DE3712050C2

DE3712050C2 -

Info

Publication number: DE3712050C2
Application number: DE3712050A
Authority: DE
Inventors: Brunetto Mailand/Milano It Brunetti; Marco Casalpusterlengo Mailand/Milano It Prada
Original assignee: Ellem Industria Farmaceutica SpA
Current assignee: Ellem Industria Farmaceutica SpA
Priority date: 1986-04-09
Filing date: 1987-04-09
Publication date: 1992-02-13
Also published as: JPH0645637B2; AU7118287A; IT8620027A0; GR870568B; IE870881L; SE8701457L; DE3712050A1; SE8701457D0; GB2189491B; IT1188646B; IT8620027A1; IE59806B1; JPS62267296A; CA1322715C; FR2597107B1; GB8708492D0; ATA88387A; GB2189491A; CH676467A5; AU597048B2

Description

Die Erfindung betrifft den durch die Patentansprüche gekennzeichneten Gegenstand und vor allem ein Arzneimittel, enthaltend das Tripeptid Arg-Ala-Arg, mit immunostimulierender Aktivität. Die Erfindung betrifft insbesondere das vorstehende Arzneimittel mit immunostimulierender Aktivität sowohl nach parenteraler wie auch oraler Verabreichung. Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist insbesondere für Krankheiten vorgesehen, die durch primären und sekundären Mangel des Immunsystems gekennzeichnet sind.

Das in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaltene Tripeptid Arg-Ala-Arg ist aus dem Journal of General Chemistry of the USSR, 1986, S. 643, 644 bekannt.

Aus Literaturdaten ist es bekannt, daß L-Alanin wichtig für die Funktion von T-Lymphocyten ist, da es wesentlich ist, damit diese Zellen in vitro auf Mitose auslösende Stimulierung antworten können (Rotter V. et al.: J. Immunol. 123, 1726, 1979); darüber hinaus ist L-Alanin für das in-vitro-Wachstum von Lymphocyten wesentlich (Nordlind K. et al.: Int. Archs Allergy appl. Immunol. 59, 215, 1979).

Laborergebnisse der Anmelderin dokumentieren jedoch nur eine sehr schwache immunostimulierende Aktivität dieser Aminosäure, wie dies im in-vitro-Versuch von Thy 1,2-Induktion an unreifen T-Zellen von normalen Mäusen gezeigt ist.

Auch von L-Arginin wird berichtet, daß es mit immunostimulierender Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo ausgestattet ist, insbesondere bei verletzten und gereizten Tieren (Barbul A. et al.: J. Surg. Res. 29, 228, 1980; J. Parenteral Enteral Nutr. 4,446, 1980; ibid. 5,492, 1981) und bei experimentell herbeigeführten Tumoren (Rettura G.: J. Parenteral Enteral Nutrition 3,409, 1979).

Vorliegend wurde im Versuch an Thy 1,2-Induktion gefunden, daß auch L-Arginin eine schwache Aktivität zeigt, obwohl diese statistisch bedeutungsvoll ist.

Im Rahmen der Erfindung wurde die Aktivität des Tripeptids mit der Sequenz Arg-Ala-Arg mit derjenigen einer Mischung von 2 einzelnen Aminosäuren in einem molaren Verhältnis von 2 Arg : 1 Ala verglichen. Das Tripeptid führte zu dem Ergebnis, daß es weitaus aktiver als die Mischung von zwei Aminosäuren ist, da es 13% der Zellen induziert (P < 0,01) (P = probability = Wahrscheinlichkeit), verglichen mit nur 5% im Fall der Mischung (statistisch nicht bedeutungsvoll).

L-Arginin wurde für beide Endpositionen des Tripeptids gewählt, da in vielen bekannten immunostimulierenden Peptiden diese Aminosäure entweder die N-terminale (wie im Fall von Thymopentin) oder die C-terminale (beispielsweise bei Tuftsin, Ubiquitin, Thymopoietin) Stellung besetzt.

