DE2450355C2

DE2450355C2 -

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Publication number: DE2450355C2
Application number: DE2450355A
Authority: DE
Inventors: Arlette Palaiseau Fr Adam; Francoise Neuilly Fr Audibert; Louis Chedid; Jean Paris Fr Choay; Rita Montrouge Fr Ciorbaru; Farielle Bagneux Fr Ellouz; Dominique Paris Fr Juy; Pierre Bures Sur Yvette Fr Lefranciernte; Claude Olivet Fr Merser; Jean-Francois Paris Fr Petit; Pierre Prof. Orleans Fr Sinay; Edgar Prof. Sceaux Fr Lederer
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1973-10-23
Filing date: 1974-10-23
Publication date: 1989-06-08
Also published as: GB1496332A; US4186194A; US4235771A; US4323559A; DE2450355A1; US4327085A; NL7413855A

Description

Die Erfindung betrifft N-Acyl-muraminsäurederivate und diese Adjuvanzien enthaltende Impfstoffe.

Die Erfindung ist auf lösliche Substanzen gerichtet, die als immunulogische Adjuvanzien wirken und in den damit behandelten Wesen die Immunreaktionen auf Antigene unterschiedlicher Art stimulieren. Die Erfindung betrifft insbesondere Adjuvanzien, die die Wirkung der schwachen Immunogene verstärken und steigern.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere als Adjuvanzien geeignete Substanzen, die für die Immunisierung von Menschen und warmblütigen Tieren gegen durch Bakterien, Viren und Parasiten hervorgerufene Infektionen und gegen verschiedene Gewebeantigene normalen oder pathologischen Ursprungs, insbesondere gegen Tumore, geeignet sind.

Man kennt bereits seit einiger Zeit Substanzen, die Adjuvanseigenschaften besitzen. Es ist beispielsweise gut bekannt, daß Materialien, wie die Zellen von Mycobakterien und die Zellwände der Mycobakterien die Bildung der Antikörper in dem Wirt bzw. den damit behandelten Wesen steigern und insbesondere die Resistenz des Wirts gegen Infektionen erhöhen, die durch zahlreiche Mikroorganismen verursacht werden. Die bekannten Substanzen dieser Art, wie das komplette Freund′sche Adjuvans, das vollständige Mycobakterienzellen enthält, haben sich aufgrund der von ihnen hervorgerufenen nachteiligen Nebenreaktionen für die Verwendung in der Therapie als unerwünscht erwiesen. Sie können beispielsweise die Empfindlichkeit des Wirts gegenüber Endotoxinen erhöhen, eine Tuberkulinhypersensibilität verursachen und Granulome, Lymphoidgewebehyperplasien und bei der Ratte unter gewissen Bedingungen eine experimentelle Polyarthritis herbeiführen. Andererseits sind bisher die Adjuvanzien auf der Grundlage von Mycobakteriensubstanzen wegen ihrer Unlöslichkeit schwierig zu reinigen gewesen.

So ist insbesondere in der FR-PS 72 22 120 ein Verfahren beschrieben, das die Herstellung eines löslichen und im wesentlichen von den genannten Nachteilen freien Adjuvans ermöglicht. Insbesondere kann ein derartiges Adjuvans beispielsweise mit einem Verfahren bereitet werden, das im wesentlichen darin besteht, einen Mycobakterienstamm, Nocardia-Zellen oder verwandte Mikroorganismen zu züchten, die Zellen des kultivierten Stammes zu gewinnen, sie aufzubrechen, die aufgebrochenen Zellwände beispielsweise durch Differentialzentrifugieren zu gewinnen, die Wachse, freien Lipide, Proteine und Nukleinsäuren abzutrennen und zu entfernen, das von den Zellwänden stammende, von Lipiden befreite Material mit einem mucolytischen Enzym, wie Lysozym, zu digerieren, den festen Rückstand zu beseitigen und die wäßrige Fraktion zu gewinnen, die die genannten löslichen Mittel enthält. Man bewirkt anschließend eine Reinigung und, mindestens in gewissen Fällen in Abhängigkeit von der Natur des behandelten Ausgangsstamms, eine Fraktionierung der erhaltenen Mittel, beispielsweise dadurch, daß man die wäßrige Fraktion über ein Molekularsieb filtriert, beispielsweise über eine mit Polydextrangel oder einem analogen Material, wie dem unter der Bezeichnung "Sephadex® G 75" oder "Sephadex® G 50" bekannten Gel, gefüllte Säule.

Beispielsweise ergibt, wenn der anfänglich gezüchtete Stamm ein Stamm von Mycobacterium smegmatis ist, die Filtration der wäßrigen Fraktion über "Sephadex® G 50" zwei aufeinanderfolgende Elutionsbanden, die beide Substanzen mit Adjuvanseigenschaften enthalten.

In der genannten Patentanmeldung ist angegeben, daß das fragliche Adjuvans und insbesondere das aus der ersten der beiden genannten Elutionsbanden gewonnene, wahrscheinlich aus einem Oligomeren beteht, dessen monomere Einheiten im wesentlichen jenen der Polymeren der Mikroorganismenzellwände, aus denen sie extrahiert worden sind, mit Ausnahme ihrer Lipidteile, die sehr klein und in gewissen Fällen nicht vorhanden sind, entsprechen. Es ist ebenfalls festgestellt worden, daß das in der zweiten der genannten beiden Elutionsbanden vorhandene Adjuvans aus einem an neutralen Zuckern armen oder sogar freien Oligomeren besteht, dessen monomere Einheit die Aminozucker und die Aminosäuren der die Zellwände der genannten Mikroorganismen bildenden Polymerisate und gegebenenfalls kleine Lipidteile enthält.

