und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. DCC (8,84 g, 42,9 mmol) wurde hinzugefügt und die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Ausgefallener Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat mit 4%iger wässr. NaHCO&sub3; extrahiert.
Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (Petrolether/EtOAc, 3 : 1) gereinigt und ergab die Titelverbindung (4,6 g, 52,3%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ = 7,34 (m, 10H), 5,17 (s, 2H), 5,16 (s, 2H), 4,17 (s, 2H), 4,05 (s, 2H), 1,39 (s, 9H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ = 169,67, 169,54, 155,04, 135,46, 128,61, 128,58, 128,46, 128,36, 128,24, 81,19, 66,86, 66,81, 49,81, 49,23, 28,10.
(c) Iminodiessigsäuredibenzylester-Hydrochlorid
Boc-Iminodiessigsäuredibenzylester (4,5 g, 10,88 mmol) wurde in Dioxan (15 ml) gelöst. Dann wurde 4,6 M HCl in Dioxan (20 ml) hinzugefügt. Die Mischung wurde 90 min bei Raumtemperatur gerührt und Et&sub2;O (200 ml) wurde hinzugefügt. Das kristalline Produkt wurde abfiltriert, zweimal mit Et&sub2;O gewaschen, im Vakuum getrocknet und ergab die Titelverbindung (3,58 g, 94,2%).
¹H-NMR (DMSO): δ = 10,0 (br. s, 2H), 7,4 (m, 10H), 5,25 (s, 4H), 4,07 (s, 4H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 166,55, 135,23, 128,60, 128,51, 128,34, 67,10, 46,73.
(d) Benzyliminodiacetatdiamid der Pyrazin-2,3-dicarbonsäure
Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (0,72 g, 4,29 mmol), Iminodiessigsäuredibenzylester-Hydrochlorid (3 g, 8,58 mmol), Pri&sub2;NEt (1,11 g, 8,6 mmol) und HOBt (237 g, 15 mol) wurden in CH&sub2;Cl&sub2; (70 ml) gelöst und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. Dann wurde DCC (1,77 g, 8,6 mmol) hinzugefügt und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde dann abfiltriert und das Filtrat mit 4% wässr. NaHCO&sub3; extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (Petrolether/EtOAc, 1 : 1) gereinigt und ergab die Titelverbindung (2,13 g, 67%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ = 8,19 (s, 2H), 7,33 (m, 20H), 5,17 (s, 4H), 5,16 (s, 4H), 4,48 (s, 4H), 4,25 (s, 4H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ = 168,53, 168,19, 166,40, 149,04, 142,78, 135,47, 135,38, 128,60, 128,58, 128,54, 128,46, 128,37, 128,30, 66,97, 51,24, 48,27.

Beispiel 17

N,N'-Bis(diethylmalonyl)pyrazin-2,3-dicarboxamid
Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (3,97 g, 23,5 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (300 ml) suspendiert. Diethylmalonat-Hydrochlorid (10 g, 47,25 mmol), HOBt (7,9 g, 50 mmol) und Pri&sub2;NEt (6,2 g, 48 mmol) wurden hinzugefügt und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimid (9,2 g, 48 mmol) wurde hinzugefügt und die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Die Mischung wurde mit 4% wässr. NaHCO&sub3; extrahiert, die organische Phase über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Petrolether/EtOAc, 1 : 1) und ergab die Titelverbindung (7,58 g, 60%).
¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ = 8,71 (s, 2H), 7,93 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 5,39 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 4,29 (m, 8H), 1,31 (t, J = 7,2 Hz, 12H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ = 165,84, 163,44, 145,77, 144,63, 62,71, 56,60, 13,96.

Beispiel 18

N,N,N',N'-Tetrakis(2-hydroxyethyl)pyridin-2,3-dicarboxamid
Pyridin-2,3-dicarbonsäuredimethylester (2 g, 10,25 mmol) wurde in EtOH (5 ml) gelöst. Diethanolamin (2,16 g, 20,5 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung 6 h zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel eingedampft, der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel (CHCl&sub3;/MeOH, 8 : 2) gereinigt und ergab die Titelverbindung (1,99 g, 57%).
¹H-NMR (DMSO): δ = 8,57 (m, 1H), 7,91 (m, 1H), 7,49 (m, 1H), 4,70 (m, 4H), 3,57 (m, 4H), 3,51 (m, 8H), 3,31 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,23 (t, J = 5,8 Hz, 2H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 168,52, 168,02, 152,15, 148,31, 135,44, 131,69, 123,62, 59,50, 58, 59, 58,42, 58,17, 51,90, 51,55, 48,63, 47,61.