Chemische Merkmale

Molekulargewicht: 401,49Optische Drehung: [α] (c = 1, Essigsäure)

HPLC-(Hochdruckflüssigkeitschromatographie)-Analyse:

Das Tripeptid wurde mit Hilfe von Ionenpaar-HPLC gemäß den im folgenden beschriebenen Trennungsbedingungen analysiert:
Elutionsmittel: NaH₂PO₄ 0,05 M, pH=4,3 + SDS (Natriumdodecylsulfat) 5×10^-4 M: CH₃OH; 50 : 50.
Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min.
Wellenlänge der Detektion: 225 nm.
Injektionsvolumen: 20 µl.
Probe: 20 µg.
Säule: µ Bondapack C18 (Waters), 300 × 3,9 mm.

Die folgenden Apparaturen wurden verwendet:

Flüssigkeitschromatograph: Series 4 (Perkin Elmer).
Injektionsventil: Reodyne mod. 7125-075, mit einer 20-µl- Schleife.
Detektor: Spektrophotometer LC 95 (Perkin Elmer).
Rechenintegrator: Data Station 3600 (Perkin Elmer).

Fig. 1 zeigt das HPLC-Profil des Tripeptids.

*) NG=Substitution eines H-Atoms der NH-Gruppe im Guanidinteil von Arginin mit der NO₂-Gruppe.

Herstellung von Arg-Ala-Arg NO₂ (1) Boc-Ala-Arg-OBe (Boc = t-Butyloxycarbonyl; OBe = Benzylester)

Zu Boc-Ala (0,1 Mol), gelöst im Methylenchlorid und auf 0°C+/-1° abgekühlt, wurde unter Rühren Isobutylchlorformiat (0,1 Mol) zugefügt, während die Temperatur auf -15°C vermindert wird. Nach 15minütigem Rühren der Reaktionsmischung bei dieser Temperatur wurde eine vorgekühlte Lösung von NG*)-Nitro-argininbenzylester- di-p-tosylat (0,1 Mol) und N-Methylmorpholin (NMM) (0,2 Mol) in Dimethylformamid langsam zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatlösung wurde mit Wasser, 1N-Chlorwasserstoffsäure, Wasser, 5% Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Es wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt ist sirupös. TLC-(Dünnschichtchromatographie)- System CHCl₃ : CH₃OH : Essigsäure (90 : 8 : 2). 95% rein: Ausbeute 80%.

Das unter (1) erhaltene Produkt wurde mit 50% Trifluoressigsäure (TFA)/Methylenchlorid (1 : 1), 10 ml/g eine halbe Stunde lang zur Entfernung der Schutzgruppen behandelt.

Es wurde unter vermindertem Druck eingedampft (der Rückstand) mit Ether verrieben, filtriert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 98%.

Das so erhaltene TFA-Ala-Arg-OBe wurde mit NMM neutralisiert und an Z3-Arg (Arginin 3 × mit Benzyloxycarbonyl substituiert) in Dimethylformamid/Tetrahydrofuran-Mischung unter Verwendung von NMM und Isobutylchlorformiat gekuppelt und wie in (1) aufgearbeitet. Ausbeute 60%. TLC-System CHCl₃ : CH₃OH (92 : 8). Ein Hauptpunkt.

Das obige Tripeptid wurde in Essigsäure/Wasser/Methanol-Mischung in Anwesenheit von Pd/C bis zur Vollständigkeit hydriert. Es wurde vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft.

Das Tripeptid-Produkt wurde durch Gegenstrom-Verteilung unter Verwendung des n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 5)-Systems gereinigt. Ausbeute 50%. TLC-System Butanol : Essigsäure : Wasser : Pyridin (32 : 6 : 22 : 20). Ein Hauptpunkt. HPLC 97%.