Diese verschiedenen Adjuvanzien stellen sicherlich einen beträchtlichen Fortschritt gegenüber den unlöslichen Adjuvanzien dar, die zuvor beschrieben worden sind. Sie bestehen jedoch aus Gemischen und man kann in der Tat daran denken, daß diese Mittel, insbesondere durch die Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens, nur aus Mycobakterien, Nocardiae, und damit verwandten Mikroorganismen erhalten werden können.

Die Erfindung betrifft nun lösliche N-Acyl-muraminsäurederivate, die als lösliche Adjuvanzien mit geringem Molekulargewicht verwendet werden können, chemisch wohldefiniert sind und - was zumindest einen Teil dieser Mittel anlangt - synthetisch hergestellt werden können. Es hat sich andererseits gezeigt, daß mindestens ein Teil dieser wohldefinierten und niedermolekularen Adjuvanzien auf biochemischem Weg hergestellt werden kann.

Die erfindungsgemäßen N-Acyl-muraminsäurederivate haben die folgende allgemeine Formel:

in der R₁ einen L-Alanyl-, L-Seryl- oder Glycylrest und R₂ L-Lysin, einen β-Hydroxy- oder L-Meso-alpha-epsilon-diamino-pimelinsäurerest darstellt und, wenn R₂ eine Diaminosäure ist, über eine Peptidbindung mit einer L-Alanin- oder D-Alaninaminosäure verknüpft sein kann und Ac eine Acetyl- oder eine Glycolylgruppe bedeutet.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung dieser Mittel oder Adjuvanzien zur Herstellung von Impfstoffen, deren immunogene Wirkung sie durch ihre Fähigkeit verstärken, die Bildung von Antikörpern gegen das impfende Antigen in dem Wirtsorganismus zu begünstigen und zu steigern, und betrifft demzufolge auch Impfstoffzubereitungen, die neben einem immunogenen oder antigenen Impfstoff ein derartiges Adjuvans enthalten.

Die bevorzugten erfindungsgemäßen N-Acyl-muraminsäurederivate haben als Rest R₁ einen L-Alanylrest.

Die Acyl-Gruppe der N-Acyl-muraminsäure wird durch eine Acetyl-Gruppe oder eine Glykolyl-Gruppe gebildet.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen N-Acyl-muraminsäurederivate besteht darin, daß man N-Acyl-muraminsäure, deren freie OH-Gruppen, mit Ausnahme derjenigen der Propionyl-Gruppe der Muraminsäure, zuvor geschützt worden sind, mit dem entsprechenden Peptid umsetzt, dessen freie OH-Gruppen ebenfalls zuvor geschützt worden sind.

Weitere Gegenstände, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den folgenden, auf bevorzugte erfindungsgemäße Adjuvanzien gerichteten Beispielen.

Beispiel 1

Im folgenden wird die chemische Synthese der erfindungsgemäßen N-Acetyl-muraminsäure-Moleküle, an denen die Di-, Tri- bzw. Tetra-Peptidketten gebunden werden, erläutert.

Im folgenden sei zunächst die Synthese der fraglichen Di-, Tri- und Tetra-Peptide vor deren Kupplung mit der N-Acetylmuraminsäure erläutert.

A) Synthese der Peptidketten

Im folgenden sind angegeben, die Synthesen:
des Hydrochlorids des Benzylesters von L-Alanyl-D-Isoglutamin:

L-Ala-D-Glu-α-NH₂,HCl,

des Hydrochlorids des Benzylesters von [L-Alanyl-D-Isoglutaminyl]-(L),Z- (D)-meso-Diaminopimelyl-(L),[D-Alanin],(D)-Amid:

[L-Ala-D-Glu-α-NH₂]-(L)-,Z-(D)-m-DAP-(L)-(O-Ala-OBzl), (D)-NH₂,HCl

des Hydrochlorids des Benzylesters von [L-Alanyl-D-Isoglutaminyl]-(L),Z- (D)-meso-Diaminopimelyl-(D)-amid:

[L-Ala-D-Glu-α-NH₂]-(L),Z-(D)-m-DAP-(L)-(OBzl), (D)-NH₂,HCl

Die angegebenen Abkürzungen bedeuten:
Z=die Benzyloxycarbonyl-Gruppe,
BOZ=die tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe,
m-DAP=meso-αα′-Diaminopimelinsäure,
OSu=Succinimidester.

Die Schmelzpunkte sind in Kapillarröhrchen mit der Vorrichtung von Dr. Tottoli bestimmt worden und nicht korrigiert. Die Bestimmungen der physikalischen Konstanten und die Elementaranalysen erfolgten an Proben, die im allgemeinen während 20 Stunden bei 78°C im Vakuum 1,33×10^-2 mbar getrocknet worden sind. Die Elementaranalysen wurden mit einer automatischen CHN-Mikroanalysenvorrichtung durchgeführt. Die optischen Drehwerte wurden mit Hilfe eines elektronischen Polarimeters bestimmt. Die Chromatographien erfolgten auf mit Kieselgel beschichteten Dünnschichtplatten in einer Lösungsmittelmischung A, das heißt einer n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser-Mischung (30/20/6/24 Volumen/Volumen) oder einer Lösungsmittelmischung B, das heißt einer Chloroform/Methanol/Ammoniak-Mischung (2/2/1 Volumen/Volumen).

a) Diamid der BOC,Z-meso-Diaminopimelinsäure [BOC, Z-m-DAP-(NH₂)₂]