Beispiel 19

N,N'-Bis(1,3-dihydroxyprop-2-yl)pyridin-2,3-dicarboxamid
Pyridin-2,3-dicarbonsäuredimethylester (2 g, 10,25 mmol) wurde in EtOH (5 ml) aufgelöst. 2-Amino-1,3-propandiol (1,87 g, 20,5 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde 6 h zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (CHCl&sub3;/MeOH, 7 : 4) gereinigt und ergab die Titelverbindung (4 g, 75%).
¹H-NMR (DMSO): δ = 8,64 (m, 1H), 8,33 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,85 (m, 1H), 7,61 (m, 1H), 4,75 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 4,45 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 3,889 (m, 2H), 3,50 (m, 8H).
¹³C-NMR (DMSO): δ = 167,64, 163,88, 148,44, 146,96, 137,14, 133,85, 125,88, 60,47, 59,83, 53,89, 52,90.

Beispiel 20

Pyrazin-2,3-dimethyl-di-(D-Ser-OH)
2,3-Bis(chlormethyl)pyrazin wurde aus 2,3-Dimethylpyrazin durch freie radikalische Chlorierung hergestellt (siehe G. R. Newkome et al., Synthesis, 1984, 676-679) und durch Chromatographie an Kieselgel (CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc, 10 : 1) gereinigt. H-D-Ser(But)-OBut (0,58 g, 2,26 mmol) und NMM (0,35 ml, 3,4 mmol) wurden in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) gelöst. Zu der gerührten Lösung fügte man 2,3-Bis-(chlormethyl)pyrazin (0,1 g, 0,57 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (1 ml) hinzu und ließ das gesamte Gemisch 2 d bei Raumtemperatur rühren. Das Gemisch wurde dann mit CH&sub2;Cl&sub2; auf 30 ml verdünnt und nacheinander mit NaHCO&sub3; (3 · 10 ml) und H&sub2;O (1 · 10 ml) extrahiert. Die organische Fraktion wurde eingedampft und erneut in CF&sub3;COOH (15 ml) gelöst. Nach 0,5-stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rückstand in H&sub2;O gelöst. Diese Lösung wurde mehrere Male mit Et&sub2;O extrahiert. Der wässrige Teil wurde direkt auf einer RP-HPLC- Säule (Vydac 201HS1022) durch Anwendung eines Lösungsmittelgradienten aus 0 bis 5% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH bei 10 ml/min über 30 min hinweg fraktioniert. Die Fraktionen, die das gemischte Produkt enthielten wurden vereinigt. Weitere Fraktionen, die das unvollständig geschützte Produkt enthielten (t-Butylgruppen im NMR nachweisbar) wurden ebenfalls vereinigt, lyophilisiert und 1,5 h mit CF&sub3;COOH weiterbehandelt. Nach der wie oben angegebenen Aufarbeitung wurden beide Teile des Produkts zusammengegeben und mittels RP-HPLC (Säule wie oben) bei isokratischer Elution mit 5 ml/min mit 0,1% aq. CF&sub3;COOH bis zur Homogenität gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt, lyophilisiert und man erhielt die Titelverbindung (7 mg). Analytische RP-HPLC: tR = 3,0 min (Vydac 201HS54, 4,6 · 250 mm, 1 ml/min, 0 bis 20% MeCN in 0,1% aq. CF&sub3;COOH über 20 min, λ = 215 nm).
FAB-MS [M+H]&spplus; = 315,3 C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub8;O&sub6;N&sub4; = 314,30
¹H-NMR (DMSO): δ = 3,86 (m, Ser Cβ&sub2;, 4H), 3,95 (m, Ser Cα , 2H), 4,4 (s, Ar-C &sub2;, 4H), 8,65 (s, Ar-H, 2H).

