DE2124003A1 - Therapeutisch verwendbare Poly peptide - Google Patents

Description

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PATENTANWÄLTE

dr. W. Schalk · dipu-ing. P.Wirth · dipl.-ing. G. Dannenberg

DR.V. SCHMIED-KOWARZIK * DR. P.WEINHOLD · DR. D. GUDEL

6 FRANKFURT AM MAIN

CS. ESCHENHEIMER STRASSE 39

j:fs~86O6

Wd/Be

Victor A. ITajjar

Atlantic Avenue

Cohasset, Massachusetts, U.S.A.

Therapeutisch verwendbare Polypeptide.

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Die vorliegende Erfindung "bezieht sich auf neue, therapeutisch wertvolle Polypeptide, die auf Phagocytose oder Pinocytose stimulierende oder hemmende Wirkung in unterschiedlichem Ausmaß haben.

Die GammaglolDulinfraktion des gesamten Säugetierblutes ist die Fraktion, welche die vom Körper erzeugten Antikörper enthält, um dem Angriff durch Antigene entgegenzuwirken. Die Gammaglobulinfraktion von Säugetierblut ist also insbesondere die Fraktion, in welcher die Substanzen enthalten sind, die der Körper zur. · Bekämpfung von Angriffen durch Infektionskrankheiten einsetzt« " Die Herstellung von Antikörpern ist ein natürlicher Abwehrmechanismus des Körpers und wird durch die Anwesenheit von Antigenen im Körper angeregt. Normalerweise werden spezifische Antikörper zur Bekämpfung spezifischer Antigene erzeugt und in vielen Fällen behält der Körper danach einen Antikörpergehalt gegenüber spezifischen Antigenen oder infektiösen Organismen, so dass Ueuinfizierung gehemmt und oft verhindert wird.

Die Verwendung der Gammaglobulinfraktion des Säugetierblutes . als ein therapeutisches Mittel hat deshalb in der Medizin beträchtliche Aufmerksamkeit gefunden, da es möglich schien, diese Fraktion von einem Einzelindividuum, der eine Infektion ψ erfolgreich überwunden hatte, zu verwenden, um den Widerstand gegen die gleiche Infektion in einem anderen Individuum zu erhöhen.

leider hat sich dieser Versuch der Prophylaxe als nicht ausreichend erfolgreich erwiesen und kann ausser in Fällen von Gammaglobulinämie nicht für längere Zeit angewendet werden. Dafür liegen mehrere Gründe vor.' Ein Grund ist, dass Patienten oft Gammaglobulin ablehnen, insbesondere bei wiederholten Gaben, weil das Gammaglobulin wie e.in Antigen wirkt und Antikörper als Gegenreaktion gebildet werden. Ferner kann eine Zunahme des (iammaglobulinspiegels im Blut über den normalen V/ort hinaus ungünstige Auswirkungen haben, wie man bei der Hypergammaglobu-Ii mim ic: sehen kann. Darüberhinau3 ist sogar in den Fällen, in

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denen eine Gaiiunaglobulinbehandlung angewendet werden kann, die Behandlung nicht so wirksam wie erwünscht, weil der grösste Teil davon mehr dazu neigt, im Blut der Patienten zu verbleiben als sich in dem Zellgewebe, welches der übliche Infektionsherd darstellt, zu verteilen.

Es wurde nun gefunden, dass das Tetrapeptide L-Threonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginin, welches von Gamaiaglobulin durch die nach- ' folgend beschriebenen Verfahren gewonnen werden kann, das aber nicht als diskretes und freies Molekül im Gammaglobulin- existiert, die Wirkung hat, Phagocytosis und eine anschliessende Bakterienvernichtung durch polymatjhonukleare Blutleukocyten, insbesondere neutrophile Leukocyten, in Säugetieren zu stimulieren. Es fördert ebenfalls im gleichen Ausmass die Pinocytose, wobei die Zellen von dem umgebenden Medium genährt werden können. Die vorliegende Anmeldung betrifft hauptsächlich die Polypeptidkle e, zu der dieses Tetrapeptid gehört, mit analogen Verbindungen, Derivaten und pharmakologisch geeigneten Salzen desselben.

Es wurde also eine neue Klasse von therapeutisch geeigneten Polypeptiden gefunden. Die Glieder dieser Klasse können Phagocytosis oder Pinocytosis hemmen oder stimulieren. Als Hauptmerlanale dieser Klasse haben ihre Giieder keine Antigenwirksamkeit und enthalten wenigstens drei bis zu etwa 19 Aminosäuren und wenigstens eine Peptideinheit, in welcher zwei Grundäminösäuren durch ein oder zwei Prolininoleküle verbunden sind. Das niedrigste Glied der Klasse ist deshalb ein Tripeptid, in welchem zwei Grundaminosäuren diirch Prolin verbunden sind.

In dieser Beschreibung werden die gebräuchlichen Abkürzungen für die verschiedenen Aminosäuren verwendet. Trotzdem diese dem Fachmann bekannt sind, werden die wichtigsten hier vorkommenden Abkürzungen nachstehend aufgeführt.

Lysin - Lys Histidin - His Arginin - Arg Threonin - Thr Ornithin - Orn Serin - Ser

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Tyrosin -Tyr Phenylalanin - Phe Prolin - Prp

Die ersten vier dieser Säuren sind die Grundaminosäuren und diese werden durch den Begriff G-rundaminosäuren,' wie er hier verwendet wird, umfasst. ' ^;

Die Grundeinheit der Klasse der Polypeptide, auf die sich die vorliegende Erfindung "bezieht, ist ein Tripeptid, in welchem zwei Grundaminosäuren durch Prolin verbunden sind. Die folgenden k Tripeptide gehören also dieser Klasse an:

• Lys-Pro-Iys Grn-Pro-Lys

Arg-Pro-Arg His-Pro-His

Arg-Pro-Lys His-Pro-Lys

Lys-Pro-Arg His-Pro-Arg

Arg-Pro-Orn His-Pro-Orn

Orn-Pro-Arg ■ Lys-Pro-His

Orn-Pro-Orn Arg-Pro-His

Lys-Pro-Orn Orn-Pro-His

Polypeptide, die auf Grund ihres hohen Wirksamkeitsgrades entweder als Stimulatoren oder Inhibitoren bevorzugt verwendet werden, sind Tetrapeptide, in welchen eine andere Aminosäure, vorzugsweise eine Hydroxyl-substituierte Aminosäure an einen der oben genannten Tripeptide gebunden ist. Solche Aminosäuren sind Threonin, Serin, Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan. Erfindungsgemäss geeignete Tetrapeptide sind deshalb folgende:

Thr-Lys-Pro-Arg Ser-Lys-Pro-Arg Thr-Iys-Pro-Lys Thr-Arg-Pro-Arg Thr-Arg-Pro-Lys Thr-Arg-Pro-Orn Thr-Iys-Pro-Orn Thr-Lys-Pro-His

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Ser-Iys-Pro-His

Diese Verbindungen, in denen die Aminosäuren sämtlich in L-Porm vorliegen, v/erden als Phagocytosis- und Pinocytosis-stimulierende Mittel "bevorzugt. Es scheint, dass diese alle wirksamer sind als die entsprechenden Tripeptide oder eines der oben genannten Tripeptide. Das zuerst genannte Tetcap ept id ist bei weitem das wirksamste. Die anderen sind etwas weniger wirksam. Die Wirksamkeit kann weiter vermindert werden, wenn wenigstens eine der in L-Porm vorliegenden Aminosäuren durch eine D-Aminosäure ersetzt wird. Durch einen derartigen Austausch ist es möglich, die Stimulatoren in Inhibitoren zu verwandeln.

Ein sehr aktiver Inhibitor oder Antogonist ist das umgekehrte Isomere des zuerst genannten Tetrapeptids, in welchem alle Aminosäuren in D-Form vorliegen. Diese Verbindung ist: Arg-Pro-Lys-Thr,

Verschiedene Inhibitionsgrade können erreicht werden, wenn eine oder mehr D-Aminosäuren durch L-Aminosäuren ersetzt werden. Die folgenden Verbindungen entsprechen also der vorliegenden Erfindung .

Arg-Pro-Lys-Ser

Lys-Pro-Iys-Thr

Arg-Pro-Arg-Thr

Lys-Pro-Arg-Thr

Orn-Pro-Arg-Thr

Orn-Pro-Lys-Thr " His-Pro-Lys-Thr

His-Pro-Lys-Ser

Im allgemeinen sind unter solchen Tetrapeptiden die wirksamsten Stimulatoren, in denen die Aminosäuren alle in L-Porm vorliegen, und die an die Grundtripeptidgruppe gebundene vierte Aminosäure eine h-droxylsubstituierte, aliphatisch^ Aminosäure ist, die durch dessen Carboxylgruppe an die Alphaaminogruppe der Grundaminosäure gebunden ist und dessen Carboxylgruppe eine Peptidbindung mit dem Prolin eingeht. Die Isomeren dieser Ver-

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bindungen in umgekehrter Anordnung, in denen alle Aminosäuren in D-Form vorliegen, sind aktive Inhibitoren.

Pentapeptide, in denen sich eine der Aminosäurenwiederholt, haben ebenfalls eine hemmende Wirkung und sind deshalb geeignete therapeutische Mittel. Zu entsprechenden erfindungsgemässen Verbindungen zählen:

Thr-lys-Pro-Pro-Arg

Thr-Thr-Lys-Pro-Arg

Thr-iys-Iys-Prο-Arg

Thr-Lys-Pro-Arg-Arg » W Ser-Lys-Pro-Pro-Arg

Diese Gruppen können auch die sich wiederholende Einheit in· Polypeptiden erfindungsgemäss mit bis zu etwa 19 Aminosäuren sein.

Wenn nicht besonders als D oder L identifiziert, können die Aminosäuren ausdrücklich in beiden Formen vorliegen.

Es ist offensichtlich möglich, Verbindungen innerhalb der definierten Klasse herzustellen und zu verwenden,, die variierende stimulierende oder hemmende Wirkung haben. Dies ist sehr wichtig, weil es medizinische Syndrome gibt, bei denen der Patient im P wesentlichen nicht zur Phagocytose oder Pinocytose fähig ist, was bei Individuen mit Splenektomie der Fäll ist, und Zustände, bei denen die Phagoeytose so ausgeprägt ist, dass andere offensichtlich normale Zellen verbraucht werden. Dieses geschieht mit Patienten, die unter den sogenannten Kollagen-Krankheiten, wie zum Beispiel rheumatische Arthritis und Lupus erythematodes, leiden. Eine abnormale Phagocytosewirksamkeit bei diesen Patienten kann zu einer krankhaften Gefassveränderung in den Gelenken und anderen Organen führen. Daher ist eine Behandlung von diesen Patienten mit den erfindungsgemässen Inhibitorverbindungen durchzuführen.