Das Tripeptid ist gegenüber der in vitro simulierten gastrischen Umgebung (Magenraum) resistent. In dieser Untersuchung wurde der simulierte gastrische (Magen) Saft USP XXI (HCl + Pepsin) (= United States Pharmacology XXI Ed.) bei 37°C während 5 Stunden verwendet.

Biologische Aktivitäten 1.A. In-vitro-Induktion von THY-1,2-Antigen

Die Fähigkeit von Arg-Ala-Arg in vitro die Differenzierung (Entwicklung) von Maus-T-Zell-Vorläufern in Lymphocyten expimierende T-Zellmarker hervorzurufen, wurde durch Nachweisen der Induzierung von Thy-1,2-Membranantigen untersucht.

Material und Verfahren

Es wurden 8 Wochen alte Mäuse (nu/nu) (= nude/nude) mit fehlender oder mangelhaft ausgebildeter Thymusdrüse, welche auf einem C3H/He-Untergrund, der unter speziellen pathogenfreien Bedingungen gehalten wurde, aufgezogen worden waren, verwendet.

Herstellung der Zellen

Die Milz wurde aseptisch entfernt, fein zerkleinert und durch ein feinmaschiges, rostfreies Stahlsieb in HBSS (Hank's balanced salt solution; Gibco Ltd.) eingeführt. Die Splenocyten, gewaschen und in 199-Medium (Gibco Ltd.), ergänzt mit 1% BSA (Bovin-Serum-Albumin, Boehringer Mannheim) und Gentamycin (100 µg/ml) erneut suspendiert, wurden 45 Minuten lang in äquilibrierten Wollesäulen gemäß dem Verfahren von Julius et al. (Eur. J. Immunol. 3, 645, 1973) inkubiert. Die ausfließenden Zellpopulationen, angereichert mit Vorläufer- T-Zellen, wurden in der biologischen Prüfung (bioassay) verwendet.

Die biologische Prüfung wurde wie folgt durchgeführt (Induction Bioassay):
0,5×10⁶ ausfließende Zellen in 0,1 ml Medium wurden bei 37°C 18 Stunden lang mit 0,1 ml des Tripeptids oder mit Medium alleine inkubiert. Die Kulturen wurden doppelt angesetzt. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen mit 0,87% Ammoniumchlorid gewaschen, um die roten Blutkörperchen zu lysieren und dann mit HBSS.

Die Induktion (Auslösung der Bildung) von Membran Thy 1,2- Antigen wurde durch einen direkten Immunofluoreszenztest bestimmt.

Direkter Immunofluoreszenztest:

Die Zellen wurden bei 4°C 20 Minuten lang mit mit Fluoreszein-konjugiertem monoclonalem Antikörper (Bio-Yeda) bei einer Verdünnung von 1 : 200 inkubiert. Die Mischung wurde bei 300 g 5 Minuten lang zentrifugiert, zweimal in HBSS gewaschen und dann zur Zählung am Fluoreszenzmikroskop (Leitz Orthoplan) suspendiert.

Der Unterschied in Prozenten von fluoreszierenden Zellen zwischen Kulturen mit und ohne Tripeptid ergab die induzierende (auslösende) Aktivität des Produkts.

Ergebnisse

Wie in der Tabelle gezeigt, induziert das Tripeptid das Erscheinen von Marker-Thy-1,2 an unreifen T-Zellen mit einer optimalen Empfindlichkeit bei 10 µg/ml. Die Kurve des Dosis/ Empfindlichkeitsverhältnisses ist glockenförmig, da sowohl niedrigere als auch höhere Konzentrationen des Tripeptids eine kleinere Induzierung hervorrufen.

1.B. In-vivo-Induktion von THY-1,2-Antigen Material und Verfahren

ELS2 (ELS2 = Arg-Ala-Arg) wurde an vier aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, nach denen den Mäusen 24 Stunden Ruhe gewährt wurde. Dann wurden die Milzen entfernt und die Zellen wurden durch Fluoreszenz auf Expression von Thy-1,2-Antigen untersucht. Den Kontrollmäusen wurde Medium 199 (M 199) gegeben, dem Medium, in welchem das Arzneimittel gelöst wurde. Die Mäuse hatten ein durchschnittliches Gewicht von 24 g.