Man setzt aus 6,12 g (7,80 mMol) des Dicyclohexylammoniumsalzes der BOC,Z-meso-Diaminopimelinsäure (das man nach den Methoden von P. Dezelee und E. Bricas (Biochem. 1970, 9, 823) und P. Dezelee und E. Bricas ("Peptides 1969: Proceedings of the Tenth European Peptide Symposium" (E. Scoffonc, Ed) Seiten 347 bis 355, North Holland, Amsterdam) hergestellt hat mit einer 4n Chlorwasserstoffsäurelösung in Tetrahydrofuran die Säure frei. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit 25 ml Tetrahydrofuran aufgenommen und man versetzt die auf -10°C abgekühlte Lösung mit 4,05 ml (15,6 mMol) Isobutylchlorcarbonat und 2,2 ml (15,6 mMol) Triäthylamin. Nach Ablauf von 10 Minuten leitet man während 30 Minuten bei Raumtemperatur einen trockenen Ammoniakstrom in die Lösung ein. Es bildet sich ein sehr voluminöser weißer Niederschlag, der nach dem Abdestillieren des Tetrahydrofurans mit einer Mischung aus Äthylacetat (60 ml) und Wasser (20 ml) aufgenommen wird. Die organische Lösung wird dann zweimal mit jeweils 20 ml einer 1m Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen. Anschließend trocknet man die Lösung über Magnesiumsulfat und engt sie zur Trockene ein. Der erhaltene feste Rückstand wird aus einer Äthylacetat/Hexan-Mischung umkristallisiert, wobei man 2,06 g (Ausbeute 63%) der Titelverbindung erhält.
Schmelzpunkt: 169°C bis 172°C.

Analyse: C₂₀H₃₀O₆N₄=422,49
ber.: C 56,9, H 7,2, N 13,3%;
gef.: C 56,8, H 7,5, N 13,5%.

b) Hydrochlorid des Diamins der Z-meso-Diaminopimelinsäure [Z-m-DAP-(NH₂)₂,HCl]

Man löst 1,86 g (4,4 Mol) des Diamids der BOC,Z-meso-Diaminopimelinsäure in 14 ml einer 1n Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Nach 30 Minuten bei 25°C engt man die Lösung zur Trockene ein und trocknet den Rückstand in Gegenwart von Natriumhydroxid in einem Exsikkator. Das Produkt wird schließlich aus einer Methanol/Äther-Mischung kristallisiert. Man erhält 1,5 g der Titelverbindung (Ausbeute 90,5%).
Schmelzpunkt: 138°C bis 140°C. Rf (A)=0,7.

c) Hydrochlorid des Z-(D)-meso-Diaminopimelinsäure-(D)-monoamids [Z-(D)-m-DAP-(D)-NH₂,HCl]

Dieses Produkt erhält man nach der von Dezelee und Bricas angegebenen Methode (Lefrancier und E. Bricas, Bull. Soc. Chim. Biol., 1967, 49, 1257) zur Herstellung des BOC-(D)-meso-Diaminopimelinsäure- (D)-monobutyloxycarbonylhydrazids [BOC-(D)- m-DAP-(D)-NH-NH-BOC].

Man stellt den pH-Wert einer Lösung von 1,144 g (3,2 mMol) des Hydrochlorids des Diamids der Z-meso-Diaminopimelinsäure in 100 ml destilliertem Wasser bei 37°C mit einer 1n Kaliumhydroxidlösung auf einen Wert von 8,6 ein. Dann gibt man 3 ml einer zuvor aktivierten Leucin-Aminopeptidase-Lösung zu (das heißt eine 90 Minuten auf 37°C gehaltene Mischung aus 0,8 ml einer Lösung von Leucinaminopeptidase, die 2 mg Protein pro ml enthält, 0,7 ml destilliertem Wasser, 1,5 ml eines 0,5m Tris-Puffers (pH 8,5) und 3 ml einer 0,025m Magnesiumsulfatlösung). Man hält den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer 0,1n H₂SO₄-Lösung mit Hilfe einer Vorrichtung zur Konstanthaltung des pH-Wertes auf einem Wert von 8,6. Nach etwa einer Nacht wird eine geringe Menge eines Niederschlags abfiltriert, das Filtrat mit einer 2n Chlorwasserstoffsäurelösung angesäuert und auf ein geringes Volumen eingeengt. Der erhaltene Niederschlag wird nach dem Aufbewahren über Nacht bei 0°C abfiltriert (400 mg, Ausbeute 70%). Das Filtrat wird auf 4 ml eingeengt und über eine SE-Sephadex® (NH₄⁺) gefüllte Kolonne (2×20 cm) geführt, die zuvor mit einer 1m Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Hydrochlorid des Z-(D)-meso-Diaminopimelinsäure-(D)-monoamids wird mit einer 0,1m Ammoniumacetatlösung in 1m Essigsäurelösung eluiert. Durch Gefriertrocknen erhält man 100 mg des Produktes. Die beiden Chargen werden aus einer Äthanol/Äther-Mischung umkristallisiert. Man erhält 480 mg des Produktes (Ausbeute 84%).
Schmelzpunkt: 245°C bis 250°C.

[a] = 5° (c=0,5 HClN) · Rf (A) = 0,65.

d) Succinimidester von BOC-L-Alanyl-D-Isoglutamin [BOC-L-Ala-D-Glu(OSu)-NH₂]

Zu einer Lösung von 4,05 g (10 mMol) BOC-L-Alanyl-D-Isoglutamin (2) in 30 ml Dimethylformamid gibt man 1,15 g (10 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 2,26 g (11 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur filtriert man den Dicyclohexylharnstoff ab und engt das Filtrat zur Trockene ein. Das Produkt wird aus einer Isopropylalkohol/Diisopropyläther- Mischung umkristallisiert, wobei man 4 g des Produktes (Ausbeute 100%) erhält. Schmelzpunkt: 69°C bis 70°C (unter Zersetzung).