Wie oben erwähnt, sind Tetrapeptide die bevorzugten Verbindungen, von denen Thr-Lys-Pro-Arg, in welcher alle Aminosäuren in der

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L-I'orm vorliegen, die Verbindung mit der höchsten" stimulierenden Wirkung ist. Das "bevorzugte inhibierende Mittel ist Arg-Pro-Lys-Thr, worin alle Aminosäuren in der D-Form anwesend sind. Der Einfachheit halber wird die zuerst genannte Verbindung als Tuftsin IV und die zweite Verbindung als Retrotuftsin IV bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Tuftsin IV näher beschrieben. Dieses Tetrapeptid wurde chemisch synthetisiert und erwies sich mit einem der Produkte als identisch, die in äusserst geringen Mengen von Gammaglobulin durch sehr langwierige Verfahren abgetrennt werden können, die die Spaltung von Leukokinin, eines der bekannten Proteinfraktionen in Gammaglobulin, umfassen. Leukokinin wird in der Milz hergestellt oder aktiviert. Individuen mit Splenektomie haben deshalb einen · Mangel an Tuftsin IV.

Tuftsin IV, wie es in dem Blut von Säugetieren enthalten ifc stellt einen Teil des grösseren Moleküls Leukokinin dar, was aus der Abtrennungsmethode erkennbar wird, bei der ein spezifisches Enzym Leukokininase für die Spaltung erforderlich ist. ''Es scheint, dass Phagocytose und Pinocytose durch einen Mechanismus angeregt wird, welcher umfasst a) Bindung des Leukokininmoleküls an eine bestimmte Stelle an der Zellmembrane, b) Spaltung des Leukokininmoleküls durch die Wirksamkeit der Membranenzyms-Leukokininase, welches einen integralen Tedl der Bindungsstelle bildet, und c) Überführung als Komplex mit dem Enzym zu der Stelle seiner Wirksamkeit, wo es offensichtlich zur Ausübung seiner stimulierenden Wirkung zerstört wird; In keinem Fall ist ein Verfahren bekannt, welches nicht die enzymatisch^ Spaltung erforderlich macht und die Isolierung des reinen Tetrapeptids ermöglicht. Es ist tatsächlich kein Verfahren bekannt, das die Isolierung von geeigneten Mengen an Tuftsin IV aus einer praktisch annehmbaren Menge an Säugetierblut ermöglicht.

Leukokinin selbst ist als therapeutisches Mittel-nicht geeignet, ■v/eil das Molekül nicht als ein autologes Molekül erhalten werden kann, sondern nur aus vereinigten heterologen Quellen. Aus

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diesem Grunde und wegen seiner Grosse und differierenden Struktur, leitet es eine Antigen-Antikörper-Reaktiori in dem Wirtorganismus ein und wird zurückgewiesen. Tuftsin IV jedoch scheint in jeglichem menschlichen Leukokinin identisch zu sein, und weil es ein kleines Molekül ist, verursacht-es keine Antikörper-Reaktion» · /

Als kleines Molekül wird es ausserdem leicht in das Zellgewebe transportiert, wo es eine Phägocytose-Wirkung auf jeglichem Organismus oder Teilchen durch direkte Einwirkung auf die Phago-■ cyten und nicht die Bakterien ausübt. In diesem Sinne wirkt Tuftsin IV als ein allgemeines Antibiotikum, aber es verursacht nicht wie dieses eine allergische Reaktion und bewirkt auch nicht das erhöhte Auftreten von resistenten Organismen, Dieses ist oft bei bakteriellen Infektionen, die mit Antibiotika behandelt werden, der Pail, weil sie selektiv auf die Bakterien wirken und dabei resistente Mutante überleben. Tuftsin IV ist ein nicht toxisches, nicht-antigenes, therapeutisch geeignetes. Phagocytose und Pinocytose stimulierendes Tetrapeptid, das die körpereigene Abwehr gegen das Eindrigen von Fremdsubstanzen . erhöht.

Tuftsin IV und die verwandten Polypeptide, Tuftsin I, Tuftsin II und Tuftsin III, die alle eine Phagocytose- und Pinocytosewir- W kung aufweisen, können aus verschiedenen Gammaglobulinfraktionen, die auf Phosphorcellulosekolonnen chromatographiert worden sind, erhalten werden. Das allgemeine Verfahren wird nachfolgend beschrieben.

Gammaglobulin wird aus Menschen-, Hunde- oder Kaninchen-Serum durch Ausfällung bei 0,53' Ammoniumsulfatsättigung erhalten. Das Verfahren für die Isolierung der Tuftsine wird ausführlich in den Beispielen beschrieben. Tuftsin I wird durch Behandlung einer Fraktion aus einer Phosphorcellulosekolonne (PCI) mit Trypsin oder Enzymen, die aus den Membranen der roten Blutkörperchen und den Membranen der .Zellen von polymorphonuklearen neutrophilen weissen Blutkörperchen erhalten worden sind, hergestellt.

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Tuftsin II, III und IV werden aus der Phosphorcellulosefraktion IV ('PC IV) durch Behandlung dieser Fraktion mit Trypsin oder Bnzymleukokininase, die aus den Membranen der neutrophilen Leukocyten und aus peritonealen Ausscheidungen des Kaninchens durch bekannte Verfahren hergestellt worden sind, erhalten. Sie sind in der Hauptsache Peptide, die von dem Rest der Proteine nach der Enzymbehandlung durch Ausfällung der letzteren mit 5/' Trichloressigsäure abgetrennt werden. Der überstehende Teil enthält die Tuftsinverbindungen. Trichloressigsäure wird durch Itherextraktion entfernt und die Tuftsine werden lyophilisiert und an Sephadex G-10 Kolonnen chromatograp^iert, die mit einer fliessenden Elutionsflüssi^keit aus mit Chloroform gesättigter 0,1 η Essigsäure im Gleichgewicht steht. Die abfliessende Lösung wird in 1 ml Proben aufgefangen. Die Proben 115 bis 125 enthalten Tuftsin II, und die Proben 135 bis 158 enthalten Tuftsin III und IV. Die Lösung, welche Tuftsin III und IV enthält, wird lyophilisiert und in Pyridin-Azetat-Puffer bei pH 4 aufgenommen. Die Mischung wird in Dowex 50 Kolonnen ehromatographiert und bei pH 4,0 bis 6,0 in 1,2 bis 2,5 m Pyridinlösung (lineares Konzentrationsgefälle) eluiert. Die abfliessende Lösung wird in 2 ml Proben aufgefangen. Tuftsin III ist in den Proben 20 bis und Tuftsin IV ist in den Proben 65 bis 78 enthalten.

Tuftsin IV wurde einer Dünnschiohtchromatographie unter Verwendung von Propanol/tfasser 2 : 1 unterzogen und man erhielt eine einzelne Zone. Die Behandlung des Peptids mit Dansylchlorid ergab eine einzelne fluoreszierende Zone bei der Dünnschichtchromatographie mit Silicagel unter Verwendung von Chloroform-Methanol -Ss s ig säure im Verhältnis von 15 : 4 : 1.

Durch Hydrolyse von Tuftsin IV mit Gn HCl bei 105°C für die Dauer von 20 Stunden wurde Threonin, Lysin, Prolin und Arginin im Verhältnis von 1,00 : 1,00 : 1,05 :' 0,92 erhalten. Duvoh Aufschluss mit Carboxypeptidase B wird nur Arginin freigesetzt als Ami no.--i au ro mi. Car boxy!·: νΛ gruppen. 13 ach dem Aufschluss Mit Leu·-, cinaminopeptidi.'se wird nur Threonin als die Säure mit Aiuinoendgruppcn freigesetzt. Ausserdem ergeben die Produkte der en.zy-

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matisehen Umsetzungen durch "Dansylierung" nur Arginin und Threonin als die freien Dansylkomponenten. Die positive Sakaguchi-Färbung sprach nach der Umsetzung mit Carboxypeptidase B weiterhin auf der SiIicagel-Dünnschicht für die Anwesenheit von Arginin als eine Aminosäure mit Carboxylendgruppen. Durch Tritiumaustausch im Anschluss an die Behandlung des Pepiids mit Essigs äureanhydr id in Pyridin in Tritiumwasser wurde Arginin als der einzige radioaktive Rest festgestellt. Die Anwesenheit von-Prolin zwischen Lysin und Arginin wurde durch die Beständigkeit des Peptids gegenüber TrypsinaufSchluss nachgewiesen, Die Entfernung von Arginin durch Car"boxypeptidase B und Erhitzen unter " ' Rückfluss des restlichen Peptids mit Essigsäureanhydrid für 45 Minuten in Tritiumwasser ergab Prolin als der einzige radioaktive Rest. "Dansylierung¹¹ des Peptids nach Entfernung von Threonin mit Aminopeptidase ergab Didansyllysin als die nächste Aminoendgruppe, Auf diese Weise wurde die Struktur von Tuftsin IV als Thr-Lys-Pro-Arg nachgewiesen. Dies wird ferner durch Edmanabbau und Identifizierung der Thiohydantoinreste und auch durch "Dansylierung" des erhaltenen Rückstandes und der Edman Subtraktivmethode bestätigt. Die Identität von Tuftsin IV wird schliesslich auch durch dessen Synthese aus den Teil-Aminosäurer, wie sie unten und in den Beispielen erläuter-t wird, nachgewiesen.

P Durch ein ähnliches Verfahren wurde die Struktur Tuftsin I, II, und III als im wesentlichen von polypeptideriifatür nachgewiesen.

Tuftsin IV kann auch aus der im Handel erhältlichen Gammaglobulin-Cohn-Fraktion II durch das in den Beispielen erläuterte Verfahren, jedoch nicht in praktisch verwendbaren Mengen isoliert werden.

