DE2124003C2 - Threonyl-lysyl-prolyl-arginin, Derivate und Salze und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Präparate - Google Patents

Description

c) an der Hydroxylgruppe des Threonins veresterte oder

d) an der Aminogruppe des Threonins acylierte Derivate

sowie die pharmakologisch verträglichen Salze dieser Verbindungen.

2. Pharmazeutische Präparate, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine therapeutisch wirksame Menge von wenigstens einer Verbindung nach Anspruch 1 und übliche Träger- und Hilfsstoffe enthalten.

Die Erfindung betrifft ein neues, therapeutisch wertvolles Tetrapeptid bzw. dessen Derivate und Salze, die in verbesserter Weise auf Phagozytose oder Pinesytose einwirken.

Die Gammaglobulinfraktion des gesamten Säugetierblutes ist die Fraktion, welche die vom Körper erzeugten Antikörper enthält, um dem Angriff durch Antigene entgegenzuwirken. Die Gammaglobulinfraktion von Säugetierblut ist also insbesondere die Fraktion, in welcher die Substanzen enthalten sind, die der Körper zur Bekämpfung von Angriffen durch Infektionskrankheiten einsetzt. Die Herstellung von Antikörpern ist ein natürlicher Abwehrmechanismus des Körpers und wird durch die Anwesenheit von 'Antigenen im Körper angeregt. Normalerweise werden spezifische Antikörper zur Bekämpfung spezifischer Antigene erzeugt und in vielen Fällen behält der Körper danach einen Antikörpergehalt gegenüber spezifischen Antigenen oder infektiösen Organismen, so daß Neuinfizierung gehemmt und oft verhindert wird.

Die Verwendung der Gammaglobulinfraktion des Säugetierblutes als ein therapeutisches Mittel hat deshalb in der Medizin beträchtliche Aufmerksamkeit gefunden, da es möglich schien, diese Fraktion von einem Einzelindividuum, der eine Infektion erfolgreich überwunden hatte, zu verwenden, um den Widerstand gegen die gleiche Infektion in einem anderen Individuum zu erhöhen.

Leider hat sich dieser Versuch der Prophylaxe als nicht ausreichend erfolgreich erwiesen und kann außer in Fällen von Gammaglobulinämie nicht für längere Zeit angewendet werden. Dafür liegen mehrere Gründe vor. Ein Grund ist, daß Patienten oft Gammaglobulin ablehnen, insbesondere bei wiederholten Gaben, weil das Gammaglobulin wie ein Antigen wirkt und Antikörper als Gegenreaktion gebildet werden. Ferner kann eine Zunahme des Gammaglobulinspiegels im Blut über den normalen Wert hinaus ungünstige Auswirkungen haben, wie man bei der Hypergammaglobulinämie sehen kann. Dariiber hinaus ist sogar in den Fällen, in denen eine Gammaglobulinbehandlung angewendet werden kann, die Behandlung nicht so wirksam wie erwünscht, weil der größte Teil davon mehr dazu neigt, im Blut der Patienten zu verbleiben als sich in dem Zellgewebe, welches der übliche Infektionsherd darstellt, zu verteilen.

Es wurde nun gefunden, daß das Tetrapeptid L-Threonyl-L-lysyl-L-proIyl-L-arginin, welches aus

ίο Gammaglobulin durch die nachfolgend beschriebenen Verfahren gewonnen werden kann, das aber nicht als diskretes und freies Molekül im Gammaglobulin existiert, die Wirkung hat, Phagozytose und eine anschließende Bakterienvernichtung durch polymor-

phonukleare Blutleukocyten, insbesondere neutrophile Leukocyten, in Säugetieren zu stimulieren. Es fördert ebenfalls im gleichen Ausmaß die Pinozytost_: ?/obei die Zellen von dem umgebenden Medium genähert werden können. Ferner besitzt es keine Antigenwirksamkeit.

Die vorliegende Anmeldung betrifft dieses Tetrapeptid und Derivate und pharmakologisch geeignete Salze desselben.

Erfindungsgemäße Verbindungen, in denen die Aminosäuren sämtlich in L-Form vorliegen, werden als Phagazytose- und Pinozytose-stimulierende Mittel bevorzugt Die Wirksamkeit kann vermindert werden, wenn wenigstens eine der in L-Form vorliegenden Aminosäuren durch eine D-Aminosäure ersetzt wird. Durch einen derartigen Austausch ist es möglich, die Simulatoren in Inhibitoren zu verwandeln.

Die variierende stimulierende oder hemmende Wirkung ist deshalb sehr wichtig, weil es medizinische Syndrome gibt, bei denen der Patient im wesentlichen nicht zur Phagozytose oder Pinozytose fähig ist, was bei Individuen mit Splenektomie der Fall ist, und Zustände, bei denen die Phagozytose so ausgeprägt ist, daß andere offensichtlich normale Zellen verbraucht werden. Dieses geschieht mit Patienten, die unter den sogenannten Kollagen-Krankheiten, wie zum Beispiel rheumatisehe Arthritis und Lupus erythematodes, leiden. Eine abnormale Phagozytosewirksamkeit bei diesen Patienten kann zu einer krankhaften Gefäßveränderung in den Gelenken und anderen Organen führen. Daher ist eine Behandlung von diesen Patienten mit den erfindungsgemäßen Inhibitorverbindungen durchzuführen.

Wie oben erwähnt, wird bevorzugt, wenn im Thr-Lys-Pro-Arg alle Aminosäuren in der L-Form vorliegen, sofern die höchst stimulierende Wirkung erwünscht wird. Der Einfachheit ha;'jer wird diese Verbindung als Tuftsin IV bezeichnet.

Di3ses Tetrapeptid wurde chemisch synthetisiert und erwies sich mit einem der Produkte als identisch, die in äußerst geringen Mengen von Gammaglobulin durch sehr langwierige Verfahren abgetrennt werden können, die die Spaltung von Leukokinin, eines der bekannten Proteinfraktionen in Gammaglobulin, umfassen. Leukokinin wird in der Milz hergestellt oder aktiviert. Individuen mit Splenektomie haben deshalb einen Mangel an Tuftsin IV.

Tuftsin !V, wie es in dem Blut von Säugetieren enthalten ist, stellt einen Teil des größeren Moleküls Leukokinin dar, was aus der Abtrennungsmelhode erkennbar wird, bei der ein spezifisches Enzym Leukokininase für die Spaltung erforderlich ist. Es

hi scheint, daß Phagozytose und Pinozytose durch einen Mechanismus angeregt wird, welcher umfaßt a) Bindung des Leukokininmoleküls an eine bestimmte Stelle an der Zellmembrane, b) Spaltung des Leukokininmoleküls

durch die Wirksamkeit der Membranenzyms-Leukokininase, welches einen integralen Teil der Bindungsstelle bildet, und c) Überführung als Komplex mit dem Enzym zu der Stelle seiner Wirksamkeit, wo es offensichtlich zur Ausübung seiner stimulierenden Wirkung zerstört wird. In keinem Fall ist ein Verfahren bekannt, welches nicht die enzymatische Spaltung erforderlich macht und die Isolierung des reinen Tetrapeptids ermöglicht: Es ist tatsächlich kein Verfahren bekannt, das die Isolierung von geeigneten Mengen an Tuftsin IV aus einer in praktisch annehmbaren Menge an Säugetierblut ermöglicht.

Leukokinin selbst ist als therapeutisches Mittel nicht geeignet, weil das Molekül nicht als ein autologes Molekül erhalten werden kann, sondern nur aus vereinigten heterologen Quellen. Aus diesem Grunde und wegen seiner Größe und differierenden Struktur, leitet es eine Antigen-Antikörper-Reaktion in den: Wirtorganismus el" und wird zurückgewiesen. Tuftsin IV jedoch scheint in jeglichem menschlichen Leukokinin identisch zu sein, und weil es ein kleines Molekül ist, verursacht es keine Antikörper-Reaktion.