Ergebnisse

Die Daten zeigen, daß ELS2 fähig ist, die Reifung von Splenocyten sowohl nach oraler wie nach intraperitonealer Verabreichung zu induzieren.

Die optimale Dosis beträgt 1055 µg/kg, während mit höheren Dosen eine Plateau-Empfindlichkeit beobachtet wird.

2. In-vitro-Stimulation von Lymphokin-Erzeugung Material und Verfahren Herstellung von menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen (PBMC).

Peripheres Blut wird von gesunden freiwilligen Versuchspersonen durch Venenpunktion erhalten. Die roten Blutkörperchen werden von den weißen Blutkörperchen auf Ficoll-Hipaque-Gradienten abgetrennt. Die Crusta phlogistica bzw. der Leukozytenfilm (PBMC) wird entfernt und gewaschen und die Zellen werden in einer Menge von 1 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640, ergänzt durch 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin und 1% Hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS, 56°C, 30 min) erneut suspendiert.

Herstellung des Wachstumsfaktors

PBMC in einer Menge von 1 × 10⁶ Zellen/ml in 1% Hitze-inaktiviertem FCS werden mit oder ohne Phytohämagglutinin (PHA) bei 0,75% Konzentration (vol/vol) inkubiert. Das zu untersuchende Peptid wird in einer Konzentration von 1 µg/ml geeigneten Kulturen zugefügt. Die Inkubationsdauer beträgt 18 bis 24 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre. Die Kulturen werden dann durch 0,2 mM-Filter filtriert und die Überstände auf Anwesenheit von Wachstumsfaktoren untersucht.

Messung der Wachstumsfaktoren in den Überständen A. Versuchszellen

Die B-Zellen, welche verwendet werden, um auf die Anwesenheit von B-Zell-Wachstumsfaktor (BCGF) zu prüfen, sind Langzeit-kultivierte Zellinien, gehalten auf BCGF und sind EBV (Ebbstein- Barr-Virus) -negativ. Diese Zellen werden in Serum-freiem Medium unter Verwendung von Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemikalien) gezüchtet und sprechen nicht auf IL-2 (Interlekin- 2) an.

Die T-Zellen, welche verwendet werden, um auf die Anwesenheit von IL-2 zu prüfen, werden frisch isoliert. Sie werden zuerst mit PHA (0,75%) angeregt und in Kultur wenigstens 10 Tage vor der Verwendung gehalten (um den Hintergrund zu vermindern und ihre Abhängigkeit von IL-2 zu begründen).

B. Herstellung von Versuchszellen zur Verwendung in der Prüfung (Assay)

1. Die B-Zellen werden gewöhnlich 4 Tage nach der letzten Fütterung mit BCGF verwendet. Sie werden viermal in RPMI 1640 gewaschen, um jegliches zurückgebliebene BCGF zu entfernen und auf eine Konzentration von 15 × 10⁴ Zellen/ml in RPMI 1640 und Nutridoma (bei 1% Endkonzentration) eingestellt.
2. Die T-Zellen werden vier Tage nach der letzten Fütterung mit IL-2 verwendet. Sie werden viermal gewaschen und auf 50 × 10⁴ Zellen/ml in RPMI 1640 mit 5% FCS eingestellt.