Die Phagocytose-Wirksamkeit der erfindungsgemässen Produkte wird durch den nachfolgenden Versuch nachgewiesen:

Es wurden Leukocyten-Schichten von Hunde- oder Mexischenblut oder peritonealen Ausscheidungen von Kaninchen oder Meerschweinchen hergestellt, dreimal mit Krebs-Ringer-Medium gewaschen und

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in dem gleichen Medium suspendiert. Insgesamt 0,15 ml dieses · Mediums, das 4-5 χ 10 neutrophilische leukocyteri pro mm enthielt, wurden in ein Reaktionsgefäss pipettiert. Dann wurden 0,1 ml der Tuftsinmischung mit 0,2 bis 2 γ, in das Gefäss gegeben und dann 0,05 ml an in inaktiviertem Opsonin-reichem Serum opsoninbehandelten Staphylokokken zugefügt. Somit lagen 1,5 bis 2 Bakterien pro Keutrcphil vor. Das Endvolumen betrug 0,3 ml. Dieses wurde bei 8 TJ.p.M. und 35 C für eine halbe Stunde lang zentrifugiert. Dann wurden Aufstriche hergestellt und mit Wright's Farbe.gefärbt. Die Anzahl der gezählten Zellen, in denen Bakterien eingeschlossen sind, au£ je 100 Seilen stellt den Phagocytose-Index,

Die stimulierende Wirkung von Tuftsin IV und verwandter erfindungsgemässer Produkte wird durch 3-stündige Inkubation bei 30⁰C mit Pronase, Subtilisin, Carboxypeptidase B und Leuzin-Aminopeptidase, unter Verwendung von 40 pg Protein pro· ml ui sr optimalen Bedingungen der Enzymwirkung, zerstört. In ähnlicher Weise wird es durch Inkubation mit den löslichen Anteilen in der Flüssigkeit über zerstöxten Leukocyten und Membranpräparaten von menschlichen Erythrocyten und Rattenleber bei pH 7,0 in Phosphor puff er zerstört.. Tti all diesen Medien ist der Phagocytose-Wert gleich gross wie bei den Vergloichsproben. Tuftsin IV wird durch Belüftung in Anwesenheit oder Abwesenheit von Cystein, Erwärmung auf 80⁰C für die Dauer von 10 Minuten in 80$ Äthanol, enzymatische Behandlung mit Trypsin, Chymotrypsin, Clostridiopeptidase B, Phosphatase, Desoxyribonuklease oder Ribonuklease nicht zerstört. Der nach solchen Behandlungen erhaltene Phagocytose-Wert war etwa 2,5 mal grosser als- derjenige bei den Vergleichsproben. Tuftsin IV ist löslieh in 95/^igem Alkohol, Pyridin und Essigsäure und unlöslich in Äther.

Die erfindungsgemässen Produkte sind wertvolle therapeutische Mittel für Mensch und Säugetiere und als anregende oder hemmende Mittel in äusserst niedrigen Dosen wirksam. Der Arzt oder Tierarzt kann die Dosis bestimmen, die für eine bestimmte Anwendung am geeignetsten ist. Diese kann von Patent zu Patient je nach

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der Grosse desselben, den Behandlungsbedingungen und anderen Faktoren, die leicht von einem Fachmann "bewertet werden können, variieren. Für kontinuierliche Verabreichung über-längere Zeiträume hinaus an Individuen mit mehr oder weniger permanenten metabolisehen Abweichungen oder Individuen mit Splenektomie werden die Produkte normalerweise in unterschiedlichen Dosisformen verabreicht, die verhältnismässig gross sein können, . um einen entsprechenden Blutspiegel schnell aufzubauen, und auch verhältnismässig klein, um einen wirksamen Spiegel aufrechtzuerhalten. Pur zeitweilige Behandlungen zur.Bekämpfung von akuten oder chronischen Infektionen körtnen unterschiedliche ^ Dosen angewendet werden. Die Produkte können in sehr hohen Mengen verabreicht werden, sogar bis zu 2 oder mehr Gramm pro Tag. Normalerweise werden sie in Dosiseinheiten von etwa 250 mg des aktiven Bestandteils.verabreicht und die Anzahl der Einheiten, die dem Behandlungszustand angepasst ist, kann täglich vorgeschrieben werden.

Die erfindungsgemässen Produkte können allein gereicht werden. Sie werden im allgemeinen jedoch mit pharmazeutisch geeigneten, nicht toxischen Trägern verabreicht, wobei das Mengenverhältnis von der Eignung und der.chemischen Natur des bestimmten-Trägers, der gewählten Verabreichungsart und der üblichen phar- ^ mazeutischen Praxis mitbestimmt wird. Zum Beispiel können sie ■ zur Bekämpfung von verschiedenen Infektionen oder zur Aufrechterhaltung von einem therapeutisch wirksamen Spiegel im Blut oder im Gewebe oral in der Form von Tabletten oder Kapseln, die einen Träger in-der Form von Stärke, Milchzucker, bestimmte Tonerdesorten usw. enthalten, verabreicht werden. Sie können mit einem entsprechenden Überzug versehen sein, damit sie gegenüber der Ivlagensäure und Verdauungsenzymen des Magens beständiger sind. Für intravenöse und intramuskuläre Verabreichung können sie in der J¹OrBi einer sterilen Lösung verabreicht werden, in der auch andere gelöste Stoffe enthalten sind, zum Beispiel ' genügend Salze oder Glukose, um die I/ös\mg isotoiiisch zu machen.

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Die erfindungsgemässen Produkte haben den besonderen Vorteil, dass sie im Gegensatz zu vielen therapeutischen Produkten, die eine Peptidbindung enthalten, oral verabreicht werden können, weil sie gegenüber enzymatischer Hydrolyse durch die Enzyme des unteren Verdauungstraktes beständig sind. Auf Grund ihrer amphoteren Natur können sie für orale Verabreichung'an nichttoxischen Ionenaustauscherharze absorbiert werden, die entweder anionisch oder kationisch sein können* um eine langsame Freigabe entweder im Magen oder den Därmen oder beiden zu bewirken. Ausserdem bewirkt die Absorption bei diesen Harzen, · dass sie umso beständiger gegenüber enzymatischer Zersetzung sind.

Ein weiterer Vorteil, der sich aus der amphoteren Natur der erfindungsgemässen Produkte ergibt, liegt darin, dass sie in Form von pharmakologisch geeigneten Salzen verwendet werden können, die entweder Metallsalze oder Säureadditionssalze sein können. Diese Salze haben den Vorteil, dass sie wasserlöslich sind und sich besonders für parenterale Verabreichung eignen. Die Metallsalze, insbesondere die Alkalisalze, sind ■ verhältnismässig stabil und v/erden aus diesem Grunde gegenüber den Säureadditionssalzen bevorzugt. Die Natriumsalze werden besonders bevorzugt, da sie leicht herstellbar·sind. .

Die Säuren, die zur Herstellung der erfindungsgemässen pharinakologisch geeigneten Säureadditionssalzen verwendet werden können, sind solche, die nicht toxische Anione enthalten. Zu Beispielen wie diesen zählen: Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Milch-, Zitronen-, Wein-, Oxal-, Bernstein-, Malein-, Glukon-, Zuckersäure und dergleichen.

Die erfindungsgomässen Polypeptide .können durch eine Vielzahl von für die 3-rnthese von einfachen und komplexen Polypeptiden und sogar verhältnismässig niedermolekularen Proteinen bekannten Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen umfassen diese Verfahren die stufenweise Herstellung durch aufeinanderfolgende Verknüpfung mit einer weiteren Aminosäure, um fortschreitend

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grössere Moleküle herzustellen. Die Aminosäuren werden durch Kondensation zwischen der Karbοxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe einer anderen Aminosäure, wobei eine Peptidbindung gebildet wird, miteinander verbunden. Zur Regelung dieser Reaktionen ist es notwendig, dass die Aminogruppe der einen Säure und die Karboxylgruppe der anderen blookiert werden. Es ist notwendig, dass die Schutzgruppen leicht entfernbar sind. Die gesamte Folge der Reaktionen muss ohne Razemisierung der. Produkte stattfinden. Bestimmte Aminosäuren haben zusätzliche funktioneile Gruppen, zum Beispiel die Hydroxylgruppe von Tyrosin oder von Threonin. Ss ist normalerweise erforderlich, dass diese zusätzlichen Gruppen mit einem leicht entfernbaren Blockierungsmittel geschützt werden, so dass die Kondensation nicht gestört wird.

Pur die Herstellung von Polypeptiden sind eine Reihe von Verfahren und eine Vielzahl von Blockierungsmitteln bekannt. Die meisten dieser Verfahren sind zur Synthese der Polypeptidklasse, die die vorliegende Erfindung betrifft, anwendbar. Es erscheint jedoch nicht zweckmässig, die Anwendbarkeit aller dieser zu beschreiben, so dass nur einige davon in den Beispielen erläutert werden.

Die für die Herstellung der erfindungsgeinässen Polypeptide gegenwärtig bevorzugten Verfahren sind da-s Merrifield-Verfahren und das H-Carboxyanhydridverfahren. Bei dem zuerst genannten Verfahren wird eine Aminosäure zuerst an ein Harzteilchen gebunden, wie über eine Esterbindung, und das Peptid wird stufenweise durch aufeinanderfolgende Addition der geschützten Aminosäuren zu der wachsenden Kette gebildet.

Bei dem zweiten Verfahren wird ein N-CarboxyaminoSäureanhydrid mit der Aminogruppe einer zweiten Aminosäure oder eines Peptids unter solchen Bedingungen umgesetzt, dass die einzige in ausreichender Konzentration in reaktiver lOrm während des Reaktionsverlaufs anwesende Aminogruppe diejenige ist, die

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an der Umsetzung "beteiligt sein soll. Diese Regelung wird durch Auswahl von Konzentration, Temperatur, Zeit und -Wasser^· stoffionenkonzentration bewirkt. Hie Verknüpfungsreaktion findet normalerweise unter alkalischen Bedingungen statt, gewöhnlich bei einem pH-Wert von etwa 8,5 bis 11·. Das als Zwischenprodukt erhaltene Karbamat wird dann dekarboxyliert, indem der pH-Wert auf etwa 3 bis 5 herabgesetzt wird. Das gebildete Produkt kann mit einem anderen 1-Carboxyaminosäureanhydrid ohne Trennung und unter den im wesentlichen gleichen Bedingungen umgesetzt werden. Dieses Verfahren stellt eine sehr schnelle Herstellungsmethode für Polypeptide dar.

Sowohl Tuftsin IV als auch Retrotuftsin IV werden durch diese und durch andere Methoden, wie sie in den Beispielen erläutert sind, hergestellt. Das synthetisch hergestellte Tuftsin IV erwies sich mit dem durch das oben genannte Verfahren isolierte Produkt als identisch.