Als kleines Molekül wird es außerdem leicht in das Zellgewebe transportiert, wo es eine Phagozytose-Wirkung auf jeglichem Organismus oder Teilchen durch direkte Einwirkung auf die Phagozylen und nicht die Bakterien ausübt. In diesem Sinne wirkt Tuftsin IV als ein allgemeines Antibiotikum, aber es verursacht nicht wie dieses eine allergische Reaktion und bewirkt auch nicht das erhöhte Auftreten von resistenten Organis- so men. Dieses ist oft bei bakteriellen Infektionen, die mit Antibiotika behandelt werden, der FaI,, weil sie selektiv auf die Bakterien wirken und dubei resistcnte Mutante überleben. Tuftsin IV ist ein nicht toxis hes, nicht-antigenes, therapeutisch geeignetes, Phagozytose und }5 Pinozytose stimulierendes Tetrapeptid, das die körpereigene Abwehr gegen das Eindringen von Fremdsubstanzen erhöht.

Tuftsin IV kann aus verschiedenen Gammaglobulinfraktionen, die auf Phosphorcellulosekolonnen chromatographiert worden sind, erhalten werden. Das allgemeine Verfahren wird nachfolgend beschrieben.

Gammaglobulin wird aus Menschen-, Hunde- oder Kaninchen-Serum durch Ausfällung bei 0,33 Ammoniumsulfatsättigung erhalten. Das Verfahren für die Isolierung der Tuftsine wird ausführlich in den Beispielen beschrieben, Tuftsin I wird durch Behandlung einer Fraktion aus einer Phosphorcellulosekolonne (PCI) mit Trypsin oder Enzymen, die aus den Membranen der roten Blutkörperchen und den Membranen der Zellen von polymorphonuklearen neutrophilen weißen Blutkörperchen erhalten worden sind, hergestellt.

Tuftsin IV wird aus der Phosphorcellulosefraktion IV (PC IV) durch Behandlung dieser Fraktion mit Trypsin 5s oder Enzymleukokininase, die aus den Membranen der neutrophilen Leukocyten und aus peritonealen Ausscheidungen des Kaninchens durch bekannte Verfahren hergestellt worden sind, erhalten. Es sind in der Hauptsache Peptide, die von dem Rest der Proteine mi nach der Enzymbehandlung durch Ausfällung der letzteren mit 5% Trichloressigsäure abgetrennt werden. Der überstehende Teil enthält die Tuftsinverbindungen. Trichloressigsäure wird durch Ätherextraktion entfernt und die Tuftsine werden lyophilisiert und an Sephadex fts G-IO Kolonnen Chromatographien, die mit einer fließenden Elutionsflüssigkeit aus mit Chloroform gesättigter 0,1 η Essigsäure im Gleichgewicht steht. Die abfließende Lösung wird in 1 ml Proben aufgefangen. Die Proben 115 bis 125 enthalten Tuftsin II, und die Proben 135 bis 158 enthalten Tuftsin III und IV. Die Lösung, welche Tuftsin III und IV enthält, wird lyophilisiert und in Pyridin-Azetat-Puffer bei pH 4 aufgenommen. Die Mischung wird in Dowex 50 Kolonnen chromatographiert und bei pH 4,0 bis 6,0 in 1,2 bis 2,5 m Pyridinlösung {lineares Konzentratiousgefälle) eluiert. Die abfließende Lösung wird in 2 ml Proben aufgefangen. Tuftsin III ist in den Proben 20 bis 35 und Tuftsin IV ist in den Proben 65 bis 78 enthalten.

Tuftsin IV wurde einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Propanol/Wasser 2 :1 unterzogen und man erhielt eine einzelne Zone. Die Behandlung des Peptids mit Dansylchlorid ergab eine einzelne fluoreszierende Zone bei der Dünnschichtchromatographie mit Silicagel unter Verwendung von Chloroform-Methanol-Essigsäure im Verhältnis von 15:4:1.

Durch Hydrolyse von Tuftsin IV mit 6n HCl bei 105⁰C für die Dauer von 20 Stunden wurde Threonin. Lysin, Prolin und Arginin im Verhältnis von 1,00 :1,00 :1,05 :0,92 erhalten. Durch Abbau mit Carboxypeptidase B wird nur Arginin als C-terminale Aminosäure freigesetzt. Nach dem Abbau mit Leucinaminopeptidase wird nur Threonin als N-terminale Aminosäure freigesetzt Außerdem ergeben die Produkte der enzymatischen Umsetzungen durch »Dansylierung« nur Arginin und Threonin als die freien Dansylkomponenten. Die positive Sakaguchi-Färbung sprach nach der Umsetzung mit Carboxypeptidase B weiterhin auf der Silicagel-Dünnschicht für die Anwesenheit von Arginin als eine Aminosäure mit Carboxylendgruppen. Durch Tritiumaustausch im Anschluß an die Behandlung des Peptids mit Essigsäureanhydrid in Pyridin in Tritiumwasser wurde Arginin als der einzige radioaktive Rest festgestellt. Die Anwesenheit von Prolin zwischen Lysin und Arginin wurde durch die Beständigkeit des Peptids gegenüber JVypsinaufschluß nachgewiesen. Die Entfernung von Arginin durch Carboxypeptidase B und Erhitzen unter Rückfluß des restlichen Peptids mit Essigsäureanhydrid für 45 Minuten in Tritiumwasser ergab Prolin als der einzige radioaktive Rest. »Dansylierung« des Peptids nach Entfernung von Threonin mit Aminopeptidase ergab Didansyllysin als die nächste Aminoendgruppe. Auf diese Weise wurde die Struktur von Tuftsin IV als Thr-Lys-Pro-Arg nachgewiesen. Dies wird ferner durch Edmanabbau und Identifizierung der Thiohydantoinreste und auch durch »Dansylierung« des erhaltenen Rückstandes und der Edman Subtraktivmethode bestätigt. Die Identität von Tuftsin IV wird schließlich auch durch dessen Synthese aus den Teil-Aminosäuren, wie sie unten und in den Beispielen erläutert wird, nachgewiesen.

Tuftsin IV kann auch aus der im Handel erhältlichen Gammaglobuün-Cohn-Fraktion Il durch das in den Beispielen erläuterte Verfahren, jedoch nicht in praktisch verwendbaren Mengen isoliert werden.

Die Phagozytose-Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Produktes wird durch den nachfolgenden Versuch nachgewiesen:

Es wurden Leukocyten-Schichten von Hunde- oder Menschenblut oder peritonealen Ausscheidungen von Kaninchen oder Meerschweinchen hergestellt, dreimal mit Krebs-Ringer-Medium gewaschen und in dem gleichen Medium suspendiert. Insgesamt 0,15 ml dieses Mediums, das 4-5x10* neutrophilische Leukocyten pro mm³ enthielt, wurden in ein Reaktionsgefäß

pipettiert. Dann wurden 0,1 ml der Tuftsinmischung mit 0,2 bis 2 γ, in das Gefäß gegeben und dann 0,05 ml an inaktiviertem Opsonin-reichem Serum opsoninbehandelten Staphylokokken zugefügt Somit lagen 1,5 bis 2 Bakterien pro Neutrophil vor. Das Endvolumen betrug 0,3 ml. Dieses wurde bei 8 U.p.M. und 35°C für eine halbe Stunde lang zentrifugiert. Dann wurden Aufstriche hergestellt und mit Wrights Farbe gefärbt. Die Anzahl der gezählten Zellen, in denen Bakterien eingeschlossen sind, auf je 100 Zellen stellt den Phagocytose-Index.