[α] = 12,2° (c=1 Dioxan).

Es scheint, als ob sich dieses Produkt ziemlich schnell zersetzt. Es wird daher entweder in Gegenwart von P₂O₅ im Exsikkator aufbewahrt oder unmittelbar vor seiner Verwendung hergestellt.

e) Hydrochlorid des Benzylesters von L-Alanyl-D-Isoglutamin

Man löst 1 g (2,5 mMol) des Benzylesters von BOC-L-Alanyl-D- Isoglutamin (2) in 30 ml einer 1n Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Nach 30 Minuten engt man die Lösung zur Trockene ein, nimmt den Rückstand in einer minimalen Menge Methanol auf und fällt das Produkt mit Äther aus. Man erhält 800 mg des Produktes (Ausbeute 94%).
Schmelzpunkt: 153°C bis 157°C.

[α] = +8,1° (c=1 Methanol).

Analyse: C₁₅H₂₂O₄N₃Cl=342,87
ber.: C 52,5, H 6,5, N 12,3%;
gef.: C 52,5, H 6,4, N 12,2%.

f) [BOC-L-Alanyl-D-Isoglutaminyl]-(L),Z-(D)-meso-DAP-(D)-NH₂

Man löst 1,18 g (3,3 mMol) des Hydrochlorids des Z-(D)-meso- Diaminopimelinsäure-monoamids in 5 ml destilliertem Wasser. Dann gibt man bei 0°C 0,72 ml (6,6 mMol) N-Methylmorpholin und dann eine Lösung von 1,2 g (3 mMol) des Succinimidesters von BOC-L- Alanyl-D-Isoglutamin in 15 ml Dimethylformamid zu. Der zu Beginn der Reaktion beobachtete Niederschlag löst sich nach 2 Stunden. Nach 48 Stunden wird die Reaktionsmischung zur Trockene eingeengt und mit 50 ml n-Butylalkohol, den man zuvor mit einer 1m Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebracht hat, und 20 ml einer 1m Essigsäurelösung, die man zuvor mit n-Butylalkohol ins Gleichgewicht gebracht hat, aufgenommen. Die n-Butanol-Phase wird fünfmal mit kleinen Mengen der Essigsäurelösung extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Phasen werden dreimal mit 10 ml n-Butylalkohol gewaschen. Die organischen Phasen werden schließlich vereinigt und fast zur Trockene eingedampft. Durch Zugabe von Äther erhält man 1,8 g eines Niederschlags, den man in absolutem Äthanol aufnimmt. Das unlösliche Material wird abfiltriert und das Filtrat auf ein minimales Volumen eingeengt. Durch Ausfällen mit Äther erhält man 1,6 g der Titelverbindung (Ausbeute 80%), die einen Erweichungspunkt von 10°C bis 110°C und einen Schmelzpunkt von 115°C aufweist.

[α] = -5° (c=1 Methanol).

Analyse: C₂₈H₄₂O₁₀N₆=623,09
ber.: C 54,0, H 6,8, N 13,5%;
gef.: C 54,1, H 6,7, N 13,5%.

g) [BOC-L-Ala-D-Glu-α-NH₂]-(L),Z-(D)-meso-DAP-(L)-D-Ala-OBzl,(D)NH₂

Man löst 570 mg (0,92 mMol) [BOC-Ala-D-Glu-α-NH₂]-(L),Z-(D)- meso-DAP-(D)-NH₂ in 30 ml Tetrahydrofuran. Bei -15°C gibt man 0,26 ml (1 mMol) Isobutylchlorcarbonat und 0,11 ml (1 mMol) N-Methylmorpholin zu. Nach 10 Minuten setzt man eine Lösung von 352 mg (1 mMol) D-Alanin-benzylester-p-toluolsulfonat in 10 ml Tetrahydrofuran und 0,11 ml (1 mMol) N-Methylmorpholin zu. Man erhält nach Ablauf einer Stunde bei Raumtemperatur einen solvatisierten Niederschlag. Die Reaktion wird während weiterer 24 Stunden fortgesetzt. Nach dem Einengen zur Trockene nimmt man den Rückstand mit 25 ml Äthylacetat und 10 ml destilliertem Wasser auf. Die organische Phase wird nacheinander mit einer 10%igen Zitronensäurelösung, mit destilliertem Wasser, mit einer 1m Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit destilliertem Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert gewaschen. Die Äthylacetat- Phase wird eingeengt und der erhaltene Rückstand in einem Exsikkator in Gegenwart von P₂O₅ getrocknet. Das Produkt wird in einer Äthylacetat/Petroläther-Mischung kristallisiert. Man erhält 400 mg der Titelverbindung (Ausbeute 55%). Erweichungspunkt: 180°C, Schmelzpunkt: 215°C (der optische Drehwert einer methanolischen Lösung (c=1) kann wegen eines zu geringen Wertes außer Betracht bleiben).

Analyse: C₃₈H₅₃O₁₁N₇=783,89
ber.: C 58,2, H 6,8, N 12,5%;
gef.: C 58,0, H 6,7, N 12,55%.

h) Hydrochlorid von [L-Ala-D-Glu-α-NH₂](L),Z-(D)-meso-DAP-(L)[L-Ala-OBzl],(D)-NH₂

Man löst 850 mg (1,1 mMol) BOC-L-Ala-D-Glu-α-NH₂(L),Z-(D)- DAP-(L)-L-Ala-OBzl,(D)-NH₂ in 5 ml einer 1n Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Nach 30minütiger Umsetzung bei 25°C engt man die Lösung zur Trockene ein und kristallisiert den Rückstand aus einer Methanol/Äther-Mischung aus. Man erhält die Titelverbindung in einer Menge von 750 mg (Ausbeute 95%).
Schmelzpunkt: 90°C bis 100°C (wenig deutlich).