Einer der Gründe, weshalb Tuftsin IV und Retrotuftsin IV

-bevorzugte Glieder dieser Klasse sind, ist die Tatsache, dass sie einen hohen Yy'irksamkeitsgrad haben. Ausserdem eignen sie sich, um leicht Modifikationen des Moleküls vorzunehmen und Verbindungen herzustellen, die eine grössere oder geringere Aktivität als das Stammtetrapeptid aufweisen, oder mehr oder weniger leicht von dem Gewebe absorbiert werden oder speziell für die gewählte Art der Verabreichung geeignet sind.

Obwohl Tetrapeptide die bevorzugten Glieder dieser Klasse sind, sind die in der vorliegenden Erfindung betreffenden Verbindungen allgemein therapeutisch geeignete nicht antigene Polypeptide, Sie enthalten wenigstens drei und bis zu etwa 19 Aminosäuren, die eine Einheit oder v/iederkehrende Einheiten umfassen, wobei jede Einheit drei bis 5 Aminosäuren enthält und jede vyiederkehrende Einheit an eine benachbarte Einheit durch Prolin oder Cystin gebunden ist und jede Einheit zwei Grundaminosäuren enthält, d'ie durch ein oder zwei Prolinmoleküle miteinander verbunden sind. Obwohl die wiederkehrenden Einheiten normalerweise

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identisch, sind, ist es nicht wesentlich, dass sie es sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf pharmakologisch geeignete Salze und Derivate dieser Polypeptide. Zu typischen Gliedern der Klasse zählen zum Beispiel:

Lys'-Pro-Arg

Lys-Pro-Arg-Pro-Lys-Pro-Arg '

Arg-Pro-Lys-Thr-Cys-Cys-Thr-Lys-Pro-Arg Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Thr-Lys-Pro-Arg-Prο-Thr-Lys-Prο-Arg.

Ton den Polypeptiden, die mehr als vier Aminosäuren enthalten, ^ werden die Nonapeptiden bevorzugt, weil sie nicht schwierig herzustellen sind. Sie sind besonders für solche Patienten geeignet, die einem kontinuierlichen Behandlungsplan mit Tuftsin unterzogen werden, denn sie eignen sich für eine Herabsetzung der Anzahl der Dosiseinheiten, die verabreicht werden, ohne dass eine gleichzeitige Herabsetzung des Blutspiegels erfolgt. Das Molekulargewicht des Nonapeptids ist so niedrig, dass praktisch keine Gefahr einer antigenen oder allergischen Reaktion auch bei überempfindlichen Individuen besteht. Ausserdem diffundiert das lonapeptid auf Grund seines niedrigen Molekulargewichts leicht im gesaraten Peritoneum.

^ Obwohl wenigstens theoretisch fast jede Aminosäure zur Verbindung der wiederkehrenden Einheit verwendet werden kann, werden Prolin .und Cystin als verbindende Aminosäuren bevorzugt, weil diese Aminosäuren Peptidbindungen bilden, die gegenüber den Enzymen des Verdauungstraktes verhältnismässig beständig sind. Da man die erfindungsgemässen Produkte mit hohem Molekulargewicht normalerweise für Patienten verwendet, die einer Langzeitbehandlung unterworfen werden, wird die orale Verabreichung des Medikamentes bevorzugt. Es ist deshalb wichtig, dass das orale Mittel gegenüber der Verdauung ausreichend beständig ist, damit die Absorption ermöglicht wird. . - - . . ·

Es können zweekmässig eine grosse Anzahl nicht toxischer Derivate der erfindungsgemässen Polypeptide verwendet werden. Die phar-

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makologisch geeigneten Salze wurden bereits oben erwähnt, und Amide, Ester, acylierte Derivate und andere können ebenfalls verwendet werden.

Tuftsin IV kann zum Beispiel leicht als Amid erhalten v/erden. Zum Beispiel kann das Tetrapeptid mit Thionylchlorid unter Bildung des Säurechlorids umgesetzt werden und dieses reagiert mit Ammoniak unter Bildung des Amids bei Bedingungen, bei denen die Razemisierung herabgesetzt wird. Das Tetrapeptid kann auch durch aufeinanderfolgende Verknüpfung von Prolin, Lysin, und Threonin mit einem Argininester gebildet werden und anschlie-. ßend wird der erhaltene Tetrapeptidester zu einem Amid durch Amiaonolyse umgewandelt. Der Ester kann zum Beispiel ein niederes Alkanolester mit bis zu etwa 6 Kohlenstoffatomen sein.

Enzyme sind im Körper vorhanden, die sowohl die Amid- als auch die Estergruppen hydrolysieren» so dass die stimulierende Wirkung der Säure erhalten wird. Sowohl Ester- als auch Amidderivate sind als therapeutische Mittel geeignet, weil sie eine erhöhte chemische Stabilität im Vergleich zu den freien Säuren aufweisen. Sie weisen andere Absorptions- und Diffusionsgeschwindigkeiten in die Gewebe und verzögerte Ausscheidung durch die Hieren auf. Sie können in Form von pharmakologisch geeigneten Salzen verwendet werden.

Andere geeignete Derivate können durch Modifizierung der freien funktionellen Gruppen an dem Polypeptidgrundgerüst erhalten werden, zum Beispiel freie Hydroxylgriippen oder freie Aminogruppen. Eine sehr geeignete Klasse der Derivate ist diejenige, bei v/elcher eine freie Hydroxylgruppe, zum Beispiel die freie Hydroxylgruppe von Threonin oder Tyrosin, mit einer Alkanoyl- oder Alkenoylgruppe, welche bis zu 18 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, verestert ist. Es kann auch eine Aminogruppe, zum Beispiel die Aminogruppe von Threonin oder Lysin, mit einer Alkanoyl- oder Alkenoylgruppe, welche bis zu etwa 18 Kohlenstoffatomen enthält, cicyliert werden. In beiden Fällen werden solche Derivate bevorzugt, in denen die das Derivat bildenden Gruppen etwa 11

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"bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, da die längeren Kohlenwasserstoffketten eine erhöhte lipoid-Iöslichkeit dem Molekül vermitteln und deren Transport durch die Zellenwände erhöht wird.

Beide Typen von Derivaten können direkt aus dem Polypeptid hergestellt werden, vorzugsweise werden sie jedoch durch Einbringen in das Peptid während der Synthese einer Aminosäure mit der gewählten Gruppe, wobei zum Beispiel die Alkanoylgruppe "bereits anwesend ist.

Obwohl die Tuftsine und andere Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem Sinn natürliche therapeutische Mittel sind und so allein verwendet werden können, v/erden sie oft zusammen mit einem oder mehreren anderen therapeutisch aktiven Subßtan-zen, wie zum Beispiel einem antibiotischen, antifungalen oder antiviralen Mittel, verabreicht. Ein Grund dafür ist, dass akute möglicherweise letale Infektionen mit allen vorhandenen Mitteln bekämpft werden. Ein anderer Grund ist die Beseitigung von Toxinen, insbesondere der Endotoxine der gramnegativen Bakterien und anderer Überbleibsel, die sich im Gewebe und im Blut auf Grund des Absterbens von infektiösen Mikroorganismen ansammeln» Toxämie, die auf Grund solcher Ansammlungen'entsteht, ist manchmal genauso, wenn nicht sogar gefährlicher für die Gesundheit des Patienten als die ursprüngliche Infektion. Die Anwesenheit, von Tuftsin IV oder analogen Verbindungen von diesem hilft dem Körper» die Endotoxine zu eliminieren,· Die erfindungsgemässen Produkte können zusammen mit Substanzen, wie Tetracyclin, Chlorte tracyclin, Neomycin, Erythromycin, Novobiocin, Penicillin, Chloramphenikol und Hitrofurazon verabreicht werden.

Es ist auch möglich, die Verbindung mit anderen Mitteln, wie zum Beispiel Antibiotika, chemisch zu kombinieren, um beide Substanzen gleichzeitig an die betreffende Stelle zu bringen, damit beide ihre Heilwirkung entfalten können. Zum Beispiel kann die Carboxylgruppe des Penicillins zur Veresterung von Tuftsin IY über die Hydroxylgruppe von Threonin verwendet

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werden. Es kann auch eine Amidbindun.:· über die Alpha-Aminogruppe von Threonin oder die Epsilon-Aminogruppe von Lysin gebildet werden.

Die erfindungsgemässen stimulierenden Peptide können auch zur Erhaltung von nützlichen Eigenschaften des Gesamtblutes verwendet werden. Es wurde festgestellt, dass beim Stehenlassen auch unter normaler Kühlung das gesamte Blut seine Phagoeytosewirksamkeit verliert und die weissen Zellen zu verschwinden beginnen. Die Zugabe von geringen Mengen von beispielsweise Tuftsin IV hat eine umgekehrte Wirkung.

Di e folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung:

Beispiel 1

Tuftsine aus Gammaglobulin durch'Leukokinin.

