DD273774A1 - Verfahren zur herstellung von diacetylsplenotritin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung von Diacetylsplenotritinen Ac-Arg-Lys(Ac)-Glu-R der Formel I, d. h., der (Na-Acetyl-arginyl)-(Ne-Acetyl-lysyl)-glutaminsaeure mit ihren Derivaten. Sie werden durch Acetylierung von Splenotritin Arg-Lys-Glu-R oder durch Umsetzung des (Na-Acetyl-Arg)-(Ne-Acetyl-Lys)-Dipeptids mit Glutaminsaeurederivaten erhalten. Als Acetylierungsmittel werden besonders N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid sowie 1-Acetoxy-benzotriazol eingesetzt. Die Titelverbindungen eignen sich zur Normalisierung der Funktion des Immunsystems bei primaeren und sekundaeren Immundefizienzen und zur Stimulierung von Stammzellen des Knochenmarks. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Diacetylsplenotritinen Ac-Arg-LysfAcl-Glu" der Formel I. Diese Verbindungen weisen ausgezeichnete pharmakologische Eigenschaften auf. f:ie üben z. B. einen direkten Einfluß auf die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen des Knochenmarks aus. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes

Die aus dem Thymus bzw. der Milz isolierten Peptide Thymopoietin und Splenin haben sich als Verbindungen erwiesen, die das Immunsystem beeinflussen (Audhya, T. et al., Biochemistry 20 [1981 ], 6195). Die Spleninsequenz 32 bis 36 - Arg-Lys- GIu-VaI-Tyr -wird als Splenopentin (Audhya, T. et al., Proc. Notl. Acad. Sei. USA (1984]-.81:2847), die Sequenz 32 bis 34-Arg-Lys-Glu als Splenotritin (DD-WP 250539) bezeichnet.

Alkanoylierte Verbindungen der Arginyl-Lysyl-Glutaminsäure sind in der zitierten Schrift DD-WP 250 539 genannt worden, jedoch nicht Diacetylsplenotritine.

Das Tripeptid Arg-Lys-Glu selbst ist in den DE-OS 3712090 und 3712050 beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, der medizinischen Praxis das Mittel Diacetylsplenotritin zur Verfügung zu stellen und der pharmazeutischen Industrie Verfahren zu seiner Herstellung.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zu entwickeln, nach denen sich Diacetylsplenotritine (DAc-SP3), d.h. die N°-Acetylarginyl-N^c-acetyl-lysyl-glutaminsäure und ihre Analoga der Formel I,

Ac-Arg-Lys(Ac)-Glu-R I

in der Ac für Acetyl und P. für OH, NH₂, NHR¹, N(R')₂ sowie R¹ steht und in der R¹ C,-C,₈-Alkyl, C,-C_rAlkenyl, C,-C₇-Alkinyl, Ce-Cjo-Alkanyl,-(CHOH)_n-In = 1-8),-(CH₂L-NH-GIu-Lys-Arg (rn = 1-18) sowie-(CH₂CH₂O)_m-Glu-Lys-Arg und-(CH₂CH₂O)_mNH-Glu-Lys-Arg (m = 1-10000) bedeutet, herstellen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß man Splenotritin (SP3), Arg-Lys-Glu-R, acetyliert oder die Synthese des Tripeptids durch Kupplung des acetylierten Dipeptids Ac-Arg-Lys(Ac)OH mit den entsprechenden Glu-Derivaten vornimmt. Als Acetylierungsmittel eignen sich wegen der Bildung unerwünschter Nebenprodukte (Glutarimid-Bildung) weniger die üblichen Mittel, wie Acetanhydrid oder Säurehalogenide. Die Umsetzung mit Essigsäure-p-nitrophenylester verläuft zwar nebenproduktfrei, jedoch bereitet dio Entfernung des dabei entstehenden toxischen p-Nitrophenols, speziell aus argininhaltigen Peptiden, erheblicho Schwierigkeiten. Erfindungsgemäß gelingt die selektive Acetylierung jedoch bei Verwendung der entsprechenden N-Hydroxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximidester von Carbonsäuren, im besonderen bei Verwendung von N-Acetoxy-norborn-ö-en^.S-dicarboximid (Acetyl-ONB) (II) sowie von 1-Acetoxy-benzotriazol (Acetyl-OBt) (III).