Beispiel 21

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di-[(D-Ser)-benzylester]
D-Serinbenzylester-Hydrochlorid (0,93 g, 4 mmol) wurde in DMF (20 ml) gelöst und NMM (0,4 ml, 4 mmol) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde zu einer vorbereiteten Lösung von Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (0,17 g, 1 mmol), 0-(7-Azabenzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (0,76 g, 2 mmol) und NMM (0,4 ml, 4 mmol) in DMF (10 ml) gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 2,5 h gerührt. DMF wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mittels CH&sub2;Cl&sub2; und 5% aq. NaHCO&sub3; aufgetrennt. Die organische Phase wurde weiter mit 5% aq. NaHCO&sub3;, 5% aq. Zitronensäure und H&sub2;O extrahiert bevor man sie über Na&sub2;SO&sub4; trocknete, filtrierte und eindampfte. Der Rückstand wurde aus Hexan/PriOH (1 : 1) umkristallisiert, abfiltriert, mit Et&sub2;O gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Material wurde erneut in MeCN/H&sub2;O (3 : 1) gelöst, die Lösung wurde lyophilisiert und man erhielt die reine Titelverbindung.
MALDI-TOF MS [M+H]&spplus; = 523,3, C&sub2;&sub6;H&sub2;&sub6;O&sub8;N&sub4; = 522,51
¹H-NMR (DMSO): δ = 3,72-3,88 (dm, Ser Cβ&sub2;, 4H), 4,62 (m, Ser Cα , 2H), 5,16 (s, Ar-C &sub2;, 4H), 7,29-7,40 (m, Ar-H Benzyl, 1OH), 8,81 (s, Ar-H Pyrazin, 2H).

Beispiel 22

Pyrazin-2-[N-bis-(2-hydroxyethyl)-carboxamid]- 3-[N-(2-methyl-1,3-propandiol-2-yl]-carboxamid
Eine Lösung aus Pyrazin-2,3-dicarbonsäure (50 g, 297,50 mmol) in 300 ml Methanol und 15 ml konzentrierter Schwefelsäure wurde 24 h zum Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde zur Entfernung des Methanols aufkonzentriert, der Rückstand in 450 ml Ethylacetat aufgenommen und die Lösung mit 450 ml gesättigter NaHCO&sub3; extrahiert. Die organische Phase wurde dann nacheinander mit 450 ml H&sub2;O extrahiert, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Pyrazin-2,3-dicarbonsäuredimethylester wurde als oranges Öl erhalten (46,9 g) 80%).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) : δ = 164,32, 145,20, 144,41, 52,90.
(b) Pyrazin-2-[N-bis-(2-hydroxyethyl)-carboxamid]-3- [N-(2-methyl-1,3-propandiol-2-yl)-carboxamid]
Eine Lösung aus Pyrazin-2,3-dicarbonsäuredimethylester (0,25 g, 1,27 mmol), 2-Amino-2-methylpropan-1,3-diol (0,132 g, 1,26 mmol) und Diethanolamin (0,134 g, 1,27 mmol) in 15 ml Ethanol wurde 24 h zum Rückfluß erhitzt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand (0,26 g) wurde mit 90 g Kieselgel 60 (35 bis 70 mesh) und CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (5 : 1) vorgereinigt. Die verbliebenen 120 mg wurden mit Kieselgel 60 (20 bis 45 mesh) und Methylethylketon/Methanol (40 : 5) gereinigt. Ausbeute: 38 mg der reinen Verbindung. ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;): δ = 167,21, 162,15, 149,87, 146,36, 143,13, 142,33, 63,43, 59,15, 58,32, 58,28, 51,15, 48,03, 18,07.

Beispiel 23

Pyrazin-2-[N-bis-(2-hydroxyethyl)-carboxamid]- 3-[N-tris(hydroxymethyl)methyl]carboxamid
Eine Lösung aus Pyrazin-2,3-dicarbonsäuredimethylester (5,5 g, 28,04 mmol), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (3,4 g, 28,07 mmol) und Diethanolamin (2,85 g, 27,11 mmol) in 60 ml Ethanol wurde 24 h zum Rückfluß erhitzt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt (11,72 g) wurde mit 90 g Kieselgel 60 (35 bis 70 mesh) und CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (5 : 1) gereinigt. Der Rückstand nach dem Eindampfen wurde erneut in 5 mLH&sub2;O gelöst, die Lösung lyophilisiert und man erhielt 200 mg der Titelverbindung als gelbliches Pulver.
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;): δ = 170,72, 164,80, 151,02, 147,93, 145,03, 143,79, 63,78, 62,45, 61,05, 60,45, 53,40, 50,29.