Ganiaaglobulin (150 mg) von der Cohnfi*aktion II in 10 ml 0,05 m Acetatpuffer (pH 4,8) wurde auf eine Ceilulosephosphatsäule . (4 χ 12 cm)j die vorher mit dem gleichen Puffer bis zum Gleichgewicht behandelt worden.war, aufgebracht. Die Fliessgeschwindigkeit wurde auf 2 ml/Min eingestellt und der Abfluss wurde in Portionen von 4,0 ml aufgefangen. Das drei- bis vierfache Volumen des Lösungsmittelpuffers (400 bis"55O ml) wurde durch die Säule laufen gelassen, um eine entfernung- des gelegentlich verunreinigenden Albumins zu gewährleisten. In diesem Abfluss ist kein Gamnaglobulin enthalten. Die erste Gainmaglobulinfraktion wurde mit 0,05 m Acetatpuffer (pH 4,8)' in 0,15 m NaCl eluiert und enthielt 51 mg Protein (34'¹Q. Die Eluierung mit dem gleichen Puffer wurde fortgesetzt bis die Absorption.bei 280 inu derjenigen des Puffers entsprach. Dies wurde routinemässig mit jeder Fraktion erreicht, nachdeia das 1,3- bis 1,7-fache Volumen des cluierenden Puffers durch die Säule gegangen waren, d.h. .bis 180 - 230 ml des Abflusses aufgefangen waren. Die zweite Fraktion enthielt 37 ml G-emmaglobulin (25^) und wurde unter

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Verwendung von 0,05 m Acetatpuffer · (pH 5»0) in 0,15 m ITaOl eluiert; die dritte Fraktion von 29 mg (19/Ό wurde bei pH 5,2 unter sonst gleichen Mengen an Puffer und Salzkonzentration eluiert. Schliesslich wurde eine, vierte Fraktion, 20 mg Gammaglobulin (13/0 eluiert, indem sowohl der pH-Wer't auf 5>4 als auch die NaCl-Konzentration auf 0,2m· erhöht wurde/ Die Analyse •der Ergebnisse hinsichtlich des gesamten, in jeder Fraktion gewonnenen Proteins ergab eine Standardabweichung von etwa ί 5/ö für die ersten beiden
letzten beide'n Fraktionen.

für die ersten beiden Fraktionen und etwa - 2tfo für die

' Dann wurde eine erneute Chromatographie der getrennten Fraktionen durchgeführt. Jede Fraktion wurde auf eine 0,60 Sättigung mit festem Ammoniumsulfat eingestellt und 8 Stunden lang bei O⁰C stehen gelassen. Das ausgefällte Protein wurde dann durch Zentrifugieren und Dialysieren gegenüber 0,05 m Acetatpuffer bei pH 4,8 gesammelt. Die Bedingungen für die erneute Chromatographie waren die gleichen wie sie oben beschrieben sind. Das beschriebene Herstellungsverfahren wurde angewendet, um einige 100 mg der Fraktion IV (PC IV), welche lieukokinin enthält, erhalten.

100 mg der Fraktion PC IV wurden mit Leukokininase, die aus polymorphonuklearen Leukocytenmembranen vom Menschen, Hund oder Hase hergestellt worden war, behandelt. 5" .A¹S ^von Leukokininaseprotein wurden pro mg an PC IV in einem Endvolumen von 25 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 6,7) gegeben. Es wurde zwei Stunden lang bei 37⁰C inkubiert. Die Reaktion wurde beendet, indem Triehloressigsäure bis auf eine Endkonzentration von 5$ zugefügt wurde. Der Niederschlag wurde abgetrennt . Nach der Extraktion mit Äther zur Entfernung der !Erichloressigsäure wurde das Material auf einer Dowex 10 Säule lyophilisiert und fraktioniert, die mit einer Eluierungsflüssigkeit aus mit Chloroform gesättigter 0,1 m Esüigsäiire bis zum Gleichgewicht behan-. delt worden war. Das Betxvoluinen der Säule betrug 295 ml; das leervolumen 115 ml, die Höhe 118 cm und der Innendurchmesser .1,8 cm. Es wurden 1 ml Proben in Gläschen in einem automatischen

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Fraktionssammler aufgefangen. In den Gläschen Nr. 115-125 war .Tuftsin II und in den Gläschen Nr. 135-158 Tuftsin Illund IV enthalten. Die Tuftsin III und IV enthaltende-Flüssigkeit ■· wurde lyophilisiert und in Pyridin-Acetat-Puffer (pH 4)»der 1,2 m Pyridin enthielt, aufgenommen. Dann wurde eine Chromatographie auf einer Aminex-Säule, Höhe 60 cm, Innendurchmesser 0,6 cm, durchgeführt, wo "bei mit einem linearen Gradient bei 60 C eluiert wurde. Der Ausgangspuffer war Pyridin-Acetat (pH 4>0), der 1,2 m Pyridin enthielt, und der Endpuffer ist Pyridin-Acetat (pH 6,0), in welchem 2,5 m Pyridin enthalten sind. In jedem Gläschen wurden 2 ml Proben gesammelt. Die*Flüssigkeit in den Gläschen 20 bis 35 enthielt Tuftsin III und in den Gläschen Nr. 65 - 78 wurde Tuftsin IV in der Flüssigkeit gesammelt. Die zuletzt genannte Flüssigkeit stellte einen scharfen symmetrischen Peak dar. Bei Dünnschichtchromatographie mit SiIicagel unter Verwendung einer Entwicklungslösung aus Proponal und Wasser im Verhältnis von 2 : 1 erhielt man eine einzige Zone. Danaylierung des Peptids mit Dansylchlorid ergab ebenfalls eine einzige fluoreszierende Zone bei Dünnschichtehromatographie mit Silicagel unter Verwendung einer Entwicklungslösung aus Chloroform, Methanol und Essigsäure im Verhältnis von 15 ϊ 4 : 1. ..

Die Aminosäurezusammensetzung nach der Hydrolyse in 6 η HCl bei 105°C für 20 Stunden ergab ein Molverhältnis an Threonin 1,01, lysin 1,00, Prolin 1,07 und Arginin 0,90. Alle Aminosäuren lagen in der L-^orm vor. Bei der Behandlung mit Carboxypeptidase B bei 80/ per ml und 20° für 2 Stunden bei pH 7,4 wurde nur Arginin als Verbindung mit der Carboxylendgruppe freigesetzt und zwar 50$ des Peptids. Nach der Behandlung mit Leukin-Aminopeptidase bei 80/ per ml und 25°C für 2 Stunden bei pH 8,5 rait MgCIp 3 x 10 m wurde nur Threonin als Verbindung mit Aminoendgruppe zu 30 °ß> des^eptids freigesetzt. Daraus ergibt sich die Reihe Thr-Lys-Pro-rArg, und die gewonnene Menge lag bei etwa 1.000/ug in einer-Ausbeute von 1,0/ug pro ■ 1000/ug der Fraktion PC IV oder 1,0/ug pro 10000/Ug des gesamten Gammagiobulins. '

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Beispiel 2

Tuftsin aus Cohn-Fraktion II

1 g des Gammaglobulins der Cohn-Fraktion II wurde mit Trypsin, 5 mg je 100 mg Gammaglobulin in 0,1 m Chlorwasserstoffsäurepuffer, welcher 0,01 m Calcium enthält, hei pH 8,1 eine Stunde lang bei 37 C und einem Endvolumen von 250 ml behandelt. Das freigesetzte Tuftsin wurde von dem übrigen Gammaglobulin durch Ausfällung in 5$ Trichloressigsäure ausgetrennt und der Niederschlag verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde dreimal mit Äther extrahiert und das Material lyophilisiert, in 0,5 ml " Essigsäure (0,1 m) aufgenommen und auf einer Sephadex-G-10 Säule chromatographiert. Diese Säule, die mit 0,1 m Essigsäure, die

auch als Eluierungslösung diente, bis zum Gleichgewicht behandelt wurde, war bei. einem Bettvolumen von 295 ml, Leervolumen von 115 ml, Höhe von 116 cm und einem Innendurchmesser von 1,8 cm chromatographiert. Es wurden 1 ml Proben in Gläschen in einem automatischen Fraktionssammler aufgefangen. Die in den Gläschen 115 bis 125 aufgefangene Flüssigkeit enthielt Tuftsin II und die Flüssigkeit in den Gläschen 135 bis 158 Tuftsin III und IV. Die Tuftsin III und IV enthaltende Flüssigkeit wurde lyophilisiert und in Pyridi-n-Acetatpuffer (pH 4)» welcher 1,2m Pyridin enthielt, aufgenommen. Dann wurde sie auf Aminexsäulen (Höhe 60 cm, ) Innendurchmesser 0,6 cm) chromatographier£ und bei einem linearen Gradienten und 60 C eluiert. Der Ausgangspuffer war Pyridin-Acetat (pH 4_f0) und enthielt 1,2 m Pyridin. In jedem Gläschen wurden 2 ml Proben aufgefangen. Die in den Gläschen 20 bis 35 aufgefangene Flüssigkeit enthielt Tuftsin III. Tuftsin IV wurde in der Flüssigkeit der Gläschen 65 bis 78 gesammelt. Letzteres stellte einen schäften symmetrischen Peak dar. Die Düiinschichtchromatigraphie mit Silicagel unter Verwendung von Propanol/ Wasser 2 : 1 ergab eine einzelne Zone. Dansylierung des Peptids mit Dansylchlorid ergab ebenfalls einen einzigen fluoreszierenden Streifen bei der Dünnscliichtchromatographie mit Silicagel . unter Verwendung von Chloroform, Methanol und. Essigsäure im Verhältnis von-15 '· 4 : 1·

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Die Aminosäurezusammensetzung nach der Hydrolyse in 6 η HCl "bei 1O5°C für 20 Stunden ergab Threonin, Lysin, Prolin und Arginin in einem Molverhältnis von 1,03 : 1,00 : 1,04 : 0,93. Bei der Behandlung mit Carboxypeptidase B unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurde nur Arginin als eine Verbindung mit Garboxylendgruppen freigesetzt und zwar etwa 60*£ des Peptids. Nach der Behandlung mit leucin-Aminopeptidase, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde nur -Threonin als Verbindung mit Aminoendgruppen zu 35 i° des Peptids freigesetzt. Alle Aminosäuren lagen in der L—Form vor.

Beispiel 3

Tuftsin IV durch direkte Trypsinbehandlung von Gammaglobulin.

Frisches Gammaglobulin wurde aus 100 ml an Menschen- oder Hunde* serum wie folgt hergestellt: Zu 100 ml Serum wurden 100 ml Natriumchlorid (0,15 n) und 100 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben. Ben Niederschlag liess man bei Zimmertemperatur zv/ei Stunden lang stehen. Dieser wurde abzentrifugiert und dann in 20 ml Natriumchlorid (0,15 n) gelöst. Dann wurden 10 ml an gesättigtem Ammoniumsulfat zugegeben. Nachdem man die Lösung zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen hatte, wurde sie über Nacht bei 5 C stehen gelassen. Das Präparat wurde dann abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Der Gammaglobulinniederschlag wurde dann gegen 1 Liter Natriumchlorid (0,15 n) für die Dauer von 4 Stunden dia- · lysiert. Die Dialyse wurde zweimal wiederholt.

1 g des frisch hergestellten Gammaglobulins wurde dann mit Trypsin zersetzt und auf 'einer Dowex-10-Säule und Aminex-Säule genau wie in Beispiel 2 beschrieben weiterbehandelt. Die Ergebnisse der Analyse von Tuftsin IV waren ebenfalls ähnlich: Threonin 0,98, Lysin 1,0, Prolin 1,03 und Arginin 0,87·

Beispiel 4

Tuftsin IV aus frisch hergestelltem Gammaglobulin.