CIf₅-CO-O-N

III

Mit Hilfe dieser Acylierungsmittel gelingt es, DAc-SF'3 in guten Ausbeuten (>90% d.Th.) unter Vermeidung unerwünsc hter Nebenreaktionen herzustellen. Nach der Acylierung wird iias DAc-SP3 mit Hilfe der in der Peptidchemie üblichen chromatographischen Methoden gereinigt (preparative HPLC an RP18 in Methanol/Triethylamin/Ameisensäure), Verteilungschromatographie an Kieselgel 100 mit Schwyzer System Pyridin/Eisessig/Wasser/Essigester) sowie lonenaustauschchromatographie. Die Charakterisierung des gereinigten Produkt erfolgte über Aminosäureanalyse, C,H,N-Analyse, Dünnschichtchromatographie in verschiedenen Laufmittelsystemen, HPLC sowie NMR-Spektroskopie.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß das als Acetylierungsmittel eingesetzte N-Acetoxy-norborn-S-en^.S-dicarboximid (Formel II) besondere Vorteile aufweist. Auf Grund seiner hohen Hydrolysestabilität besitzt es eine sehr gute Lagerungsstabilität und kann bei Acetylierungen sowohl in organischen wie wäßrigen Medien eingesetzt werden, vor allem wegen seiner hohen Reaktionsfähigkeit mit Aminogruppen auch ohne Basenzusatz in extrem kurzer Zeit. Das im Reaktionsverlauf entstehende N-Mydroxy-norborn-S-en^^-dicarboximid läßt sich leicht abtrennen und ist nicht toxisch, so daß seine Anwendung vor allem in der pharmazeutischen Industrie besonders vorteilhaft ist.

Mit der Acylierung von Splenotritin wird das Ziel erreicht, die enzymatische Abbaustabilität zu erhöhen und damit die Bioverfügbarkeit als immunbiologisch wirksames Arzneimittel zu verbessern. Überraschenderweise ließ sich nachweisen, daß DAc-SP3 die Reifung und Differenzierung von Stammzellen des Knochenmarks anregt.

Unter den denkbaren acylieren Splenotritinen hat sich das DAc-SP3 als die wichtigste und am besten handhabbare Verbindung erwiesen.

Durch Vermischen der neuen Verbindung DAc-SP3 mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen gelangt man zu den entsprechenden pharmazeutischen Verabreichungsformen.

Zum Nachweis der immunologischen Wirkung wurde die quantitative Zunahme von T4-Antigenen auf der Oberfläche menschlichar T-Lymphozyten bei Patienten mit systemischem Lupus Erythematodes (SLE) in vitro gemessen. Die knochenmarkstammzellstimulierendo Wirkung erfolgte im Koloniebildungstest.

Die vorgestellten Ergebnisse berechtigen zu der Annahme, daß Immunabwehrschwächen durch DAc-SP3 günstig beeinflußt werden können. Ein derartiger Zustand ist angeboren bzw. erworben. Eine erworbene Immunabwehrschwäche kann als Folge notwendiger therapeutischer Maßnahmen (Zytostatikatherapie und Bestrahlungstherapie bei Krebserkrankungen) auftreten bzw. ist obligat bei AIDS im Spätstadium der Krankheit. Entsprechend der vorgestellten Ergebnisse sollte durch DAc-SP3 eine derartige beeinträchtigte Funktion des Immunsystems verbessert werden können.

Ausführungsbeispiele

1. Herstellung von (N^a-Acetyl-arginyl)(N^c-acetyl-lysyl)glutamin (DAc-SP3)

1.1. Synthese von DAc-SP3 durch Umsetzung von SP3 mit N-Acetoxy-Norborn-o-en^.S-dicarhoximid (II)

50mMol Arg-Lys-GIu-OH (SP3) werden in 150ml Wasser gelöst und mit einer Lösung von 33,2g (150mMol) Acetyl-ONB in 100ml Dimethylformamid versetzt. Man gibt solange Dimethylformamid zu, bis eine homogene Lösung entsteht. Nach achtstündigem Rühren bei Raumtemperatur (DC-Kontrolle) wird das Lösungsmittel im Vak. entfernt und der verbleibende Rückstand in MeOH gelöst. Diese Lösung wird in Ether eingerührt. Der Feststoff wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und im Vak. über KOH getrocknet.