Die stimulierende Wirkung von Tuftsin IV wird durch 3stündige Inkubation bei 30⁰C mit Pronase, Subtilisin, Carboxypeptidase B und Leuzin-Aminopeptidase, unter Verwendung von 40 μg Protein pro ml unter optimalen is Bedingungen der Enzymwirkung, zerstörL In ähnlicher Weise wird es durch Inkubation mit den löslichen Anteilen in der Flüssigkeit über zerstörten Leukocyten und Membranpräparaten von menschlichen Erythrocyten und Rattenleber bei pH 7,0 in Phosphorpuffer zerstörL In all diesen Medien ist der Phagoytose-Wert gleich groß wie bei den Vergleichsprob-m. Tuftsin IV wird durch Belüftung in Anwesenheit oder Abwesenheit von Cystein, Erwärmung auf 8O⁰C für die Dauer von 10 Minuten in 80% Äthanol, enzymatische Behandlung mit Trypsin, Chymotrypsin, Clostridiopeptidase B, Phosphatase, Desoxyribonuklease oder Ribonuklease nicht zerstörL Der nach solchen Behandlungen erhaltene Phagozytose-Wert war etwa 2,5mal größer als derjenige bei den Vergleichsproben. Tuftsin IV ist löslich in 95°/oigem Alkohol, Pyridin und Essigsäure und unlöslich in Äther.

Die erfindurigsgemäßen Produkte sind wertvolle therapeutische Mittel für Mensch und Säugetiere und als anregende oder hemmende Mittel in äußerst niedrigen Dosen wirksam. Der Arzt oder Tierarzt kann die Dosis bestimmen, die für eine bestimmte Anwendung am geeignetsten ist. Diese kann von Patient zu Patient je nach der Größe desselben, den Behandlungsbedingungen und anderen Faktoren, die leicht von einem Fachmann bewertet werden können, variieren. Für kontinuierliche Verabreichung über längere Zeiträume hinaus an Individuen mit mehr oder weniger permanenten metabolischen Abweichungen oder Individuen mit Splenektomie werden die Produkte normalerveise in unterschiedlichen Dosisformen verabreicht, die verhältnismäßig groß sein können, um einen entsprechenden Blutspiegel schnell aufzubauen, und auch verhältnismäßig klein, um einen wirksamen Spiegel aufrechtzuerhalten. Für zeitweilige Behandlungen zur Bekämpfung von akuten oder chronischen Infektionen können unterschiedliche Dosen angewendet werden. Die Produkte können in sehr hohen Mengen verabreicht werden, sogar bis zu 2 oder mehr Gramm pro Tag. Normalerweise werden sie in Dosiseinheiten von etwa 250 mg des aktiven Bestandteils verabreicht und die Anzahl der Einheiten, die dem Behandlungszustand angepaßt ist, kann täglich vorgeschrieben werden.

Die erfindungsgemäßen Produkte können allein gereicht werden. Sie werden im allgemeinen jedoch mit pharmazeutisch geeigneten, nicht toxischen Trägern verabreicht, wobei das Mengenverhältnis von der Eignung und der chemischen Natur des bestimmten Trägers, der gewählten Verabreichungsart und der üblichen pharmazeutischen Praxis mitbestimmt wird, /um Beispiel kernen sie zur Bekämpfung von verschiedenen Infektionen oder zur Aufrechterhaltung von einem therapeutisch wirksamen Spiegel im Blut oder im Gewebe oral in der Form von Tabletten oder Kapseln, die einen Träger in der Form von Scärke, Milchzucker, bestimmte Tonerdesorten usw. enthalten, verabreicht werden. Sie können mit einem entsprechenden Überzug versehen sein, damit sie gegenüber der Magensäure und Verdauungsenzymen des Magens beständiger sind. Für intravenöse und intramuskuläre Verabreichung können sie in der Form einer sterilen Lösung verabreicht werden, in der auch andere gelöste Stoffe enthalten sind, zum Beispiel genügend Salze oder Glukose, um die Lösung isotonisch zu machen.

Die erfindungsgemäßen Produkte haben den besonderen Vorteil, daß sie im Gegensatz zu vielen therapeutischen Produkten, die eine Peptidbindung enthalten, oral verabreicht werden können, weil sie gegenüber enzymatischer Hydrolyse durch die Enzyme des unteren Verdauungstraktes beständig sind. Auf Grund ihrer amphoteren Natur können sie für orale Verabreichung an nichttoxischen Ionenaustauscherharze absorbiert werden, die entweder anionisch oder kationisch sein können, um eine langsame Freigabe entweder im Magen oder den Därmen oder beiden zu bewirken. Außerdem bewirkt die Absorption bei diesen Harzen, daß sie umso beständiger gegenüber enzymatischer Zersetzung sind.

Ein weiterer Vorteil, der sich aus der amphoteren Natur der erfindungsgemäßen Produkte ergibt, leigt darin, daß sie in Form von pharniakologisch geeigneten Salzen verwendet werden können, die entweder Metallsalze oder Säureadditionssalze sein können. Diese Salze haben den Vorteil, daß sie wasserlöslich sind und sich besonders für parenterale Verabreichung eignen. Die Metallsalze, insbesondere die Alkalisalze, sind verhältnismäßig stabil und werden aus diesem Grunde gegenüber den Säureadditionssalzen bevorzugt. Die Natriumsalze werden besonders bevorzugt, da sie leicht herstellbar sind.

Die Säuren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmakologisch geeigneten Säureadditionssalze verwendet werden können, sind solche, die nicht toxische Anionen enthalten. Zu Beispielen wie diesen zählen: Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Milch-, Zitronen-, Wein-, Oxal-, Bernsiein-, Malein-, Glukon- und Zuckersäure.

Das erfindungsgemäße Tetrapeptid kann nach für die Synthese von Peptiden bekannten Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen unifassen diese Verfahren die stufenweise Herstellung durch aufeinanderfolgende Verknüpfung mit einer weiteren Aminosäure, um fortschreitend größere Moleküle herzustellen. Die Aminosäuren werden durch Kondensation zwischen der Carboxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe einer anderen Aminosäure miteinander verbunden. Zur Regelung dieser Reaktionen ist es notwendig, daß die Aminogruppe der einen Säure und die Carboxylgruppe der anderen blockiert werden. Es ist notwendig, daß die Schutzgruppen leicht entfernbar sind. Die gesamte Folg" der Reaktionen muß ohne Razemisierung der Produkte stattfinden. Threonin besitzt eine zusätzliche funktiönelle Gruppe, nämlich die Hydroxylgruppe. Es ist normalerweise erforderlich, daß eine solche zusätzliche Gruppe mit einem leicht entfernbaren Blockierungsmittel geschützt wird, so daß die Kondensation n^:~ht gestört wird.

Die meisten der. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden sind zur Synthese des erfindungsgemäßen Tetrapeptids anwendbar.

Gegenwärtig bevorzugte Verfahren sind das Merrifield-Verfahren und das N-Carboxyanhydridverfahren. Bei dem zuerst genannten Verfahren wird eine Aminosäure zuerst an ein Harzteiichen gebunden, wie über eine Esterbindung, und das Peptid wird stufenweise ί durch aufeinanderfolgende Addition der geschützten Aminosäuren /u der wachsenden Kette gebildet.

Hei dem zweiten Verfahren wird ein N-Carboxyaminosäureanhydrid mit der Aminogruppe einer zweiten Aminosäure oder eines Peptids unter solchen Bedingun- i" gen umgesetzt, daß die einzige in ausreichender Konzentration in reaktiver form während des Reak uonsverlaufs anwesende Aminogruppe diejenige ist. die an der Imsetziing beteiligt sein soll. Diese Regelung wird durch Auswahl von Konzentration. Temperatur. '■ /.fit und Wasserstoffionenkon/entration bewirkt. Die Verkniipfungsreaktion findet normalerweise unter alkalischen Bedingungen statt, gewöhnlich bei einem nH-WVrt um etwa 8") his I i. Das als Zwischenprodukt erhaltene ( arbamat wird dann dekarboxvüert. indem > der pH-Wert auf etwa 5 bis 3 herabgesetzt wird. Das gebildete Produkt kann mit einem anderen N-C'arboxvaminosiiureanhvdrid ohne Trennung und unter den mi wesentlichen gleichen Bedingungen umgesetzt werden. Dieses Verfahren stellt eine sehr schnelle :~> Herstellungsmethode fur PoK peptide dar.