[α] = +3,5° (c=0,5 Methanol).

Analyse: C₃₃H₄₆ O₉N₇Cl, HCl 0,25 H₂O
ber.: C 52,2, H 6,3, N 12,9%;
gef.: C 52,26, H 6,14, N 12,69%.

Die Analyse der Aminosäuren von 0,5 mg des vollständig hydrolysierten Derivats (wobei die Hydrolyse in Gegenwart von 6n Chlorwasserstoffsäurelösung während 24 Stunden bei 110°C in einem vakuumdichten Röhrchen erfolgt) ergibt folgendes Verhältnis: Ala 1,9; Glu 1; DAP 1.

i) Hydrochlorid des Benzylesters des Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(D)-monoamids. Z-(D)-m-DAP-(L)-OBzl,(D)-NH₂,HCl

Das hierfür eingesetzte Di-Z-meso-diaminopimelyl-(D)-monoamid erhält man nach der von J. van Heÿenhoort, E. Bricas und C. Nicot (Bull. Soc. Chim. 1969, 8, 2743) beschriebenen Methode.

Man bringt 4,57 g (10 mMol) dieses Derivats in 50 ml wasserfreiem Äther in Suspension. Dann gibt man im Verlaufe von 30 Minuten bei 0°C unter Rühren 10 mMol feinpulverisiertes Phosphorpentachlorid zu. Nach der vollständigen Lösung des Phosphorpentachlorids filtriert man die Reaktionsmischung und engt das Filtrat im Vakuum bei 40°C ein. Nach der Zugabe frischen Lösungsmittels wiederholt man das Einengen mehrfach. Der Rückstand wird dann in 10 ml Benzylalkohol aufgenommen und die Lösung bei 0°C in einen Kolben gegossen, in dem sich 50 ml zuvor mit Chlorwasserstoff gesättigten Äthers befinden. Unter Rühren der Lösung läßt man die Temperatur auf 25°C ansteigen. Unter Kohlendioxidentwicklung bildet sich ein Niederschlag. Man läßt über Nacht stehen, filtriert den Niederschlag ab und wäscht ihn mit Äther. Man erhält in dieser Weise die angegebene Titelverbindung.

j) [BOC-L-Ala-D-Glu-α-NH₂]-(L),Z-(D)-m-DAP-(L)-OBzl,(D)-NH₂

Man löst 500 mg (2 mMol) Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(D)-monoamidbenzylester- hydrochlorid in 10 ml Dimethylformamid. Dann gibt man bei 0°C 0,22 ml (2 mMol) N-Methylmorpholin und schließlich eine Lösung von 800 mg (2 mMol) BOC-L-Alanyl-D-Isoglutaminsuccinimidester in 10 ml Dimethylformamid zu.

Nach 48 Stunden engt man die Reaktionsmischung zur Trockene ein und nimmt sie mit 50 ml zuvor mit einer 1m Essigsäurelösung ins Gleichgewicht gebrachtem N-Butylalkohol und 20 ml einer zuvor mit n-Butylalkohol ins Gleichgewicht gebrachten 1m Essigsäurelösung auf. Die n-Butanol-Phase wird fünfmal mit kleinen Mengen der Essigsäurelösung extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Phasen werden dreimal mit 10 ml Butylalkohol gewaschen. Die organischen Phasen werden schließlich vereinigt und zur Trockene eingeengt. Durch Ausfällen mit Äther erhält man die angegebene Titelverbindung (j).

k) Hydrochlorid von [L-Ala-D-Glu-a-NH₂](L),Z-(D)-meso-DAP-(L)-OBzl,(D)-NH₂

Man löst 712 mg (1 mMol) BOC-L-Ala-D-Glu-α-NH₂(L),Z-(D)-m- DAP-(L)OBzl,(D)-NH in 5 ml einer Lösung von Chlorwasserstoff in Essigsäure. Nach 30minütiger Reaktion bei 25°C wird die Lösung zur Trockene eingeengt, der Rückstand mit Methanol aufgenommen und mit Äther ausgefällt. Man erhält 600 mg der Titelverbindung (98%).

Die Analyse der Aminosäuren eines durch vollständiges saures Hydrolysieren von 0,5 g des Derivats erhaltenen Hydrolysats (wobei die Hydrolyse mit 6n Chlorwasserstoffsäurelösung während 24 Stunden bei 110°C in einem vakuumdicht verschlossenen Röhrchen erfolgt) ergibt folgende Zusammensetzung: Ala 0,95, Glu 1, DAP 0,90.

B) Vollsynthese des Glycopeptids 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(γ-OH)-D-α-Glu-NH₂

Die durchgeführten Reaktionen werden durch das folgende Reaktionsschema I verdeutlicht. In diesem Schema steht die Abkürzung "Ph" für die Phenyl-Gruppe und die Abkürzung "Ac" für die Acetyl-Gruppe.

a) Herstellung von Benzyl-2-acetamido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D-glucopyranosid (Verbindung A des Schemas I)

Man erhält diese Verbindung ausgehend von Benzyl-2-acetamido- 3,4,6-tri-O-acetyl-2-desoxy-β-D-glucopyranosid durch Desacetylieren mit Natriummethanolat und Einführen der 4,6-O-Benzyliden- Schutzgruppe nach der Methode von P. H. Gross und R. W. Jeanloz (J. Org. Chem. 32 (1967), 2759).