Ausbeute:

Anschließend erfolgt Reinigung durch Verteilungschromatographie. Durch Lyophilisieren aus verd. Salzsäure wird das entsprechende DAc-SP3 χ HCI erhalten.

MG = 552,044

Summenformel C₂₁H₃₈N₇O₈CI

ber. C: 45,69 H: 6,94 N: 17,76

gef. C: 45,52 H: 7,02 N: 17,63

1.2. Synthese von DAc-SP3 durch Umsetzung von SP3 mit i-Acetoxybenzotriazol (Acetyl-OBt) (III)

Die Umsetzung von SP3 mit Acetyl-OBt und Aufarbeitung erfolgt analog 1.1. Ausbeute: >90%d.Th.

1.3. Synthese von DAc-SH3 durch Umsetzung von Ac-Arg-Lys(Ac)OH mit H-GIu(OBzI)₂

3,86g (1 mMol) AcArgLys(Ac)OH werden in 20ml DMF gelöst und bei Raumtemperatur unter Rühren 0,91 g (1,2mMol) Komplex F (krist. Addukt von 1 Mol DCC und 3 Mol Pentafluorphenol) zugegeben Nach 10min Rühren wird auf O⁰C abgekühlt und eine Lösung von 5g (1 mMol) HGIu(OBzI)₂ χ TosOH und 0,11 ml N-Methylmor.iholin in 15ml DMFzugefügt. Nach 30min Rühren bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Harnstoff filtriert, das Filtrat eingeengt und aus Methanol/Essigester umkristallisiert. Ausbeute: 5,7g (82% d.Th.)

Durch Hydrieren des geschütztenTripeptides mit Pd/A-Kohle in Methanol in Gegenwart von verd. Salzsäure wird das freie Peptid nach Abfiltrieren des Katalysators, Einengen des Filtrates und nachfolgendem Lyophilisieren in einer Reinheit von >93% erhalten.

Ausbeute: 5,07g (92% d.Th.)

Durch nachfolgende chromatographische Reinigung über ionenaustauscher wird in >84%iger Ausbeute ein Produkt mit einer Reinheit von >98% erhalten.

DAc-SP 3 x HCI: 552,044

2. Testung

2.1. Zunahme von T4-Antigenen auf der Oberfläche menschlicher Lymphozyten nach Kontakt mit DAc-SP3 Funktionstüchtige (reife) T-Helferlymphozyten besitzen auf ihrer Oberfläche T4-Antigene, T-Suppressorlymphozyten T8-Antigene. Bei Patienten mit Systomischem Lupus Erythematodes (SLE) wurde mittels monoklonaler Antikörper ein verminderter Gehalt von T4-Antigenen auf der Lymphozytenoberfläche bestimmt.

Als Holge therapeutischer Maßnahmen normalisieren sich die Worte Wurden vor Therapie Jie Lymphozyten der Patienten mit DAc-SP3 in Kontakt gebracht, war nach 2stündiger Inkubation eine individuell differente, jedoch permanent erhöhte Anzahl von T4-Antigenen nachweisbar. Die T8-Antigene (Oberflächenantigene auf T-Supressoriyrnphozyten bzw. zytotoxischen T-Lymphozyten) veränderten sich dagegen quantitativ nicht. T4-Antigene nehmen zu, wenn sich T4-Zellen vermehren bzw. wenn die Antigene vermehrt auf ihrer Oberfläche exprimiert werden. Die Untersuchungen ergaben, daß die Lymphozyten der SLE-Patienten nach Kontakt mit DAc-SP3 keine erhöhten ³H-Thymidineinbauraten aufweisen.