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Frisch hergestelltes Gamma globulin (wie in Beispiel 3) wurde auf Phosphorcellulosesaulen, wie in Beispiel 1 beschrieben, fraktioniert. Dann wurden 100 mg der Fraktion IV mit Leukokinase behandelt und auf einer Dowex-10-Säule und Aminex-Säulen, wie in Beispiel 1 beschrieben, fraktioniert. Das isolierte Tuftsin IV ergab gleiche Reste mit ähnlichen Werten, wie sie in Beispiel 1, 2 und 3 erhalten wurden: Threonin 0,92, Lysin 1,00, Prolin 1,04 und Arginin 0,97.

Beispiel 5

Synthese von Tuftsin IV.

13>8 m Mol tBOC-N -Nitroarginin wurden mit 10 g Chlormethyl-Harz (Polystyroldivinylbenzolchlormethylharz 2,2 m Mol des Chlorids pro Gramm des Harzes) in einer Mischung von 12,4 m Mol Triethylamin und 30 ml Äthanol für 24 Stunden bei 80⁰C unter ständigem magnetischem Rühren umgesetzt. Das Harz wurde dann gründlich mit Essigsäure, dann mit absolutem Äthanol,mit Wasser mit zunehmender Menge an Äthanol, abschliessend mit absolutem Äthanol und dann mit Meihanol und Methylenchlorid gewaschen.· Das Harz wurde dann im Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet. 30 mg des Harzes wurden mit 6 η HCl in Dioxan für 24 Stunden hydrolysiert. Das FiItrat wurde im Vakuum getrocknet und in Zitratpuffer (pH 2,2, 0,2n). gelöst. Eine angemessene Menge wurde in einem Amino säur eanalysator auf Ornithin", Arginin und Nitroarginin geprüft. Die ersten zwei sind Nebenprodukte der sauren Hydrolyse des Nitroarginin-Harzes. Die Summe aller drei stellt die Menge des veresterten t-BOC-nitroarginins dar, welches 0,3 m Mol pro Gramm Harz beträgt. " '

1,5 g des Harzes, das 0,45 m Mol t-BOC-ni tr ο-arginin entspricht, wird in einem Merrifield-Feststoffphasen-Behälter, welcher mit einer Klemme an einen Halter eines 180° schwenkbaren Hubmotors befestigt ist, gegeben. Alle Arbeitsgänge erfolgen dann bei Zimmertemperatur bei 180 Schaukelbewegung, so dass das Harz beständig geschüttelt wird. Die schützende t-BOC-Gruppe wurde

mit 15 ml von 50. °/a Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlörid für eine Umsetzungsdauer von 30 Minuten abgespalten. Das Harz wurde dann mit Methylenchlorid und anschliessend mit Chloroform je dreimal mit 15 ml gewaschen. 1 ml Triäthylamin und 9 ml Chloroform wurden dann dem Harz zugefügt und 10 Minuten lang geschüttelt, um das Hydrochlorid zu neutralisieren. Dann wurde wieder wie bereits vorher mit Chloroform und Methylenchlorid gewaschen. T-BOC-prolin, 1,35 m Mol in 15 ml Methylenchlorid, wurde dann an das N^ des Nitroarginins mit 1,35 Mol Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zwei Stunden lang unter Ιεοηΐίημ-ierlichem Rühren gekuppelt. Das Harz wurde mit je 15 ml Äthanol bzw. Chloroform und Methylenchlorid je dreimal gewaschen. Die t-BOC-Gruppe wurde aus dem Prolin mit 50 ^c/> Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt, gewaschen und mit Triäthylamin wie vorher neutralisiert. In einer ähnlichen Weise wurde 1,35 m Mol lP-t-BOC-IT^C-arbobejozoxy-(CBZ)-Lysin an Prolin gekuppelt, schutzgruppe abgetrennt, neutralisiert und 1,35 m Mol Nou-t-BOC-0-bsnzylthreonin wurde dann an das ungeschützte N⁰^- des Lysins gekuppelt. Die stufen der Abtrennung der Schutzgruppen (Abspaltung des t-BOC allein)-mit TFA, Waschen, Neutralisieren mit Triäthylamin, Waschen und Kuppeln mit DCC wurde für jeden Aminosäurerückstand in der gleichen Weise wiederholt.

30 mg des Tetrapeptidharzes wurde mit 6n Chlorwasserstoffsäure in Dioxan für die Dauer von 18 Stunden hydrolysiert und das Produkt auf dem Aminosäureanalysator geprüft. Dabei wurde eine Ausbeute von Thr 0,9» Iys 1,0, Pro 1,08, Arg 1,0 festgestellt. Der Wert für Arginin stellt wieder die Summe von Arginin, Ornithin und Nitroarginin dar. Das Tetrapeptid wurde von dem. Harz mit Bromwasserstoff in TM bei Zimmertemperatur für 1,5 Stunden abgespalten. Es wurde dann im Vakuum getrocknet, zweimal mit Y/asser gewaschen und lyophilisiert. Dessen Gewicht von 176 mg stellte eine Ausbeute von 78$, bezogen auf/das veresterte Arginin dar. ·

Es wurde dann in 10 ml Methanol, welches 10 '/> Essigsäure enthielt, aufgenommen. Diese Mischung wurde dann mit der doppelten

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Menge seines Gewichts(550 mg)Palladium auf Bariumsulfat in einer Wasserstoffatmosphäre bei einem Druck von 60 p.s.i. (4j2 at) unter kontinuierlichem Rühren 24 Stunden lang der katalytischen Hydrogenierung unterzogen; während dieser Zeit wurde kein Nitroarginin bei einem Absorptionsmaximum von 271 mti gefunden. Eine gleiche Menge wurde wieder mit 6n HGl in !fässer hydrolysiert und geprüft. Es wurde eine vergleichbare Ausbeute von Thr 0,92, Lys 1,0, Pro 1,-05 und Arg 0,98 erhalten.

Das Material wurde dann auf einer Aminex-Säule mit einem line-• aren pH-Gefälle von 4-6 mit 1,2 m bis 2,5 w Pyridin bei einer Fliessgeschwindigkeit von 8 ml pro Stunde Chromatograph!ert.

Der Hauptpeäk, das Tetrapeptid, erschien genau bei dem Tuftsin-IV-Peak, der eich von der CP-vFraktion-IV-Gammaglobulin ableitet, d.h. zwischen 138 - 150 ml, mit einem Peak mit 144 ml des Abflusses. Das aufgefangene Material wurde im Vakuum getrocknet, zweimal mit 0,1 molar Essigsäure gewaschen, in 0,1 molar Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. Iiach der Aminosäureanalyse wurde Thr 0,96, Lys 1,0, Pro 1,03, Arg 1,0 gefunden. Alle Aminosäuren, waren in L-Form.

Das Tetrapeptid,in Form des Diacetatsalzes wurde dann zu dem Natriumsalz durch Addition von drei Äquivalenten Natriumhydroxyd umgewandelt.

■*o^v

Die Endausbeute, bezogen auf das an Harz veresterte Nitroarginin, betrug etwa 65 $.

Das Verfahren wurde wiederholt, um das Tetrapeptid mit allen Aminosäuren in der D-Form zu bilden. Es wurde zweimal mit Serin anstelle des Threonins wiederholt. Es wurden sowohl alle L-als auch alle D— ormen hergestellt.

!Beispiel 6

Synthese von Tuftsin IV ' .

t-Boc-Mitroarginin wurde zu dom chlormethylierten Harz verestert,

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die Schutzgruppen abgetrennt, neutralisiert und wie in Beispiel 1 und zusätzlich noch einmal mit Dimethylformamid (OMF) gewaschen. 1,2 g, in welchem 0,25 m Mol Arginin enthalten war, wurde als Ausgangsmaterial verwendet. 1,0m Mol t-BOC-Prolin-Succinimidester wurde dem Harz in DME zugegeben und für die Dauer von 24 Stunden unter Schütteln bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Die Entblockierung, Neutralisation und Waschen erfolgte, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit einem abschliessenden Waschen mit DMP, wurden für jedes darauffolgende Kuppeln mit 1,Om Mol N-Hydroxysuccinimidestßr von N^t-BOC N^CBZ lysin.und Ν°° t-BOC-o-benzylthreonin wiederholt. Die Abspaltung von dem Harz, die katalytisehe Hydrierung und Reinigung der Säule erfolgte in derselben Weise wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Aminex-Säule, wie in Beispiel 5, zeigte einenvorherrschenden Peak in dem Tuftsin-IV-Bereich. Die Ausbeute betrug 34$, bezogen auf das veresterte Arginin. Nach der Abspaltung von dem Harz waren die Ergebnisse der Analyse wie folgt: Thr 0,85, Dys 1,0, Pro 0,95, Arg 1,08. Nach der Reinigung auf der Aminex-Säule ergab die Analyse Thr 0,93, lys 1,0, Pro 1,05, Arg 0,98. Das Tetrapeptid wurde im Vakuum getrocknet» mit 0,1 tn Essigsäure zweimal gewaschen und abschliessend in 0,1 inEssigsäure lyophilisiert und zu dem Hatriumsalz, wie in Beispiel 5 beschrieben, umgewandelt. Das Tripeptid Lys-Pro-Arg mit allen Säuren sowohl in der D-als auch der L-Form wurde in ähnlicher Weise durch Weglassen der Umsetzung mit dem geschützten Threonin hergestellt.

Beispiel 7 .

N^*-BOC-N - Nitroarginin wurde zu dem Harz, wie in Beispiel 5 beschrieben, verestert. Es wurde von Schutzgruppen abgetrennt, gewaschen und, wie in Beispiel 5 beschrieben, neutralisiert. 1,2 g, in welchem 0,32 m Mol Arginin enthalten sind, wurde mit 1,28 m Mol t-BOC-Prolin-p-Nitrophenylester in 10 ml DMF unter Schütteln für die Dauer von 18 Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt, Als die Reaktion abgeschlossen war, wurde das t-BOC abgespalten, das Harz neutralisiert und, wie in Beispiel 6 beschrieben, gewaschen. Anschliessende Kupplungen erfolgten mit N⁰H-BOC N^CBZ-Lysin-p-nitrophienylester gefolgt von N^t-BOC-O-

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benzylthreonin-p-nitrophenylester. Die Abtrennung der Schutzgruppen- von den Aminogruppen, das Waschen und Neutralisieren, die Abspaltung von dem Harz und katalytisch^ Hydrierung wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. Durch Chromatographie auf den Aminex-Säulen, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde reines Tuftsin IV isoliert. Die Analyse an dem Hauptpeak ergab Thr 0,90, Lys 1,0, Pro-1,03, Arg 1,03- Die Endausbeute betrug 65?$ an verestertem Arginin.