Das sv nthetisch hergestellte Tuftsin IV erw ies sich mit dem durch das oben genannte Verfahren isolierte Produkt als identisch.

Tuftsin \\ eignet sicn. um ie'cht Modifikationen des e Moleküls '.«irzunehmen und Verbindungen herzustellen. die eine größere oder geringere Aktivität als das S'.imnite-ntpeptid aufweisen, oder mehr oder weniger leicht '."!; dem Gewebe absorbier; werden oder speziell für die gewählte Art der \ erabreichung geeignet sind.

Tuftsin l\ t,:nn leicht als Amid erhalten werden. Zum Bespiel -:.!pr, das Tetrapeptid mii Thionv ichlond unter Bildung des Säure* hlonds iimec^.i/l werden und dieses r<_.st?.er· }··:■·■ Λ-f.niiMiiak unter Biiiiung des -\mids bei B-j.i'r-L' inL'C.. ho denen die Razemisieruiig herabge- :■ --.ν WIr₁;. Di- TeTapept'd k.inr auch durch au'eir.andcriolgende Verknüpfung ■■'·'". Prolin, l.vsm und Threonin ni:· eine·" ArgmncMer gebildet werden und anschließend w;r.: der erhaltene Tetrapeptidester zu eine" -\~:d d'jT^h AmmonoKse umgewandelt. ^:'

Bei de-, Ϊλ'ογ:" rändelt es s;;h um die C - bis (.---Vkvle^-

Fnz\ me -:r.d im Körper vorhanden, die sowohl die Amx!· .:> ,i'\r r!-e E-'ergrupp-jr. hvdroi'.sieren. so daß die stimulierende' V\ irkung der Saure erh.ii'en wird. "■■ Sowohl Ester- aK auch Amidder.v ate -,r,d als therapeutische Mute: s-.cizr.c. wei; sie eine erhöhte chemische Stabilität irr; Verglich zu den freien Sauren aufweisen. Sie weiser, andere -\bsorptions- und Diffusionsgeschwindigkeiten in die Gewebe und verzögerte v-Ausscheidung durch c;e Nieren auf. Sie können in Form von pharmakologisch geeigneten Salzen verwendet werden.

Eine sehr geeignete Klasse der Derivate ist diejenige. bei welcher die freie Hydroxylgruppe von Threonin, mit r-> emer Aikanosi- oder Aikenoylgruppe. welche bis zu 18 Kohlenstoffatome enthält, verestert ist. Es kann auch die Aminogruppe von Threonin, mit einer Alkanoyl- oder Alkenoy!gruppe, weiche bis zu 18 Kohlenstoffatomen enthält, acylier; werden. In beiden Fällen werden --=,

Solche DciTväic bevorzugt. ΪΠ ucpicfi ui£ u35 ι^ΰΠν'ΰΐ

bildenden Gruppen etwa 1! bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, da die längeren Kohlenwasserstoffketten eine erhöhte l.ipoid-l.öslichkeit dem Molekül vermitteln und deren Transport durch die Zellenwiinde erhöht wird.

Beide Typen von Derivaten können direkt aus dem Tetrapeptid hergestellt werden, vorzugsweise werden sie jedoch durch Einbringen in das Peptid während der Synthese einer Aminosäure mit der gewählten Gruppe, wobei zum Beispiel die Alkanoylgruppe bereits anwesend ist.

Es wurde festgestellt, daß beim Stehenlassen auch unter normaler Kühlung das gesamte Blut seine Phagocv losew irksainl· · -11 ν erliert und die weißen Zellen zu verschwinden beginnen. Die Zugabe von geringen Mengen von Tuftsin IV hat eine umgekehrte Wirkung.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung:

Beispiel I
TiMiMIiC' aus Ci in ti iitif globulin lim cn i.eukokiMiM

Gammaglobulin (150 mg) von der Cohnfraktion Il in IO ml 0.05 m Acetatpuffer (pH 4.8) wurde auf eine ( ellulosephosphatsäule (4 ' 12cm). die \orher mit dem gleichen Puffer bis zum Gleichgewicht behandelt worden war. aufgebracht. Die Hießgeschwindigkeit wurde auf 2 ml/Min, eingestellt und der Abfluß wurde in Portioner, von 4.0 ml aufgefangen. Das drei- bis vierfache Volumen des l.osungsmittelpuffers (400 bis 550 ml) wurde durch die Säule laufen gelassen, um eine Entfernung des gelegentlich \ ei unreinigenden Albumins zu gewährleisten. In diesem Abfluß ist kein Gammaglobulin enthalten. Die erstr Gammaglobulinfraktion wurde mit 0.05m Acetatpuffer (pH 4.8) in 0.15 m NaCI eluiert und enthielt 51 mg Protein (34^an). Die Eluierung mit dem gleichen Puffer wurde fortgesetzt bis die Absorption bei 280 mii denenigen des Puffers entsprach. Dies wurde routinemäßig mit leder Fraktion erreicht, nachdem das 1.3- bis 1."fache Volumen des elmerenden. Puffers durch die Säule gegangen waren, d.h. bis IHO-230 ml des Abflusses aufgefangen waren. Die zweite Fraktion enthielt 37 ml Gammaglobulin (23'Ί·) und wurde unter Verwendung von 0.05 m Acetatpuffer (pH 5.0) in 0.15 rn Na(I eluiert: die dritte Fraktion von 2^ mg (H"'") wurde hei pH 5.2 unter sonst gleichen Mengen an Puffer und Salzkonzentration eluiert. Schließlich wurde eine vierte Fraktion. 20 mg Gammaglobulin (I 3"^;i) eluiert. indem sowohl der pH-Wert auf 5.4 als auch die NaCI-Konzentration auf o.2m erhöht wurde. Die AnaKsc der Ergebnisse hinsichtlich lies gesamten, in jeder Fraktion gewonnenen Proteins ergab eine Standardabweichung \on e:· a r 5"·Ί für die ersten beiden Fraktionen und etw λ ± 2'"'" fur die letzten beiden Fraktionen.

Dann wurde eine erneute Chromatographie der getrennten Fraktionen durchgeführt. Jede Fraktion wurde auf eine 0.60 Sättigung mit festem Ammoniumsuifat eingestellt und 8 Stunden lang bei 0"C stehen gelassen. Das ausgefällte Protein wurde dann durch Zentrifugieren und Dialysieren gegenüber 0.05 m Acetatpuffer bei pH 4.8 gesammelt. Die Bedingungen für die erneute Chromatographie waren die gleichen wie sie oben beschrieben sind. Das beschriebene Herstellungsverfahren wurde angewendet, um einige 100 mg der Fraktion IV (PC IV). welche Leukokinin enthält, zu erhalten.

!00 mg der Fraktion PC IV wurden mit Leukokininase. die aus poiymorphonuklearen Leukocytenmembranen vom Menschen. Hund oder Hase hergestellt worden

war, behandelt. 5 jig von Leiikokininascproteiii wurden pro mg iin PC IV in einem Endvolumen von 25 ml 0,1 in Phosphatpuffer (pH 6.7) gegeben. Es wurde zwei Stunden lang bei 37'C" inkliniert. Die Reaktion wurde beendet, indem Trichloressigsäure bis auf eine F.ndkun- ', /entralion von 5% zugefügt wurde. Der Niederschlag wurde abgetrennt. Nach der Extraktion mit Äther zur EniVrnung der Trichloressigsäure wurde das Material üiif einer D"wex* 10 Säule lyophilisiert und fraktioniert, die mit einer Kluierungsflüssigkeit aus mit Chloroform in gesättigter 0.1 m Essigsäure his /um > ileichgewicht behandelt worden war. Das Hetivolumcn der Säule betrug 29") ml: das l.eervoliimen I I "ΐ nil. die Hohe I IK cm und dor Innendurchmesser 1,8 cm. Es wurden 1 ml Proben in Gläschen in einem automatischen · · Fraktionssammler aufgefangen. In ilen (Haschen Nr. I J-") t-ΊΚ war Tuftsin III und IV enthalten. Die Tuftsin III Miid IV enthaltende Flüssigkeit wurde lyophilisiert

enthielt, aufgenommen. Dann wurde eine Chromatogra- i<\ phie auf einer Ammex-Süulc Hohe 60 cm. Innendurchmesser 0.6 cm, durchgeführt, wobei mit einem linearen Gradient bei M) ( eluiert wurd'.v Der Ausgangspuffer war Ps iclin-Acct.it (pH 4,0). der 1.2 ni Pyndin enthielt, und tier Endpuffer ist Pyridin-Acetat (pH o.O). in :■·, welchem 2.Sm Pvridin enthalten sind In jedem Gläschen wurden 2 ml Proben gesammelt.