2.2. Beeinflussung der Funktion von Zellen des Knochenmarks durch DAc-SP3 (Tierbxperimentelle Untersuchungen)

Drei Monate alte AB/Bln.-Mäuse (Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin-Buch) wurden einmalig mit 80OcGY röntgenbestrahlt. Danach wurden die Tiere in je 3 Gruppen zu je 30 Tieren aufgeteilt und mit DAc-SP3 folgendermaßen weiterbehandelt:

Gruppe 1: Nach der Bestrahlung wurden den 30 Tioren Knochenmarkzellen von Tieren des gleichen Inzuchtstammes transplanted (Injektion von je 5ml 10⁶ Knochenmarkzellen pro Tier). Anschließend wurden die Tiere 3mal wöchentlich mit DAc-SP3 in einer Dosis von 10pg pro Tier behandelt (intraperitoneale Applikation). In differenten Zeitabständen nach d' r Bestrahlung und während der DAc-SP3-Behandlung wurde mittels des JERNE-Plaque-Tests die Fähigkeit der Tiere untersucht, Antikörper zu bilden: Dazu wurden die Tiere 5 Tage vor der jeweiligen Untersuchung mit Schafserythrozyten immunisiert, 5 Tage später wurden die Milzzellen der Tiere isoliert, in vitro (JERNE-Plaque-Test) mit Schafserythrozyten in Kontakt gebracht und die als Folge der gebildeten Antikörper entstehenden Plaques (Hämolyseherde) bestimmt (modifizierte Methodik nach Eckert, R.

et al. [1965]: Biomed. Biochim. Acta: 44,1239). leder Wert der Abbildung repräsentiert den Mittelwert von je 5 Einzelwerten (Antikörperbildung durch die Milzzellen von je 5 Tieren).

Gruppe 2: Gleiche Behandlung der Tiere wie in Gruppe 1, jedoch keine Therapie der Tiere mit DAc-SP3.

Gruppe 3: Alleinige Röntgenbestrahlung der Tiere: keine Transplantation syngener Knochenmarkzellen, keine Therapie der Tiere mit DAc-SP3.

Die Ergebnisse zeigen, daß unter in vivo-Bedingungen Zellen des Knochonmarks durch DAc-SP3 beschleunigt zu einer normalen Antikörperbildung befähigt werden. Dies impliziert, daß durch diese Mittel Zellen des Knochenmarks beschleunigt „reifen", d.h.

sich schneller in funktionell aktive Zellen differenzieren. Die intraperitoneale Applikation von ΊΟμρ, 2\ig und 4pg waren unter identischen Bedingungen nicht wirsam, 8pg wirkten suboptimal. Nach Applikation von 20μς und 50pg konnte ein gleichartiger Effekt wie nach der Gabe von 10 \ig gemessen werden.

Durch DAc-SP 3 lassen sich Immunabwehrschwächen des Menschen günstig beeinflussen. Ein derartiger Zustand ist Folge notwendiger therapeutischer Maßnahmen (Bestrahlungstherapie, Zytostatikatherapie) bzw. wird bei AIDS (aquired immunomodificiency syndrome) durch das HIV (human immunode ficiency virus) verursacht.

2.3. Medikation von DAc-SP3 und therapeutische Effektivität (tlerexperimer.*ille Untersuchungen)

Drei Monate alte AB/Bln.-Mäuse (Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlir.-Buch) wurden in 5 Gruppen zu je 20 Tieren aufgeteilt und folgendermaßen behandelt (Tabelle 2):

Gruppe I Keine Röntgenbestrahlung; keine DAc-SP3 Medikation (Kontrolle) Gruppell Bestrahlung mit 60OcGy; keine DAc-SP3-Medikation

Gruppe III Be&trahlung mit 60OcGy; Applikation von DAc-SP3 nach Bestrahlung:

1. Woche: 3mal umtägig 10pg intraperitoneal;

2. bis4. Woche: 3mal wöchentlich physiologische NaCI-Lösung. Gruppe IV Bestrahlung mit 60OcGy; Applikation von DAc-SP3 nach Bestrahlung:

1. und 2. Woche: wöchentlich 3mal 10μρ;

3. und 4. Woche: Applikation von physiologischer NaCI-Lösung 3mai wöchentlich Gruppe V Bestrahlung mit 60OcGy; Applikation von 10Mg DAc-SP3 3mal wöchentlich bis zur 4. Woche.