Beispiel 24

Pyrazin-2-[N-(2-methyl-1,3-propandiol-2-yl)]- 3-{N-[tris(hydroxymethyl)]methyl}carboxamid
Eine Lösung aus Pyrazin-2,3-dicarbonsäuredimethylester (5,5 g, 28,04 mmol), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (3,4 g, 28,07 mmol) und 2-Amino-2-methylpropan-1,3-diol (2,85 g, 27,11 mmol) in 60 ml Ethanol wurde 24 h zum Rückfluß erhitzt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt (11,24 g) wurde mit 90 g Kieselgel 60 (35 bis 70 mesh) und CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (5 : 1) gereinigt. Der Rück stand nach dem Eindampfen wurde erneut in 5 ml H&sub2;O gelöst, die Lösung lyophilisiert und man erhielt 260 mg der Titelverbindung als gelbliches Pulver.
¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;): δ = 164,71, 164,40, 145,99, 145,92, 144,69, 63,52, 62,72, 60,07, 58,94, 18,36.

Claims

1. Verbindungen der Formel I:

worin

R¹ für eine Gruppe

oder -G-D steht;

einer der Reste R², R³ und R&sup4; für eine Gruppe gemäß der vorstehenden Definition für R¹ steht, die gleich oder verschieden yon R¹ sein kann, und die verbleibenden zwei Reste R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe stehen;

oder R¹ und R² zusammen eine -CONH-W-NHCO- Gruppe bilden, und R³ und R&sup4; unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe stehen;

oder R³ und R&sup4; zusammen mit den dazwischenliegenden Ringkohlenstoffatomen einen aromatischen Ring bilden, und R¹ und R² jeweils für

oder -G-D stehen;

Z für -N- oder -CH- steht;

A für -CO- oder -CH&sub2;- steht;

G für cis- oder trans- -CH=CH- oder eine Gruppe der Formel

steht, worin X für -O-, -S-, -NH- oder -CH&sub2;- steht;

D für eine Gruppe -CR&sup5;R&sup6;R&sup7; oder -CR&sup8;[(CH&sub2;)l-X']&sub2; steht, worin

R&sup5; für -H oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe steht, die gegebenenfalls, durch eine Hydroxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, Carboxy-, Phenyl- oder Hydroxyphenylgruppe substituiert ist;

R&sup6; für -H oder -CH&sub3; steht;

R&sup7; für -CO&sub2;R&sup9; oder -CONR&sup9;R&sup9; steht;

R&sup8; für -H oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe steht, die gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist;

X' für -OH, -NH&sub2;, -CO&sub2;R&sup9; oder -CONR&sup9;R&sup9; steht;

jedes R&sup9; unabhängig voneinander für -H oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe steht;

l oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist;

E für -H, -OH oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl steht;

oder D und E jeweils für eine Gruppe -(CH&sub2;)k-X' oder -(CH&sub2;)k-CO&sub2;R¹&sup0; stehen, worin k eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, X' die oben angegebene Bedeutung hat und R¹&sup0; für eine C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Aralkylgruppe steht;

oder D und E zusammen mit dem dazwischenliegenden Stickstoffatom eine heterocyclische Gruppe der Formel

bilden, worin jedes m unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 1 bis 3 steht;

Y für -O-, -NH-, -S-, -SO- oder -SO&sub2;- steht;

W für eine geradkettige oder verzweigte C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylengruppe steht, die durch eine oder mehrere -O- oder -NH-, Gruppen unterbrochen sein kann und die eine oder mehrere, OH-, NH&sub2;- oder Carboxylgruppen tragen kann, oder die eine oder mehrere Carbonylgruppen neben gegebenenfalls unterbrechenden -NH-Gruppen tragen kann, wie eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylengruppe, -CH&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-O-CH&sub2;-, -CH(COR¹¹)-(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub6;-CH(COR¹¹)- oder -CH(CH&sub2;OH)-CO-V-CO-CH(CH&sub2;OH)-;

worin jedes R¹¹ unabhängig voneinander für -OH oder -NH&sub2; steht;