C. Prüfungsverfahren

1. Langzeit-kultivierte B-Zellen werden mit verschiedenen Konzentrationen von Überstand von PBMC-Kulturen in 96 Flachboden- Mikrotiterplatten inkubiert. Jede Einbuchtung hat ein Gesamtvolumen von 200 µl, bestehend aus 100 µl B-Zellen (15 × 10³ Zellen) und 100 µl Überstand. Es wird die Wirksamkeit der B-Zellen untersucht, indem sie mit verschiedenen Konzentrationen gereinigten BCGFs (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.) inkubiert werden.
Die Kulturen werden 24 Stunden lang inkubiert, wonach 1 µCi [³H-Tdr] hinzugefügt und dann zusätzlich 12 Stunden inkubiert wird. Die Kulturen werden dann geerntet und in einem Scintillationszähler gezählt.
2. Die T-Zellen werden in Flachboden-Einbuchtungen inkubiert. Das Gesamtvolumen in jeder Einbuchtung beträgt 200 µl, welches 50 × 10³ T-Zellen pro Einbuchtung beinhaltet.
Die Inkubationsdauer beträgt 72 Stunden, welche 12 Stunden Markierungsdauer mit [³H-Tdr] beinhalten.

Ergebnisse Wachstumsfaktor-Erzeugungen Versuch 1

BCGF Aktivität (C. P. M. = Zerfälle/Minute)

TCGF Aktivität (C. P. M.)

% Überstand

Versuch 2

BCGF Aktivität (C. P. M.)

% Überstand

TCGF Aktivität (C. P. M.)

% Überstand

1. Wirkung auf die RNA-Synthese

Die Wirkung von ELS2 auf die RNA-Synthese in menschlichen T-Zellen, wie durch Einverleibung von (Markierung mit) ³H-Uridin beobachtet. Zerfälle pro Minute (CPM). Nach 24 Stunden Inkubation erhaltene Ergebnisse.

T 3732
T + PHA 20 752

ELS2 Konzentration µg/ml

2. Wirkung auf die DNA-Synthese

Die Wirkung von ELS2 auf die DNA-Synthese in menschlichen T-Zellen wie durch Einverleibung von ³H-Thymidin beobachtet. Zerfälle pro Minute (CPM). Nach drei Tagen Inkubation erhaltene Ergebnisse.

T 154
T + PHA 6076

ELS2 Konzentration µg/ml

3. In-vitro-Vermehrung der Zellzahl

Das Tripeptid, welches Kulturen von entweder T-Lymphocyten oder Mischungen von T- und B-Lymphocyten jeden vierten Tag in einer Konzentration von 5 µg/ml während einer Zeitdauer von 30 Tagen zugegeben wurde, ist fähig, die Zellzahl mit einem Maximum von +50%, bezogen auf Kontrollkulturen, zu erhöhen, wobei zwischen Tag 10 und 15 des Versuchs beobachtet wurde.

Toxikologische Untersuchungen Akute Toxizität

Untersuchungen der akuten Toxizität, durchgeführt an Mäusen und Ratten, haben gezeigt, daß das Tripeptid bis zu einer Dosis von 1000 mg/kg intramuskulär (i. m.) gänzlich frei von toxischen Wirkungen ist.

Toleranz

Untersuchungen an Kaninchen und Mäusen haben gezeigt, daß das Produkt bei einer intravenösen (i. v.) bzw. intraperitonealen (i. p.) Dosis von 100 mg/kg keinerlei hämodynamische Änderungen und Verhaltenswirkungen verursacht. Insbesondere zeigt die Schlafzeit nur einen leichten Anstieg.

Allergie-hervorrufende Aktivität

Das Produkt zeigt am Meerschweinchen bei einer intramuskulären (i. m.) Dosis von 100 mg/kg keinerlei Sensibilisierungsphänomene.

Die oben erwähnten Untersuchungen wurden mit Acetatsalz des Tripeptids durchgeführt, jedoch ist es aus dem Stand der Technik wohl bekannt, daß ähnliche Ergebnisse unter Verwendung anderer Salze, beispielsweise Trifluoracetat, Hydrochlorid oder Sulfat, erhalten werden können.

Claims

1. Arzneimittel, enthaltend das Tripeptid Arg-Ala-Arg

2. Arzneimittel gemäß Anspruch 1 in Form pharmazeutisch annehmbarer Salze des Tripeptids, insbesondere in Form von Acetat, Trifluoracetat, Hydrochlorid, Sulfat.