Vier Wochen nach der subletalen Röntgenbestrahlung und der differenten DAc-SP3-Medikation wurde bei allen Tieren die Fähigkeit untersucht. Antikörper gegen Schafserythrozyten zu bilden (JERNE-Plaque-Test, s. o.). Wie ersichtlich (Tabelle), waron lediglich die Tiere der Gruppe V gleichermaßen wie die der Gruppe I zur Antikörperbildung befähigt (kein signifikanter Unterschied). Dieses Ergebnis zeigt, daß nur eine permanente Applikation von DAc-SP 3 in einer Dosierung von 3mal wöchentlich 10pg pro Maus (10 μρ pro etwa 20g Lebendgewicht) zu einer sehr schnellen Regeneration der Immunantwort führt.

Tabelle

Antikörperbildung gegen Schafserythrozyten (Plaque-bildende Milzzellen) durch AB Bln.-Mäuse nach einmaliger Röntgenbestrahlung der Tiere mit 60OcGy und nachfolgender differenter Medikation mit DAc-SP3. Bestimmung der Antikörperbildung 4 Wochen nach der Röntgenbestrahlung. Juder Wert (Mittelwert + Streuung) repräsentiert den Mittelwert von 20 Tieren.

Tiergruppe Anzahl Plaque-bildender Milzzellen pro Milz

nach einmaliger Röntgenbestrahlung und 4 Behandlungswochen" DAc-SP 3

I	26 350 ±3 800
Il	6150±1600
III	12430 ±3100
IV	15100 ±1850
V	24 050 ±3 900

1 Bohandlung&regime

Tiergruppe

Röntgenbestrahlung

DAc-SP3-Medikation

I Il III	keine 60OcGy 60OcGy
IV	60OcGy
V	60OcGy

keine (Kontrolle)

1. bis 4. Woche: wöchentlich umtägig 3mal NaGI²¹

1. Woche: umtägig3malDAc-SP3

2. bis4. Woche: wöchentlich umtägig 3mal NaCI

1. und 2. Woche: wöchentlich umtägig 3mal DAc-SP3

3. und 4. Woche: wöchentlich umtägig 3mal NaCI

1. bis 4. Woche: wöchentlich umtägig 10Mg DAc-SP 3 pro Tier

2 NaCI = physiologische NaCI-Lösung

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von Diacetylsplenotritinen (N^a-Acetyl-arginyl)-(N^e-acetyl-lysyl)-gluic Tiinsäure und ihren Derivaten Ac-Arg-Lys(Ac)-Glu-R der Formel I, in der Ac = Acetyl und R = OH, NH₂NHR¹, N(R¹J₂, R¹ bedeuten und worin R¹ für C₁-C₁₈AIkYl, C₁-C₇-Alkenyl, C₁-C₇-AIkInYl, C₅-C₂₀-Alkaryl,-(CHOH)_n-(n = 1-8),-(CH₂)_m-NHGIuLysArg (m = 1-18) sowie-(CH₂CH₂-OU-GluLysArg und -(CH₂CH₂O)_mNH-GluLysArg (m = 1-10000) steht, dadurch gekennzeichnet, daß Splenotritin der Formel Arg-Lys-Glu-R, in der R die oben angegebene Bedeutung hat,

a) acetyliert,

b) die Synthese des Tripeptides durch Umsetzung des acetylierten Dipeptides AcArgLys(Ac)OH mit den entsprechenden Glu-Derivaten vorgenommen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Arg-Lys-Glu-R mit N-Acetoxy-norborn-5-en-2,3-dicarboximid umgesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Arg-Lys-Glu-R mit 1-Acetoxybenzotriazol umgesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß (N^a-Acetyl-Arg)-N^E-Acetyl-Lys)-Dipeptid mit einem Glutaminsäurederivat umgesetzt wird.