In lieu Gläschen Nr. 65 -78 wurde Tuftsin IV in der Flüssigkeit gesammelt. Diese Flüssigkeit stellte einen scharfen symmetrischen Peak dar. Bei Dünnschichtchro- im ma' 'graphic mit Silicagel unter Verwendung eine' Entw ickliingslösung aus Propanol und Wasser im Verhältnis von 2 : 1 erhielt man eine einzige Zone. D.msvlierung des Peptids nut iJansylehlorid ergab ebenfalls eine einzige fluoreszierende /one bei Dünn- j> Schichtchromatographie mit Silicage! unter Verwendung einer Entwicklungslösung aus Chloroform. Methanol und Essigsäure im Verhältnis von 1 j : -t : I.

Die Ammosäurezusammensetziing nach der Hydrolyse in b η HCI bei 105'C für 20 Stunden ergab ein λο Molverhältnis an Threonin 1.01. Lysin !.00. Prolin 1.07 und Arginin 0.90. Alle Aminosäuren lagen in der L-Form vor. Bei der Behandlung nut Carboxypeptidase B bei 80 ν per ml und 20 für 2 Stunden bei pH 7.4 wurde nur Arginin als Verbindung mit der Carboxylendgruppe freigesetzt, und zwar 5O°/o des Peptids. Nach der Behandlung mit Leukin-Aminopeptidase bei 80 γ per ml und 25" C für 2 Stunden bei pH 8.5 mit MgCI: 3 χ 10-^! m w urde nur Threonin als Verbindung mit Aminoendgruppe zu 30% des Peptids freigesetzt. Daraus ergibt sich die so Reihe Thr-Lys-Pro-Arg, und die gewonnene Menge lag bei etwa 10O0μg in einer Ausbeute von 1.0 μg pro IGXX^g der Fraktion PC IV oder 1.0 μg pro 10 WX^g gesamten Gammaglobulins.

55 Beispie I 2

Tuftsin aus Cohn-Fraktion Il

1 g des Gammaglobulins der Cohn-Fraktion II wurde mit Trypsin. 5 mg je 100 mg Gammaglobulin in 0,1 m Chlorwasserstoffsäurepuffer, welcher 0.01 m Calcium enthält, bei pH 8.1 eine Stunde lang bei 37⁰C und einem Endvolumen von 250 ml behandelt Das freigesetzte Tuftsin wurde von dem übrigen Gammaglobulin durch Ausfällung in 5% Trichloressigsäure ausgetrennt und der Niederschlag verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde dreimal mit Äther extrahiert und das Material lyophilisiert, in 0,5 ml Essigsäure (0.1 m) aufgenommen und auf einer Sephadex-G-10 Säule Chromatographien. Diese Säule, die mit 0.1 m Essigsäure, die auch als Eluierungslösung diente, bis zum Gleichgewicht behandelt wurde, war bei einem Betivoltimen von 29¹JmI. l.eervolumen von 115 ml. Höhe von 116 cm und einem Innendurchmesser von 1,8 cm Chromatographien. Es wurden I ml Proben in Gläschen in einem automatischen Fraktionssammler aufgefangen. Die in den Gläschen 135 bis 158 aufgefangene Flüssigkeit enthielt Tuftsin 111 und IV. Sie wurde lyophilisiert und in Pyridin-Acetatpuffer (pH 4). welcher 1.2m Pyridin einhielt, aufgenommen. Dann wurde sie auf Aminexsäulen (Höhe 60cm. Innendurchmesser o.b cm) Chromatographien und bei einem linearen Gradienten und M)" C eluiert. Der Ausgangspuffer war Pyridin-Acetat (pH 4.0) und enthielt 1.2 m Pyridin. In jedem Gläschen wurden 2ml Proben auf gefangen.

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bis 78 gesammelt. Letzteres stellte einen schaden symmetrischen Peak dar. Die Dünnschichtchromatographie mit Silicagel unter Verwendung von Propanol' Wasser 2 : 1 ergab eine einzelne /.one. Diinsylierung des Peptids mit Dansylchlorid ergab ebenfalls einen einzigen fluoreszierenden Streifen bei der Dünnschichtchromatographie mit Silicagel unter Verwendung von Chloroform. Methanol und Essigsäure im Verhältnis von 15:4:1.

Die Aminosäurezusammensetzung nach der Hydrolyse in 6 r. HCI bei 105^?C für 20 Stunden ergab Threonin. Lysin, Prolin und Arginin in einem Molverhältnis von 1,03 : 1,00 : 1,04 : 0,93. Bei der Behandlung mit Carboxypeptidase B unter den in Beispiel I beschriebenen Bedingungen wurde nur Arginin als eine Verbindung mit Carboxylendgruppen freigesetzt, und zwar etwa 60⁰/o des Peptids. Nach der Behandlung mit Leucin-Aminopeptidase, wie sie in Beispiel I beschrieben ist. wurde nur Threonin als Verbindung mit Aminoendgruppen zu 35% des Peptids freigesetzt. Alle Aminosäuren lagen in der L-Form vor.

Beispiel 3

Tuftsin IV durch direkte Tryosinbehandlung von Gammaglobulin

Frisches Gammaglobulin wurde aus 100 ml an Menschen- oder Hundeserum wie folgt hergestellt: Zu 100 ml Serum wurden 100 ml Natriumchlorid (0.15 n) und 100 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben. Den Niederschlag ließ man bei Zimmertemperatur zwei Stunden lang stehen. Dieser wurde abzentrifugiert und diinn in 20 ml Natriumchlorid (0,15 n) gelöst. Dann wurden 10 ml an gesättigtem Ammoniumsulfat zugegeben. Nachdem man die Lösung zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen hatte, wurde sie über Nacht bei 5° C stehen gelassen. Das Präparat wurde dann abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Der Gammaglobuünniederschlag wurde dann gegen 1 Liter Natriumchlorid (0,15 n) für die Dauer von 4 Stunden diaiysierL Die Dialyse wurde zweimal wiederholt

1 g des frisch hergestellten Gammaglobulins wurde dann mit Trypsin zersetzt und auf einer Dowex-10-Säule und Aminex-Säule genau wie in Beispiel 2 beschrieben weiterbehandelt. Die Ergebnisse der Analyse von Tuftsin IV waren ebenfalls ähnlich: Threonin 038, Lysin 1,0, Prolin 1,03 und Arginin 0,87.

Il

Beispiel 4

Tuftsin IV aus frisch hergestelltem
Giimmaglobulin

Frisch hergestelltes Gammaglobuiin (wie in Beispiel 3) wurde auf Pliospl.orcellulosesäulen. wie in Beispiel 1 beschrieben, fraktioniert. Dann wurden 100 mg der Fraktion IV mit Leukokmase behandelt und auf einer Dowex-10-Säule und Aminex-Shulen. wie in Beispiel I beschrieben, fraktioniert. Das isolierte Tuftsin IV ergab gleiche Reste mit ähnlichen Werten, wie sie in Beispiel I. 2 und i erhalten wurden: l'hreonin 0.¹U. Lysin 1.00. Prolin 1,04 und Arginin 0>>7.