b) Herstellung von Benzyl-2-acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(D-1-carboxyäthyl)-2-desoxy--β-D-glucopyranosid (Verbindung I des Schemas I)

Man löst 4 g Benzyl-2-acetamido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D- glucopyranosid (A) bei 90°C in 450 ml wasserfreiem und von Peroxiden befreitem Dioxan. Nach der Zugabe einer 50%igen Suspension von Natriumhydrid in Öl (wobei man 2,80 g der Suspension verwendet), rührt man die Mischung während 2 Stunden bei 90°C. Dann gibt man 1,840 g L-α-Chlorpropionsäure zu. 3 Stunden nach der Zugabe der Säure versetzt man ein zweites Mal mit Natriumhydrid (2,80 g der Suspension). Die Mischung wird anschließend unter mechanischem Rühren über Nacht bei 65°C bis 67°C stehengelassen. Nach dem Abkühlen in einem Eisbad zerstört man das überschüssige Natriumhydrid vorsichtig durch Zugabe von Wasser (110 ml). Die Mischung trennt sich in zwei Phasen auf. Die untere Phase wird verworfen, während die obere Phase abgetrennt, filtriert und im Vakuum eingedampft wird. Der Rückstand wird mit 250 ml Wasser verdünnt, wonach man die erhaltene wäßrige Lösung mit Chloroform wäscht. Diese wäßrige Lösung wird anschließend auf 0°C abgekühlt und bis zu einem pH-Wert von 3 mit 2,5m Chlorwasserstoffsäurelösung versetzt. Die ausgefällte Verbindung (der Formel I) wird sofort abgesaugt und gut mit kaltem Wasser gewaschen. Nach der Kristallisation aus Methanol erhält man die Verbindung (I) in reinem Zustand (3,64 g, 76% Ausbeute).
Schmelzpunkt: 264°C bis 265°C

[α] = -52° (c=0,41 Äthanol).

IR-Spektrum: γ = 3320 (NH), 3080 (Ph), 1760 (COOH), 1660 (Amid I), 1565 (Amid II), 740 und 695 cm^-1 (Ph).

c) Herstellung des Glycopeptids: 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(γ-OH)-D-α-GluNH₂ (Verbindung der Formel V des Schemas I)

Das allgemeine Prinzip der Herstellung ist das folgende: Man kondensiert Benzyl-2-acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O- (D-1-carboxyäthyl)-2-desoxy-β-D-glucopyranosid (I) nach Woodward et al. (Tetrahedron, Suppl. 8 (1966) 321) mit L-Ala-(γ-O-Benzyl)-D-GluNH₂-hydrochlorid. Als Lösungsmittel verwendet man eine Mischung aus N,N-Dimethylformamid und Acetonitril (1/2 Volumen/Volumen). In dieser Weise erhält man 2-(Benzyl-2-acetamido-4,6,-O-benzyliden-2-desoxy-3-O-β-D- glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(γ-O-benzyl)-D-α-Glu NH₂ (III) in kristallinem Zustand mit einer Ausbeute von mehr als 80%. Das Woodward-Reagens K (N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3′- sulfonat) ist ausgewählt worden, da es praktisch nicht zu einer Racemisierung führt und mit Amiden von Glutamin-Typ sehr gute Ergebnisse erzielen läßt, und dies auch in N-N-Dimethylformamid. Der einzige Nachteil dieses zuletzt erwähnten Lösungsmittels besteht darin, daß es zu einer geringeren Ausbeute führt, was hier nicht der Fall ist, da eine Acetonitril/N,N-Dimethyl- formamid-Mischung verwendet wird. Durch Behandeln des geschützten Glycopeptids (III) mit 60%iger Essigsäure erhält man 2-(Benzyl-2-acetamido-2-desoxy-3-O-β-D-glucopyranosyl)-D- propionyl-L-Ala-(α-O-benzyl)-D-α-Glu NH₂ (IV) in kristallinem Zustand mit einer Ausbeute von etwa 70%. Das gewünschte Glycopeptid (V) erhält man durch katalytisches Hydrieren der Verbindung der Formel IV in Eisessig in Gegenwart von Palladium-auf- Kohlenstoff. Die Verbindung konnte nicht in kristallinem Zustand erhalten werden und die sehr starke Hygroskopizität dieses Produktes erlaubte keine zufriedenstellende Elementaranalyse. Das Material ist jedoch dünnschichtchromatographisch (Kieselgel, Propanol/Wasser-Mischung, 3/3 Volumen/Volumen) sowie papierchromatographisch (n-Butanol/Essigsäure/Wasser, 5/1/2 Volumen/Volumen/Volumen) homogen.

Die Synthese wird unter Anwendung der im folgenden angegebenen experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Allgemeine Bedingungen

Die Schmelzpunkte wurden in Kapillarröhrchen mit Hilfe einer Büchi-Vorrichtung bestimmt und sind nicht korrigiert. Die Drehwerte sind mit Hilfe eines Polarimeters bestimmt worden. Die Infrarotspektren wurden mit einem Spektrophotometer aufgenommen. Die Homogenität der hergestellten Verbindungen wurden chromatographisch auf Glasplatten, die mit Kieselgel mit einer Dicke von 0,25 mm) beschichtet sind, untersucht, wobei die Chromatogramme durch Verdampfen einer 50%igen Lösung von konzentrierter Schwefelsäure in Alkohol und Erhitzen mit Hilfe einer Heizeinrichtung (Epiradiateur) entwickelt wurden. Die Säulenchromatographien erfolgten auf Kieselgel (0,063-0,200 mm). Die Papierchromatogramme erfolgten nach der absteigenden Technik und werden auf Whatmann®-Papier Nr. 1 durchgeführt. Die Elementaranalysen erfolgten durch den "Service Central de Micro- Analyse du Centre National de la Recherche Scientifique (Thiais).