und

V für -NH-(CH&sub2;)&sub2;-CONH-(C&sub6;H&sub9;)-NHCO-(CH&sub2;)&sub2;-NH-, -NH-CH&sub2;-CONH-CH&sub2;-(C&sub6;H&sub4;)-CH&sub2;-NHCO-CH&sub2;-NH- oder -NH-CH(CH&sub2;CO&sub2;H)-CO-NH-CHR¹²-(CH&sub2;)&sub4;-CHR¹²-NH-CO- CH(CH&sub2;CO&sub2;H)-NH- steht, worin R¹² für -CO-NH-CH(CO&sub2;H)-(CH&sub2;)&sub4;-NH&sub2;) steht,

und deren physiologisch verträgliche Salze.

2. Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R¹ und R² jeweils für

oder -C-D stehen;

3. Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder 2, worin Z für -N- steht; R¹ und R² jeweils für

stehen und R³ und R&sup4; für -H stehen.

4. Verbindungen gemäß Anspruch 1 der Formel (1), (2) oder (3):

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-di[D-Ser-OH]

N,N,N',N'-Tetrakis(2-hydroxyethyl)pyrazin-2,3-dicarboxamid

N,N'-Bis(1,3-dihydroxyprop-2-yl)pyrazin-2,3-dicarboxamid

5. Verbindung gemäß Anspruch 1 der Formel (4):

Pyrazin-2,3-dicarboxyl-[(L-Ser)/(D-Ser)]-(Asp)&sub2;-Dasa-(Lys-OH)&sub2;.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten.

7. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Regulierung der Hämatopoese.

8. Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Regulierung der Hämatopoese.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren einen beliebigen der folgenden Schritte umfasst:

(a) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für

steht, worin A für -CO- steht) Umsetzung der entsprechenden Pydridin- oder Pyrazin-2,3-, -2,5- oder -2,6-dicarbonsäuren, -ester oder eines aktivierten Derivats davon, mit einer Gruppe der Formel II

(worin D und E die oben angegebene Bedeutung haben);

(b) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für

steht, worin A für -CH&sub2;- steht) Umsetzung des entsprechenden Pyridin- oder Pyrazin-2,3-, 2,5- oder 2,6-bis(chlormethyl)derivats mit einer Gruppe der oben angegebenen Formel II;

(c) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für -G-D steht, worin G für cis- oder trans- -CH=CH- steht) Umsetzung des entsprechenden Pyridin- oder Pyrazin-2,3-, -2,5- oder -2,6-dialdehyds mit einem Phosphorylid der Formel III

wobei ein solcher Pyridin- oder Pyrazindialdehyd geeigneterweise aus den entsprechenden Dicarbonsäuren, Disäurederivaten, Dialkoholen, Diacetalen etc. erhältlich ist.

(d) (zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R¹ und einer der Reste R², R³ und R&sup4; für -G-D steht, worin G für eine Gruppe der Formel

steht) Umsetzung der entsprechenden Pyridin- oder Pyrazin- 2,3-, -2,5- oder -2,6-Dicarbonsäuren oder eines aktivierten Derivats davon, wie Iminoester, Nitrile etc., mit einer Gruppe der Formel IV

(worin X und D die oben angegebene Bedeutung haben), worauf gegebenenfalls eine Oxidation folgt;

(e) (zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R¹ und zusammen eine -CO-NH-W-NH-CO-Gruppe bilden, worin W die oben angegebene Bedeutung hat) Umsetzung eines Diamins der Formel H&sub2;N-W-NH&sub2; mit einer Pyridin- oder Pyrazin-2,3-dicarbonsäure oder einem aktivierten Derivat davon oder einem 2,3- Carbonsäureanhydrid;

(f) (zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R³ und R&sup4; zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden) Verwendung einer bicyclischen aromatischen Verbindung, wie Chinolin-2,3-dicarbonsäure oder ihres Anhydrids, in den Verfahren (a) oder (d);

(g) Umwandlung einer gemäß einem der Schritte (a) bis (c) hergestellten Verbindung der Formel I in ein Salz davon;

(h) Auflösung einer chiralen Verbindung der Formel I in ihre Isomere.

10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die teilweise oder voll ständige Abspaltung von Schutzgruppen aus einem geschützten Derivat einer Verbindung der Formel I umfasst.