Beispiel 8 '· ■ .

Synthese von Tuftsin IY

Arginin (Monohydrochlorid), 0,2 m Mol in 2 ml Y/asser, in welchem 0,13 ml Triäthylamin enthalten sind, wurde mit 0,6 m Mol P*t-BOO-Prolin-N-Hydroxysuccinimidester (Osu) in 5 ml Tetrahydrofuran unter ständigem Rühren bei Zimmertemperatur für .24 Stunden umgesetzt. Es wurde dann im Vakuum getrocknet und der Rückstand in 0,1 m· Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. Das Material würde dann in Wasser gelöst und mit einem linearen Pyridin-Acetatgefälle auf einer Aminex-Säule 0,6 χ 60 cm bei 60⁰C chromatographiert. pH 3,1-5,6. Pyridin 0,2 - 4 i, 2 ml wurde- in jedem Röhrchen aufgefangen; die Fließgeschwindigkeit betrug 8 ml pro Stunde. Unter diesen Bedingungen werden N^t-BOC Pro-Osu und die freie Säure nicht an die Säule gebunden und erscheinen an der Vorderseite. Der Hauptpeak und erste positive Sakaguchi-Peak, welche das Dipeptid darstellen, wurde isoliert und lyophilisiert, in Wasser aufgenommen und wieder auf konstantes Gewicht lyophilisiert. Das geschützte Dipeptid (60 mg) wurde dann in ein Eisbad gebracht und 1 ml eiskaltes TFA zugefügt. Das gelöste Peptid wurde 15 Minuten lang in dem Eisbad gelassen. Es wurde dann mit 40 ml eiskaltem Wasser verdünnt und zweimal mit 80 ml eisgeldihltem Äther extrahiert·. Die kombinierten Ätherschichten wurden mit 20 ml Eiswasser zweimal extrahiert und die · gesamte gebildete wässrige Phase lyophilisiert. Das Dipeptid wurde dann in 2 ml Wasser aufgenommen, 0,12 ml Triäthylamin

9 Π 9 P 0 f- "

-wurden zugefügt und mit 0,58 m Mole N⁰^ t-BOC-N^CBZ-Cysin-Osu-Este'r in 5 ml Tetrahydrofuran bei Zimmertemperatur für die Dauer von 24 Stunden unter Rühren umgesetzt. Das Material wurde wieder im Vakuum getrocknet, in 0,1 m Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert. Es wurde dann in Wasser gelöst und auf der gleichen Aminex-Säule chromatographiert, mit der Ausnahme, daß das Pyridin-Acetatgefälle im Bereich von pH 4-6 war und 1,2 in Pyridin- (2,5 m) verwendet wurde. Das nicht umgesetzte geschützte Lysin-Osu wurde nicht gebunden. Der Hauptpeak bei der Aminosäureanalyse erwies sich als das Tripeptid, lys-Pro-Arg, 1,0, 1,08, 0,97. -Es wurde dann getrocknet und als eine wässrige lösung lyophilisiert, mit TFA von Schutzgruppen befreit und mit Äther unter den gleichen wie für das Dipeptid beschriebenen Bedingungen mit Äther extrahiert. Die Ausbeute betrug 93 mg.

Abschließend wurde 0,58 m Mol, N^ t-BOC-O-Benayl-threonin-Osu in 5 ml Tetrahydrofuran umgesetzt und in derselben ¥eise wie das Tripeptid einschließlich dem Pyridin-Acetatgefälle in der Aminex-Säule weiterbehandelt. Der Hauptpeak war das geschützte Tetrapeptid, N^ t-BOC-Thr-0-Benz-N^ CBZ-Lys-Pro-Arg. Dieses wurde, wie bereits vorher beschrieben, auf ein konstantes Gewicht von 118 mg lyophilisiert und mit HF von 'Schutzgruppen befreit. Das freie Peptid wurde dann wie in Beispiel 5 beschrieben auf einer Aminex-Säule isoliert. Die Analyse ergab JThr 0,95, I<ys 1,0, Pro 0,98, Arg 1,03.

Beispiel 9 ■ .

Synthese von Tuftsin IV .

Die verschiedenen Stufen der Synthese des ersten-Dipeptide unter Verwendung von Arginin und N t-BOC-Prolin-p-nitrophenylester wurden im wesentlichen nach dem gleichen Verfahren, wie in Be:ispiol 8 beschrieben, durchgeführt. Die UmsetKungszeit betrug 18 rtundon. Die Fraktionierung auf der Aminexsäule, Entblocltierunr und EuppoHr· mit N^t-BOC-N^CBC-Lysin-p-Nitrophony!ester wurde ebenfalls wie in Boisp.iol 8 vorgenommen.

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Das gleiche gilt für die Reinigung.auf der Aminex-Säule, die Entbiockierung und Umsetzung mit ΙΊ°\ t-B0C-0-Benz-threonin-2,4-dinitrophenylester und anschließende Reinigung und Trennung des Tetrapeptids und dessen Entblockierung mit HF und anschließende übliche Chromatographie auf der Aminex-Säule. Es folgten im wesentlichen die gleichen Stufen wie in dem W-h^iroxysuccinimidverfahren von Beispiel 8. Die Ausbeute und Reinheit waren die gleichen wie bei den vorhergehenden Beispielen bei ei-* ner Zusammensetzung von Thr 0,98, Lys 1,0, Pro 1,03 und Arg 0,95. · .

' Beispiel 10
. Synthese von Tuftsin 17 "

0,5 m Hol Arginin-freie Base wurde in 2,5 ml (-0,5 m) Boratpuffer bei pH 10,5 gelöst in einem in einem Eisbad, auf 0°C gehaltenen Schnellmischer auf O⁰C abgekühlt. 0,55 m Mol N-Carbo χ yanhydrid (NCA) des Prolins wurden in zwei gleichen Portionen in einem Abstand von 1 Minute zugegeben, während der pH-Wert durch die Zugabe von 10 η Natriiimhydroxyd konstant gehalten wurde. Eine Minute nach der zweiten Zugabe wurde der pH-Wert auf"4,8 gebracht, indem konzentrierte Schwefelsäure zugegeben wurde. Die Lösung wurde mit Np-Gas gespült, um das aus P dem erhaltenen Peptidkarbamat gebildete CO₉ zu entfernen. Der pH-Wert wurde auf 10,2 erhöht und das NCÄ"von N CBZ-Iysin (0,55 m Mol) wurde zugegeben und die Reaktion für die Dauer von 2 Minuten fortgesetzt, während der pH-Wert mit 10 η NaOH bei O⁰C bei 10,2 gehalten wurde. Dann wurde Schwefelsäure zugefügt, um den pH-Wert auf 5,0 zu bringen, während man mit N₉-Gas durchspülte. Das Präparat wurde dann durch eine Sephadex G 10-Säule geschickt, die mit 0,1 m Sssigsäuie bis sum Gleichgewicht behandelt worden war, und das Peptid isoliert", lyophilisiert und in 5 ml Tetrahydrofuran, in welchem o,13 ml Triäthy.larniii und 1,5 m Mol N^ t-BOC-O-Bonzyl-threoiiin ivucciiiiiaidester enthalten waren, aufgenommen. Dann wurde Ducclniaidester zugefügt und bei Zimmerteraijeratur für die Dauer von 24 stunden

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gerührt. Es wurde Im Vakuum abgedampft, in Wasser aufgenommen und bis zum konstanten Gewicht lyophilisiert. Dann wurde es mit TFA bei O⁰C für die Dauer von 20 Minuten entblockiert und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Es wurde dann aus einer Wasserlösung lyophilisiert und in einer Aminex-Säule, wie in' Beispiel 1 beschrieben, chromatographiert. Die Enda,usbeute betrug 28^6, bezogen auf das Arginin als Ausgangsmaterial. Zusammensetzung: Thr 0,86, lys 1,0, Pro 1,03, Arg 0,96.

Retrotuftsin IV wurde .in ähnlicher Weise hergestellt. Das ana-1oge Präparat von Tuftsin IV, in welchem Tyrosin anstelle von Threonin verwendet wird, wurde in ähnlicher Weise hergestellt. Die Hydroxylgruppe von Tyrosin wurde während der Synthese als Tetrahydropyramylather nach dem Verfahren der US-Patentschrift 3,467,667 geschützt. . . .

Das Verfahren dieses Beispiels wurde wiederholt, um die gleichen Produkte herzustellen, mit der Ausnahme, daß die Grundaminosäuren bei Verwendung als N-Carboxyanhydride als N-Chlorquecksilbersalze geschützt·wurden, wie in der US-Patentschrift 3,459,760 beschrieben ist. Die Ausbeuten waren sehr verbessert.

Beispiel 11 '

Bildung von acyliertem Tiftsin IV.

0,45 m Mol O-Benz-threonyl-rf CBZ-Iysil-propyl-N -nitroarginin-Harzester auf 1,3g Harz wurde mit 1,5m Mol Stearinsäure unter Verwendung von 1,5 m Mol Dicyclohexylcarbodiimid.in ChIoroform/Dimethylformaiflid (1:1) gekuppelt. Im übrigen wird das Verfahren für die Abspaltung von dem Harz mit HBr in GF.* COOH (TFA), Abtrennung der Schutzgruppen des Threonine and Lysins- und katalytische Hydrierung des Nitroargenins zu Arginin und Ammoniak wie in den vorherigen Beispielen beschrieben. Die Endausbeute von N-Stearyl-Tuftsin ist 6%% - 71%. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den anderen Fettsäuren in einer Ausbeute von

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etwa 37 bis 61% erhalten. Diese sind Essig-» Propion-, Butter-, Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Olein-, Linolein-, und Linolinsäure. Im Falle der drei zuletzt genannten Säuren, die ungesättigt sind, kann die Fettsäuren-Hydrierung nicht angewendet werden, da dadurch die olefinische Doppelbindung reduziert werden würde. Statt dessen wird das Peptidharz mit Fluorwasserstoff unter wasserfreien Bedingungen behandelt, um alle schützenden Gruppen und die entsprechenden acylierten Derivate des Tuftsinhydrofluorids zu entfernen. Die Ausbeute bei den ungesättigten Fettsäuren für.das Endprodukt Lipoyl-Tuftsin lag in den unteren Bereichen zwischen etwa 48 und 55^·

Die Reinigung der End-Lipoyl-Produkte variierte je nach der länge der Kette. Die hauptsächliche Verunreinigung stellte-ungebundenes Tuftsin dar. Bei Acetyl-, Propiönyl- und Butyryl-

Tuftsin erfolgte die Trennung der beiden in der Aminex-Säule (Dowex 50) bei einem linearen Gefälle des Pyridin-Acetatpuffers bei pH 4,0 bis 6,0 bei einem Pyridin-Molgefälle von 1,2 m - 2,5 m. Der erste sichtbar werdende Peak ist Lipoyltuftsin, der kleinere, freies Tuftsin, erscheint später.