B e ι s ρ ι e I ">
Synthese von f'iftsin IV

I 5.8 mMol tBOC N' -Nitroa^rginin wurden mit lOg C hiürniCiMVl-i l.iiV { "ι ii ν m\ ; ι ΊιΙ ι viii yiiiei i/oii. iiior iiicthylhar/ 2.2 mMol des Chlorids pro Gramm des Har/es) in einer Mischung von 12.4 inMol Iriäthylamin und 30 ml Äthanol fur 24 Stunden bei 80 C unter ständigem magnetischem Kuhren umgesetzt. Das Harz wurde dann gründlich mit Essigsaure, dann mit absolutem Äthanol, mit Wasser mit zunehmender Menge an Äthanol, abschließend mit absolutem Äthanol und dann mit Methanol und Methylenchlorid gewaschen. Das Harz wurde dann im Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet. JO mg des H.irzes wurden mit 6 η H(I in Dioxan für 24 Stunden hydrolysiert. Das liltrat wurde im Vakuum getrocknet und in Zitratpuffer (pH 2.2.0.2 n) gelost. (line angemessene Menge wurde in einem Aminnsaureanalvsator auf Ornithin. Arginin und Nitroargimri gepnifi. Die ersten zwei sind Nebenprodukte der sauren Hydrolyse des Nitroarginin-Harzes. Die Summe aller drei stellt die Menge ties veresterten t-BOC-Nitroargmms d.ir. welches 0.3 mMol pro Gramm Harz betragt.

1.5 g des Harzes, das 0.45 mMol t-BOC-nitro-arginin entspricht, wird in einem Merrifield-Feststoffphasen-Behälter, welcher mit einer Klemme an einen Halter eines l80^r schwenkbaren Hubmotors befestigt ist. gegeben. Alle Arbeitsgänge erfolgen dann bei Zimmertemperatur bei 180^: Schaukelbewegung, so daß das Harz beständig geschüttelt wird. Die schützende t-BOC-Gruppe wurde mit 15 ml von 50% Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid für eine Umsetzungsdauer von 30 Minuten abgespalten. Das Harz wurde dann mit Methylenchlorid und anschließend mit Chloroform je dreimal mit 15 ml gewaschen. 1ml Triäthylamin und 9 ml Chloroform wurden dann dem Harz zugefügt und 10 Minuten lang geschüttelt, um das Hydrochlorid zu neutralisieren. Dann wurde wieder wie bereits vorher mit Chloroform und Methylenchlorid gewaschen. t-BOC-prolin. 135 mMo! in 15 ml Methylenchlorid. wurde dann an das N' des Nitroarginins mit 1,35 Mol Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zwei Stunden lang unter kontinuierlichem Rühren gekuppelt Das Harz wurde mit je 15 ml Äthanol bzw. Chloroform und Methylenchlorid je dreimal gewaschen. Die t-BOC-Gruppe wurde aus dem Prolin mit 50% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt gewaschen und mit Triäthylamin wie vorher neutralisiert In einer ähnlichen Weise wurde 135 mMol N*-t-BOC-N^ECarbobenzoxy-(CBZ)-Lysin an Prolin gekuppelt. Schutzgruppe abgvitrennt, neutralisiert und 135 mMol N*-t-BOC-Ob?iizylthreonin wurde dann an das ungeschützte N> des Lysins gekuppelt Die Stufen der Abtrennung der Schutzgrup-

pen (Abspaltung df·., t-BOC allein) mit TFA. Waschen. Neutralisieren mit l'iiäthylamin. Waschen und Kuppeln mit DCC wurde für jeden Aminosäurerücksiand in der gleichen Weise wiederholt.

30 mg des Tetrapeptidharzes wurde mit 6 η Chlorwasserstoffsäure in Dioxan für die Dauer von 18 Stunden hydrolysiert und das Produkt auf dem Ammosäureanalysator geprüft. Dabei wurde eine Ausbeute von Thr 0,9. l.ys 1.0. Pro 1.08. Arg 1.0 festgestellt. Der Wert für Arginin stellt wieder die Summe von Arginin. Ornithin und Nitroarginin dar. Das l'etnipeptid wurde von dem Harz mit Bromwasserstoff in Tl-A bei Zimmertemperatur fur l."> Stunden abgespalten Ks wurde dann im Vakuum getrocknet, zweimal mit Wasser gewaschen und lyophilisiert. Dessen Gewicht von 176 mg stellte eine Ausbeute von 78%, bezogen auf das veresterte Arginin dar

Ks wurde dann in 10 ml Methanol, welches IO".n essigsäure enthielt, aufgenommen. Diese Mischung wurde dann mit der doppelten Menge seine¹· Gewichts (350 mg) Palladium auf Bariumsulfat in einer W.i^si rstoffatmosphare bei einem Druck von hti p.s.i. (4.2 at) unter kontinuierlichem Rühren 24 Stunden lang der katalytischen Hydrogenierung unterzogen; wahrend dieser Zeit wurde kein Nitroarginin bei einem Absorptionsmaximuni von 271 πιμ gefunden, f.in«. gleiche Menge wurde wieder mit bn HCI in Wasser hydrolysiert und geprüft. Ks wurde eine vergleichbare Ausbeute von Thr 0.92. l.ys 1.0. Pro 1.05 und Arg 0.98 erhalten.

Das Material wurde dann auf einer Aminex-Sauie mit einem linearen pH-Gefälle von 4 — 6 mit 1.2 m bis 2.Ί m Pyridin bei einer Fließgeschwindigkeit \on 8 ml pro Stunde Chromatographien. Der Hauptpeak. das Tetrapeptid. erschien genau bei dem Tuftsin-1 V-Peak. der siih von der CP-Fiaktion-IV-Gammaglobulin ableitet, d.h. zwischen 138- 150 ml. mit einem Peak mit M4 ml des Abflusses. Das aufgefangene Material wurde im Vakuum getrocknet, zweimal mit 0.1 molar F.ssigsaure. in 0,1 molar Essigsäure aufgenommen und Kophilisiert Nach der Aminosäureanalyse wurde Thr 0.96. l.ys 1.0. Pro 1.03. Arg 1,0 gefunden. Alle Aminosäuren waren in L-Form.

Das Tetrapeptid in Form des Diacetatsalzes wurde dann zu dem Natriumsalz durch Addition von drei Äquivalenten Natriumhydroxyd umgewandelt.

Die Endausbeute, bezogen auf da? an Harz veresterte Nitroarginin. betrug etwa 65%.

Das Verfahren wurde wiederholt, um das Tetrapeptid mit allen Aminosäuren in der D-Form zu bilden.

Beispiel 6
Synthese von Tuftsin IV

t-Boc-Nitroarginin wurde zu dem chlormethylierten Harz verestert, die Schutzgruppen abgetrennt, neutralisiert und wie in Beispiel 1 und zusätzlich noch einmal mit Dimethylformamid (DMF) gewaschen. \2 g. in welchem 0,25 mMol Arginin enthalten war. wurde als Ausgangsmaterial verwendet. 1,0 mMol t-BOC-Proiin-Succinimidester wurde dem Harz in DMF zugegeben und für die Dauer von 24 Stunden unter Schütteln bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Die Entblockierung, Neutralisation und Waschen erfolgte, wie in Beispiel 5 biichrieben, mit einem anschließenden Waschen mit DMF, wurden für jedes darauffolgende Kuppeln mit 1,0 mMol N-Hydroxysuccinimidester von N*t-BOC N^ECBZ-Lysin und N»t-BOC-o-benzylthreonin wieder-

holt. Die Abspaltung von dem Harz, die katalytisch Hydrierung und Reinigung der Säule erfolgte in derselben Weise wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Aminex-Säule. wie in Beispiel 5, zeigte einen vorherrschenden Peak in dem Tuftsin-IV-Bereich. Die Ausbeute ■> betrug 34%. bezogen auf das veresterte Arginin. Nach der Abspaltung von dem Harz waren die Ergebnisse der Analyse wie folgt: Thr 0,85, Lys 1,0, Pro 0,95. Arg 1.08. Nach der Reinigung auf der Aminex-Säule ergab die Analyse Thr 0,93. Lys 1,0, Pro 1,05. Arg 0.98. Das Tetrapeptid wurde im Vakuum getrocknet, mit 0.1 m Essigsäure zweimal gewaschen und abschließend in 0.1 in Essigsäure lyophilisiert und zu dem Natriumsalz, wie in Beispiel 5 beschrieben, umgewandelt.