2-(Benzyl-2-acetamido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-3-O-b-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(γ-O-benzyl)-D-α-Glu NH₂ (III)

Man gießt eine Lösung von 157 mg Benzyl-2-acetamido-4,6-O- benzyliden-3-O-(D-1-carboxyäthyl)-2-desoxy-β-D-glucopyranosid (I) (0,33 mMol) in 5 ml einer Acetonitril/N,N-Dimethylformamid- Mischung (2/1 Volumen/Volumen), die ein Äquivalent (0,33 mMol) Triäthylamin enthält, in eine bei 0°C gehaltene Suspension von 84,3 mg N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonat Reagens K nach Woodward) in 5 ml Acetonitril. Die Mischung wird bei 0°C gerührt, bis man eine klare Lösung erhält (wozu etwa eine Stunde und 30 Minuten erforderlich sind). Dann gibt man eine Lösung von 114,4 mg (0,33 mMol) L-Ala-(γ-O-Benzyl)-D-α-Glu NH₂-hydrochlorid (II) in 5 ml einer Acetonitril/N,N-Dimethylformamid- Mischung (2/1 Volumen/Volumen), die ein Äquivalent (0,33 mMol) Triäthylamin enthält, zu. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur über Nacht verdampft man die Lösungsmittel im Vakuum und extrahiert den erhaltenen festen Rückstand gut mit heißem Wasser, um die Nebenprodukte zu entfernen. Der Feststoff wird abgesaugt, getrocknet und aus Äthanol kristallisiert und man erhält 208 mg (82%) der Verbindung der Formel III (Schema I).
Schmelzpunkt: 243°C bis 245°C.

[α] = -20° (c=0,5, N,N-Dimethylformamid)

IR-Spektrum: γ 3440, 3320 (NH), 3080, 3060 (Ph), 1740 (Ester), 1645 (Amid I), 1540 (Amid II), 740 und 690 cm^-1 (Ph).

Analyse: C₄₀H₄₈N₄O₁₁
ber.: C 63,15, H 6,36, N 7,36%;
gef.: C 62,96, H 6,22, N 7,49%.

2-(Benzyl-2-acetamido-2-desoxy-3-O-β-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(q-O-benzyl)-D-α-Glu NH₂ (IV).

Man bringt 200 mg der Verbindung III in 15 ml 60%iger Essigsäure in Suspension und erhitzt während einer Stunde auf 100°C. Nach dem Abkühlen der Lösung verdampft man die Essigsäure im Vakuum, wobei man die letzten Spuren der Säure durch Zugabe von Wasser und durch Eindampfen beseitigt, während man die Wasserspuren durch gleichzeitige Destillation von Toluol entfernt. Der erhaltene Rückstand wird über eine mit 15 g Kieselgel beschickte Säule chromatographiert (wobei man mit einer Chloroform/Methanol-Mischung 85/15 Volumen/Volumen eluiert). Die reinen Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei man einen Rückstand erhält, der aus chromatographisch reiner Verbindung der Formel IV (siehe Schema I) besteht (129 mg, 73%). Man kristallisiert dieses Produkt aus einer Tetrahydrofuran/Petroläther-Mischung um. Man erhält 115 mg (Ausbeute 65%) der Verbindung IV.
Schmelzpunkt 217°C bis 219°C.

[α] = -1° (c=0,45, N,N-Dimethylformamid)

IR-Spektrum: γ 3450, 3230 (OH,NH), 1740 (Ester), 1645 (Amid I, breite Bande), 1545 (Amid II), 720 und 690 cm^-1 (Ph).

Analyse: C₃₃H₄₄N₄O₁₁
ber.: C 58,92, H 6,59, N 8,32%;
gef.: C 58,78, H 6,50, N 8,25%.

2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-O-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-Ala-(γ-OH)-D-α-Glu NH₂ (V)

Man hydriert 69 mg der Verbindung IV katalytisch in 10 ml Eisessig in Gegenwart von 25 ml Palladium-auf-Kohlenstoff. Nach Ablauf von 3 Stunden saugt man den Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum ein. Man erhält in dieser Weise die Verbindung der Formel V in Form eines stark hygroskopischen glasigen Materials, das nicht kristallisiert werden kann.

Diese Verbindung ist dünnschichtchromatographisch (Kieselgel, n-Propanol/Wasser 7/3 Volumen/Volumen) sowie papierchromatographisch (n-Butanol/Essigsäure/Wasser, 5/1/2 Volumen/Volumen/ Volumen) rein: R_f=0,30. Die Entwicklung der Chromatogramme erfolgt mit Hilfe des Sharon-Reagens (J. Biol. Chem. 239 (1964) PC 2398) und mit Hilfe von Silbernitrat nach der Methode von Trevelyan et al. (Nature, 166 (1950) 444). Dies bestätigt die Hydrogenolyse der Glycosid-Funktion.

Eine mit einer sehr geringen Menge durchgeführte Untersuchung zeigt die vollständige und augenblickliche Reaktion mit einer Lösung von Diazomethan in Äther, was auf die Anwesenheit einer freien Carbonsäure schließen läßt.

Nach der Hydrolyse erhält man als einzige, in der Aminosäure- Analysevorrichtung nachweisbare Bestandteile Alanin, Glutaminsäure und Muraminsäure.

Die schließlich erhaltene Verbindung (Mur-N-Ac-Ala-GluNH₂) wird dann auf ihre Adjuvans-Wirkung untersucht.

Unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise kann man ausgehend von der Verbindung der Formel I N-Acetyl-muraminsäure-Dipeptid- und -Tripeptid-Derivate herstellen, in denen man anstelle des Hydrochlorids des Benzylesters von L-Alanyl-D-Isoglutamin (Verbindung der Formel II des Schemas I, die weiter oben auch als Verbindung e bezeichnet worden ist) das Hydrochlorid des Benzylesters von [L-Alanyl-D-Isoglutaminyl]-(L),Z-(D)-meso- Diaminopimelyl-(D)-amid (Verbindung k) bzw. das Hydrochlorid des Benzylesters von [L-Alanyl-D-Isoglutaminyl]-(L), Z-(D)-meso-Diaminopimelyl-(L),[D-Alanin],(D)-Amid (Verbindung h) einsetzt.

Pharmakologische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mittel

Die erfindungsgemäßen Mittel besitzen eine starke Adjuvans- Wirkung und sind frei von ernsten Nebenwirkungen, die die therapeutische Anwendung der Mycobakterien und des Freund'schen Adjuvans beschränken. Diese äußerst vorteilhaften Eigenheiten ergeben sich durch die folgenden pharmakologischen Untersuchungen.

I) Demonstration der Adjuvans-Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mittel

Man verabreicht weiblichen Meerschweinchen (Hartley) mit einem Gewicht von 300 bis 350 g in die Sohle jeder der beiden Hinterpfoten eine Emulsion, die aus gleichen Teilen des nicht kompletten Freund'schen Adjuvans und einer Ovalbumin enthaltenden physiologischen Lösung besteht (5 mg pro Meerschweinchen) und das zu untersuchende Präparat. Man verwendet das nicht komplette (das heißt keine Mycobakterien enthaltende) Freund'sche Adjuvans (AIF) und das komplette Frend'sche Adjuvans (ACF) als Vergleichssubstanzen.

Der Gehalt der Antiovalbumin-Antikörper wird 3 Wochen nach der Injektion bestimmt. Der Gehalt der Antikörper ist in µg des Antigen-Antikörper-Niederschlags am Äquivalenzpunkt pro ml Serum angegeben.

Das Granulom (das in der folgenden Tabelle I mit dem Zeichen + angegeben ist) wird 3 Wochen nach der Injektion beobachtet.

Die verzögerte Hypersensibilität gegenüber Ovalbumin wird 4 Wochen nach der Injektion an der Hautreaktion bestimmt. Sie wird als Durchmesser des Erythems (E) in mm, die Induratio (I) oder die Nekrose (N) 48 Stunden nach der subkutanen Injektion von 10 µg oder 100 µg Ovalbumin angegeben.

Die in der folgenden Tabelle angegebenen Ergebnisse verdeutlichen die bemerkenswerte Adjuvans-Aktivität der erfindungsgemäßen Präparate.

Die in der obigen Tabelle angegebenen pharmakologischen Untersuchungen zeigen, daß die Anwesenheit einer meso-DAP-Gruppe in der an den Zuckerrest der N-Acyl-muraminsäure, ob diese nun als solche vorliegt oder Teil eines längeren Glykans bildet, gebundene Peptid-Gruppe nicht wichtig ist für die Aufrechterhaltung der Adjuvans-Aktivität der fraglichen Peptidglykan-Fragmente.

Man erhält erfindungsgemäß so mit Adjuvans-Substanzen, die zur Steigerung der Wirksamkeit von Impfstoffen bakteriellen oder viralen Ursprungs, insbesondere wenn sie schwache Immunogene darstellen, verwendet werden können. Sie können insbesondere dafür eingesetzt werden, die Immunisierung des Wirts (menschliche Patienten oder Tiere) gegen Bakterien- oder Virus-Infektionen, gegen Tumorantigene und gegen Protozoenantigene etc. zu begünstigen. Sie sind ebenfalls in wirksamer Weise zur Herstellung von Serum verwendbar. Sie können mit dem Antigen oder den genannten Impfstoffen in pharmazeutisch verträglichen, sterilen Wasser-Öl-Emulsionen verabreicht werden.

Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Substanzen in dem nicht kompletten Freund'schen Adjuvans oder in einem aus 8,5 Teilen Hexadecan, 1,5 Teilen Sorbitandilaurat (das unter der Handelsbezeichnung Arlacel erhältlich ist) oder Glycerinmonooleat und 10 Teilen isotonischer Lösung suspendiert werden.

Es ist ferner festzuhalten, daß die erfindungsgemäßen Substanzen bei geeigneten Verwendungsbedingungen ihre Adjuvans-Aktivität selbst dann entfalten, wenn sie zu dem in Salzlösung gelösten Antigen zugesetzt werden.

Es ist schließlich zu bemerken, daß diese Substanzen in Form typischer Impfstoffzusammensetzungen verabreicht werden können, die intramuskulär, intradermal oder subkutan oder auch mit der Impflanzette verabreicht werden.

Tabelle

Claims

1. N-Acyl-muraminsäurederivate der folgenden Formel in derR₁ einen L-Alanyl-, L-Seryl- oder Glycylrest und
R₂ L-Lysin oder einen β-Hydroxy- oder L-Meso-alphaepsilon- diamino-pimelinsäurerest darstellt und, wenn R₂ eine Diaminosäure ist, über eine Peptidbindung mit einer L-Alanin- oder D-Alanin-aminosäure verknüpft sein kann und
Ac eine Acetyl- oder Glycolylgruppe bedeutet.

2. Impfstoff enthaltend ein N-Acyl-muraminsäurederivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das N-Acyl-muraminsäurederivat zusammen mit einem immunogenen Mittel und mit einer flüssigen injizierbaren Zusammensetzung vorliegt.