Bei langkettigen Fettsäuren genügt zur Trennung der beiden . eine Dowex-1O-Chromatographie mit 0,1 m. Essigsäure. Tuftsin mit einer freien Nf^-Gruppe ist stark basisch, bindet sich an Sephadex und wird verzögert; es erscheint als Substanz mit geringem Molekulargewicht mit freien Aminosäuren« Das isolierte Pyridiniumsalz wird dann durch Basenaustausch zu dem Natriumsalz umgewandelt. . - .

Beispiel 12

Bildung von 0(Thr)-Stearoyl-Tuftsin IV

0,5 m Mol I^t-BOC-Threonyl-ITCBZ-lysil-prolyl-N^-nitroarginin auf 1,5 g Harz wurds gründlich mit Chloroform und Methylenchlo-' * rid gewaschen und 1,5m Mol Stearinsäure in Chloroform/üMF (1:1) wurde zugefügt. Dann wurden 1,5 m Mol Carbonj^ldiimidasol

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in den gleichen lösungsmitteln zugegeben. Die Reaktionsteilnehraer wurden bei Zimmertemperatur in dem gleichen wie bei dem Merrifieldverfahren für die Herstellung des Peptids' verwendeten Behälter zwei Stunden lang geschüttelt. Das Paptid wurde dann mit Bromwasserstoff in Trifluoressigsäure 1,5 Stunden lang bei Zimmertemperatur zersetzt. Dann wird die katalytische Hydrie-

■ rung durchgeführt, und die erhaltenen Produkte wie in den vorherigen Beispielen gereinigt.

Andere Alkanoylderivate entsprechend dem N-acylierten Derivat des vorherigen Beispiels wurden in ähnlicher Weise hergestellt.

Beispiel 13 ·

Bildung von A'enicillinyl-Tuftsin 17

Insgesamt 0,43 m Mol des gleichen, wie in Beispiel 11 verwendeten Ausgangsmaterials wurde an 1,3 m Mol Penicillin mit 1,3m Mol Dicyclohexylcarbodiimid in Chloroform/Dimethylformamid (1:1).durch zweistündige Umsetzung bei Zimmertemperatur gebunden. Das N ** penicillinyl Tuftsin IV wurde als Hydroflubrid erhalten, wobei die Abrennungsverfahren von Schutzgruppen von Beispiel 11 und abschließende Abspaltung von dem Harz mit Fluorwasserstoff unter wasserfreien Bedingungen durchgeführt wurden. Es wurde wie in Beispiel 11 beschrieben gereinigt und durch Basenaustausch zu dem Natriumsalz -umgewandelt.

Beispiel 14

Bildung von O(Thr)-Penicillinyl Tuftsin IV.

Dieees Produkt wurde unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 12 durch Umsetzung von 0,46 m Mol geschütztem Peptidharz als Ausgangsmaterial mit 2,5 m Mol Penicillin unter Verwendung von Carbonyldiimidazol als Kupplungsmittel in Chloroforra/Dimethylforraamid (1:1) hergestellt.

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Beispiel 15

Herstellung von Thr-lys-Pro-Arg-Pro-Thr-Lys-Pro-Arg.

Dieses Nonapeptid -wurde unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5 hergestellt. Nach der Bildung des Pro-Arg-Harzes wurde die Kupplung jeder anschließenden Aminosäure durchgeführt, wobei drei äquivalente Mengen der geschützten Säure, bezogen auf die Ausgangsmenge an Arginin, verwendet wurden. ψ Nachdem jede Kupplungsumsetzung abgeschlossen war, wurde das Produkt mit A'thanol, Chloroform und Methylenchlorid gewaschen. Die Abtrennung der Schutzgruppen in jeder Stufe wurde mit Trifluoressigsäure und die Neutralisation mit Triäthylamin durchgeführt. Das Nonapeptid wurde von dem Harz mit Bromwasserstoff in Trifluoressigsäure abgespalten und die Nitroargininrückstände wurden durch katalytische Hydrierung mit Palladium auf Bariumsulfat reduziert. Die R in igung wurde in einer Sephadex 6 10 und anschließend in einer Aminex-Kolonne durchgeführt.

Beispiel 16

Herstellung von Tabletten

1000 g Tuftsin IV und 2000 g Lactose werden gründlich vermischt und man läßt das Ganze durch ein 30-Mesh-Sieb (0,59 mm) passieren.

Eine Paste wurde mit 80 g Maisstärke Tind 350 ml destilliertem Wasser hergestellt.

Die oben genannte Mischung wurde dann gut mit der Paste verknetet und die Masse läßt man durch ein 4-Mesh-Sieb (4,76 mm) passieren. Die dabei erhaltenen Kügelchen wurden bei 50⁰C für 15 Stunden getrocknet. - ■

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Die getrockneten Kügelchen wurden dann zuerst in einer Granulat-Maschine granuliert und dann durch ein 16-Mesh~Sieb (1»19 nun) gesiebt. Die Körner wurden mit einer pulverigen Mischung, die durch Vermischen von 30 g Kalziumstearat, 200 g Maisstärke und 80 g IaIk erhalten worden war, umhüllt, und dann läßt man diese durch ein 40-Mesh-Sieb (0,59 mm) passieren.

Aus den in oben beschriebener Weise erhaltenen Körnchen ■wurden nach den herkömmlichen Verfahren Tabletten hergestellt, die je 250 mg Tuftsin IV enthielten.

Beispiel 17 .
Herstellung der Injektion

100 g des Hatriumsalzes von Tuftsin IV wurden in einer Menge destilliertem Pyrogen-freiem Wasser, das speziell für diesen Zweck hergestellt worden "war, aufgelöst und auf 5 Liter verdünnt. Die Lösung wurde durch Zugabe einer vorbestimmten Menge einer "wässrigen Lösung von physiologischem Kochsalz isotonisch gemacht und durch einen kleinstporigen Bakterienfilter filtriert.

Beispiel 18

Herstellung einer wässrigen Lösung zur oralen Verabreichung

Eine Mischung ans

Tuftsin IV Hydrochlorid 20,0 g

Rohrzucker 1.00,ο g

Glycerin 100,0 ml

Äthyl-p-oxybenzoat 1,5 g

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künstliche Orangen-Essenz 0,2 ml . Ätherisches Orangenöl . 1,0 ml

wurde in destillLertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml gebracht.

209826/110 6.

Claims (14)

1. Patentansprüche

   Therapeutisch geeignete nicht-antigene Polypeptide, dadurch e ken η zeich net, daß sie wenigstens dre'i und bis zu etwa 19 Aminosäuren enthalten, die eine Einheit oder wiederkehrende Einheiten umfassen, wobei Jede Einheit etwa drei bis fünf Aminosäuren enthält, Jede wiederkehrende Einheit mit einer benachbarten Einheit durch Prolin oder Cystein verbunden ist,' und jede Einheit zwei Grundaminosäuren enthält, die durch ein oder zwei Prolinmoleküle miteinander verbunden sind, sowie deren pharmakologisch geeignete Salze und Derivate.
2. 2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch . gekennzeichnet, daß es neun Aminosäuren enthält, worin die wiederkehrende Einheit Thr-Lys-Pro-Arg ist, und pharmakologisch geeignete Salze und Derivate derselben.
3. 3. Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß alle Aminosäuren darin.in der Ir-Form vorliegen.
4. 4. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es neun Aminosäuren enthält, worin die wiederkehrende Einheit Arg-Pro-Iiys-Thr ist, und pharmakologisch geeignete. Salze und Derivate derselben.
5. 5. Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß alle Aminosäuren in der D-Form vorliegen.
6. 6. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es vier Aminosäuren enthält, die miteinander.verbunden Thr-Lys-Pro-Arg bilden, und pharmakologisch geeignete Salze und Derivate derselben.

   209826/110 S
7. 7. Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß alle Aminosäuren in der L-Form vorliegen.
8. 8. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es vier Aminosäuren enthält, die miteinander verbunden Arg-Pro-Lys-Thr bilden, und pharmakologisch geeignete Salze und Derivate derselben.
9. 9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß alle Aminosäuren in der D-Form vorliegen.
10. 10. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es drei Aminosäuren enthält, die miteinander verbunden Lys-Pro-Lys, Arg-Pro-Arg, Arg-Pro-Lys,.Lys-Pro-Arg, · Arg-Pro-Orn, Orn-Pro-Arg, Orn-Pro-Orn, Lys-Pro-Orn, Orn-Pro-Lys, His-Pro-His, His-Pro-Lys, His-Pro-Arg, His-Pro-Orn, Lys-Pro-His, Arg-Pro-His oder Orn-Pro-His bilden, und pharmakologisch geeignete Salze und Derivate' derselben.
11. 11. Thr-Lys-Pro-Arg Amide,niedere Ester und pharmakologisch· geeignete Säureadditionssalze von diesen.
12. 12. Thr-Lys-Pro-Arg, dadurch gekennzeichnet , daß die Hydroxylgruppe des Threoninanteils mit einer Alkanoyl- oder Alkenoylgruppe mit bis zu etwa 18 Kohlenstoffatomen verestert ■ ist, und pharmakologisch geeignete Salze und Derivate von diesen.
13. 13. Thr-Lys-Pro-Arg, dadurch gekennzeichnet , daß die Aminogruppe des Threoninanteils mit .einer Alkanoyl- oder Alk©.noylgruppe mit bis zu etwa 18 Kohlenstoffatomen verestert. ist, und pharmakologisch geeignete Salze und Derivate von diesen.
14. 14. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es eine therapeutisch wirksame Kenge von wenigstens · einer Verbindung von Anspruch 1 bis 13 gegebenenfalls zusammen mit einem ungiftigen Träger enthält.

    Der Patentanwalt 209826/1106