Beispiel 7

N^-BOC-N^-Nitroarginin wurde zu clem I larz, wie in Heispiel 5 beschrieben, verestert. Fs wurde von .jCilü'/irrüppcn «!./getrennt, gcwnscncn uriu. wie in Beispiel 5 beschrieben, neutralisiert. 1.2 g. in welchem :> > 0.32 rnMi.i Arginin enthalten sind, wurde mit 1.28 mMol t-BOC-Prolin-p-Ni'.rophcnylestcr in 10 nil DMF' unter Schütteln für die Dauer von 18 Stunden bei Zimmertemper.iiur umgesetzt. Als die Reaktion abgeschlossen war. wurde das t-BOC abgespalten, das Harz neutralisiert ->■> und. wie in Beispiel 6 beschrieben, gewaschen. Anschließende Kupplungen erfolgten mit Nm-BOC N'CBZ-Lysin-p-nitrophenylester gefolgt von Nm-BOC-O-benzylthreonin-p-nitrophrnylester. Die Abtrennung der Schutzgruppe!! vun Jei· Aminogruppen, das w Waschen und Neutralisieren, die Abspaltung von dem Harz und katalytisch^ Hydrierung wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. Durch Chromatographie auf den Aminex-Säulen, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde reines Tuftsin IV isoliert. Die Analyse an dem '.'· Hi.uptpcak ergab Thr 0.90, Lys 1.0. Pro 1,03. Arg 1.03. Die Endausbeute betrug 65% an verestertem Arginin.

Beispiel 8 Synthese von Tuftsin IV

Arginin (Monohydrochlorid). 0.2 mMol in 2 ml Wasser, in welchem 0.1 3 ml Triethylamin enthalten sind, wurde mit 0.6 mMol NM-BOC-Prolin-N-Hydrowsuccinimidester (Osu) in 5 ml Tetrahydrofuran unter ständi- '■' gern Rühren bei Zimmertemperatur für 24 Stunden umgesetzt. Es wurde dann im Vakuum getrocknet und der Rückstand in 0.1 m Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. Das Material wurde dann in Wasser gelöst und mit einem linearen Pyridin-Acetatgefälle auf einer Aminex-Säule 0.6 χ 60 cm bei 60⁷C Chromatographien. pH 3.1-5.6. Pyridin 0.2-4 m. 2 ml wurde in jedem Röhrchen aufgefangen: die Fließgeschwindigkeit betrug 8 ml pro Stunde. Unter diesen Bedingungen werden Nm-BOC Pro-Osu und die freie Säure nicht an die Säule gebunden und erscheinen an der Vorderseite. Der Hauptpeak und erste positive Sakaguchi-Peak, welche das Dipeptid darstellen, wurde isoliert und lyophilisiert, in Wasser aufgenommen und wieder auf Konstantes Gewicht lyophilisiert Das geschützte Dipeptid (60 mg) w> wurde dann in ein Eisbad gebracht und 1 ml eiskaltes TFA zugefügt. Das gelöste Peptid wurde 15 Minuten lang in dem Eisbad gelassen. Es wurde dann mit 40 ml eiskaltem Wasser verdünnt und zweimal mit 80 ml eisgekühltem Äther extrahiert. Die kombinierten Ätherschichten wurden mit 20 ml Eiswasser zweimal extrahiert und die gesamte gebildete wäßrige Phase lyophilisiert. Das Dipeptid wurde dann in 2 ml Wasser aufgenommen. 0.12 ml Triethylamin wurden zugefügt und mit 0,58 mMol NM-BOC-N'CBZ-Cysin-Osu-Ester iu 5 ml Tetrahydrofuran bei Zimmertemperatur für die Dauer von 24 Stunden unter Rühren umgesetzt. Das Material wurde wieder im Vakuum getrocknet, in 0.1 m Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. Es wurde dann in Wasser gelöst und auf der gleichen Aminex-Säule Chromatographien, mit der Ausnahme, daß das Pyridin-Acetatgefälle im Bereich von pH 4-6 war unii 1,2 m Pyridin- (2.5 m) verwendet wurde. Das nicht umgesetzte geschützte I.ysin-Osu wurde nicht gebunden. Der Hauptpeak bei der Aininosäurcanalyse erwies sich als das Tripcptid. Lys-Pro-Arg. 1.0. 1,08. 0.97. Es wurde dann getrocknet und als eine wäßrige Lösung lyophilisiert. mit TFA von .Schutzgruppen befreit und mit Äther unter den gleichen wie für das Dipeptid beschriebenen Bedingungen mit Äther extrahiert. Die Ausbcte betrug 93 mg.

-Λ~ Γ» CO

r\ η ...ι

threonin-Osu in 5 ml Tetrahydrofuran umgesetzt und in derselben Weise wie das Tripeptid einschließlich dem Pyridin-Acetatgefälle in der AminevSäule wei'.erbehandelt. Der Hauptpeak war das geschützte Tetra'icptid. NM-BOC-Thr-O-Bcn/-N'CBZ-Lys-Pro-Arg. Dieses wurde, wie bereits vorher beschrieben, auf ein konstantes Gewicht von 118 mg lyophilisiert und mit HF von Schutzgruppen befreit. Das freie Peptid wurde dann wie in Beispiel 5 beschrieben auf einer Aminex-Säule isolict. Die Analsse ergab Thr 0.95. Lys 1.0. Pro 0.98. Arg Lu3.

Beispiel 9 Synthese von Tuftsin IV

Die verschiedenen Stufen der Synthese des ersten Dipeptids unter Verwendung von Arginin und N-t-BOC-Prolin-p-nitrophenvlester wurden im wesentliche: nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die Umsetzungszeit betrug 18 Stunden. Die Fraktionierung auf der Aminexsäule. F.ntblockieriing und Kuppeln mit Nm-BOC-N'CBS-Lvsin-p-Nitrophen\lester wurde ebenfalls wie in Beispiel 8 vorgenommen.

Das gleiche gilt für die Reinigung auf der Aminex-Säule. die Entblockierung und Umsetzung mit Nm-BOC-O-Benz-threonin-2.4-dinitrophenylester und anschließende Reinigung und Trennung des Tetrapeptids und dessen Entblockierung mit HF und anschließende übliche Chromatographie auf der Aminex-Säule. Es folgten im wesentlichen die gleichen Stufen wie in dem N-hydroxysuccinimidverfahren von Beispiel 8. Die Ausbeute und Reinheit waren die gleichen wie bei den vorhergehenden Beispielen bei einer Zusammensetzung von Thr 0.98. Lys 1,0, Pro 1.03 und Arg 0.95.

Beispiel 10 Synthese von Tuftsin IV

0.5 mMol Arginin-freie Base wurde in 2.5 ml (0.5 m) Boratpuffer bei pH 10,5 gelöst in einem in einem Eisbad auf 0°C gehaltenen Schnellmischer auf 0^cC abgekühlt. 0,55 mMol N-Carboxyanhydrid (NCA) des Prolins wurden in zwei gleichen Portionen in einem Abstand von 1 Minute zugegeben, während der pH-Wert durch die Zugabe von ' 10 η Natriumhydroxyd konstant gehalten wurde. Eine Minute nach der zweiten Zugabe wurde der pH-Wert auf 4,8 gebracht, indem konzentrierte Schwefelsäure zugegeben wurde. Die Lösung

wurde mit Nj-Gas gespült, um das aus dem erhaltenen Peptidkarbamat gebildete COi zu entfernen. Der pH-Wert wurde auf 10,2 erhöht und das NCA von N CBZ-Lysin (0,55 mMol) wurde zugegeben und die Reaktion für die Dauer von 2 Minuten fortgesetzt, während der pH-Wert mit 10 η NaOH bei O³C bei 10,2 gehalten wurde. Dann wurde Schwefelsäure zugefügt, um den pH-Wert auf 5,0 zu bringen, während man mit NrGas durchspülte. Das Präparat wurde dann durch eine Sephadex G ΙΟ-Säule geschickt, die mit 0,1 m Essigsäure bis zum Gleichgewicht behandelt worden war, und das Peptid isoliert, lyophilisiert und in 5 ml Tetrahydrofuran, in welchem 0,13 ml Triäthylamin und 1,5 mMol Nn-BOC-O-Benzyl-threonin Succinimidester enthalten waren, aufgenommen. Dann wurde Succinimidester zugefügt und bei Zimmertemperatur für die Dauer von 24 Stunden gerührt. Es wurde im Vakuum abgedampf». in Wasser aufgenommen und bis zum konstanten Gewicht lyophilisiert. Dann wurde es mit TFA bei 0⁰C für die Dauer von 20 Minuten entblockiert und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Es wurde dann aus einer Wasserlösung lyopliilisiert und in einer Aminex-Säule, wie in Beispiel 1 beschrieben, Chromatographien. Die Endausbeute betrug 28%, bezogen auf das Arginin als Ausgangsmaterial. Zusammensetzung: Thr 0,86, Lys 1,0, Pro 1.03. Arg 0.96.

Das Verfahren dieses Beispiels wurde wiederholt, um die gleichen Produkte herzustellen, mit der Ausnahme, daß die Grundaminosäuren bei Verwendung als N-Carboxyanhydride als N-Chlorquecksilbersalze geschützt wurden, wie in der US-Patentschrift 34 59 760 beschrieben ist. Die Ausbeuten waren sehr verbessert.

Beispiel 11
Bildung von N-terminal-acyliertem Tuftsin IV

0.45 mMol O-Benzyl-threonyl-N'-Cbz-lysyl-prolyl-N^G-nitroarginin-Harzester auf 13 g Harz wurde mit 1,5 mMol Stearinsäure unter Verwendung von 1,5 mMol Dicyclohexyicarbodiirr.id in Chloroform/Dimethylformamid (1:1) gekuppelt. Im übrigen wird das Verfahren für die Abspaltung von dem Harz mit HBr in CF₃ COOH (TFA), Abtrennung der Schutzgruppen des Threonins und Lysins und katalytische Hydrierung des Nitroarginins zu Arginin und Ammoniak angewendet, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben. Die Endausbeute von N-Stearoryl-Tuftsin ist 63% - 71 %.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit den anderen Fettsäuren in einer Ausbeute von etwa 37 bis 67% erhalten. Diese sind Essig-, Propion-, Butter-, Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Olein-, Linol- und Linolensäure. Im Falle der drei zuletzt genannten Säuren, die ungesättigt sind, kann die Hydrierung nicht angewendet werden, da dadurch die olefinische Doppelbindung reduziert werden würde. Statt dessen wird das Peptidharz mit Fluorwasserstoff unter wasserfreien Bedingungen behandelt, um alle schützenden Gruppen und die entsprechenden acylierten Derivate des Tuftsinhydrofluorids zu entfernen. Die Ausbeute bei den ungesättigten Fettsäuren für das Endprodukt N-Acyl-Tuftsin lag in den unteren Bereichen zwischen etwa 48 und 55%.

Die Reinigung der N-Aeyl-Prödükte variiert je nach der Länge der Kette. Die hauptsächliche Verunreinigung stellte ungebundenes Tuftsin dar. Bei Acetyl-, Propionvl- und Butyryl-Tuftsin erfolgte die Trennung der beiden in der Amincx-Säule (Dowcx® 50) bei einem linearen Gefälle des Pyridin-Acetatpuffers bei pH 4.0 bis 6.0 bei einem Pyridin-Molgefälle von 1.2 m- 2.5 m. Der erste sichtbar werdende Peak ist N-Acyl-Tuftsin, der kleinere (freies Tuftsin) erscheint spaten

Bei langkettigen Fettsäuren genügt zur Trennung der beiden eine Dowex^e-10-Chromatographie mit 0,1 m

, Essigsäure. Tuftsin mit einer freien NHrGruppe ist stark basisch, bindet sich an Sephadex und wird verzögert; es erscheint als Substanz mit geringem Molekulargewicht mit freien Aminosäuren. Das isolierte Pyridiumsalz wird dann durch Basenaustausch zu dem

,ι Natriumsalz umgewandelt.

Beispiel 12
Bildung von O(Thr)-Stearoyl-Tuftsin IV

0,5 mMol Nu-BOC-Threonyl-N*Cbz-lysyl-prolyl-N^G-nitroarginin auf 1,5 g Harz wurde gründlich mit Chloroform und Methylenchlorid gewaschen und 1,5 mMol Stearinsäure in Chioroform/DMF (1:1] wurde zugefügt. Dann wurden 1,5 mMol Carbonyldiimi-

i, dazol in den gleichen Lösungsmitteln zugegeben. Die Reaktionsteilnehmer wurden bei Zimmertemperatur in dem gleichen wie bei dem Merrifieldverfahren für die Herstellung des Peptids verwendeten Behälter zwei Stunden lang geschüttelt. Das Peptid wurde dann mil

. Bromwasserstoff in Trifluoressigsäure 1,5 Stunden lang bei Zimmertemperatur abgebaut. Dann wird die katalytische Hydrierung durchgeführt und die erhaltenen Produkte wie in den vorherigen Beispielen gereinigt

Beispiel 13
Herstellung von Tabletten

1000 g Tuftsin IV und 2000 g Lactose werder gründlich vermischt und man läßt das Ganze durch eir Sieb mit einer Maschenweite von 0,59 mm passieren.

Eine Paste wurde mit 80 g Maisstärke und 350 m destilliertem Wasser hergestellt.

Die oben genannte Mischung wurde dann gut mit dei

- Paste verknetet und die Masse läßt man durch ein Siet mit einer Maschenweite von 4,76 mm passieren. Die dabei erhaltenen Kügelchen wurden bei 50°C für i; Stunden getrocknet.

Die getrockneten Kügelchen wurden dann zuerst ir

• einer Granulat-Maschine granuliert und dann durch eir Sieb mit einer Maschenweite von 1,19 mm gesiebt. Di< Körner wurden mit einer pulverigen Mischung, di< durch Vermischen von 30 g Kalziumstearat, 200j Maisstärke und 80 g Talk erhalten worden war. umhüllt

"·" und dann läßt man diese durch ein Sieb mit eine Maschenweite von 0,59 mm passieren.

Aus den in oben beschriebener Weise erhaltenei Körnchen wurden nach den herkömmlichen Verfahret Tabletten hergestellt, die je 250 mg Tuftsin IN ■·■■ enthielten.

Beispiel 14
Herstellung einer Injektionslösung

100 g des Natriumsalzes von Tuftsin IV wurden ir einer Menge destilliertem Pyrogen-freiem Wasser, da; speziell für diesen Zweck hergestellt worden war aufgelöst und auf ΐ Liter verdünnt. Die Lösung wurde durch Zugabe liner vorbestimmten Menge cinei wäßrigen Lösung von physiologischem Kochsal? isotonisch gemacht und durch einen kleinstporiger Bakterienfilter filtriert.

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17

Beispiel

Herstellung einer wäQrigen Lösung zur oralen Verabreichung

Glycerin	100,0 ml
Äthyl-p-oxybenzoat .	1.5 g
künstliche Orangen-Essenz	0,2 ml
ätherisches Orangenöl	1,0 ml

Eine Mischung aus

Tuftsin IV-Hydrochlorid Rohrzucker

20,0 g 100,0 g wurde in destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml gebracht.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Das Tetrapeptid Threonyl-lysyl-prolyl-arginin sowie dessen

a) Ci-bisCfi-Alkylesterund

b) Amide,

ferner mit einem Acylrest, der sich von einer Alkansäure oder Alkensäure mit bis zu 18 C-Atomen oder von Linol- oder Linolensäure ableitet,